Rongeurs
Transport cérébral d’un transporteur synthétique de cuivre chez la souris moblo EU2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
56 souriceaux mâles porteurs d'une maladie génétique grave vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Ils reçoivent un transporteur synthétique de cuivre par injection sous-cutanée, avec quatre séances d'imagerie et cinq prélèvements sanguins sous anesthésie, avant mise à mort vers le 35e jour. La gravité tient surtout à la maladie elle-même, qui provoque faiblesse musculaire, malformations et risque d'anévrisme chez les animaux non traités. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'évaluer le passage du cuivre vers le cerveau chez l'animal malade.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare dont l’incidence est estimée à 1 patient pour 250 000 naissances. Cette maladie touche les enfants (garçons uniquement) et elle due à une mutation génétique qui entraîne une carence généralisée en cuivre caractérisée par des cheveux fins et tortillés et dont les symptômes sont, entre autres, un défaut du développement squelettique et des troubles neurologiques sévères qui sont la cause du pronostic grave de cette maladie. En effet, le cuivre est un métal impliqué dans un grand nombre de réactions biochimiques intervenant dans la respiration cellulaire, le métabolisme du fer, le métabolisme des pigments, des neurotransmetteurs, etc. Ainsi, une carence en cuivre s’exprime par un déficit de ces différentes activités biologiques. Le seul traitement actuel pour les patients réside dans l’administration d’histidinate de cuivre qui restaure les concentrations normales en cuivre dans le sang, mais pas au niveau du cerveau. Cette absence d’amélioration clinique s’explique par l’impossibilité pour le cuivre de passer la barrière hémato-méningée qui entoure le cerveau. Notre projet vise à tester chez la souris mâle porteuse de la maladie une nouvelle thérapeutique basée sur l’administration, sous la peau, d’un transporteur synthétique du cuivre capable de franchir cette barrière hémato-encéphalique. Nous souhaitons maintenant démontrer grâce à des techniques d’imagerie médicale que ce transporteur synthétique du cuivre est capable de franchir la barrière hémato-encéphalique pour délivrer le cuivre jusqu’au cerveau de la souris porteuse de la maladie.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester chez la souris mâle porteuse de la maladie une nouvelle thérapeutique basée sur l’administration sous-cutanée d’un transporteur synthétique du cuivre (TSC) capable de franchir cette barrière hémato-encéphalique. Les effets attendus sont un assombrissement du pelage qui est un indicateur du métabolisme correct du cuivre, ainsi qu’une amélioration de l’activité physique globale et une augmentation de l’espérance de vie ainsi qu'à une amélioration de l'activité locomotrice de la souris.
Procédures
Les animaux ne subissent pas de chirurgie mais 4 séances d'imagerie TEP/TDMX (20 minutes chacune maximum) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane et 5 prélèvements sanguins ( 30 secondes par prélèvement) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane
Impact sur les animaux
Chez les animaux non traités, les effets de la carence en cuivre sont la perte de la couleur du pelage, une baisse du tonus musculaire, poids plus faible qu'une souris non porteuse de la maladie, malformation des membres inférieurs et un risque d'anévrisme aortique. Les séances d'imagerie TEP réalisées dans cette étude n'ont pas d'effets indésirables chez l'animal.
Devenir
les souris sont maintenues en vie à la fin de la PE1 (entretien de la lignée) et de la PE2 (Administration par injection Sous-cutanée du TSC) et sont mises à mort après la derniere séance d'imagerie de la PE3 qui permet de visualiser les effets du traitement sur le passage de la BHE.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’évaluation de l’efficacité de transport du cuivre dans le cerveau via la barrière hémato-encéphalique chez l’animal porteur de la maladie.
Réduction
L’étude portera sur 56 souris mâles de laboratoire. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Le test non paramétrique de Mann et Whitney sera utilisé pour analyser les résultatsde cette étude.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). Les animaux présentant des signes avancés de souffrance liée à la progression de la maladie, seront soulagés par un traitement antalgique.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce souris se justifie par l’existence d’animaux porteurs de la mutation du gène ATP7A conduisant à une carence systémique en cuivre, proche de la maladie de Menkès observée chez l’homme. Le protocole expérimental démarrera chez les souriceaux à J5, en période de lactation, et sera poursuivie jusqu’à J35, date de mise à mort des animaux. L’imagerie médicale nécessite des souris de corpulence supérieure ou égale à J35, mais le protocole ne peut excéder cette date car les animaux hémizygotes non traités avec le TSC ne pourront pas survivre au-delà de 5 semaines.
Immunothérapie anti-Galectine 9 dans le cancer du sein triple négatif: preuve de concept chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée à partir de cellules cancéreuses, puis elles reçoivent jusqu'à huit injections d'un anticorps, avant mise à mort au plus tard trente jours après. Le porteur décrit une perte de poids et des difficultés respiratoires possibles liées au développement de métastases. Il annonce espérer démontrer l'efficacité d'une immunothérapie et juge le modèle animal seul capable de reproduire ces mécanismes tumoraux.
Objectifs
Un des cancers du sein les plus agressifs, qui représente 15 à 20% des cancers du sein, présente un taux élevé de rechute. L’absence de thérapies spécifiques le rende difficile à traiter. Nos données montrent que les cellules de cancer du sein triple négatif résistant à une irradiation présentent de façon plus abondante une protéine particulière appelée Gal9. Cette protéine pourrait servir de cible thérapeutique pour lutter plus efficacement contre cette maladie. L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’efficacité thérapeutique d’un anticorps ciblant Gal9 dans un modèle de cancer du sein triple négatif chez la souris. Notre projet consistera dans un premier temps à faire pousser des tumeurs à partir de cellules irradiées in vitro. Les cellules seront irradiées puis injectées dans la glande amammaire. La croissance des tumeurs sera suivie et comparée à des tumeurs issues de cellules non irradiées. La deuxième phase de notre projet dépendra de l’efficacité de notre première procédure. Elle consistera à injecter des cellules irradiées ou non irradiées à des souris et de traiter immédiatement ces souris avec un anticorps ciblant Gal9. Ce traitement devrait permettre de minimiser le développement du cancer, en particulier chez les souris dont les tumeurs expriment fortement Gal9.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer l'efficacité d'une thérapie ciblant Gal9 dans ce cancer particulièrement agressif. Les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif et soumises à de la radiothérapie pourraient être particulièrement éligibles à cette thérapie.
Procédures
1 Injection sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (10 minutes) Injections intra-péritonéales sur animaux vigiles (jusqu’à 8, à raison de 2 par semaine)
Impact sur les animaux
Le développement des tumeurs pourrait s'accompagner d'une perte de poids en plus d'une gêne physique pour les animaux. Des effets indésirables liés à la présence de métastases sont envisageables ; ils se traduiraient par des difficultés respiratoires plus ou moins prononcées. La grille de points limites que nous proposons permettra de tenir compte de ces potentiels effets indésirables. En ce qui concerne l'injection d'anticorps anti-(gal9), plusieurs papiers ont déjà été publiés à ce sujet et ne montrent pas d'effets indésirables particuliers.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, au maximum 30 jours après le début du traitement. Les raisons sont les suivantes: - le score maximum de points limites sera atteint, - les souris n'auront pas de tumeur primaire mais seront susceptibles d'avoir développé des métastases pulmonaires - les souris auront bien répondu à l’immunothérapie et l’analyse des réponses immuno-inflammatoires sera nécessaire pour l'expliquer.
