Rongeurs

496 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une nuit de mise en reproduction et un frottis vaginal, la moitié des femelles gestantes reçoit un régime pauvre en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance chez les fœtus, et toutes subissent au seizième jour une ouverture de l'abdomen pour une électroporation in utero, qui marque les neurones des fœtus. Leurs petits sont tués à trois, huit ou trente jours de vie pour étudier leur cerveau, et une portée sur trois seulement donne un marquage exploitable, selon l'expérience du laboratoire. Les mères et les petits en surnombre sont proposés en interne à un autre projet avant d'être mis à mort.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.

Bénéfices attendus

Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.

Procédures

Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minute à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.

Devenir

Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative (Annexe 2). Des recherches bibliographiques, des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. En revanche, les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins sur lesquelles le projet s’est inspiré (43% de réussite). Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Selon les expériences passées du laboratoire, 1 portée sur 3 obtient des résultats positifs au marquage in utero. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour P8 et P30. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la glande mammaire, par chirurgie sous anesthésie, puis des injections dans la tumeur, avec une croissance tumorale pouvant durer jusqu'à 75 jours, pour tester une thérapie reprogrammant les cellules cancéreuses. Le porteur décrit une possible perte de poids, une gêne au déplacement et une inflammation cutanée de la tumeur. Les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou pour analyse, les bénéfices pour les patients restant annoncés à moyen terme.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'efficacité antitumorale d'une thérapie innovante, combinée à des anticorps thérapeutiques, chez la souris. La thérapie d'intérêt reprogramme les cellules tumorales afin de les transformer en cellules immunitaires qui vont ainsi réveiller et armer le système immunitaire afin qu'il détruise les cellules tumorales non reprogrammées. Le projet proposé comportera 3 procédures qui serviront à tester l'efficacité antitumorale de la thérapie de reprogrammation en combinaison avec des anticorps thérapeutiques, sur des modèles tumoraux représentatifs d'indication oncologiques avec de forts besoins d'innovation thérapeutique. L’efficacité antitumorale sera étudiée sur le cancer colorectal, le mélanome, le fibrosarcome, le cancer de la vessie, cancer du sein. Les modèles tumoraux de cancer du sein seront implantés dans la glande mammaire des souris, les autres modèles seront implantés en sous-cutané au niveau du flanc des souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et de caractériser en phase préclinique une approche thérapeutique anticancéreuse très innovante, sur un large panel d’indications oncologiques. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale. La thérapie étudiée devra encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- Injection sous cutanée et orthotopique mammaire de cellules tumorales : quelques minutes -implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum - croissance de tumeurs sous cutanée sur le flanc, durée maximale 75 jours, durée moyenne 3 semaines -injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques, pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes - injection intratumorale de composés thérapeutiques à une dose tolérée pour un maximum de 2 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes

Impact sur les animaux

1/Nuisances attendues : -Injection sous-cutanée de cellules : douleur à la piqure et l'injection; durée quelques secondes -Suite d’une chirurgie sous-cutanée sous anesthésie et anti-douleurs : douleur au réveil 20 minutes maximum ; gène cutanée à la cicatrisation 48h maximum -croissance d’une tumeur sur le flanc ou dans la glande mammaire : gène cutanée, gène au déplacement ; durée maximum 50 et 75 jours respectivement. -injections intrapéritonéales ou intratumorales : douleur de la piqure ; 5 secondes. 2/Nuisances potentielles : -perte de poids de moins de 20% du poids maximal : 4 jours maximum -inflammation de surface de la tumeur : douleur cutanée, démangeaisons ; maximum 48h

Devenir

Les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement et analyse post mortem, soit parce qu'ils ont atteint un point limite tels que définis pour chaque procédure

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Certaines caractéristiques individuelles seront étudiées in vitro/ex vivo dans le cadre du projet européen (modèles organoïdes, modèles bio-imprimés), l’impact et l’efficacité de la thérapie étudiée en combinaison avec des traitements immuno-stimulants approuvés ne peut être pleinement évaluées que dans un système complet.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement avec le test statistique approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie), à savoir 10 souris par groupe thérapeutique, pour un total 8 groupes. Ces 8 groupes thérapeutiques seront testés sur 12 modèles tumoraux représentatifs de cancers à fort besoin thérapeutique. Les tests statistiques utilisés seront un t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral, pour la comparaison des volumes tumoraux. Et un test de Mantel-Cox pour la courbe d’espérance de vie. Dans notre expérience, les effectifs de 10 souris par groupe permettent de caractériser avec les tests cités des différences significatives supérieures à 25% de gain d’inhibition de croissance tumorale ou de 20% d’espérance de vie. Ces gains sont au minimum de l’intérêt thérapeutique. Tous les modèles tumoraux utilisés auront été préalablement testés in vitro pour leur bonne réponse à la thérapie étudiée. Pour chaque groupe thérapeutique, les tumeurs et les organes lymphoïdes (rate et ganglions) seront analysées post-mortem sur 5 souris indépendantes. Les paramètres étudiés seront les cellules immunitaires présentes dans ces organes, l’analyse statistique se fera par comparaison de moyennes (t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral). Notre expérience de l’immunophénotypage a montré que ce test permet de mettre en évidence une différence biologiquement significative des populations immunitaires.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Pour les modèles implantés dans la glande mammaire, connus pour développer des inflammations cutanées superficielles au niveau de la tumeur, les animaux seront stabulés sur une litière en cellulose moins agressive que la litière en copeaux. Des prélèvements en point final (tumeurs et organes) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Par rapport aux rats, la souris permet également d’utiliser moins de composés pour obtenir une dose/poids. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. Les modèles tumoraux prévus dans ce projet sont utilisés fréquemment sur des souris de cet âge, avec un taux de prise supérieur à 99%.

