Rongeurs
Induction de tumeurs pulmonaires dans un modèle de souris mutantes K-rasG12D et implication de la protéine Atad2 (Partie 2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Après avoir reçu sous anesthésie, dans une première partie du projet décrite dans une autre demande, des particules virales instillées dans la trachée pour déclencher des tumeurs du poumon, les souris passent un scanner sous anesthésie gazeuse à 4, 6, 8, 10 et 12 semaines. 60 souris vont être utilisées dans cette seconde partie, dont 40 génétiquement modifiées pour le gène étudié, Atad2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger alors que des tumeurs se développent dans leurs poumons. Le porteur renvoie les effets indésirables à des "points limites" qu'il ne détaille nulle part. Au terme de ce suivi, toutes les souris sont tuées et leurs poumons prélevés.
Objectifs
La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).
Bénéfices attendus
Notre gène d'intérêt est situé sur le chromosome 8q23 chez l'homme, dans une région instable proche de la région de l'oncogène Myc. Cette proximité avec Myc entraîne souvent son amplification dans différents types de cancer. Presque la totalité des études sur notre géne d'intérêt ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur son degré d’implication dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité d’Atad2 est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.
Procédures
Durant toute la période de cette procédure, l'observation de développement des tumeurs pulmonaires chez les animaux sera réalisée par imagerie microCT sous anesthésie gazeuse. Cette procédure d’imagerie sera répétée à 4, 6, 8, 10 et 12 semaines post-induction. La durée d'un scan est d'environ 15 minutes, soit environ 20 minutes d'anesthésie au total.
Impact sur les animaux
Dans cette partie du projet, les souris qui ont préalablement reçu les particules d'adéno-Cre par voie intratrachéale (voir DAP Partie 1) seront suivies à l'animalerie de l'IAB et observées pour le développement tumoral. Les effets indésirables, décrits dans les points limites, seront surveillés.
Devenir
A l'issue de cette procédure, toutes les souris seront sacrifées et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.
Remplacement
Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.
Réduction
Dans ce projet nous allons utiliser 40 souris modifiées génétiquement pour notre gène d'intérêt. Ce nombre maximal fera l'objet de tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 5 dans des cages à 22°C avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Du coton et des tubes en carton seront disposés dans toutes les cages. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. 4 à 5 jours d’acclimatation seront laissés avant le début des expérimentations. Les souris seront observées quotidiennement.
Choix des espèces
Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants plus particulièrement la souris. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Dans notre étude, nous pensons que le meilleur moyen d'évaluer le rôle de la protéine Atad2 dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules est d'utiliser des souris invalidées génétiquement pour Atad2 ainsi que des souris sauvages avec lee même fond génétique. Ce modèle murin est très puissant et devrait nous aider à mieux comprendre la liaison Les souris utilisées dans cette étude viennent d'un laboratoire de recherche américain. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que les effets de l'intubation intratrachéale.
Rôle de la vasopressine et de l’apeline dans la prééclampsie chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Livrées "supposées gestantes" au deuxième jour de gestation, 4 664 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour provoquer chez elles une prééclampsie, une hypertension de la grossesse, et tester sur elles des traitements. Elles subissent une chirurgie, la pose d'une pompe osmotique sous la peau ou la ligature des artères utérines, 18 heures en cage à urine, douze jours de mesures quotidiennes de la pression par brassard à la queue, une méthode que le porteur dit "légèrement stressante", et des injections sous-cutanées quotidiennes pendant quatre à douze jours ou une injection intraveineuse. Toutes sont tuées au CO2 dans le dernier tiers de leur gestation, pour récupérer leur sang par ponction cardiaque, leurs fœtus, leurs placentas et leurs reins. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d'un organisme entier", aucune méthode in vitro ne reproduisant selon lui la prééclampsie.
Objectifs
La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rat. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 12 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rates gestantes, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rates gestantes jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.
Devenir
Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation par euthanasie gazeuse au CO2 à la fin de chacune des procédures expérimentales afin de récupérer du sang par ponction cardiaque et des tissus d’intérêts (fœtus, placentas, reins) pour des analyses complémentaires.
Remplacement
Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.
Réduction
Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rongeurs par condition différentes. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.
Choix des espèces
Le rat est une espèce pertinente pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.
Evaluation de la pharmacocinétique (absorption, distribution, métabolisme et élimination) de composés administrés à l’animal
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1000
7 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter veineux, des prélèvements sanguins répétés, un séjour en cage à métabolisme sur sol grillagé que le porteur reconnaît de dimensions inférieures à la réglementation, puis un prélèvement terminal sous anesthésie. Le projet sert à mesurer le devenir de médicaments candidats dans l'organisme, en partie dans un cadre de formation professionnelle. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode substitutive" aux études pharmacocinétiques in vivo.
Objectifs
Après une phase de sélection basée sur des modèles informatiques et des tests cellulaires, les molécules répondant aux critères des programmes de recherche en termes d’efficacité et de sélectivité par rapport aux cibles étudiées, sont évaluées en utilisant des modèles in vitro dérivés de cellules ou de tissus animaux. Les molécules retenues sont ensuite caractérisées in vivo pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques, dans un premier temps, dans les modèles utilisés en pharmacologie ou en toxicologie.
Bénéfices attendus
Les molécules retenues sont caractérisées in vivo pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques, dans les modèles utilisés en pharmacologie, puis au fur et à mesure de la progression de la molécule dans le développement et en fonction du type de molécules testées (molécules biologiques ou petites molécules chimiques), de l’activité pharmacologique du produit et des espèces animales qui seront utilisées en toxicologie
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : sang : 3 à 6 sur 24h ou bien 9 à 11 sur 28 jours dans le respect des volumes cumulés compatibles avec la pratique vétérinaire, urine-fécès : sur une durée de 24 à 168h maximum Procédure chirurgicale pour pose de cathéters veineux : environ 1h/animal Prélèvements terminaux sur animaux anesthésiés : sang, tissus, liquide céphalo-rachidien.