Remplacement
Nous avons accumulé de nombreuses expériences sur modèles cellulaires mais nous devons maintenant tester l’utilité de notre traitement sur l’animal puisqu’il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes complexes impliqués dans le développement tumoral et les réponses immunitaires associées.
Réduction
Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécéssaire et suffisant de souris. Pour chaque condition expérimentale, un nombre de 10 souris par groupe pour un total de 70 souris.
Raffinement
L’état général des souris sera contrôlé visuellement quotidiennement en ouvrant chaque cage. Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours (lundi au vendredi). La grille sera également utilisée tous les 2 jours. La souffrance des animaux ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalent à l’introduction d’une aiguille. Cependant, une grille d’évaluation de la douleur, adaptée à ce projet, a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur. En cas d’atteinte d’un niveau défini de points limites, la mise à mort de l’animal sera anticipée.
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisée dans des modèles développés in vitro et vise à valider la pertinence de notre travail dans le cancer du sein triple négatif. Il est essentiel de tester la pertinence de notre cible thérapeurique dans un modèle beaucoup plus complexe que des cultures cellulaires et de tester son action anti-cancéreuse. La souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement les étapes du développement du cancer du sein en intégrant les réponses des cellules de l'immunité observées chez l'humain. Le cancer mammaire est majoritairement présent chez l'adulte. Pour cette raison, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines.
Régulation de l’évitement comportemental par la dopamine
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des chocs électriques "d'intensité modérée" apprennent aux souris à éviter un lieu, et cinq des six procédures comportent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, certaines souris passant en outre deux semaines isolées. 646 souris adultes, mâles et femelles, issues de différentes lignées transgéniques, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis tuées par une dose létale d'anesthésique suivie d'une perfusion de fixateur par le cœur. Il s'agit de comprendre comment l'aire tegmentale ventrale du cerveau contrôle cet évitement, ce qui "pourrait" selon le porteur aider à identifier des cibles thérapeutiques contre l'évitement persistant du stress post-traumatique. Le porteur range la chirurgie parmi les "procédures douloureuses", sans préciser ce qu'elle implante ou injecte, ni le nombre de chocs, ni les tests réunis sous l'expression "validation comportementale".
Objectifs
Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’aire tegmentale ventrale qui jouent un rôle clef dans le comportement de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’aire tegmentale ventrale contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ce circuit.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.
Procédures
Ce projet implique 6 procédures expérimentales. La procédure 1 consiste en une série d’expériences de validation comportementale. Les procédures 2-6 comprennent toutes la chirurgie stéréotaxique pour étudier des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement de place. A l’issue de ces expériences, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Le comportement d’évitement de place engendre de l’inconfort pour l’animal puisque des chocs électriques d’intensité modérée sont administrés à l’animal. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses. L’isolement des souris pendant 2 semaines engendre de l’inconfort pour l’animal.
Devenir
Notre étude nécessite de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 646 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.
Thérapie génique de la perte d’audition
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sourdes de naissance ou rendues sourdes selon le protocole, et utilisées pour certaines dès leurs premiers jours, elles subissent jusqu'à quatre tests auditifs sous anesthésie et une chirurgie de la cochlée, sous anesthésie, pour y injecter un vecteur viral, précédée pour une partie d'entre elles d'une à trois injections de tamoxifène dans l'abdomen. Le projet doit établir la "preuve de concept" de vecteurs de thérapie génique contre des surdités héréditaires ou liées à l'âge, et selon le porteur il "pourrait poser les bases d'un développement clinique" si les résultats sont probants. Le porteur dit ne s'attendre à aucun signe de souffrance ou d'inconfort lié à la surdité, y compris quand la chirurgie peut faire baisser ou perdre l'audition de l'oreille injectée, cette surdité étant "unilatérale".
Objectifs
Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests auditifs au nombre de 1 à 4 avec un intervalle minimal d’au moins une semaine entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Des animaux seront soumis à des injections sur une semaine, 1 à 3 fois, par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes). L’injection de vecteur de thérapie génique sera réalisée après l’injection du tamoxifène. Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui sera réalisée une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’Isoflurane L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).
Devenir
Les animaux seront mis à mort car ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 8-21 jours après la naissance Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par la SBEA de l’Institut Pasteur.
Choix des espèces
Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.
Rôle du thalamus médian dans la synchronisation des aires corticales pendant le sommeil profond chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Nées transgéniques, 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Chacune subit une chirurgie de trois à six heures sous anesthésie générale pour l'implantation d'équipements miniaturisés d'enregistrement et de stimulation, puis s'habitue en deux à huit jours à porter environ 3 g d'implant et d'équipement, avant des enregistrements menés jusqu'à l'âge de 35 semaines. Le porteur reconnaît que naître transgénique constitue un "potentiel effet indésirable", que le poids de l'équipement peut causer gêne et stress, et que le stress de la chirurgie ou de la contention peut rendre les souris agressives entre elles. Le projet doit aussi mesurer le rôle de la synchronisation cérébrale du sommeil profond dans la consolidation de la mémoire, sans que le porteur décrive aucune tâche d'apprentissage ni aucun test de mémoire.
Objectifs
Les objectifs de cette étude sont 1- d’élucider les mécanismes qui permettent la synchronisation des activités neuronales entre des aires cérébrales distantes pendant le sommeil profond et 2- de déterminer l’importance de cette synchronisation dans la consolidation de la mémoire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice direct de cette étude est l’amélioration des connaissances, dans deux domaines, 1- les mécanismes de base du sommeil profond, et 2- le rôle du sommeil profond dans les processus d’apprentissage et de mémoire. En plus de ce bénéfice direct, les bénéfices indirects de cette recherche fondamentales sont 1- découvrir une nouvelle région cible pour le traitement des troubles du sommeil profond, 2- mettre en évidence l’importance relative des différentes phases du sommeil pour l’apprentissage et la mémoire. 30% de la population européenne est en déficit chronique de sommeil et ceci a de nombreuses conséquences sociales et économiques. Le manque de sommeil est en effet associé à une augmentation des risques d’accidents, mais aussi a un risque accru de souffrir de nombreuses pathologies comme la dépression, l’anxiété, l’obésité, etc. D’autre part la majorité des troubles psychiatriques et des maladies neuro-dégénératives sont associées à des sommeils détériorés qui amplifieraient les symptômes. De plus en plus d’études suggèrent que le sommeil pourrait jouer un rôle important dans l’étiologie de ces pathologies. Il est donc de première importance de comprendre le fonctionnement du sommeil en conditions physiologiques et pathologiques pour ajouter une corde à l’arc thérapeutique.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie consistant en l'implantation d'équipements d'enregisterment et de stimulation miniaturisés. La chirugie d'implantation dure 3-6 heures. Une fois la chirurgie effectuée, les animaux seront hébergés en groupe et libres de leurs mouvements.
