Rats
Rôle du système vestibulaire dans la perception du temps et mécanismes cérébraux sous-jacents
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
362 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 196 d'entre eux étant classés en souffrance sévère. Placés en restriction alimentaire pendant un mois, ils subissent soit une exposition à une hypergravité de 2 G pendant 24 heures ou 30 jours, soit une destruction chirurgicale des récepteurs vestibulaires par labyrinthectomie ou section du nerf. Le porteur indique que ces atteintes provoquent désorientation, troubles de l'équilibre et de la marche, et que les rats seront tués pour prélever leur cerveau. Il présente le projet comme une recherche fondamentale sur la perception du temps chez les astronautes et les patients vestibulaires.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un cadre de recherche fondamentale qui vise à évaluer le rôle du système vestibulaire sur la perception du temps. Chez les astronautes, la perception du temps est modifiée lorsqu’ils sont soumis à des modifications d’accélération de gravité (décollage de fusée, mise en orbite, retour sur terre). Cela compromet leur efficacité dans l’utilisation de commandes, la prise de décision, etc... Il s’agit d’un des freins essentiels à la possibilité de très longs voyages spatiaux. Mais, les mécanismes cérébraux sous-jacents à ces modifications comportementales ne sont pas connus et le rôle du système vestibulaire dans les mécanismes de perception du temps n’a jamais été étudié. Dans un premier temps, les effets de la gravité sur les mécanismes cognitifs de perception temporelle seront étudiés. Ainsi, nous évaluerons les effets induits par différents délais d’expositions à l’hypergravité de groupes de rongeurs sur des tâches comportementales évaluant la perception du temps. Dans un deuxième temps, les mêmes tests comportementaux seront utilisés afin d’évaluer les performances chez des rongeurs soumis à deux types de déafférentations vestibulaires. En effet, des perturbations cognitives comparables à celles observées dans l’espace ont également été reportées chez les patients aréflexiques vestibulaires (ayant une perte bilatérale des entrées sensorielles vestibulaires). Les pathologies vestibulaires se caractérisent par des épisodes imprévisibles et souvent récurrents de vertiges, associés à des déséquilibres posturaux au repos ou lors de déplacements, et de nombreux déficits cognitifs. Cet ensemble de symptômes impacte considérablement la vie quotidienne des patients. Ce projet permettra de mieux appréhender le rôle du système vestibulaire dans les mécanismes cérébraux relatifs à l’intégration et à la perception des durées. Les deux procédures utilisées impactent les récepteurs vestibulaires périphériques, organe sensoriel dédiés à la perception de la gravité terrestre, et seront combinés à des approches immunohistochimiques pour comprendre en détail le rôle des entrées vestibulaires dans les réseaux neuronaux de la cognition temporelle.
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront de comprendre en détail le rôle du système vestibulaire dans les perturbations cognitives observées chez l’homme, que ce soit chez des patients présentant des pathologies vestibulaires ou chez les astronautes soumis à des changements de gravité. Des troubles cognitifs comparables sont en effet observés chez ces deux populations. Une identification précise de ces perturbations comportementales suivie de l’étude des mécanismes cérébraux sous-jacents permettra ainsi d’améliorer la prise en charge des patients vestibulaires qui ont des troubles perceptivo-cognitifs particulièrement handicapant au quotidien, mais également des astronautes dans le but de limiter les risques durant les vols spatiaux.