Impact sur les animaux
Les contraintes/douleurs attendues sont : - la mise à jeun : stress léger de courte durée suite à la mise à jeun. - l'implantation chirurgicale d’un cathéter veineux : douleur per et post opératoire et inconfort post-opératoire. l'administration du composé à tester : stress léger et inconfort transitoire. - le prélèvement urinaire en cage à métabolisme durée de 24 à 168h maximum : stress et inconfort lié à l’individualisation (rat uniquement), dimensions de la cage inférieures à la règlementation et sol grillagé. les prélèvements sanguins répétés : stress et inconfort de courte durée. - les prélèvements sous anesthésie terminale : douleur en cas de laparotomie. - le recueil biliaire après réception des animaux cathétérisés du fournisseur agrée sur 48h max : stress et inconfort car acclimatation réduite, dimensions de la cage inférieures à la règlementation et éventuellement sol grillagé. - le développement d’une pathologie (souris porteuses de tumeur, souris immunodéprimées, souris transgéniques ou non modèles de pathologie d’intérêt) : gêne lors de la croissance de la tumeur, infections opportunistes, impact sur le bien-être animal en fonction du modèle.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les tissus et fluides pour évaluer la diffusion du produit étudié dans l’organisme.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode substitutive aux études pharmacocinétiques in vivo. Les tests in vitro et in silico permettent d’étudier certains aspects de la pharmacocinétique (absorption, métabolisme) mais ne peuvent pas fournir l’ensemble des éléments caractérisant le devenir du médicament dans un organisme vivant depuis son absorption jusqu’à son élimination
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules testées in vivo sont sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires et informatiques. Le nombre d’animaux utilisés dans les études pharmacocinétiques est basé sur les lignes directrices ICH et se limite au strict nécessaire pour atteindre l’objectif scientifique. Dans le cas des études non réglementaires, une analyse biostatistique réalisée par un expert interne permet d’optimiser les effectifs et les designs d’étude. Par ailleurs, le développement de méthodes de dosage adaptées à des micro-volumes de sang permet de réaliser des prélèvements répétés chez un même animal - souris ou rat - et d’utiliser ainsi moins de rongeurs dans ce projet. La manipulation, les techniques d’administration et de prélèvement sont réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.
Raffinement
Les conditions d’utilisation des animaux sont encadrées par des recommandations éthiques internes. Les animaux sont hébergés sur de la litière avec enrichissement du milieu. Aliment et eau sont distribués ad libitum et la pièce est éclairée selon un cycle 12h-12h. L’observation des animaux est faite quotidiennement par le personnel de l’animalerie et de l’étude dûment formé à la reconnaissance des signes cliniques en lien avec les services vétérinaires. Les prélèvements terminaux et au sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie et uniquement lorsqu’aucune autre voie de prélèvement est appropriée. Les cathétérisations sont réalisés sous anesthésie et analgésie adaptées et selon les techniques aseptiques. Les modèles transgéniques ou porteurs de tumeurs dont l’état général peut se dégrader sont suivis cliniquement avec l’application de point limites spécifiques
Choix des espèces
Concernant les études de pharmacocinétiques réglementaires, les espèces utilisées sont les mêmes que celles étudiées dans les études de pharmacologie de sécurité ou de toxicologies. Dans ce cadre, le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ICH, CHMP, FDA…) sur des bases scientifiques telles que : Les données de pharmacocinétique et métabolisme inter espèces Les résultats des études de toxicologie La cible thérapeutique visés Le(s) véhicule(s) envisagé(s) Dans le cas d’études non règlementaires, les études de pharmacocinétique sont effectuées pour caractériser des composés d’intérêt dans les modèles animaux en support de l’activité pharmacologique. Dans ce cadre, le choix de l’espèce dépend de la cible thérapeutique étudiée et des modèles pharmacologiques développés par les équipes de pharmacologie, à ce stade précoce essentiellement de souris ou des rats.
Effet des polluants environnementaux sur la qualité spermatique
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
648 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ingèrent des polluants environnementaux, avec ou sans antioxydants, dans leur eau de boisson pendant environ deux semaines, subissent une ponction sanguine intracardiaque sous anesthésie puis sont tuées pour prélever l'épididyme. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet physiologique notable" aux doses employées, tout en classant les procédures en gravité modérée. Il indique qu'il est "impossible de remplacer" l'animal, la seule façon d'obtenir les spermatozoïdes étant de les prélever après la mort.
Objectifs
Les objectifs de ce projets sont les suivants : - déterminer l'impact de la consommations de polluants envirronementaux, à des doses supra-physiologiques mais relativement faibles, sur la qualité globale et nucléaire des spermatozoïdes ; - travailler sur des temps d'exposition courts de l'ordre de 2 semaines, justifiant les doses mentionnées, pour objectiver principalement les événements post-testiculaires au niveau de l'épididyme ; - tester l'efficacité de supplémentations orales antioxydantes sur les effets néfastes des polluants.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : (1) affiner les connaissances sur les effets reprotoxiques de polluants fréquents dans l'envirronement, (2) apporter des données nouvelles concernant la susceptibilité des gamètes mâles aux effets nocifs dans l'épididyme, donc après leur production dans le testicule, (3) démontrer l'intérêt de supplémentations orales antioxydantes dans la prévention des dégats nucléaires des spermatozoïdes chez des individus exposés à des stress envirronementaux.
Procédures
Les animaux seront soumis, selon les lots, à trois types d'interventions : apports des polluants et/ou des antioxydants par supplémentation de l'eau de boisson ; prélèvement de sang par ponction intra-cardiaque, sous anesthésie générale; mise à mort dans l'objectif de prélever des tissus et des organes.
Impact sur les animaux
Aux doses faibles utilisées et sur les durées d'exposition prévues pour ce projet, aucun effet physiologique notable, ou effet indésirable, susceptible d'entraîner une altération du bien-être des animaux n'est prévu.
Devenir
A la fin de l'exposition aux molécules souhaitées dans l'eau de boisson, les animaux seront tous mis à mort car il n'existe pas d'autre méthode pour obtenir les spermatozoïdes des souris mâles que d'aller les prélever dans la queue de l'épididyme.
Remplacement
Notre objectif est d'analyser les effets de polluants environnementaux sur la qualité spermatique. Il n'existe pas de modèle alternatif permettant d'aborder de telles questions. Il est donc impossible de remplacer l'utilisation des animaux dans ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux dans chaque lot est réduit au minimum tout en permettant d'appliquer des tests statistiques robustes et en prenant en compte les variations inter-individuelles.
Raffinement
Les molécules seront toutes diluées dans l'eau de boisson, ce qui permet d'éviter de gaver les animaux quotidiennement, minimisant ainsi le stress et l'inconfort associés à une telle procédure, tout en évitant de blesser les animaux. Les souris seront soumises aux observations quotidiennes réglementaires pour la détection éventuelle de signes de douleur.
Choix des espèces
Notre objectif est d'analyser les effets de polluants environnementaux sur la qualité spermatique. Nous utiliserons donc des mâles matures sexuellement (8 semaines).
Recherche translationnelle préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 1200
7 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des composés candidats et des agents inducteurs par diverses voies pendant deux semaines, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever des tissus. Le projet vise à cribler de nouvelles molécules anti-inflammatoires dans le cadre d'un programme de recherche pharmaceutique. Le porteur annonce peu de signes cliniques hormis des inflammations locales, et affirme que le recours au modèle animal est "indispensable" une fois les molécules validées in vitro.