Impact sur les animaux
Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soit un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale. Le niveau de douleur de cette procédure est modéré et sera atténué par un analgésique pré-opératoire et des analgésiques pendant les 5 jours post-opératoires. La déshydratation pendant la chirurgie sera prévenue par injection de saline. Après les 5 jours post-opératoires, les animaux seront progressivement habitués à être restreint de leur mouvement pendant une brève période dans la main de l’expérimentateur. Une fois les animaux habitués à la contention, leur implant sera connecté au système d’enregistrement (caméra et/ou préamplificateur). Le poids total de l’implant + équipement est d'environ 3 g. Ce poids peut occasionner une gêne pour l’animal ainsi qu’un stress les premiers jours. Pour limiter cela, les animaux seront habitués sur 2-8 jours au port des équipements pendant des périodes de plus en plus longues 2-5 fois par jour. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés en groupe. Néanmoins, il est possible que le stress induit par la chirurgie ou la contention rende les animaux agressifs entre eux. Une manipulation très progressive sera effectuée afin de limiter au maximum les situations où les animaux devraient être séparés. Néanmoins, en cas d’agression, les animaux seront hébergés dans des cages larges avec une grille séparant deux compartiments qui permettent d’héberger deux animaux dans un environnement contigu tout en empêchant les agressions.
Devenir
A l'issue de ce protocole expérimental, les souris seront euthanasiées. En effet, il est essentiel de prélever leur cerveau afin d'effectuer des analyses complémentaires.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques se basant sur des linear mixed models qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle et de test afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.
Raffinement
Le haut niveau de complexité des chirurgies effectué sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrements pendant des mois. Dans ce projet, je combinerai les techniques d’imagerie chez l’animal libre de ses mouvements et les enregistrements électrophysiologiques ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux et d’obtenir des données encore plus riches puisque combinant deux techniques de pointe sur le même animal. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, j’ai donc raffiné les étapes d’habituation et de contention afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux.
Choix des espèces
Ce projet requiert l’utilisation de souris transgéniques. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. La souris possède une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. La diversité des modèles génétiques existants chez la souris permet tout un panel de manipulation de l’activité neuronal dans des types cellulaires donnés. Mon étude vise à déterminer comment différents types de cellules sont impliqués dans la synchronisation des oscillations. L’utilisation de souris transgéniques spécifiques permettra de répondre à ces questions. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgie seront effectuées entre 8 et 20 semaines et les enregistrements entre 10 et 35 semaines. En effet, ce projet vise à étudier les oscillations chez des animaux adultes non âgés.
Effets in vivo des inhibiteurs de DYRK1A sur la prolifération des cellules bêta du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 rats, dont des rats rendus diabétiques, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant quatre semaines un inhibiteur par injection, voie orale ou patch, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires par section du bout de la queue et des tests métaboliques, avant d'être tués pour analyse du pancréas. Le projet vise une "preuve de concept" pour une molécule candidate contre le diabète. Le porteur n'attend "aucun effet indésirable" hormis la douleur des piqûres et des coupures de queue, et affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement".
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique associée à une diminution de la masse des cellules β du pancréas qui sécrètent l’insuline. La régénération des cellules béta est désormais considérée comme une stratégie thérapeutique de premier plan. Au cours des dernières décennies, des études ont été menée pour identifier les cibles moléculaires pouvant être modulées afin de restaurer la masse β cellulaire et parmi elles l'enzyme DYRK1A. Nous proposons d’étudier, in vivo, un nouvel inhibiteur de DYRK1A, plus puissant et plus spécifique que ceux actuellement disponibles pour la recherche et ayant comme particularité d’être actif sous différentes voies d’administration ( intra-péritonéale, transdermique et orale). Durant 4 semaines nous administrerons, selon ces trois voies, deux doses de cet inhibiteur à deux modèles animaux, le rat Wistar non diabèrique et le rat Goto Kakizaki ( GK) diabétique. Nous analyserons par des tests in vivo l'évolution de la glycémie et de l’Insulinémie. Enfin, à l’issue des traitements, les animaux seront sacrifiés et une étude par des approches d'immunohistochimie sera menée pour analyser les aspects structurels et fonctionnels du pancréas .
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera la livraison d'une preuve de concept solide indiquant que l’inhibiteur EMD92 est un candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée sur les patients diabétiques. En plus de construire une meilleure connaissance de l'implication de DYRK1A dans la régulation de la croissance des cellules β au cours du diabète, des résultats positifs sur les rats diabétiques GK nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique « curative », capable de prévenir la progression du diabète, grâce à la restauration d'une masse cellulaire β fonctionnelle
Procédures
Dans ce projet des rats mâles Wistar et GK âgés de 8 semaines recevront les molécules d'intérêt selon 3 voies d’administration et durant 4 semaines : -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront une injections intrapéritonéales (IP) 1 jour sur 2, -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront par voie orale (dans l’eau de boisson) -32 rats wistar et 32 rats GK recevront par diffusion transdermique (par patch). Un prelèvement de sang de 10 microlitres sera réalisé une fois par semaine jusqu'a la fin du traitement. A l'issue du traitement tous les animaux ( 96 rats wistar et 96 rats GK) subiront des tests métaboliques durant lesquels il recevront une injection soit de glucose pour mesurer la tolérance à cette molécule, soit d'insuline pour etudier leur sensiblité à cette hormone. Au cours du test de tolerance au glucose 4 prélèvements de sang seront faient de chacun 10 microlitres.
Impact sur les animaux
Les molécules étudiées ne sont pas censé induire de toxicité, aucun effet indésirable n’est donc attendu sur les animaux. De plus, ces molécules ne pouvant pas traverser la barrière hémato-encéphalique, aucune neurotoxicité ne devrait être observée. Par contre de legers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure d'aiguille lors de l'injection en intrapéritonéale des molécules, du glucose et de l'insuline pendant les tests in vivo ainsi qu'à la coupure de l'extrémité de la queue lors des prelèvements de sang.
Devenir
Aprés le traitement à l'EMD tous les animaux sont gardés en vie. Aprés les tests métaboliques les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Pour ce projet il n'existe pas de méthode de remplacement à celle faisant appel aux modèles animaux. Ils sont les seuls à nous permettre d'appréhender les paramètres structurels du pancréas, à savoir les interactions entre les cellules bêta et les cellules acinaires/canalaires qui entrent dans la constitution du pancréas. Le choix du rat Wistar et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'il présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme
Réduction
Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur. Les résultats seront analysés et validés par des tests statistiques adaptés : Mann-Whitney, Wilcoxon ou Anova (différences significatives P
Raffinement
Pour le traitement nécessitant une injection ainsi que pour les tests in vivo, les animaux sont préparés à la contention par les expérimentateurs. La douleur liée à l'injection est celle du niveau d'une piqure de l'aiguille. Ces méthodes sont en accord avec la classe lègère des procédures.