2 000 rongeurs, 1 000 souris et 1 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie gazeuse, ils subissent un prélèvement de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine temporale, puis sont mis à mort, pour valider des kits de dosage de marqueurs sanguins jugés peu fiables. Le porteur précise employer des animaux issus de l'élevage des lignées et non utilisés par ailleurs. Il présente ainsi la mise à mort comme un usage d'animaux déjà destinés à être tués.

Objectifs

De très nombreux marqueurs sanguins circulants permettent d'évaluer chez l'homme l'existence de certaines pathologies et d'en suivre leur évolution. On peut citer par exemple la troponine qui est un marqueur d'infarctus du myocarde et permet son diagnostic et son suivi en clinique humaine. De même il existe des protéines ou marqueurs spécifiques de pathologie, rénales, musculaires, d'inflammation, de cancer,....... Certains modèles de rongeurs génétiquement modifiées, dont les lignées sont présentes dans l'animalerie de notre institut, reproduisent ces pathologies humaines et pourraient nous être utiles à la mise en place et la validation de ces marqueurs chez la Souris et/ou le Rat afin de pouvoir les suivre et les identifier lors d'études scientifiques à venir. Des kits de dosage spécifiques de ces espèces sont commercialisés mais nous avons constaté que beaucoup ne sont pas fiables ou pas spécifiques, c'est pourquoi nous voulons les valider avant de proposer les dosages de ces marqueurs. Pour cela nous envisageons de prélever du sang sur des animaux générés durant l'élevage des lignées, juste avant la mise à mort de ces animaux qui ne sont pas utilisés dans des protocoles expérimentaux. La présence de ces marqueurs dans le sang étant souvent labile, il est nécessaire que les animaux soient encore vivants au moment du prélèvement sanguin. Les lignées seront sélectionnées d'après des critères scientifiques afin d'être sûr que les modèles prélevés représentent des animaux susceptibles d'avoir une perturbation de l'un ou l'autre des marqueurs d'intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de nous permettre de valider des réactifs utilisés dans l'analyse de certains marqueurs sanguins. Ces réactifs sont censés cibler de manière spécifique des marqueurs d'intérêt, comme cela peut être fait lors d'une analyse sanguine humaine. Néanmoins, il apparait que la sensibilité, fiabilitié ou spécificité de ces kits n'est pas toujours garantie, rendant certaines analyses peu fiables. Nous souhaitons ainsi mettre en place une étape de validation afin de garantir que lors de leur utilisation dans un projet d'analyse scientifique, nous pourrons obtenir des informations valides et porteuses d'informations fiables sur lequel pourront s'appuyer les conclusions des chercheurs.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse à l'aide d'une boite à induction puis d'un masque. Ils s'endormiront et nous effectuerons le prélevement sanguin sur les animaux endormis. Pour cela, selon la préférence de l'expérimentateur, nous préleverons le sang à la veine temporale superficielle ou au sinus retro-orbital. Les animaux seront ensuite mis à mort à la fin de la procédure, dans la même anesthésie. La durée de l'anesthésie et du prélèvement sanguin est d'environ 3-4 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux subiront le stress de l'endormissement durant l'anesthésie générale. Par la suite, ils resteront endormis durant le prélevement sanguin puis leur mise à mort.

Devenir

Les animaux employés dans cette procédure sont des animaux générés durant l'élevage et le maintien des lignées. Ils ne seront pas employés dans des procédure expérimentales additionnelles et seront mis à mort.

Remplacement

Cette étude a pour but de mettre en place le dosage de marqueurs sanguins chez la Souris ou le Rat en vue d'etudes scientifiques futures et à venir visant à reproduire et étudier des pathologies humaines Etant donné que nous avons à disposition de nombreux modèles génétiquement modifés reproduisant des pathologies humaines ce modèle ne peut être substitué.

Réduction

Les lignées de Souris ou de Rat étant déjà existantes dans l'institut cette étude ne génèrera pas un supplément d'animaux utilisés. Nous utiliserons en effet des animaux générés durant les élevages de ces lignées mais non utilisés pour des procédures expérimentales. Si les fonds génétiques sont similaires, nous essaierons au mieux de rapprocher les prélevements et analyses pour mutualiser les groupes controles et réduire le nombre d'animaux utilisés. Etant donné la variabilité des analyses biochimiques, nous utilisons 10 animaux par condition expérimental soit 40 animaux par marqueur étudié (10 males controles, 10 males mutants, 10 femelles controles, 10 femelles mutantes). A raison de 5 lignées étudiées par années, durant 5 ans, cela représente 1000 animaux au maximum par espèce étudiée, soit un total de 2000 animaux (Souris et Rat). Nous utiliserons des analyses paramétriques de type analyse de variance à deux facteurs suivies d'analyses post-hoc pour pouvoir conclure sur la significativité des résultats obtenus.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes avec un enrichissement, accès à la nourriture et à l'eau sans restriction. Ils seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bon état général. Une anesthésie générale gazeuse sera effectuée avant le prélèvement sanguin des animaux afin d'empêcher toute souffrance. Les animaux seront ensuite mis à mort sans réveil.