Objectifs
On dénombre environ 80 maladies immuno-inflammatoires telles que le psoriasis, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. On estime que 5 à 8% de la population mondiale est touchée par une maladie auto-immune, caractérisée par une réponse inadaptée du système immunitaire qui se retourne contre les propres tissus du patient. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients.
Bénéfices attendus
L’objectif ultime est de pouvoir supprimer spécifiquement le mécanisme à l’origine d’une maladie auto-immune, sans impacter le bon fonctionnement du système immunitaire. Ces nouvelles molécules fourniront aux patients des thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices ciblées qui pourront grandement améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Dans ce projet, les animaux recevront des agents biologiques et composés par diffrentes voies d'administration définies par la réglementation. L'administration des composés (durée = 1 min/animal) se fera 1 à 2 fois par jour sur une durée de maximale de 2 semaines. L'induction avec des agents biologiques (durée = 1 min/animal) se ferra 1 à 2 fois au cours de l'étude de 2 semaines. Un à deux prélèvements sanguins seront également effectués sur animaux préalalement anesthésiés (durée = 2-3 min/animal) pour suivre la pharmacocinétique des composés testés sur l'ensemble de l'étude de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux ne développeront pas de signes cliniques notoires hormis des inflammations locales légères.
Devenir
Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour collecte de tissus
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec du materiels de nidification. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé. Des analgésiques seront utilisées en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature.
L’inflammation pour stimuler la régénération rétinienne dans un modèle de dégénérescence induite aiguë chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une dégénérescence de la rétine leur est provoquée, puis elles reçoivent sous anesthésie une injection dans l'œil et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, avant d'être tuées de 4 à 72 heures plus tard pour analyse de la rétine. Le porteur cherche à réveiller les capacités de régénération de la rétine en modulant l'inflammation, en s'appuyant sur ce qui s'observe chez le poisson. Les retombées pour les patients atteints de dégénérescence rétinienne sont renvoyées au conditionnel, le porteur jugeant la souris "indispensable" malgré un modèle d'explants qu'il utilise en amont.
Objectifs
La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation (e.g. les cytokines de la famille du TNF-α ou de l'interleukine 6 (IL-6)) favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller.
Bénéfices attendus
A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telle que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet abouti, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.
Procédures
Les animaux du présent projet seront soumis à quatre actes expérimentaux: (i) anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 20 minutes. (ii)- injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 5 minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser l'injection. (iii) injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra entre 2 (MNU, puis EdU) et 5 injections intrapéritonéales (MNU, puis de façon journalière 1 à 4 injections d'EdU) selon le nombre de jours nécessaires à la procédure. (iv) alimentation formulée : de P45 à la fin de l'expérience (P60+4h, P61, P62, ou P63).
Impact sur les animaux
(i) Les phénotypes des animaux utilisés dans nos expériences sont restreints à la rétine. (ii) Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement de la forme humide de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie un certain temps (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthnasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.
Remplacement
Préalablement aux expériences in vivo nous validerons nos hypothèses grâce à la technique de culture d’explants rétiniens issus de souris euthanasiées n’ayant subi aucune procédure préalable. Les explants rétiniens cultivés ex vivo dégénèrent progressivement. Ils sont un excellent modèle pour tester l’effet de molécules anti- ou pro-inflammatoires, ou à potentiel régénératif. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que l’œil est un organe complexe composés de différents tissus en communication permanente les uns avec les autres ainsi qu’avec la circulation sanguine systémique et le cerveau via le nerf optique. Ces interactions sont cruciales pour l’obtention d’un signal visuel correct et participent à tous les processus cellulaires y compris la réparation et la régénération. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales sans utilisation d'animaux vivants n’apportent pas la même pertinence d'information.
Réduction
Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée de souris sauvages C57BL/6JRj choisie ne présente aucune mutation induisant une dégénérescence rétinienne contrairement à la lignée C57BL/6NRj qui développe spontanément une dégénérescence des photorécepteurs. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs. Pour déterminer le stade auquel nos expériences seront réalisées, il nous faut prendre en compte les contraintes liées au développement de la rétine et du système immunitaire chez la souris, ainsi que les contraintes techniques. Les souris de la lignée C57BL /6J seront utilisés à partir de P45 quand la rétine est totalement mature pour les expériences nécessitant l'utilisation d'une alimentation formulée. Il faut un minimum d'une dizaine de jour pour obtenir une diminution significative du nombre de microglies. Afin d'induire la dégénérescence rétinienne, le MNU sera injecté à P59 puis la suite des actes expérimentaux aura lieu 16h après (temps nécessaire à l'enclenchement du processus de dégénérescence).
Mécanismes immuno-régulateurs des pathologies cardiométaboliques et de leurs comorbidités: récepteurs nucléaires et membranaires (1/2 ET 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système respiratoire
25 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Elles servent à reproduire une dizaine de pathologies comme l'anaphylaxie, l'asthme, le psoriasis, la septicémie ou le diabète de type 2, au moyen d'injections répétées, de gavages, de nébulisations et de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la douleur, inhérente à certains de ces modèles inflammatoires, ne peut pas être prise en charge dans certaines procédures sans interférer avec les résultats. Il affirme que la complexité des interactions entre organes rend l'expérimentation in vivo "indispensable", les retombées thérapeutiques restant formulées comme de simples perspectives.