Choix des espèces
Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme. Les rats seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge, les rats GK développent le diabète et les cellules béta du pancréas sont altérées. Le traitement à l’EMD92 a pour but de rétablir cette défection en augmentant la masse béta cellulaire. Pour les rats Wistar, le traitement à l’EMD92 indiquera l’effet de la molécule sur les cellules béta d’un pancréas sain.
Validation de vecteurs viraux AAV pour leur capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse unique de vecteurs viraux dans la queue puis sont tuées quatre semaines plus tard pour analyse, afin d'identifier un vecteur capable de franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur évoque le syndrome de Rett comme application, mais l'étude porte ici sur la sélection du vecteur, non sur un traitement. Il décrit une évaluation préalable in vitro sur neurones et organoïdes, tout en jugeant la souris "indispensable et nécessaire".
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Seules les filles sont atteintes de cette pathologie, les garçons étant très rares et mourant d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi que des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse, visant à corriger le gène muté MECP2. Dans ce but, on utilise souvent des virus adéno-associés (AAV) comme des transporteurs ou vecteurs pour délivrer le matériel génétique visant à corriger la pathologie. Ces vecteurs présentent une inocuité et une expression à long terme des gènes thérapeutiques dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Une injection directe dans le cerveau ne permet cependant qu'une correction localisée des cellules portant la mutation au site d'injection. Par ailleurs, les injections dans des sites multiples dans le cas des troubles neurodégénératifs peuvent potentiellement augmenter la survenue d’effets indésirables. L'objectif est ainsi de développer des vecteurs AAV pouvant être injectés par voie intraveineuse périphérique et qui soient capables de passer la barrière hémato-encéphalique. Dans le cadre de ce programme, différents types de vecteurs AAV vont être générés, évalués in vitro sur des cellules et des organoides cérébraux, puis in vivo dans un modèle de souris, afin de valider la capacité de ces AAV à passer la barrière hémato-encéphalique de manière efficace, de vérifier le tropisme cérébral et l'absence de distribution dans d'autres organes. Après identification du vecteur AAV présentant les caractéristiques optimales répondant à ces critères, celui-ci sera évalué dans un modèle de souris du syndrome de Rett, portant des mutations dans le gène MECP2, afin de valider l'effet thérapeutique (cette étude fera l'objet d'une demande d'autorisation séparée).
Bénéfices attendus
L'identification de vecteurs AAV permettant de passer de manière efficace la barrière hémato-encéphalique ouvrira la voie à de nombreuses applications de thérapie génique dans le cadre des pathologies du système nerveux central, dont ici en exemple le syndrome de Rett pour lequel aucune thérapie n'existe à ce jour.
Procédures
On pratiquera une injection des vecteurs AAV par voie intraveineuse, sur l'ensemble des animaux (160 souris), en une administration unique, à l'age de 6 semaines. Les animaux seront analysés 4 semaines après administration des vecteurs.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés à l'injection de vecteurs AAV par voie intraveineuse, tel que des saignements au site d'injection. Il y a notamment toujours une goutte de sang après chaque injection, mais c’est la preuve que l’injection est réussie et que le produit a bien été injecté dans la veine. Pour limiter les saignements, on réalise une compression immédiatement après l'injection, qui favorise ainsi l'hémostase. Dans de rares cas, l'injection IV ne réussit pas du 1er coup, auquel cas le geste est répété. Les injections se font ainsi à l'extrémité de la queue afin de pouvoir remonter le long de la veine et réinjecter le cas échéant.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après l'administration des vecteurs pour procéder aux analyses post-mortem (histologiques et de biologie molculaire)
Remplacement
L'objectif de cette étude est d'identifier le vecteur AAV qui permet de passer la barrière hémato-encéphalique avec efficacité, dans la perspective de traitement par thérapie génique de pathologies du système nerveux central. La librairie de vecteurs AAV sera d'abord évaluée in vitro en culture de cellules neuronales, dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) de patients et dans des organoides cérébraux. Seuls les variants qui permettent d'obtenir les résultats in vitro les plus prometteurs seront évalués in vivo dans le modèle souris, modèle animal qui reste indispensable et nécessaire pour évaluer l'efficacité de transduction des vecteurs AAV à l'échelle de l'organisme entier, notamment dans le cadre de l'étude du passage de la barrière hémato-encéphalique.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 5 souris par vecteur AAV et par dose, dans deux fonds génétiques différents. L'efficacité de transduction dans le cerveau, et donc de passage de la barrière hémato-encéphalique, sera évaluée par quantification du génome viral par ddPCR, et par analyse de la fluorescence sur 10 coupes sagittales de cerveau. Ce nombre de souris et de coupes sera suffisant pour définir le vecteur AAV présentant le meilleur tropisme pour le cerveau, et ce de manière qualitative / semi-quantitative, par dénombrement des cellules transduites fluorescentes. Concernant l’analyse de la fluorescence, il s’agira d’une analyse qualitative. A partir du moment où on voit un signal GFP dans le cerveau, cela signifiera qu’on a franchi la barrière hémato- encéphalique. On pourra affiner en faisant un score semi-quantitatif (rare cellules, quelques cellules, beaucoup de cellules). Concernant les quantifications du génome viral par ddPCR, nous réaliserons une analyse non paramétrique de Krustal-Wallis sur l’ensemble des groupes, suivi d’une analyse post hoc de Dunn pour les multiples comparaisons. Le seuil alpha sera de 0.05.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Après les injections des vecteurs AAV par voie intraveineuse, les animaux seront observés pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de saignement au niveau du site d'injection. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris est nécessaire pour évaluer la capacité des vecteurs AAV à passer la barrière hémato-encéphalique, dans la perspective de traitement par thérapie génique de pathologies du système nerveux central. De plus, il existe des modèles de souris du syndrome de Rett, portant des mutations dans le gène Mecp2, ces modèles étant utilisés dans un 2è temps pour évaluer l'efficacité thérapeutique du vecteur AAV optimal. L'injection par voie intraveineuse sera réalisée sur des animaux de 6 semaines, où le passage de la barrière hémato-encéphalique serait le plus efficace d'après la littérature. Il s'agit aussi de l'age qui sera indiqué dans l'évaluation de l'effet thérapeutique des AAV dans les modèles de souris du syndrome de Rett (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptomes du syndrome de Rett).