Choix des espèces

Notre institut possède une animalerie de rongeur (Souris et Rat) et nos études portent sur l'étude de ces animaux génétiquement modifiées, c'est pourquoi nous avons choisi ces espèces Par ailleurs la souris représente un modèle de choix pour l'étude de pathologies humaines S'agissant de lignées en élevage dont la mise à mort est décidée par le chercheur en charge des animaux, l’âge va dépendre des projets Certains marqueurs évoluant avec l’âge il peut être intéressant de prélever des animaux d'âges différents. Des marqueurs de vieillissement pourront être évalués sur des animaux âgés dans le cas où cela se présenterait

2 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui provoque une fibrose de la peau et un phénotype "dommageable" (posture voûtée, pelage hirsute, organes thoraciques plus gros), et subissent biopsies d'oreille, prises de sang et administrations d'un traitement pendant six semaines. Le porteur indique retenir la lignée selon le critère "requis par le client". Les animaux sont tués pour prélèvements, le remplacement étant écarté au motif qu'un "organisme entier" est nécessaire.

Objectifs

Le but de ce projet est de caractériser un modèle de souris atteintes de fibrose de peau et d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’un traitement sur ce modèle. Ces souris sont issues d’une mutation spontanée. Bien que le mécanisme ne soit pas clairement établi, cette mutation conduirait à une augmentation de la matrice extracellulaire et une fibrose des tissus concernés. Cette lignée mutante est utilisée en recherche pour étudier les pathologies humaines lourdes liées à la fibrose et ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêt pour des études cliniques.

Bénéfices attendus

Cette lignée mutante est utilisée en recherche pour étudier les pathologies humaines liées à la fibrose comme le syndrome de Marfan, la sclérodermie, l’emphysème pulmonaire ou la cardiomégalie. Ce sont des pathologies lourdes pouvant être très handicapantes, voire léthales et pour lesquelles aucune thérapie efficace n’existe. C’est pourquoi il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués et de développer de nouvelles thérapies. Ce projet permettra de sélectionner des molécules candidates d’intérêt pour des études pré-cliniques et cliniques.

Procédures

Prélèvements sur animaux vigiles : une biopsie d’oreille (durée environ 20s), sang (veine saphène ou submandibulaire ; maximum 1/sem pendant 6 semaines maximum; il faut compter environ 3 min pour un prelevement de sang). Un prélèvement terminal sur animaux anesthésiés : sang par voie retro-orbitaire (environ 3 min). Administration sur animaux vigiles : sous cutanée ou intra-péritonéale ou intra-veineuse ou orale pendant 6 semaines maximum (il faut compter environ 1 min par admnistration).

Impact sur les animaux

Les souris mutantes ont un phénotype dommageable et présentent une hyperplasie du tissu conjonctif, du cartilage et des os. En revanche, les tendons sont plus courts en comparaison à des souris contrôles. Aussi, les organes thoraciques (cœur, poumons) sont plus gros, mais les autres organes ne sont pas affectés par la mutation. Les mâles et femelles mutants sont fertiles mais leur performance de reproduction est légèrement inférieure à la normale. Selon la littérature, les animaux mutants sont reconnaissables dès 7 jours par la « rigidité » cutanée et à mesure que les souris vieillissent, les souris développement une posture voutée et un pelage hirsute. Il n’y a cependant à notre connaissance aucune donnée dans la littérature sur une mortalité prématurée des souris mutantes. Ces animaux seront surveillés quotidiennement et une grille d’observation a été établie afin de limiter les effets indésirables sur les animaux.

Devenir

Mise à mort. Des prelevements tissulaires pour analyse seront effectués sur les animaux.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le profil d’élimination, la tolérance et l’efficacité d’une molécule à visée thérapeutique en développement pour une utilisation chez l’Homme. Pour cela un organisme entier est nécessaire. Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet.

Réduction

La stratégie expérimentale permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés puisque : - seules des molécules candidates optimisées in vitro seront testées sur l’animal - les deux sexes pourront être utilisés, - les souris mutante et contrôles seront issues de la même portée permettant ainsi d’utiliser des tests statistiques plus puissants avec un nombre d’animaux limités. Au cours de l'étape de validation du modèle des tests statistiques adaptés seront appliqués dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés : tests statistiques paramétriques de type Student’s t-test, pour comparer les groupes 2 à 2, ou ANOVA, pour comparer plusieurs groupes.