Objectifs
But : Ce projet a donc pour but d’étudier la contribution des cellules immunes dans les pathologies immuno-inflammatoires et métaboliques et dans l’aggravation des unes par les autres. Il s’agira notamment de déterminer comment certains facteurs régulent le développement et la fonction des cellules immunes dans le contexte des maladies métaboliques. Ces facteurs sont d’une part, certains récepteurs nucléaires, activateurs ou répresseurs transcriptionnels activés par un ligand (un lipide ou un dérivé d’acide gras) ou des récepteurs membranaires.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental: meilleure connaissance du rôle des récepteurs nucléaires dans les processus pathophysiologiques impliquant le système immuno-inflammatoire Sur le plan appliqué: les mécanismes mis en évidence pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En effet, les récepteurs nucélaires peuvent être ciblés pharmatologiquement par de petites molécules
Procédures
P1 Anaphylaxie. 1. Injection intraveineuse, intrapéritonéale et intradermique. 2. Prélèvement sanguin. 3. Injection intraveneuse ou intradermique. 4. Gavage. 5. Injection intraveineuse. 6 Prise de témpérature (2h). 7 Prélèvement sanguin. P2 Athme. 1. Prélèvement sanguin. 2. Sensibilisation (3-5 nébulisation, injection intransale, intrapéritonéale, ou intratrachélae). 3. Nébulisation (20min). 4. Pléthysmographie (30 min). 5. Prélèvement sanguin. P3 Dermatite atopique. 1. Prélèvment sanguin. 2. Rasage. 3. Application topique. 4. Pose de "" (5X 3-4 jours). 5. Nébulisation (20min) ou injection intranasale. 6. Pléthysmographie. 7. Prélèvement sanguin. P4 Psoriasis. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Rasage. 4. Application topique (5). 6 Prélvement sanguin. P5 Hypersensibilité. 1. Prélèvmeent sanguin. 2. Application topique (3). 4. Rasage. 5. Application topique (2). 6 Prélèvement sanguin. P6 Septicémie et P7 Endotoxémie. 1. Prélèvement sanguin. 2. Gavage. 3. Injection intrapéritonéale ou sous cutanée. 4. Prélèvement sanguin. P8 Inflammation stérile. 1.Prélèvement sanguin. 2. Injection intrrapéritonéale. 3. Gavage (3). 4. Injection sous-cutanée. 5. Prélèvement sanguin. P9 Athérosclérose et P10-13 Diabète de type 2 (DT2). 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Prélèvement sanguin (6). P10-11 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Gavage. 4. Gavage ou injection intrapéritonéale. 5 Prélèvement sanguin (9). P10-12 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Cathétérisation (30 min). 4. Clamp (2h). 5. Prélèvement sanguin. P14 Exercice. 1. Exercice sur tapis de course (4X1h) 2. Prélèvement sanguin. 3. Exercice sur tapis de course (80X1h) 4. Prélèvement sanguin. P15-11-18 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation biliaire (1h). 15-11-19 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation canal thoracique (1h). P16 Colite. 1. Prélèvement sanguin. 2. Injection Intrapéritonéale ou intrarectale. 3. Prélèvement sanguin. P17 Immunisation. 1. Prélevement sanguin. 2. Injection intrapéritonéale (3). 3. Gavage (8). 4. Prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
La douleur faisant partie de certains processus patholgiques, notamment pour l'inflammation intestinale et les processus allergiques, celle-ci ne peut être prise en charge dans certaines procédures sauf à interférer avec les résultats
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la suite des procédures ou enchaînement de procédures
Remplacement
Les pathologies métaboliques et/ou immunes impliquent de nombreux organes du corps et de nombreux types cellulaires circulant entre ces organes. Comme il est impossible de reproduire la complexité de ces interactions in vitro, l’expérimentation animale in vivo est indispensable pour reproduire de manière aussi réaliste que possible ces pathologies.
Réduction
L’utilisation de conditions les plus standardisées possibles (conditions d’hébergement, âge et sexe des animaux, groupes contrôles appariés, horaires de réalisation des expériences…) et l’entraînement et la dextérité du personnel impliqué dans l’expérimentation permettent de diminuer la variabilité individuelle des réponses des animaux et par voie de conséquence le nombre d’animaux nécessaires par groupe pour obtenir des résultats significatifs. De
Raffinement
L’hébergement dans des conditions sanitaires optimales (exemptes d’organismes -opportunistes etpathogènes spécifiques), l’enrichissement de l’environnement dans les cages (abris et « jeux »), le maintien des interactions sociales, l’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress durant toute la vie des animaux y compris durant l’expérimentation. Une surveillance quotidienne est également pratiquée.
Choix des espèces
En raison du grand nombre de lignées génétiquement modifiées disponibles et de la facilité relative avec laquelle il est possible d’en créer de nouvelles, la souris a été choisie comme modèle d’étude. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines), âge à partir duquel le système immunitaire est mature. De plus les pathologies cardiométaboliques sont des pathologies de l'adulte.
Validation de l’efficacité antitumorale du ZZW-115 et ses dérivées dans des modelés du cancer pancréatique spontané
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer du pancréas vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant huit semaines pour tester une molécule anti-tumorale, la ZZW-115, et ses dérivés. Le porteur décrit des signes possibles de cyphose, de prostration, de poil hirsute et de perte de poids, et prévoit la mise à mort avant l'apparition d'un phénotype trop dommageable. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle proche de l'humain est indispensable et qu'il ne peut se passer de l'animal vivant.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer très meurtrier. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents efficaces basés sur la nanotechnologie pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, un analogue de la trifluopérazine (ZZW-115) et des dérivées sont été développé et s'ont avéré très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs ont été obtenu in vitro qui montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire de plus de 50 lignées cellulaires différentes. De plus, nous avons obtenu des résultats prometteurs in vivo qui montrent une réduction significative de la croissance tumorale de xénogreffes obtenues après implantation de cellules tumorales humaines (MIAPaCa2 ou Hep3B) sur des souris NUDE. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique, NUPR1. Cependant, nos résultats ont été basés sur des modèles de xénogreffes et jamais sur des modèles spontanés, qui se rapprocheraient davantage de la réalité du patient. En ce sens, nous avons deux objectifs avec ce projet, d'une part évaluer le pouvoir de cette famille de molécules comme agent préventif, pour cela nous utiliserons des souris avec la mutation Pdx1-Cre;KrasG12D/+, qui développent des lésions précancéreuses : les PanINs. Notre objectif est d'évaluer si le traitement à partir de l'âge de 5 semaines réduit l'apparition de ces lésions chez les souris traitées avec le ZZW-115 ou ses dérivés. D'autre part, notre objectif est d'évaluer si ce groupe de molécules a un effet curatif dans des modèles d'adénocarcinome pancréatique spontané. À cette fin, nous utiliserons le modèle KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), l'un des modèles les plus précis qui récapitule le plus fidèlement la carcinogenèse telle qu'elle se produit chez les patients. Dans ce cas, nous allons évaluer si le ZZW-115 et ses dérivés ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, notre objectif est de déterminer si le ZZW-115 (et deux de ses dérivés) est efficace dans le traitement de l'hypertension artérielle. 1) prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. Par le passé, notre groupe de recherche a démontré que l'apparition des PanINs était liée à la présence de NUPR1, c'est-à-dire que chez les souris KO de NUPR1, même en présence de l'oncogène Kras, les lésions précancéreuses n'apparaissaient pas. En ce sens, notre objectif est de démontrer qu'avec des inhibiteurs pharmacologiques, nous pourrions prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. 2) étudier l'effet du ZZW-115 et de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) dans des modèles animaux de cancer pancréatique spontané. Dans le passé, nos études ont toujours été réalisées dans des modèles animaux avec des xénogreffes, cependant, ce modèle, bien qu'il présente de nombreux avantages, est insuffisant à plusieurs égards. Avec le modèle animal KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), un modèle qui récapitule plus fidèlement la carcinogenèse pancréatique chez les patients, nous pourrons déterminer si l'inhibition de NUPR1 par des inhibiteurs pharmacologiques a un effet anti-tumoral dans un modèle spontané et immunocompétent. 3) d'évaluer quel traitement, le ZZW-115 ou l'un de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) a un plus grand pouvoir antitumoral. Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.