Optimisation de combinaisons de radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie pour un modèle murin de tumeur cérébrale orthotopique
- Recherche appliquée
- Cancers
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée par chirurgie stéréotaxique, puis elles reçoivent radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie, avec un suivi par imagerie et des prélèvements sanguins, avant mise à mort. Le projet cherche à optimiser des combinaisons de traitements contre le glioblastome, dont le porteur rappelle la médiane de survie d'environ treize mois. Il juge "indispensable" de tester ces combinaisons et n'envisage qu'une étude in vivo à ce stade.
Objectifs
Les nouvelles techniques de radiothérapie (RT) permettent de délivrer des traitements hypofractionnés (avec des fractions de 3 à 15-20Gy) tout en évitant de fortes toxicités radio-induites. Depuis plusieurs années il est décrit dans la littérature que la radiothérapie modifiait le microenvironnement tumoral. La description de ces mécanismes a entrainé un intérêt à associer la RT à des immunothérapies. Cependant, jusqu’à récemment l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire n’était pas connu. L’objectif de ce projet est de décrire la réponse immunitaire radio-induite selon le fractionnement de la radiothérapie et la combinaison avec des chimiothérapies et/ou immunothérapie, pour un modèle de glioblastome orthotopique afin de pouvoir optimiser les combinaisons de traitements.
Bénéfices attendus
Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005. Pourtant cette pathologie présente une incidence de 3/100 000 habitants et la médiane de survie des patients est d’environ 13 mois. Il est donc indispensable de développer/tester de nouvelles combinaisons de traitements dans le but de les évaluer rapidement via des essais cliniques. Les combinaisons de radiothérapie et immunothérapie sont de plus en plus développé en essais cliniques pour d’autres localisations que des tumeurs cérébrales. Ces combinaisons semblent plutôt bien tolérées et pour plusieurs indications les premiers résultats sont très encourageants. Les résultats obtenus dans ce projet permettront de proposer une combinaison de RT + immunothérapie +/- CT optimisé sur le schéma de fractionnement de la RT et son effet sur la réponse immunitaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure de chirurgie stéréotaxique pour implantation de cellules tumorales, puis 7 jours plus tard à un traitement par radiothérapie (1 ou 4 fractions espacées de 24h - non invasif sous anesthésie) et/ou chimiothérapie (per os 5 fois par semaine pendant 3 semaines et/ou immunothérapie (intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines). Le volume tumoral sera suivi par IRM ou imagerie optique à J7, J14, J21 (procédure non invasive sous anesthésie). 150 µL de sang sera prélevé à J0, J7, J14 et J21 sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances / effets indésirables peuvent provenir de trois éléments du protocole : 1) la procédure de chirurgie intra cérébrale par technique de stéréotaxie ; 2) la radiothérapie intracérébrale ; 3) la croissance tumorale intra cérébrale. 1) La chirurgie stéréotaxique pour l’implantation des tumeurs sera réalisée selon la procédure enseignée par l’université de Strasbourg lors du DU de chirurgie intra cérébrale, et déjà utilisée par nos collaborateurs qui se sont proposés pour nous assister pour les premières injections. Une étude pilote de 10 souris est prévue afin de pouvoir affiner si besoin les points limites détaillés dans ce protocole. Ces souris bénéficieront d’un suivi plus fin (notamment durant les heures post-opératoires….). Les effets indésirables potentiels attendus lors de la procédure de chirurgies, sont: une hypothermie post opératoire, une infection post opératoire, des signes de douleurs, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions. 2) Concernant la procédure de radiothérapie externe, peu d’effets indésirables sont attendus puisque ce traitement sera délivré en plusieurs faisceaux et avec une précision qui permet de délivrer la dose souhaitée sur la tumeur tout en évitant la dose reçue aux organes à risque avoisinants. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. 3) Enfin une tumeur intra cérébrale de taille trop importante peut entrainer des symptômes tels qu’un comportement atypique, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions ainsi qu’une perte de poids ou une douleur. Si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids de plus de 20%, cf tableau annexe), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : -Les animaux dont la greffe n’aura pas prise -Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude -Euthanasiés si points limites atteints L’ensemble des souris seront euthanasiées de la même manière : dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Remplacement
A ce stade de nos connaissances, seule une étude in vivo sur des modèles animaux syngéniques (animaux pour lesquels une greffe de cellules cancéreuses d’origine murine pourra former une tumeur) de développement tumoral permettra d’analyser l’effet de l’inhibiteur de PAR1 (traitement en développement) seul et/ou combiné à la radiothérapie et/ou chimiothérapie et/ou immunothérapie sur l’efficacité thérapeutique et la réponse immunitaire. De plus, notre étude repose sur l’effet de la radiothérapie hypofractionnée (forte dose administrée à en 1 ou 4 séances) sur le recrutement de cellules immunitaires au sein de la tumeur (selon les cellules présentes elles peuvent accélérer ou ralentir l’efficacité de la radiothérapie). Le modèle animal est le seul permettant de tels objectifs impliquant la présence de plusieurs types de cellules dans une tumeur.
Réduction
Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus sur l’étude du système immunitaire dans l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales (avec évaluation de la croissance des tumeurs et/ou de leur composition en différents types de cellules au cours du temps après traitement). Dans une démarche de Réduction, les quantités de cellules injectées ainsi que les coordonnées stéréotaxiques utilisées pour les injections seront celles optimisées par nos collaborateurs de ce projet qui ont testé cette année plusieurs conditions et fixé les conditions optimales d’injections. Ces échanges de protocole au sein d’une collaboration nous permettent d’éviter de répéter ces étapes d’optimisation et ainsi de réduire le nombre d’animaux à utiliser, notamment dans l’étude pilote de la procédure N°1. La prise tumorale dans des souris sélectionnées est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires (pour garantir des volumes de tumeurs homogène au moment du traitement) au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris (qui se sont initialement développées dans les mêmes types de souris) permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité et la fiabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat (trois expérimentations indépendantes).
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages (ayant une surface de 800 cm2 (425 x 266 x 185 mm)) de 10 individus en présence d’enrichissement. Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées sans anesthésie en intra péritonéale ou en par voie orale selon les formulations des médicaments. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids (cf tableau annexe Points limites)), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur (transplantation, irradiation) seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs évaluée régulièrement. Les symptômes seront gradés à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de la douleur, poids…) et l’animal pris en charge selon le score obtenu (traitement de la douleur si nécessaire). Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Souris de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.
Étude des processus biologiques induisant l’aggravation de maladies chroniques du sang et leur transformation en cancer (du sang).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées pour détruire leur moelle osseuse puis greffées par injection de cellules malades, avec des biopsies de moelle au fémur, pour reproduire la transformation d'une maladie chronique du sang en leucémie aiguë. Le porteur indique des complications possibles comme des thromboses, des hémorragies, des infections et des diarrhées liées à l'immunodépression. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces interactions et qu'un "organisme entier" est nécessaire pour tester les molécules.