Raffinement

La stratégie expérimentale permet de réduire la souffrance et l’angoisse des animaux puisque le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation générale des signes cliniques (week-ends et jours fériés inclus). Les animaux présentant des signes de souffrance seront pesés et suivis quotidiennement selon une fiche d’observation/points limites. Les animaux ayant atteint les points limites seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

La finalité de ce projet est d’évaluer une thérapie sur un modèle animal présentant une fibrose de peau. La lignée murine Tsk1 correspond au critère requis par notre client (phénotype, croissance rapide, données dans la littérature, ...), c’est pourquoi cette espèce est utilisée dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte pour le maintien de lignée et l’obtention de jeunes souris. Aucun animal n’est gardé au-delà de 10 mois, âge auquel la reproduction est moins efficace (Procédure 1). Dans les études, les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines d’âge (Procédure 2). L’utilisation de ces souris nous permet de faire un parallèle avec l’Homme et de couvrir une période au cours de laquelle le traitement serait potentiellement utilisé.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des bactéries par gavage cinq jours par semaine et une application répétée d'un produit sur les oreilles pour provoquer une inflammation de type dermatite atopique, afin de tester l'effet anti-inflammatoire de deux bactéries intestinales. Le porteur affirme que l'induction ne génère pas de douleur apparente ni de grattage. Les animaux sont tués et leurs oreilles prélevées pour analyser la réponse inflammatoire.

Objectifs

Les maladies atopiques telles que la dermatite atopique (DA), l’asthme ou la rhinite allergique touche environ 30% des personnes dans les pays développés. La dermatite atopique se caractérise par des lésions de la peau et est dues à une réaction allergique. Sa cause est complexe et reste mal comprise à ce jour. Elle serait associée à des défauts génétiques de la peau, et/ou autres anomalies immunologiques, qui favoriseraient la pénétration d’allergènes au sein de l’organisme, et le développement de l’allergie chez les individus. Le microbiote intestinal joue egalement un rôle important dans les maladies allergiques, y compris la DA. Les probiotiques contribuent à l’amélioration de l’environnement intestinal, l’équilibre des réponses immunitaires et la régulation du métabolisme. La plupart des études suggèrent que les suppléments probiotiques peuvent être une alternative pour la prévention et le traitement de la DA. C'est donc dans ce contexte que les proprietés anti-inflammatoires de 2 bactéries intestinales seront testée dans un modèle de dermatite atopique chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer la capacité de deux bactéries, connues pour leurs propriétés anti-inflammatoires dans des modèles d’inflammation intestinales, à réguler l’inflammation cutanée de type DA dans un modèle murin induit par l’application répétée de calcipotriol

Procédures

Le traitement à base de bactéries intestinales sera réalisée par gavage sur animaux vigile, 5 fois par semaine pendant 24jours. L'application du calcipotriol servant à induire la dermatite atopique, sera appliquée sur les oreilles des animaux anesthésiés avec de l'isofluorane. Le traitement corticoide utilisé en control sera appliqué sur l'oreille des souris 6h aprés l'application du calcipotriol, et sur des souris anesthésiées à l'isofluorane. La mesure de la réponse clinique (mesure de l'epaisseur de l'oreille) sera réalisée sous isofluorane.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux sont surveillés 5 jours par semaine et tout animal qui présenterait des signes physiologiques anormaux (souris prostrées, poils hérissés ou encore apparition de nécrose cutanée) suite à l’application cutanée des composés, serait mis à mort. A noter que l'induction de dermatite atopique chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente et ne conduit pas les souris à se gratter.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, et les oreilles sont prélévées afin d'analyser la réponse inflammatoire et le pouvoir anti inflammatoire des bactéries testées.

Remplacement

L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact de candidat médicament, sur une inflammation de type dermatite atopique. Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 9 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes (tests non paramétriques de Kruskal-Wallis pour comparer l’ensemble des groupes ainsi que tests de Mann-Whitney en comparaison deux à deux). Une seule dose de bactérie sera testée, celle çi ayant deja été validé dans une précedente procédure et pour une autre pathologie.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress pour l’animal. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceuxci. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique telle que l’allergie et autres inflammation cutanée en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou encore l’induction de des différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent dans la bouche un fil de soie imprégné de bactéries maintenu contre les molaires, renouvelé tous les trois à quatre jours pendant 28 jours pour provoquer une destruction des tissus de soutien des dents. Le porteur affirme n'observer aucune perte de poids ni changement de comportement et administre des antalgiques. Les animaux sont tués par saignée du cœur pour prélever les tissus, la souris étant présentée comme l'espèce la plus utilisée pour ce modèle.