Procédures
Les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution (véhicule ou traitement, 60 microlitres) par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 8 semaines (chaque jour). L’intervention dure 15-20 secondes.
Impact sur les animaux
Les premiers signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, poil hirsute, diminution du poids de l’animal. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris NUDE dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que le ZZW-115 n'a montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse (4% isoflurane, 3 - 5 minutes). Le sang, les tumeurs et les organes seront ensuite prélevés en vue des analyses biochimiques et histologiques pour l’évaluation de l’effet anti-cancer et la toxicité éventuelle. Les cadavres seront stockés dans un congélateur à -20°C en attendant leur évacuation par la société spécialisée dans le traitement des déchets biologiques.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le ZZW-115 et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 96 individus (4 groupes de 12 souris KIC et 4 groupes de 12 souris KC) conformément à la règle de réduction.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution contenant le ZZW-115 sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%. Aucun animal ne faisant pas partie de l'étude n'est maintenu avec un phénotype dommageable. Les souris sont sacrifiées avant l’apparition de ce phénotype dommageable
Choix des espèces
Les souris sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées. Les animaux KC seront utilisés à 6 semaines, juste avant l'apparition des lésions précancéreuses, pour évaluer l'effet protecteur du ZZW-115 et de ses analogues. Les animaux KPC seront utilisés à partir de 10 semaines, lorsque des lésions précancéreuses se seront développées, pour évaluer si le ZZW-115 et ses analogues sont efficaces pour inhiber la progression des tumeurs.
Etude du remodelage structurel et fonctionnel de la barrière épithéliale digestive et de la barrière urothéliale après lésion médullaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
416 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière qui paralyse ses membres inférieurs, puis des instillations vésicales, des gavages et des prélèvements de sang, pour étudier les troubles digestifs et urinaires qui suivent une atteinte médullaire. Le porteur anticipe 15 à 20 % de pertes liées à la chirurgie et signale un risque d'infections urinaires. Sur le remplacement, il affirme que la corrélation entre in vitro et in vivo est insuffisante et juge le modèle animal "indispensable".
Objectifs
En France, les lésions de la moelle épinière représentent 10 à 80 cas/million d’habitants/an, soit environ 1000 nouveaux patients/an. Les troubles du transit après lésion médullaire sont majeurs, et notamment les troubles de motricité colique. Les troubles urinaires sont également invalidants. La compréhension de ces troubles apparaît comme un enjeu de santé majeur, et n’est pas faisable en tant que telle en recherche chez l’Homme. Nous avons malheureusement besoin d’un modèle animal de lésion médullaire chronique pour partir des troubles observés in vivo, et en faire le parallèle avec les troubles fonctionnels observables ex vivo. Lors d’une 1ère étude, nous avons soulevé le rôle de médiateurs lipidiques dans les processus physiopathologiques affectant à la fois les fonctions de la barrière intestinale et vésicale ainsi que le Système Nerveux Entérique (SNE). Parmi ces médiateurs, figurent les médiateurs lipidiques dérivés des acides gras. En effet, les dérivés d'acides gras polyinsaturés (AGPI), peuvent réguler une multitude de réponses cellulaires, notamment la croissance et la mort cellulaire, l'inflammation. Cependant, leur impact sur le SNE et les dysfonctionnements de la barrière intestinale et vésicale reste inconnu. Les objectifs de cette étude seront de développer un modèle murin de lésions médullaires chroniques et de tester l’effet de différents médiateurs lipidiques sur la barrière urothéliale et digestive. Ce projet sera réalisé en tenant compte du principe des 3R. Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable (Réduire). Afin de limiter toutes sources d'angoisse et de souffrance, la réalisation du modèle de lésion médullaire sera effectuée sous anesthésie générale et les animaux recevront de l'analgésique avant et après l'opération. Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, et avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Le bien-être des souris sera surveillé quotidiennement, avec un remplacement de la litière et un enrichissement par frisottis, et en évaluant l'état général des animaux, et des points limites seront mis en place (Raffiner). La corrélation in vitro-in vivo n'étant pas satisfaisante, le recours à l'utilisation de modèles animaux est indispensable dans notre étude et il n’y a pas d’alternative au Remplacement. Les expériences seront réalisées en plusieurs fois et ce projet nécessitera 416 animaux (souris C57Bl6) dont 32 souris de «réforme».
Bénéfices attendus
Plusieurs bénéfices sont attendus suite à ces expériences : - Démontrer les changements suite à une lésion médullaire haute, de la motilité et des fonctions de barrière dans des souris SCI (Spinal Cord Injury) par rapport à des souris contrôles -Identifier le rôle de dérivés de certains médiateurs lipidiques sur les fonctions de la barrière urothéliale et les processus associés (prolifération cellulaire, mort cellulaire, …) ainsi que leur implication suite à une lésion médullaire - Identifier les cibles moléculaires clés sous-jacentes à ces changements fonctionnels grâce aux tissus murins collectés à la fin des expériences
Procédures
Lésion médullaire: Les animaux seront anesthésiés dans un 1er temps afin d’effectuer la lésion médullaire ; et cette procédure dure 15 minutes par animal ; au début de l’expérimentation. Les instillations de médiateur lipidique (ou de son solvant) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane, que ce soit par instillation transuréthrale ou par voie sus-pubienne sous contrôle échographique. Les souris seront anesthésiées 3 minutes au maximum ; à partir de J14 et 3 fois/semaine soit 6 fois au total. L’étude du transit colique, du transit total et de la perméabilité intestinale sont réalisées en même temps ce qui permet de limiter les manipulations. Les souris seront gavées au début. Il y aura un prélèvement de sang (15 µl ± 5 µl) pour la perméabilité intestinale. L’endroit de l’incision sera ensuite comprimé avec une compresse afin de stopper le saignement. Ces 3 techniques seront réalisées 2 fois au total ; à J7 et J21. Pour le transit colique distal, les souris seront anesthésiées très rapidement (1 min), le temps de mettre la bille dans le colon. Cette procédure sera réalisée à J8 et J22. Pour l’open field, les animaux seront placés individuellement au centre d’une enceinte carrée et leurs mouvements seront enregistrés. Nous effectuerons cette procédure 2 fois au total : à J8 et J25.