Objectifs
Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) représentent un ensemble de maladies hématologiques (maladies du sang) affectant un des sous-groupes de cellules constituant le sang: le groupe myéloïde. Celui-ci inclut les granulocytes (cellules impliquées dans l’immunité), les thrombocytes (communément appelés « plaquettes », responsables de la coagulation sanguine) et les érythrocytes (couramment appelés « globules rouges » chargés du transport d’oxygène dans le sang). Des études scientifiques basées sur le « séquençage de l’ADN » (une méthode utilisée en laboratoire afin de connaître de manière exacte le type et l’ordre des molécules constituant notre ADN), ont permis de montrer l’existence de modifications génétiques (mutations) à l’origine de cette maladie. Ces mutations perturbent principalement des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, entraînant ainsi la multiplication anormale et accrue de ces cellules. D’une part, ces mutations semblent également être impliquées dans la transformation de cette maladie vers en un cancer du sang particulier dit «Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) », associé à de très faibles chances de guérison et/ou de survie. D’autre part, cette transformation en LAM serait aussi liée à des modifications touchant à l’environnement dans lequel se trouvent ces cellules : la moelle osseuse. Ainsi, l’objectif de notre projet est d’identifier les processus biologiques propres aux cellules des NMP et propres à leur environnement (moelle osseuse) impliqués dans la transformation de la maladie (NMP) vers un cancer du sang plus grave (LAM). Il permettra alors de déterminer de nouvelles pistes de préventions et de traitements (cibles thérapeutiques), afin d’empêcher la transformation des NMP en cette maladie dévastatrice qu'est la LAM.
Bénéfices attendus
Les processus responsables de la transformation des NMP en LAM secondaire sont encore mal compris. Ils semblent liés d’une part à des anomalies génétiques au sein des cellules sanguines et d’autre part à des anomalies de leur microenvironnement, au sein de la moelle osseuse, dans lequel évoluent les cellules malades des NMP. Le microenvironnement est constitué d’autres types de cellules (immunitaires, neuronales, ...etc.) baignant dans une matrice (une sorte de gelée chargée de molécules nécessaires à la survie de ces cellules). L’altération de ces cellules et/ou de cette matrice conduit à des anomalies du microenvironnement, ce qui perturberait aussi les cellules sanguines se nichant dans cette moelle osseuse. Ainsi, la compréhension des mécanismes responsables de la transformation des NMP en LAM et le développement de stratégies thérapeutiques permettant de prévenir l’apparition de cette complication, représentent un enjeu important pour les patients atteints de NMP.
Procédures
Afin d'identifier les mécanismes à l'origine de la transformation de la NMP en un cancer du sang plus grave qu’est la LAM, nous mettrons en place un modèle de souris « chimères », c’est-à-dire, ayant reçu des cellules provenant de notre modèle de souris malade afin de suivre leur développement. Pour cela des souris normales seront irradiées (étape durant 15 minutes, non douloureuse permettant d’éliminer les cellules de leur moelle osseuse) avant de recevoir par injection intraveineuse (injection d’une durée d’une minute, sur souris éveillée dans la veine de la queue) des cellules obtenues à partir de la moelle osseuse de nos souris transgéniques en post-mortem. Les souris seront alors maintenues sous antibiotiques durant les deux semaines afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire causée par cette irradiation. Les cellules injectées, correspondant à des cellules malades de NMP, pourront être préalablement modifiées génétiquement afin d'invalider l'expression d'autres gènes et ainsi déterminer comment a lieu la transformation de la NMP en LAM. Pour suivre le développement des cellules malades de NMP et leur éventuelle modification à l'origine d'un cancer du sang, nous réaliserons des biopsies de moelle osseuse au niveau du fémur des souris (geste technique de moins de 5 minutes réalisé sous anesthésie et analgésie, deux fois maximum pour chaque souris). Nous effectuerons également des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées et durant maximum une minute par souris) de manière bimensuelle sur toute la durée (maximum 12 mois) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Enfin, nous réaliserons des expériences d'imagerie afin de visualiser les interactions potentielles entre les cellules de la NMP et celles de leur environnement (observation d'une heure au niveau du crâne sur souris anesthésiée après incision de la peau sur 5mm. L'incision sera refermée après l'imagerie par des points de suture). Ensuite nous testerons des traitements sur une durée de 28 jours (injection non douloureuse deux fois par jour dans l'abdomen ou sous la peau ou par gavage avec une sonde spécifique). Chaque injection, réalisée sur souris éveillée, prend moins d'une minute. Le suivi de l'efficacité des traitements sera réalisé par prélèvement de sang ou de moelle osseuse, comme décrit précédemment.
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiées exprimant la mutation fréquemment retrouvée chez les patients NMP peuvent présenter des complications thrombotiques et hémorragiques (caillot sanguins et saignements), comme cela est observé chez les patients. Pour prévenir ces complications, plusieurs mesures seront prises, en particulier lors des prélèvements sanguins afin d'éviter la survenue de thrombose. Dans le cas des procédures impliquant une irradiation des animaux préalablement à l’injection de cellules par voie intraveineuse, des événements d’infection et de déshydratation pourraient apparaître. Ceci pourrait potentiellement induire des diarrhées modérées ou aiguës, ce pourquoi les souris seront maintenues sous antibiotiques durant la période de prise de greffe. En outre, l’administration des traitements standards de NMP par voie orale (gavage) constitue un risque d’irritation du tube digestif des animaux. Pour cela, nous prévoyons d’administrer un antidouleur par voie non invasive (sous-cutanée) afin de réduire au minimum leur souffrance. Toutefois, les conditions d’hébergement des souris ainsi que leur suivi quotidien permettront de prévenir le risque de souffrance et d’agir dans un délai très court (compensation de la perte en eau par ajout d’une gélose hydratée notamment). Enfin, et étant donné que nous travaillons sur la transformation des NMP en LAM secondaires, les animaux risquent de développer une leucémie mais seront aussitôt euthanasiés dès l’apparition de la maladie. Lors de la mise en place des essais thérapeutiques, nous veillerons au bien-être des souris, malgré la répétition des administrations (deux fois par jour pendant 28 jours) et nous arrêterons les tests dès que des signes de souffrance apparaîtront chez ces animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro pertinent pour l'étude de la transformation leucémique des NMP, récapitulant les interactions entre l'environnement (moelle osseuse) et les cellules de NMP. Or la transformation des cellules malades de NMP vers le cancer du sang implique ces interactions. De plus, le test de molécules thérapeutiques nécessite l'utilisation d'un organisme entier afin de miner les conditions de distribution du médicaments comme cela se passera chez l'Homme.
Réduction
Étant donné que nous travaillons depuis plusieurs années sur des modèles animaux, nous avons acquis de l’expérience et une expertise dans ce domaine. Nous avons ainsi mis à profit nos connaissances théoriques et pratiques afin de mettre en place un protocole exprimental incluant le minimum d’animaux. Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique quotidien des souris sera également entrepris pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. En cas d’irritation du tube digestif, les animaux recevront une dose d’antidouleur afin de réduire leur souffrance au minimum. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs thérapeutiques. Dans notre cas, nous disposons d'un modèle de souris génétiquement modifiées, exprimant la mutation la plus fréquemment retrouvée chez les patients atteints de la pathologie humaine que notre projet vise à étudier (la NMP). Pour mettre en place ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 6 à 12 semaines (jeunes adultes). Notre modèle de souris "chimères" nécessitera des souris receveuses normales, âgées de 6 et 8 semaines au moment de la transplantation de moelle osseuse. Ce âge est celui où la mise en place du modèle de souris "chimère" est le meilleur comme cela est décrit dans de nombreux articles scientifiques du domaine.