Objectifs

La parodontite est une maladie inflammatoire chronique très fréquente (47% de la population adulte américaine). Elle entraine une destruction des tissus de soutien des dents, générant des édentements précoces et une difficulté à la réhabilitation orale. Elle est déclenchée par un déséquilibre du micobiote dentaire (plaque dentaire) avec une infection par des bactéries spécifiques. Les parodontites sont une source chronique de passage de bactéries dans le sang et d'une inflammation généralisée de faible intensité, favorisant des maladies inflammatoires à distance (ex : maladies cardiovasculaires). Il n'existe pas de cibles thérapeutiques de l'inflammation pour le traitement des parodontites, ni de biomarqueurs pour évaluer précocement et mieux suivre des malades, notamment ceux atteints d'autres maladies inflammatoires chroniques. Les neutrophiles sont les leucocytes (globules blancs) les plus abondants dans les lésions parodontales et semblent clés dans le développement des parodontites. Récemment, il apparait qu’il existe des sous types de neutrophiles aux fonction pro-inflammatoires ou pro-résolutives de l'inflammation. Parmi ceux-ci, certains neutrophiles se distinguent par l’expression d’une enzyme protéolytique au cours de l’apoptose (mort celullaire programmée), ce qui module leur élimination par les macrophages. Notre objectif est de déterminer si ce mécanisme interfère avec l’inflammation et la résorption osseuse dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite pendant 4 semaines, selon un protocole validé, chez des souris surexprimant l’enzyme protéolytique et présentant un activité modifiée des neutrophiles. Nous caractériserons la destruction du parodonte chez ces souris en comparaison de souris contrôles (souris du même fond génétique, et pour lesquelles le meme modèle de parodontite expérimental est appliqué).

Bénéfices attendus

Notre projet est le premier à tester les conséquences d’une régulation de l’inflammation chez des souris surexprimant une enzyme protéolytique dans la pathogénie de la parodontite. Il permet d’accroitre les connaissances dans le développement de cette maladie. Ce projet participe à l’identification de pistes thérapeutiques régulant l’inflammation de la parodontite pour laquelle plus de 30% des situations échappent au traitement conventionnel (traitement qui repose actuellement exclusivement sur le contrôle de l’infection). De plus, les conséquences systémiques seront recherchées, l’inflammation parodontale influant sur des processus pathogéniques à distance, tels que l’athérosclérose. Enfin, la parodontite est un modèle parfait de maladies inflammatoires choniques au cours de laquelle la régulation des neutrophiles est primordiale. Elle partage des mécanismes pathogéniques communs avec, par exemple, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde : les résultats de ces travaux permtteraient d’ouvrir des perspectives dans l’étude de la pathogénie et de stratégies thérapeutiques d’autres maladies inflammatoires chroniques.

Procédures

Avant chaque expérimentation, les souris sont anesthésiées par une anesthésie générale par voie intra-péritonéale de Kétamine 180mg/kg-Xylazine 20mg/kg en solution injectable dans du sérum physiologique. L'intervention chirurgicale sera effectuée selon une procédure qui dure environ 10 min/souris. La procédure est la suivante: a. Zone d’intervention: Intra-buccale sur les faces palatines de 1ère et 2nde molaires droite et gauche de l'animal. b. Incision superficielle d’environ 0,5 mm de longueur à l’aide d’un bistouri stérile au niveau de la face palatine de la première molaire droite. c. Implantation en sous gingival du côté droit au niveau de la première molaire d’une suture de soie chirurgicale 6-0 imprégnée d’une solution de bactéries. d. Dépose d’un matériau adhésif collé (ciment verre ionomère) pour maintenir le fil en place. Après chaque pose de ligature, les souris sont placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil. Cette procédure est répétée tous les 3-4 jours pendant 28 jours pour induire une inflammation chronique locale et une destruction du parodonte. Dès la seconde intervention, il n'est pas nécessaire de répéter l'incision superficielle ni d’ajouter le matériau ciment verre ionomère car l'inflammation générée permet de plus aisément glisser et d’assurer le maintien du fil dans le sillon gingivo dentaire. Entre chaque renouvellement, les souris seront maintenues dans des cages dans un environnement enrichi avec nourriture et eau ad libidum. Au bout de 14 jours, une destruction parodontale peut etre observée du coté ligature +/- P gingivalis pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Une anesthésie profonde est réalisée pour prévenir la souffrance des souris lors de la pose et du renouvellement des ligatures. Après réveil des animaux et suivi dans le temps, nous administrons des antalgiques. Notre expérience ne nous montre aucune modification observable de l’état de santé des souris (pas de perte de poids, pas de modifications comportementales, apparence physique normale). Une prise de poids en accord avec les conditions d’élevage est observée démontrant que les souris se nourrissent correctement.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort par exsanguination cardiaque sous anesthésie et analgésie profonde, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude des parodontites, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie.

Réduction

Une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris montre une différence significative sur la perte osseuse et l'inflammation parodontale avec 6 souris/groupe. Le suivi longitudinal par micro-CT (imagerie radiologique de précision et en 3 dimensions) sur souris vivante de la perte osseuse induite nous permet aussi de rationaliser le nombre de souris. Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques sont également basés sur notre expérience pour ce type d’étude. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet et de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.

Raffinement

L'expérimentation ne conduit pas à des altérations évidentes des souris. Le suivi quotidien des animaux et la mise en place de points limites permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’approche moléculaire et histologique. De nombreux outils d’analyses sont développés et adaptés à ce modèle. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent par des cages de calorimétrie qui mesurent le métabolisme sans intervention invasive, mais isolées, avant d'être mises à mort par dislocation cervicale pour prélèvement de sang et de tissus. Le porteur reconnaît que l'isolement empêche l'animal de préserver sa température en groupe et peut accroître l'anxiété. Il classe pourtant la gravité en modérée et affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier le métabolisme de façon intégrée.