Impact sur les animaux
La lésion médullaire induit une mobilité réduite des animaux. Les souris ont les membres inférieurs paralysés mais peuvent toujours se déplacer. Il peut y avoir des risques d’infections urinaires et pour éviter cela, nous changerons la litière quotidiennement tout au long de l’expérimentation. Suite à la chirurgie, les animaux recevront du Metacam associé à de la buprénorphine pendant 3 jours afin de réduire au maximum la douleur. La période post-chirurgie est très importante et la responsable du projet ainsi que l’étudiant associé prêteront une grande attention au bien-être de l’animal : les souris seront observées 2 à 3 fois/jour les 3 premiers jours ; puis quotidiennement. Afin d’éviter une déshydratation de l’animal, nous lui injecterons du NaCl en s.c (200 ul) le soir de la chirurgie ainsi que les 2 à 3 jours suivants. Les animaux auront un accès à l’eau facilité par des tétines plus longes sur les biberons ainsi que des croquettes humides ajoutées quotidiennement dans la cage. Au cours du temps, il est possible de voir les animaux avec des « fécès accrochées à leur postérieur ». Si c’est le cas, les animaux seront nettoyés à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique.
Devenir
Procédures 1, 2 et 3 : les procédures 1 et 2 serviront à la mise au point du modèle (cathétérisation transuréthrale ou instillation sus-pubienne) tandis que la procédure 3 sera la manip complète. Dans les 3 procédures, les animaux auront une chirurgie de lésion médullaire et ceci est classé en procédure sévère.
Remplacement
La compréhension des troubles du transit observés chez les patients ayant une atteinte de la moelle épinière apparaît comme un enjeu de santé majeur, et n’est pas faisable en tant que telle en recherche chez l’Homme. Nous avons malheureusement besoin d’un modèle animal de lésion médullaire chronique pour partir à la fois des troubles observés in vivo, et en faire le parallèle avec les troubles fonctionnels observables ex vivo, et également sur des études plus fondamentales protéiques ou transcriptomiques des régulateurs de motricité digestive au niveau du SNE, ou bien en immunohistochimie. Par conséquent, le recours à l'utilisation de modèles animaux est indispensable dans notre étude et il n’y a pas d’alternative au Remplacement.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable. 2 types d’analyses statistiques seront réalisés : A- "one way anova (Kruskal Wallis test)" pour comparer les différents groupes entre eux à un instant donné, suivi d'un post test de Dunn (qui permettra de comparer 2 conditions données) B- Un two way repeated measure ANOVA suivi d’un post test de Bonferroni pour comparer l'évolution des groupes entre eux au cours du temps Dans ce nombre d’animaux, nous avons inclus les pertes liées à la chirurgie qui est une procédure sévère. Nous estimons entre 15 et 20 % de perte malheureusement (échec de la chirurgie, euthanasie de l’animal si atteinte de points limites, …) Nous avons prévu 24 animaux/condition afin d’être sûre d’en avoir 20/condition.
Raffinement
Afin de limiter toutes sources d'angoisse et de souffrance, la réalisation du modèle de lésion médullaire sera effectuée sous anesthésie générale. Les animaux du modèle recevront de l'analgésique avant l'opération, puis 1 fois par jour pendant 3 jours, pour éviter toute souffrance. Afin d’éviter une déshydratation de l’animal, nous lui injecterons du NaCl en s.c (200 ul) le soir de la chirurgie ainsi que les 2 à 3 jours suivants. Les animaux auront un accès à l’eau facilité par des tétines plus longes sur les biberons ainsi que des croquettes humides ajoutées quotidiennement dans la cage. Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, et avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude tous les jours, avec un remplacement journalier de la litière et une mise en place d'un enrichissement par frisottis. La période post-chirurgie est très importante et la responsable du projet ainsi que l’étudiant associé prêteront une grande attention au bien-être de l’animal : les souris seront observées 2 à 3 fois/jour les 3 premiers jours ; puis quotidiennement. Au cours du temps, il est possible de voir les animaux avec des « fécès accrochées à leur postérieur ». Si c’est le cas, les animaux seront nettoyés à l’aide d’une compresse imbibée de sérum physiologique. Des points limites seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris présente un temps de transit idéal pour les études de motricité et de perméabilité in vivo. Les souris seront âgées de 6-8 semaines. A ce stade, les souris sont adultes et ont des fonctions digestives assez développées pour nos études.
Développement d’une sonde théranostique ciblant les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des traitements par injection et des séances d'imagerie sous anesthésie, la radiothérapie pouvant provoquer une nécrose de la tumeur, avant d'être tué pour prélever la tumeur et les organes voisins. Le porteur prévoit une grille de score entraînant la mise à mort au-delà de six points ou d'un volume tumoral de 1 500 mm3. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la réponse immunitaire à la radiothérapie impose le recours à l'animal.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. L’impact du microenvironnement tumoral, notamment la présence de cellules immunitaires agressives, sur le développement tumoral est aujourd’hui clairement établie. La présence de ces cellules immunitaires (e.g. les lymphocytes T régulateur (Treg)) favorise l’échappement tumoral qui promeut le caractère agressif et invasif des cancers. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes théranostiques (combinant des propriétés d’imagerie et de thérapie) pour évaluer la présence de ces cellules immunitaires au sein des tumeurs au court de divers traitements (radiothérapie, immunothérapies…), et également cibler spécifiquement ces cellules pro-tumorales dans le cadre de stratégies thérapeutiques (e.g. radiothérapie interne vectorisée). Cela permettra d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen non-invasif d’imagerie moléculaire.
Bénéfices attendus
Le développement de nouveaux agents d’imagerie permettra à terme de réaliser ou affiner le diagnostic chez l’homme mais également de suivre l’efficacité des traitements tout en utilisant des méthodes non invasives. Ce projet aboutira également au développement de traceurs théranostiques permettant une utilisation diagnostique et thérapeutique ciblant les Treg, acteurs majeurs de l’agressivité tumorale, de l’invasion métastatique et de la résistance aux traitements.