Etude de validation de la diffusion d’Angiotensine II et de Phenylephrine par implantation de mini-pompes osmotiques chez la Souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une minipompe est implantée sous leur peau par chirurgie pour diffuser deux molécules provoquant une hypertension, avec des échographies sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, avant mise à mort pour analyses. Le projet ne vise pas une connaissance nouvelle mais à vérifier la fiabilité du matériel servant à modéliser l'hypertension chez la souris. Le porteur juge cette étape "indispensable" pour valider ses futures études pharmacologiques.
Objectifs
Le but de ce projet est d'analyser de manière précise une modalité d'administration d'un mélange de composés utilisé chez la Souris pour modéliser l'hypertension. En effet, afin de reproduire des conditions pathologiques sur le modèle Souris, nous utilisons une diffusion continue d'une faible dose de deux molécules (Angiotensine 2 et Phenylephrine) dans la cavité péritonéale. Cette diffusion est gérée par une mini-pompe placée en sous-cutané, qui doit envoyer durant une période de 28 jours complets une concentration continue de la solution dans l'organisme afin de soumettre le système cardiaque à une surcharge vasculaire entrainant une hypertension. Ce protocole est ensuite utilisé pour modéliser les atteintes observées chez l'Homme afin d'étudier des gênes ou des composés potentiellement utilisables pour réduire ces symptomes. Néanmoins, nous avons observé dans une étude précédente que durant la dernière semaine de traitement, après le 21ème jour de diffusion, nous observions une forte réduction de l'hypertension sur une modèle génétiquement modifié. Cela nous questionne sur la durée réelle de diffusion des composés dans l'organisme. Pour répondre à ce point, nous souhaitons réaliser une étude de validation de ce protocole.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mettre en évidence de manière robuste la variabilité expérimentale possible due au matériel employé pour modéliser l'hypertension chez la Souris. Cette étape est indispensable pour pouvoir poursuivre nos études pharmacologiques sur le modèle Souris et conclure sans équivoque sur les données générées dans ce cadre.
Procédures
Les animaux subiront plusieurs échographies pour surveiller leurs fonctions cardiaques. Elle seront anesthésiée par voie gazeuse. Des prélevements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la décision du manipulateur, afin de favoriser le bien-être de l'animal (le prélevement vigile se fait à la veine temporale superficielle et s'avère moins stressant qu'une anesthésie gazeuse couplée au prélevement au sinus orbital) Une implantation de minipompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une implantation sous-cutanée des mini-pompes. Celles ci restent sous la peau durant l'ensemble du projet, et ont une longeur de 3 cm et un diamètre de 0.7 cm. La chirurgie est simple et maitrisée pour cette implantation et aucune complication n'a été observée dans le projet précédent. Une couverture analgésique durant l'implantation et dans les jours suivant celle-ci, couplée à des conditions antiseptiques permettent de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions optimales. Suite à cette implantation, les animaux effectueront une anesthésie gazeuse pour passer une échographie cardiaque chaque semaine. Celle-ci dure environ 30 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Durant cette anesthésie, un prélevement sanguin à la veine temporale superficielle sera effectué.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques et histologiques.
Remplacement
Etant donné que ce protocole vise à modéliser un phénomène cardiaque complet, à savoir la mise en place d'une hypertension, nous ne disposons pas actuellement de modèles alternatifs n'utilisant pas l'animal.
Réduction
Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 14 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 12 et 14 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 28 animaux recevant une minipompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).
Raffinement
Les animaux seront hebergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté. Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. Lors des échographies, les animaux seront anesthésies par voie gazeuse. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront agés de 1 an, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente.
Elevage d’un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (projet multi-site 2/2)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
4 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Il s'agit d'élever et de faire se reproduire par fécondation in vitro une lignée porteuse d'une forme de nanisme, les femelles recevant des hormones de superovulation puis étant tuées pour prélever leurs ovocytes, les mâles étant tués pour leur sperme. Les animaux porteurs de la mutation expriment eux-mêmes un phénotype pathologique avant d'être sacrifiés. Le porteur affirme que le projet "ne peut pas se faire sans modèle animal" pour valider un futur traitement, et décrit le choix du rongeur par son faible coût de reproduction.
Objectifs
Le but de ce projet est de produire des lots par fécondation In Vitro (FIV), après maintien et superovulation d'un modèle murin de dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (lignée SEDc). la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. Ces lots seront utilisés afin de développer un traitement contre cette maladie. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2.
Bénéfices attendus
Ce projet aura des bénéfices pour l’homme à plusieurs niveaux. Actuellement, il n’existe pas pour cette maladie de traitements qui restaurent une croissance osseuse et qui permette donc aux patients de grandir mais surtout qui élimine les complications dues à cette pathologie. Ce projet pourra donc offrir à long terme des solutions thérapeutiques pour soigner cette maladie. De plus, cette maladie étant encore peu connue, ce projet permettra à court terme de mieux comprendre sa physiopathologie grâce au modèle de souris malades.
Procédures
Les femelles seront injectées avec des hormones qui vont stimuler leurs production d’ovocytes. Ces femelles seront ensuite euthanasiées pour récupérer les ovocytes. Ils seront utilisés pour une FIV avec du sperme récolté à partir d'un mâle qu'il est nécessaire de mette à mort également.
Impact sur les animaux
Avant de réaliser les injections d'hormones et de sacrifier les animaux pour prélever les ovocytes et le sperme, les souris SEDc seront hébergés pendant une à deux semaines et pourront exprimés un phénotype plus ou moins modéré. Ensuite, les femelles de ce projet seront injectées avec des hormones puis seront euthanasiées afin de prélever les ovocytes qui serviront pour les FIV. Les mâles seront également sacrifiés pour prélever le sperme. Avant le prélèvement de sperme et d’ovocytes, une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique à ce projet.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés pour prélever les ovocytes et le sperme afin de réaliser des fécondations in vitro.
Remplacement
Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de SEDc, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins finaux. Le nombre d’animaux est calculé selon les protocoles expérimentaux de manière à obtenir le minimum d’animaux par groupe permettant des résultats significatifs et homogènes. Des analyses statistiques ont pour cela été utilisées. De plus, et afin d'optimiser les rendements de la superovulation et des FIV, la dose optimale et l'âge des femelles ont préalablement étés définis pour chaque souche en effectuant des injections préliminaires dose-réponse et par expérience.