Objectifs

Le métabolisme énergétique se traduit globalement par une adaptation équilibrée du comportement alimentaire et de la dépense énergétique, comprenant différents paramètres tels que l’activité musculaire, le maintien de la température corporelle et le métabolisme de base, chacun dépendant du statut de l’individu (veille, sommeil) et des conditions environnementales (température, présence ou absence de nourriture). Un élément majeur dans la régulation de la balance énergétique est la capacité de l’organisme à: transformer les nutriments ingérés afin de les stocker, de signaler au reste de l’organisme le statut des réserves énergétiques, et enfin, de mobiliser ces réserves le moment voulu. Jusqu'à récemment, l'évolution a favorisé la capacité à stocker efficacement les nutriments sous forme de graisse pendant les périodes d’abondance tout en développant des stratégies pour se prémunir contre les périodes de disettes intermittentes. Cependant, cet avantage sélectif est devenu délétère dans notre société moderne, caractérisée par la sédentarité et l’abondance de nourriture riche, propice au développement de maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type 2. Pour cela nous nous intéressons à une protéine clef du métabolisme énergétique, impliquée dans la transformation du sucre en gras, et reconnue dans le développement de la stéatose hépatique inflammatoire, de l’obésité, et du diabète de type 2. L’objectif de ce projet est d’étudier au moyen de cages calorimétriques (un outil non-invasif et complètement automatisé), le métabolisme énergétique et la capacité adaptative au cours de la journée des lignées de souris vigiles génétiquement invalidées pour le gène codant cette protéine clef du métabolisme énergétique de façon globale ou ciblée (dans le foie, le tissu adipeux et l’intestin) dans le but de mieux comprendre les processus métaboliques et moléculaires impliqués dans le devenir des nutriments, leur stockage et l’implication des trois organes. Il s’agit de remettre en perspective les caractéristiques (Prise alimentaire, dépense énergétique, utilisation des nutriments et comportement) de l’animal vigile des différentes lignées , au regard 1) du métabolisme de l'animale de nuit (période active) comme de jour (période de repos), et 2) dans différentes conditions environnementales de température et d’accès à la nourriture.

Bénéfices attendus

Les différents paramètres évalués au moyen de l’analyse calorimétrique permettent de caractériser les mécanismes biologiques de l’animal in vivo reliant la prise alimentaire, la balance énergétique, la capacité d’utilisation des aliments, et les comportements de l’animal. L’analyse statistique combinée des 4 différentes lignées permettra, au regard de chaque paramètre analysé, d’évaluer l’importance de cette protéine clef du métabolisme énergétique de manière tissu spécifique et son impact sur les fonctions des autres tissus. In fine, ce projet permettra une meilleure compréhension des maladies métaboliques (obésité/diabête/stéatose hépatique). Les tests d’adaptations permettent de mettre l’animal dans une situation physiologique qui implique les différents paramètres impliqués dans la régulation de la balance énergétique (La prise alimentaire et hydrique, la consommation d’oxygène et la production de dioxyde de carbone, le quotient respiratoire indicatueur du type nutriment utilisé, La dépense énergétique globale de l’animal issue de l'activité locomotrice, de la thermogénèse et du métabolisme de base, l’activité locomotrice spontanée ) selon l'absence ou la présence de la protéine d'intérêt dans les différents organes (foie, le tissu adipeux et l’intestin). Ceci permettra d'effectuer une analyse croisée des paramètres génétiques, des tests d’adaptations, le tout en fonction du temps. Exemple : L’absence de nourriture induit une diminution de la dépense énergétique, une mobilisation des réserves lipidiques (tissu adipeux), une plus grande activité métabolique de conversion au niveau du foie. A l’inverse la reprise alimentaire fait appel aux capacités ; d’ingestion au niveau de l’intestin et de stockage au niveau du tissu adipeux. Ce projet sera donc un apport important dans la compréhension du rôle de cette protéine dans le stockage, l’utilisation des nutriments et l’implication des trois organes.

Procédures

L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal et n'est pas invasive. Aucun prélévement n'aura lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jour lors de l'individualisation (7 fois), puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes par souris) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques (soit 3 fois par souris).

Impact sur les animaux

L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. En effet, l’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. La seule nuisance pouvant entrainer une modification du comportement de l'animale et du comportement d'espèce est que la mesure en cage de calorimétrie ne peut se faire que sur animal isolé. L'animal préserve mieux sa température corporelle lorsqu'il est en groupe, pour remédier à cela l'animal aura à sa disposition tout le matériel nécessaire à la confection d' un nid. L'interaction sociale (hiérarchie, diminution de l’anxiété, routine journalière) entre animaux de la même espèce est reconnue, l’individualisation peut avoir une incidence comme un surcroit d’anxiété. L'observation régulière de l'animal est primordiale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure par dislocation cervicale. Le sang et différents tissus seront prélevés pour des analyses biochimiques et transcriptomiques