Procédures
Les animaux subiront des injections de cellules par voie sous-cutanée (injection unique, 5 minutes sous anesthésie). Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (injections quotidiennes sur 15 jours maximum, 15 secondes de contention maximum par animal). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (SPECT/CT, session d’imagerie de 45 minutes sous anesthésie maximum répétée une fois par semaine sur 8 semaines maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de tumeurs seront observés quotidiennement et suivis 3 fois par semaine depuis l’implantation des cellules. La pousse tumorale en SC peut occasionner une gêne à la mobilité qui sera évaluée. La radiothérapie peut entrainer l’apparition d’une nécrose tumorale de surface. Généralement cette nécrose est « sèche » et n’est pas associée à de la douleur. Cependant si cette nécrose était responsable de douleur (évaluée par palpation de la tumeur nécrosée) et /ou une taille de tumeur supérieure à 1500 mm3 les souris seraient sacrifiées. Les observations faites lors de la procédure 1 permettront d’adapter les points limites pour les procédures suivantes. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures. Les critères d’arrêt du protocole par rapport à la souffrance et les points limites seront déterminés suivant le tableau en annexe 1. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera sacrifié. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.
Devenir
L’analyse du microenvironnement tumorale nécessite le prélèvement de la tumeur et des organes avoisinants. L’analyse de la biodistribution des différents traceurs radioactifs nécessite également le prélèvement de différents organes justifiant ainsi le recours à l’euthanasie de tous les animaux inclus dans ce projet.
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la radiothérapie sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
En comparaison avec une étude de « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Enfin, la totalité des procédures d’imagerie impliquant les animaux (injection intraveineuse, sous-cutanée et imagerie) sera réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante pour réduire l’inconfort potentiel à son minimum permettant ainsi le RAFFINEMENT de l’étude.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permet, sur un nombre d’animaux relativement réduit, de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. C’est pourquoi les tumeurs CT26 ou 4T1 seront greffées sur des souris Balb/c et les tumeurs MC38 sur des souris C57Bl/6. Des souris de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel > 20 g seront utilisées.
Evaluation du potentiel thérapeutique d’un nanomédicament enzymatique pour un traitement anti-tumoral.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections du composé et des prélèvements sanguins, la tumeur étant tolérée jusqu'à un volume de 1 500 mm3, pour tester un nanomédicament censé affamer les cancers. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur n'est prévu pour ne pas fausser les résultats de l'expérimentation. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de système alternatif et que ces expériences ont une valeur prédictive supérieure aux tests de laboratoire.
Objectifs
Il s’agit d’un projet visant à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement contre le cancer. Les cellules cancéreuses ont besoin d’un apport continu en nutriments pour leur croissance rapide. Les acides aminés sont essentiels à la survie des cellules cancéreuses. Le traitement que nous développons exploite cette vulnérabilité et a pour but d’affamer les tumeurs en les privant de ces ressources essentielles. En effet, la molécule active de notre médicament est une enzyme, une molécule qui détruit les nutriments en les découpant. Le développement de ces nouveaux médicaments s’appuie sur une technologie novatrice qui permet 1) d’améliorer le temps d’action de l’enzyme (pour affamer la tumeur) et 2) d’être invisible par le système immunitaire, dont le rôle est de préserver l’organisme en détruisant les corps étrangers (pour éviter le rejet du traitement par l’organisme). Des tests réalisés en laboratoire sur des cellules cancéreuses ont montré que notre médicament peut les affamer et donc les éliminer. Cependant une caractérisation plus approfondie de l’efficacité de notre médicament est nécessaire afin de développer un traitement sûr et efficace. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Dans ce cadre, les objectifs de ce projet sont : 1) De confirmer l’efficacité anti-tumorale du médicament chez des souris porteuses de tumeur. 2) D’évaluer la capacité du médicament à se localiser dans la tumeur (à trouver son site d’action). 3) De démontrer la capacité de notre médicament à échapper à sa destruction par le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le processus de développement de nouveaux médicaments. Les études précliniques (tests en laboratoire et sur animaux) sont des étapes fondamentales avant de pouvoir administrer un nouveau médicament à l’Homme. Les résultats attendus lors de ces expériences devraient confirmer l’efficacité anti-tumorale de nos nouveaux médicaments et nous permettre de sélectionner le type de cancer pour lequel le traitement sera le plus efficace. De plus, en démontrant que nos médicaments sont efficaces et échappent à la surveillance du système immunitaire, nous validerons notre procédé de production de nouveaux médicaments. Cette validation permettra d’ouvrir de nombreuses possibilités quant au développement de futures thérapies utilisant cette stratégie.
Procédures
Ce projet requiert l’utilisation de deux modèles murins : des souris sans système immunitaire (1-3, 5) et des souris avec système immunitaire (4-7). Les gestes réalisés seront les suivant : 1) Greffe sous-cutanée de cellules tumorales (10-15 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, 1 seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 2) Injection intra-tumoral d’un agent antinéoplasique (5-10 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles lorsque le volume tumoral aura atteint la taille souhaitée. Ce geste sera réalisé une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 480 et 768 (min-max). 3) Mesure de la taille des tumeurs (20 - 30 secondes). La croissance des tumeurs sera suivie par mesure au pied à coulisse sur les animaux vigiles. Ces mesures seront réalisées 2 fois par semaines pendant la durée de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 4) Injection intra-péritonéale de l’enzyme (3 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Deux injections seront réalisées par souris, espacées de 14 jours. . Le nombre d’animaux concernés est entre 120 et 264 (min-max). 5) Injection intraveineuse d’un agent anti-tumoral (20-30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Une seule injection par souris sera réalisée sur la durée de l’étude. Les deux modèles murins utilisés dans notre étude sont concernés. Le nombre de souris sans système immunitaire nécessaire est entre 96 et 240 (min-Max), et celui avec système immunitaire entre 120 et 264 (min-max). 6) Prélèvements sanguins dans la veine caudale (30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Un maximum de trois prélèvements par souris sera effectué sur l’ensemble de la durée de l’étude. Les volume et fréquence de prélèvements sanguins ont été établis de manière à ne pas prélever plus de 20% du volume sanguin total de la souris sur une durée de 2 semaines. Le nombre d’animaux concernés est entre 128 et 272(min-max). 7) Imagerie par SPECT/CT (20 minutes). Ce geste sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiées par inhalation de 4% d’isoflurane dans une boite à induction puis de 2,5% au masque. L’acquisition des images sera réalisée à différents temps après injection du nanomédicaments : 4h, 24h, 3 jours, 7 jours, 10 jours et 15 jours. Le nombre d’animaux concernés est entre 96 et 240 (min-max).