Procédures
A l’exception de 6 animaux satellites, tous les rats prévus dans ce projet sont placés en restriction alimentaire durant toute la période d’apprentissage (1 mois) des deux tâches comportementales. Lorsque les animaux ont terminé l’apprentissage, des atteintes vestibulaires sont appliquées (première partie : hypergravité, deuxième partie : perte des informations vestibulaires) pour mieux comprendre le rôle de cet organe sensoriel sur les mécanismes de perception du temps. Ils sont ensuite testés à deux délais : un délai précoce (inférieur à une semaine) et un délai tardif adapté à l’atteinte vestibulaire (15 jours après hypergravité, 14 ou 30 jours après chirurgie vestibulaire). Durant les tests comportementaux, des récompenses alimentaires sont distribuées aux animaux après une bonne réponse. Ainsi, la restriction alimentaire est nécessaire pour assurer une bonne motivation des rongeurs. Les animaux étant également testés à des délais tardifs dans les deux parties du projet, la restriction sera suspendue, puis réappliquée 4 jours avant les dernières évaluations comportementales . L’apport de nourriture aux animaux restreints sera adapté en fonction de la courbe de croissance des animaux satellites, non restreints. Dans la première procédure visant à étudier l’influence de l’hypergravité sur la perception du temps, 40 rats sont placés dans un champ gravitaire de 2G durant 24h et 40 rats sont placés dans ces mêmes conditions durant 30 jours. Les animaux contrôles de cette procédure sont placés dans des conditions similaires aux groupes 2G sans modifications du champ gravitaire (même pièce d’hébergement avec les mêmes conditions de lumière, de son et de température) pendant les délais de 24h (n=40) et 30 jours (n=40). Dans la seconde procédure visant à étudier l’influence d’une perte bilatérale des informations vestibulaires sur la perception du temps, 48 rats sont labyrinthectomisés bilatéralement (destruction des récepteurs vestibulaires périphériques, temps estimé de la chirurgie : 1h30), 68 rats sont neurectomisés bilatéralement (découpe du nerfs reliant les récepteurs vestibulaires périphériques au système nerveux central, temps estimé: 2h30) et 80 rats sont opérés sans atteintes des nerfs vestibulaires ou des récepteurs vestibulaires périphériques (groupes contrôles non-lésés, temps estimé: 30 minutes). Pour les deux chirurgies, l’analgésie est induite par injection sous-cutanée de buprénorphine 30 min avant l’anesthésie (durée : 1 minute).
Impact sur les animaux
La mise en hypergravité des animaux peut potentiellement induire une augmentation du niveau de stress en induisant une sensation d’alourdissement, et en perturbant leurs déplacements dans l’espace. Les animaux pourraient alors s’immobiliser pendant quelques heures avant de s’adapter au nouveau référentiel gravitationnel et de reprendre une activité normale. La perte bilatérale des informations vestibulaires périphériques induit une désorientation des animaux, des troubles oculaires et posturo-locomoteurs (perte d’équilibre, déviation de la marche, élargissement de la surface du polygone de sustentation), à court terme (3 jours post-labyrinthectomie et 5 à 7 jours post-neurectomie). Des processus de compensation par d’autres modalités sensorielles se développent durant cette période dite « critique », et la majorité des troubles induits par la lésion disparaissent, ou s’atténuent très fortement après une dizaine de jours.
Devenir
L’ensemble des rats utilisés dans les deux procédures de ce projet seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des investigations immunohistochimiques. Ces prélèvements permettront de corréler les résultats des études comportementales avec les atteintes cérébrales observées.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est, pour l’instant, nécessaire pour vérifier d’un point de vue cellulaire les effets comportementaux induits par les protocoles impactant les récepteurs vestibulaires périphériques utilisés dans ce projet. Par ailleurs, l'étude de la cinétique d'expression des mécanismes cellulaires de neuroplasticité dans les régions cérébrales d’intérêts étudiées dans ce projet ne peut se faire que chez un modèle biologique vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduits au maximum pour chaque groupe en fonction des données issues de la littérature présentant les taux de survie des rongeurs soumis aux mêmes procédures chirurgicales en ayant pour but de conserver un nombre d’animaux suffisant pour les analyses comportementales (labyrinthectomies : 86% (n=12) et neurectomies : 60% (n=17) ; groupes contrôles et groupes soumis à l’hypergravité : n=10). Des groupes de 10 animaux sont utilisés pour les études comportementales ; ce nombre a été estimé en fonction de la littérature. En effet, une étude précédente évaluant les déficits attentionnels de rats soumis à des LVB sur des dispositifs de conditionnement opérant similaires à ceux présents dans notre laboratoire a utilisé des effectifs similaires. Par ailleurs, n’ayant aucune donnée