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique de manière intégrée. Elle ne peut se faire que sur l’animal vigile. L’étude des différents paramètres métaboliques impactés par une modification d’expression du gène cible dans des organes précis nécessite l'utilisation d'un modèle in vivo. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en tenant compte des impératifs de l’analyse statistique. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Le choix de l'analyse statistique est déterminant. l'ANOVA, ANCOVA ou une ANOVA avec mesures répétées entre les lignées et leurs contrôles respectifs seront prioritaires. Enfin à l’issue de cette étude une analyse en composante Principale (CPA) sera menée en intégrant les 4 lignées en interaction avec les tests d'adaptation (Jeun, reprise alimentaire et thermoneutralité) afin de ranger en ordre (avec sa probabilité) l'importance de chaque organe (dont le facteur de transcription aura été invalidé) dans les paramêtres mesurés, le tout en fonction du temps.

Raffinement

L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive et limite au maximum le stress de l’animal. La mesure en calorimétrie indirecte s’effectue dans des cages d’hébergement classiques. L'animal aura à sa disposition tout le matériel nécessaire à la confection d' un nid. Pour rappel, les conditions d’hébergement et les caractéristiques de la cage métabolique sont les suivantes : - l’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2), conforme à la directive 2010/63/EU : 371 x 189 x 126 mm (LxlxH). - différents enrichissements sont présents dans la cage (roue d’activité, carré de coton). - les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal dans ses déplacements - les cages sont non-hermétiques et sont soumises à un flux d’air calibré de 2litres/min. En cas de problème technique, un échange d’air (passif) avec l’extérieur est maintenu. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévus en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. L’analyse ne peut se faire que sur l’animal individualisé.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques (KO) disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. De plus,l'utilisation de modèles de souris transgéniques permet une étude approfondie de l'étiologie de maladie métabolique comme le diabête de type 2, la stéatose hépatique, et l'obésité en général. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris doivent être âgées au minimum de 12 semaines, c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.

2 090 rongeurs, 1 640 souris et 450 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées par de nombreuses voies, jusque dans le duodénum ou la trachée sous anesthésie, pendant jusqu'à 24 semaines, pour tester des molécules de thérapie génique contre des maladies génétiques. Le porteur mentionne des modèles génétiquement modifiés au phénotype "dommageable", les animaux étant tués avant l'apparition des symptômes. Il justifie le recours à deux espèces par les exigences des études réglementaires et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour un développement préclinique.

Objectifs

Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent sur des pathologies génétiques essentiellement neuromusculaires. Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi. Dans ce contexte, nous développons une approche innovante de modulation de l’épissage en interférerant avec la machinerie d’épissage des ARN pré-messagers. Il s’agit plus précisément de forcer la machinerie d’épissage à former et « libérer » des ARN messagers exempts de mutations et capables d’être traduits en protéines fonctionnelles. Pour cela nous développons de courtes séquences d’oligonucléotides antisens (AON) chimiquement modifiés qui gardent la capacité de se lier aux ARN par complémentarité de bases. Le deuxième outil est matérialisé sous la forme d’un petit ARN nucléaire, l’U7snRNA, modifié au niveau de sa séquence d’origine pour participer, au même titre que les AONs, à la modulation de l’épissage des ARN mutés. Les outils dérivés de l’U7snRNA sont délivrés par deux types de vecteurs. Les premiers sont des vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Le deuxième type de vecteur que nous développons est matérialisé sous forme de molécule d’ADN nu dérivée du génome des AAV. Le recours aux AAV comme vecteurs de gènes est largement utilisé à travers le monde et des essais cliniques de thérapie génique sont autorisés par les instances règlementaires depuis de nombreuses années.Dans le cadre de cette approche envisagée, il s’agit de trouver la meilleure molécule et la meilleure voie d’administration pour la délivrance de nos outils thérapeutiques dans l’environnement in vivo.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie génétiques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une amélioration significative chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients traités.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée pourront être plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Aucun animal ne recevra plus d’une injection par jour. En revanche, afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 1, nous testerons des voies d’administration moins invasives chez le patient en vue d’un essai clinique, à savoir une administration orale (intra-stomachal ou intra dudodenum) et une administration pulmonaire (intra- nasale ou intra-tracheal). L’administration intra-duodenum sera réalisée uniquement sur un petit nombre d’animaux pour voir si la molécule passe le duodenum. Cette intervention durera 1h entre l’anesthesie et le réveil de l’animal et ne sera pas répétée. En revanche, pour l’administration intra stomachal, intra nasal et intra tracheal ; afin de permettre l’accumulation progressive et compte tenue de la demi-vie des molécules thérapeutiques dans la circulation, les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal et intra-nasale sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Pour les administrations intra tracheal elles se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthesie et le réveil. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. Pour cela, les animaux recevront une anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxilaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de même de facon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses. Cependant les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la présence de plaies seront évalués post-adminsitration jusqu’au sacrifice. Les animaux montrant un signe quelconque de détérioration de santé dûe à une potentielle toxicité de nos molécules seront sacrifiés immédiatement. Les autres nuisances qui pourraient être observées concernent surtout les animaux subissant la procédure d’administration intra-duodenum qui pourraient présenter des difficultés d’alimentation du fait du déplacement possible du duodenum lors de l’administation. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoins. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classé « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs, et les animaux dans ce projet seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si les symptômes devaient apparaitre prématurément.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de toutes les procédures afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)

Remplacement

Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.