Raffinement
Les points limites sont observés pendant toute la durée du projet. Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modéle. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant un enrichissement minimum (bâtons de bois et matériel de nidification).
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est largement bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de celui-ci un modèle de choix fiable pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats valables pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les demandes et les objectifs scientifiques du projet. Nous utiliserons pour ce projet des femelles âgées de minimum 3 semaines pour les donneuses d'ovocytes (idéalement de 3 à 6 semaines) et des mâles de plus de 10 semaines pour les donneurs de sperme.
Néphrotoxicité du lithium : rôle de la prolifération des cellules du canal collecteur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du lithium et diverses molécules par gavage, injection intrapéritonéale, croquettes enrichies ou minipompe implantée sous la peau, avec passages en cage à métabolisme et injection rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyse des reins. Le projet cherche à comprendre la toxicité rénale du lithium, que le porteur qualifie de traitement "incontournable" du trouble bipolaire. Les atteintes possibles décrites vont de la soif intense à la douleur liée aux injections et aux implantations chirurgicales.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une affection à la fois fréquente, touchant 1 à 4% de la population mondiale, et grave, puisque les accès maniaques et dépressifs engagent le pronostic vital en raison du risque suicidaire. Le traitement le plus efficace à ce jour est le Carbonate de Lithium. Cette efficacité incontestée est contrebalancée par des effets secondaires à long terme, et en particulier rénaux. Ceux-ci se manifestent d’abord par une incapacité à concentrer les urines et donc une soif intense, puis à plus long terme par une insuffisance rénale avec l'apparition de microkystes rénaux, pouvant évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Le mécanisme impliquerait un type de cellules particulières du rein, les cellules principales du canal collecteur responsables de l'équilibre de l'eau et du sel, et donc du milieu intérieur, dans l'organisme. Les données de la littérature ont montré une prolifération de ces cellules suite à une exposition à doses thérapeutiques au lithium. Cette prolifération semble médiée par le GDF15, facteur de croissance précédemment connu du laboratoire pour son effet en situation d’acidose. Notre projet vise à déterminer in vitro (sur des cultures cellulaires, dont sphéroïdes 3D) et in vivo sur un modèle d’exposition à long terme (jusqu’à 6 mois) le rôle et les mécanismes de la prolifération de ces cellules dans la progression vers l’insuffisance rénale. L’objectif de ce projet est ainsi de mieux comprendre la toxicité rénale du lithium et de mettre en évidence des pistes thérapeutiques préventives et curatives sur un modèle expérimental avant le développement d’essais cliniques.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiopathologie. Il vise à élucider certains mécanismes qui sous-tendent la toxicité rénale d’un traitement incontournable de la maladie bipolaire et de proposer des traitements préventifs.
Procédures
Un groupe de 80 souris sera soumis à une mise en cage métabolique pendant une durée de 4heures, chez un animal vigile, à 15 jours, 1 mois, 3 mois et 6 mois du début de la procédure : soit 4 fois par souris. Ces mêmes souris seront soumises à une mesure de DFG : injection rétro-orbitaire de FITC-inuline sous anesthésie à l'isoflurane, puis prélèvements microcapillaires à la queue à 3, 7, 10, 15, 20, 40 et 60 minutes, qui seront réalisées à 1 mois, 3 mois et 6 mois, soit 3 fois par souris. Un groupe de 40 souris sera soumis à un gavage gastrique de mubritinib sur animal vigile quotidien pendant 4 semaines. Un groupe de 40 souris sera soumis à une injection intrapéritonéale de canertinib sur animal vigile quotidienne pendant 4 semaines. Enfin, un groupe de 80 souris sera soumis à une intervention chirurgicale consistant à la pose de minipompes osmotiques sous-cutanées sous anesthésie générale (réalisée par injection intrapéritonéale) : une pose par souris. Les minipompes seront laissées pendant une durée de 4 semaines. Enfin, 400 souris seront nourries par des croquettes enrichies en médicaments données au long cours aux humains (amiloride et lithium) sans autre intervention que le prélèvement d'urines par simple contention et la surveillance de la prise de boissons, d'aliments et du poids.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l'animal et utilisés chez l'homme. Le traitement par carbonate de lithium induit une augmentation de la consommation d'eau et de la diurèse ; le traitement par mubritinib peut être responsable d'un inconfort lié au gavage gastrique, il est par ailleurs bien toléré ; le traitement par canertinib peut entraîner du fait de sa voie d'administration des douleurs liées à l'injection intrapéritonéale, il est bien toléré par ailleurs. Le traitement par tolvaptan peut entraîner des douleurs liées à l'implantation sous-cutanée des minipompes. Il est responsable également d'une augmentation de la diurèse et d'une augmentation de la consommation d'eau. La mise en cages métaboliques peut entrainer un stress chez la souris. La mesure du débit de filtration glomérulaire peut entraîner des douleurs au point d'injection du produit.
Devenir
Les souris sont euthanasiées car les prélèvements et analyses sont nécessaires sur les tissus afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur l'architecture des reins, la présence de microkystes et de fibrose, et ceci n'est pas possible avec le maintien en vie.
Remplacement
Le projet vise élucider des mécanismes responsables de l’homéostasie cellulaire du rein en réponse à des stimuli physiopathologiques. Ces stimuli sont transduits au niveau de différents tissus/organes en messages hormonaux, humoraux et/ou physiques qui sont perçus par le rein. La réponse rénale quant à elle intègre plusieurs types cellulaires, avec des interactions para et endocrines entre elles. L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes entiers.
Réduction
Pour toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre, le nombre de souris par groupe sera de 10, avec un nombre total de 640 animaux. Ce chiffre correspond à la taille des effectifs établis grâce au calcul du nombre d'animaux nécessaires pour que les tests statistiques soient interprétables.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la souffrance des animaux, nous prévoyons de mettre en place des critères d’interruption des procédures expérimentales basés sur des paramètres non invasifs représentatifs de l’évolution de la pathologie tels que la mesure de la variation du poids corporel (Perte de poids de plus de 10 % par rapport à la dernière pesée), la pression artérielle et la surveillance quotidienne du comportement des animaux (paralysie des membres postérieurs, epistaxis, animal prostré, ne bougeant plus). La procédure en cage métabolique concernant la plus faible proportion de souris possible, et sera réalisée après habituation des souris à la procédure sur une très courte période (6h). Enfin, pour limiter la douleur dans la procédure de mesure du débit de filtration glomérulaire (procédure 6), la sédation à l’isoflurane est privilégiée.
Choix des espèces
L’intérêt d’utiliser des souris pour cette procédure est que nous maîtrisons la transgénèse chez ces animaux, et que les modèles transgéniques sont déjà disponibles, sans nécessité de nouveaux élevages et croisement dans une autre espèce. Les expériences sont réalisées chez des souris adultes de 8 semaines pesant 25-30g au début de l’expérimentation. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse soit totalement terminée. Les animaux sont étudiés jeunes car une exposition longue (6 mois) est prévue dans un groupe d’étude.