préliminaire au laboratoire, nous ne pouvons pas réaliser de test statistique afin d’estimer plus précisément le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Durant les deux premiers jours en hypergravité, et les deux premiers jours post-chirurgie, un gel nutritionnel est déposé dans les cages des animaux, ainsi que des croquettes. Dans la centrifugeuse, les animaux seront suivis quotidiennement par l’expérimentateur (caméras placées dans chaque nacelles). La centrifugeuse sera arrêtée au minimum deux fois par semaines pour effectuer le change des cages et des biberons des animaux. A chaque arrêt de la centrifugeuse, les animaux seront pesés et leur apparence et comportement évalués selon une grille de score du bien-être animal. Les animaux subissant une chirurgie seront soumis à des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés, pesés et évalués quotidiennement. Enfin, les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur) et sensibilisés au bien-être des animaux. La personne réalisant les chirurgies a suivi la formation adaptée afin de garantir les bonnes pratiques limitant au maximum la souffrance des animaux.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle rat dans le cadre de ce projet est pertinente pour de nombreuses raisons. Dans un premier temps, les atteintes vestibulaires appliquées sur les rongeurs reproduisent les symptômes observés en clinique chez les astronautes (mise en hypergravité) et les patients vestibulaires (déafférentations vestibulaires). Dans un second temps, le recours aux modèles animaux est pour l’instant nécessaire pour observer l’impact de ces atteintes dans les différentes structures cérébrales impliquées. Or l’étude de ces mécanismes est un processus biologique qui ne peut, pour l’instant, qu’être étudié sur un modèle biologique vivant. De plus, des données préliminaires obtenues au laboratoire ont montré que l’apprentissage des tâches de conditionnement opérant sur écran tactile est plus rapide chez un modèle rat que chez la souris, ce qui limite la durée de la restriction alimentaire imposée aux animaux Nous utiliserons des rats âgés de 8 à 10 semaines, sortis de la période pubertaire, pour l’étude des mécanismes cérébraux sous-jacents aux tests comportementaux développés.
Chirurgie du système reproducteur ches les rongeurs de laboratoire pour une utilisation à des fins scientifiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Rats : 3750
Hamsters dorés : 625
Gerbilles de Mongolie : 625
25 000 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une chirurgie de l'appareil reproducteur, ovariectomie, hystérectomie, ligature des trompes, vasectomie ou castration, avant d'être expédié vers d'autres laboratoires pour leurs propres expériences. Le porteur décrit ce projet comme la fourniture de rongeurs "préparés", à raison d'environ 5 000 par an, et indique n'appliquer aucune approche statistique sur les effectifs. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode de substitution" pour évaluer les réactions du "corps vivant entier".
Objectifs
Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année sur rats, souris, hamsters et gerbilles ; pour les femelles (ovariectomie, hystérectomie, ovario-hystérectomie, ligature des trompes) et pour les males (vasectomie, castration) (environ : 5000/an).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Le bénéfice est aussi de ne pas avoir l’influence hormonale ou de modifier le comportement dans les tests ou d'obtenir des femelles pseudogestantes.
Procédures
Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurge du système reproducteur (ovariectomie, hystérectomie, ovario-hystérectomie, ligature des trompes, vasectomie ou castration).
Impact sur les animaux
La chirurgie du système reproducteur est composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Les animaux sont maintenus en groupe.
Devenir
La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche
Remplacement
Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales
Réduction
Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Les animaux commenceront le projet à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum).
Impact d’un régime supplémenté par un extrait végétal standardisé sur le comportement, les profils métabolique, inflammatoire et oxydant dans un modèle d’obésité expérimentale chez le rat
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
56 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis pendant trois mois à un régime obésogène, ils reçoivent un gavage quotidien, quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, des tests de tolérance au glucose et le test du labyrinthe en croix surélevé, pour mesurer les effets d'un extrait végétal sur le poids et le comportement. Le porteur présente cette étude comme une étape avant de passer à l'espèce cible, le chien, et affirme que le rat permet d'analyser des organes non prélevables chez le chien. Sur le remplacement, il conclut à l'absence de méthodes in silico et in vitro capables de répondre aux questions posées.