Impact sur les animaux
Tout au long du déroulement des expériences précédemment décrites, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée par les animaliers ou l’expérimentateur. L’évolution de la taille des tumeurs sera notamment suivie. Le volume tumoral maximal toléré de 1500 mm3 n’induit pas de problèmes de locomotion ou de contrainte mécanique chez la souris. La tumeur est située en sous-cutanée sur le flanc de l’animal. La manipulation de l’animal n’implique pas de palpation de la tumeur mais simplement une mesure au pied à coulisse, minimisant ainsi la douleur. On détermine la longueur (L, en mm) puis la largeur de la tumeur (l, en mm), le volume tumoral et alors calculé selon la formule suivante : volume en mm3 = Lx(lxl)x0,52. Au-delà d'un volume tumoral de 1500 mm3, l’expérience sera arrêtée. Il n'y a pas de douleur prévisible associée à ce protocole expérimental d'injection de lignées cellulaires en sous-cutanée. Concernant les études d’immunisation des souris, nous appliquerons des protocoles établis et décrit dans la littérature. Il n’y a pas de douleur prévisible associée à cette procédure expérimentale d’immunisation.
Devenir
Lorsque les expériences seront terminées, les animaux ne pourront pas être gardés. Dans le respect de la réglementation, la fin de vie des animaux sera induite de manière réglementaire par insufflation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie/analgésie chimique.
Remplacement
Dans les processus de développement des médicaments, les études de validation d’un nouveau composé jouent un rôle fondamental. Elles font généralement appel à des expérimentations animales. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences sur les animaux ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées en laboratoire. Les processus de développement des cancers ainsi que les interactions du système immunitaire avec les médicaments sont des processus complexes qui résultent de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ceux-ci sont difficilement modélisables en laboratoire. Ainsi, même si des expériences préliminaires ont été réalisées au laboratoire les réponses obtenues ne sont qu’indicatives. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs de remplacement.
Réduction
Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans ce but, le nombre de souris à inclure par groupe est limité 8. La significativité statistique de ces différences sera déterminée. Au-delà d’une différence significative entre les différents groupes de souris au sein d’une même expérience, ce qui est important c’est la reproductibilité de l’expérience. Donc on prévoit de reproduire une fois chaque étape. S’il n’y a pas trop d’hétérogénéité au sein des groupes lors de la première expérience on réduira le nombre de souris par groupe de 8 à 6. S’il y contradiction entre la première et la seconde expérience on prévoit une troisième expérience avec 6 souris par groupe.
Raffinement
Une fois les animaux réceptionnés, un délai de 7 jours sera respecté avant le début du protocole expérimental. Les souris seront hébergées au maximum par 5 dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30- 50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu sera enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux (sciure de peuplier, copeaux, briques de peuplier). Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des expériences. En cas de signes comportementaux, physiologiques, d’une perte de poids de 20% du poids total de l'animal (critère non applicable pour les souris porteuses de tumeurs), d'une difficulté à se mouvoir ou d’une détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal reflétant une douleur associée à l'expérimentation, celle-ci sera terminée prématurément et les animaux seront euthanasiés. Il n’y a pas de traitement antidouleur prévu pour ne pas biaiser les résultats de l'expérimentation en cours.
Choix des espèces
Notre projet nécessite l’utilisation de deux modèles murins : - Modèle de souris dépourvue de système immunitaire : ces souris sont les modèles animaux les plus utilisés pour les études concernant le développement tumoral car le taux de prise de greffe est le plus élevé. Ces souris sont couramment utilisées puisque l’absence de système immunitaire empêche le rejet des cellules humaines et favorise leur développement de la tumeur. - Modèle de souris avec système immunitaire : ces souris sont des modèles animaux qui ont la capacité de développer une réponse immunitaire rapide et efficace 14 à 21 jours après immunisation. Dans le cas de notre étude, des travaux ont été publiés utilisant ce modèle de souris avec une immunisation avec notre enzyme d’intérêt . Les souris utilisées seront des souris adultes de 6 à 8 semaines. Ce choix est motivé par les nombreuses études utilisant des modèles murins semblables à ceux utilisés dans notre étude.
Rôle d’une protéine impliquée dans l’activation des cellules souches musculaires en réponse à des lésions musculaires induites par l’exercice chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des séries d'injections intrapéritonéales et subit un protocole d'électrostimulation des muscles du mollet sous anesthésie, censé imiter une déchirure musculaire, avant d'être tué pour analyser le tissu musculaire. Le porteur attribue le niveau modéré au cumul des injections, des électrostimulations et des anesthésies. Sur le remplacement, il affirme que l'électrostimulation est impossible à reproduire in vitro et que seule l'analyse du tissu entier révèle l'effet recherché.
Objectifs
Le maintien de la quantité et de la qualité des muscles est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à se réparer après une lésion musculaire (par exemple un claquage ou contusion musculaire). Les muscles possèdent des cellules de réserve, appelées cellules souches, qui ont une contribution importante à cette capacité de réparation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires lésées. Il a été démontré qu’une protéine X impliquée dans l’activation des cellules de réserve joue un rôle clé dans la réparation du muscle in vitro et in vivo dans un modèle murin de lésion toxique (i.e., injection d’un venin de serpent). Toutefois le rôle de la protéine X dans la réparation du muscle lésé en réponse à un exercice n’est à ce jour pas connu. Le projet étudie le rôle de la protéine X dans l’activation des cellules de réserve et ses conséquences fonctionnelles en utilisant un modèle d’exercice mimant une déchirure musculaire chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant l’activation des cellules de réserve en réponse à une blessure musculaire. L’amélioration des connaissances sur la réparation du muscle après une lésion permettra à termes de proposer des stratégies thérapeutiques efficaces aussi bien pour le muscle sain (par exemple, athlètes de haut niveau) que pour le muscle pathologique (par exemple, arthroplastie totale de hanche, patients atteints de dystrophie, personne âgée). Une meilleure réparation du muscle est essentielle pour les performances des sportifs mais également pour la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux recevront des injections en intra péritonéales (lot n°1 : 4 injections sur 4 jours, puis 2 semaines plus tard 3 injections en 3 jours. Lot n°2 ; 4 injections sur 4 jours). La durée de chaque injection est inférieure à 30 secondes. Les animaux sont soumis à un protocole d’exercice réalisé sous anesthésie générale (électrostimulations des muscles du mollet). La durée d’anesthésie générale est inférieure à 15 minutes. La durée du protocole d’exercice est de 5 minutes
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables des différentes substances injectées. Après le protocole d'exercice, qui concerne un seul muscle de la patte arrière, les animaux ne présentent aucun signe de souffrance et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater dès leur réveil. Aussi, il a été démontré que les anesthésies à l’isoflurane liées au protocole d’exercice et à la mesure de force n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Ce projet est l'aboutissement des études in vitro et ex vivo qui ont été menées auparavant. Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe.
Réduction
Le modèle d'exercice utilisé est totalement non-invasif et permet de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux, et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales incluent un recours à l'anesthésie générale profonde. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable, bien que non attendu.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans la régénération du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux sont donc utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.