Réduction

Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations (moins invasives pour le patient en vue d’un essai clinique) à savoir l’administration par voie orale ou pulmonaire. Les tests type student, fisher, ANOVA ou Bonferroni/Dunn seront effectués pour chaque lot afin d’obtenir une analyse statistique correcte en utilisant le moins d’animaux possibles suite au plan d’expérience préalablement défini.

Raffinement

LLors de leur arrivée, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, et les animaux seront sacrifiés avant l’apparition des symptômes. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une autorisation à part au sein de notre animalerie pour la procédure d’élevage.Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.

Choix des espèces

Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique pré-clinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces étant exigés dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Cependant, afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveaux-nés à 4 semaines). Enfin, un de nos objectifs consistera à vérifier la possibilité du passage de la barrière placentaire des médicaments, et nous traiterons pour cela des adultes gestantes.

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent sur un tapis roulant trois fois par semaine pendant six semaines, subissent un test d'endurance final et deux prélèvements de sang, pour évaluer l'effet d'un extrait de microalgue sur la performance sportive. Le porteur reconnaît que la course peut stresser les animaux et prévoit des séances d'habituation. L'objet du projet relève de la nutrition sportive, et les animaux sont tués pour recueillir du matériel biologique.

Objectifs

L'effort d'endurance mobilise de nombreuses ressources, notamment les nutriments issus de l'alimentation. Ces nutriments sont majoritairement utilisés au niveau musculaire afin de produire une contraction et une relaxation optimales, mais également afin que les muscles puissent récupérer correctement après l'effort. Toutefois, les sportifs qui s'entrainent avec une grande fréquence ont besoin d'une plus grande quantité de substrats afin de pouvoir soutenir un effort intense sur une base régulière, nécessaire pour progresser. Ce protocole est destiné à évaluer l'effet d'un extrait de microalgue dans ce contexte de nutrition sportive.

Bénéfices attendus

Les effets potentiels de la supplementation en microalgue seront évalués sur la performance des animaux suite au test d'endurance final. De plus, les modifications métaboliques seront identifiées par des dosages des marqeurs des voies du métabolisme énergétique et musculaire. Des marqueurs inflammatoires et du stress oxydant seront également recherchés.

Procédures

Les souris seront nourries ad libitum pendant 6 semaines avec un régime contrôle ou avec un régime supplémenté avec un extrait de microalgue (1 extrait, 4 doses). Les animaux courront sur un tapis de course adapté pendant ces 6 semaines tous les lundis, mercredis et vendredi pendant 1h. Lors de la dernière course, les souris seront soumises à un test d'endurance afin de mesurer leur performance. 2 prélévements de sang de 100µL sur animal vigile seront réalisés à 6 semaines d'intervalle.

Impact sur les animaux

La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Afin de limiter ce stress, les animaux suivront des séances d'habituation lors des premières séances de course. Lors de ces séances, les souris seront tout d’abord laissées libres d’exploration sur le tapis d’exercice éteint. L’appareil sera ensuite allumé pour que les animaux s’habituent au bruit du moteur puis le tapis roulant sera mis en marche pendant 5 min à la vitesse de 9 m/min, avec une pente de +5 degré.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux mis à mort pour recueil du materiel biologique nécessaire aux analyses.

Remplacement

L'étude des relations entre alimentation et activité physique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro n’a la capacité d’intégrer cette complexité ni de mesurer les niveaux d'endurance à l'effort physique.

Réduction

Le nombre d'animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Des études du même type portent sur 8 à 10 animaux, du fait de la forte variabilité entre animaux au niveau de la performance sportive. Nous avons choisi de travailler avec 9 animaux afin que le nombre d'animaux par cage soit homogène (3 souris par cage). Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. La course sur tapis roulant peut engendrer un stress chez l'animal. Afin de limiter ce stress, les animaux suivront des séances d'habituation lors des premières séances de course. Lors de ces séances, les souris seront tout d’abord laissées libres d’exploration sur le tapis d’exercice éteint. L’appareil sera ensuite allumé pour que les animaux s’habituent au bruit du moteur puis le tapis roulant sera mis en marche pendant 5 min à la vitesse de 9 m/min, avec une pente de +5 degré. Les animaux seront observés hebdomadairement afin de détecter des comportements agressifs de certains animaux, si tel est le cas l'animal agressif sera isolé de ses congénères dans une cage individuelle. Si un animal est blessé, il sera soigné par badigeonnage de bétadine sur la zone lésée, il sera également isolé le temps de la cicatrisation de ses blessures. Dans tous les cas, les animaux isolés resteront en contact visuel, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Pour chaque procédure, des points limites spécifiques et des points d'arrêt ont été prévus.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant la mobilisation des ressources énergétiques, notamment au cours d’un exercice imposé. Le modèle C57Bl/6J est une souche reconnue pour ce type d'expérimentation. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.