Objectifs
Les plantes fournissent un ensemble important de composés bioactifs qui forment la base de nombreux produits thérapeutiques. Parmi ces plantes, une est traditionnellement utilisée pour ses propriétés sédatives, anti-spasmodiques et anti-inflammatoires et son extrait sera utilisé pour notre étude. L'objectif est d'étudier les effets de la supplémentation en extrait végétal standardisé sur la prise de poids et le comportement chez le rat. Les résultats obtenus nous permettront d'appronfondir ceux réalisés chez le modèle cible, le chien qui ont été menés il y a quelques mois. Notre hypothèse est que la supplémentation en extrait botanique standardisé de la plante étudiée mettrait en jeu des mécanismes multiples (anti-inflammatoire, métabolique, antioxydante, augmentation de la diversité microbienne, réduction du comportement hyperphagique, action calmante) grâce à l'action combinée de ses composants bioactifs dont l'action serait supérieure à celle exercée par le traceur actif seul. Notre premier objectif est d'étudier les effets de notre extrait et de son traceur sur le profil métabolique des rats soumis à un régime obésogène (hyperlipidique/hyperglucidique) par leur suivi clinique et biologique (analyse du microbiote intesinal, des paramètres biochimiques comme les cytokines ou encore métaboliques comme le taux de cholestérol ou de lipides sériques). Notre second objectif sera d'analyser l'effet sédatif de notre extrait végétal standardisé en comparaison à son traceur actif en utilisant le test du labyrinthe en croix surélevé et en dosant un neurotransmetteur dont le rôle principal consiste en une régulation dite « inhibitrice » de l'activité cérébrale, l'acide gamma-aminobutyrique (GABA).
Bénéfices attendus
Les protocoles mis en oeuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé testé (comparativement à son traceur) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées à l'obésité. Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé étudié
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. Pendant 3 mois, 48 rats suivront un régime obésogène (hyperlipidique/hyperlipidique) et la totalité des rats (soit 56 rats) auront 4 prélèvements sanguins sur une période de 3 mois ( à 0, 4, 8 et 12 semaines) d'une durée de 20 min environ par rat ( anesthésie (10 min) + prélèvement sanguin (5 min) + réveil (5 min)) ; 4 tests de 5 minutes dans un labyrinthe en croix surélevé ( à 0, 4, 8 et 12 semaines); 3 tests de tolérance au glucose d'une durée de 2h (prélèvements d'une goutte de sang d'une durée d'1 min à différents temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes); à 0, 6 et 12 semaines); des recueils de selles d'une durée de 10 minutes environ (4 fois, à 0, 4, 8 et 12 semaines) ; et seront gavés oralement quotidiennement pendant 3 mois (chaque gavage durera environ 2 à 5 minutes), puis seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
L'exposition des rats au régime obésogène peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Le remplacement des rats n’est pas possible pour répondre aux questions du projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro). Les rats sont utilisés afin de valider les effets de l'extrait végétal étudié avant de passer sur l'espèce cible : le chien ; pour limiter le nombre d'expérimentations sur celui-ci. L'utilisation du rat nous permet aussi d'étudier des organes, non prélevables chez le chien.
Réduction
Nous utilisons 8 rats par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque rat, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
L'exposition des rats au régime hyperlipidique/hyperglucidique peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire. L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus. Nous utilisons des points limites adaptés et des critères d'arrêt de souffrance détaillés à chaque procédure.
Choix des espèces
Les rats sont acclimatés à l'âge de 6 semaines avant de commencer l'étude à 8 semaines (cycle de 12h jour/nuit). Cela permet d'éviter des résultats faussés par le stress induit lors du changement d'environnement. L'exposition des rats Wistar à un régime obésogène (hyperlipidique/hyperglucidique) permettra d'étudier la capacité de l'extrait végétal standardisé testé à prévenir le développement de troubles métaboliques associés à l'obésité. Les effets de cet extrait végétal ne peuvent être étudiés de manière pertinente sur des modèles in silico et in vitro. Nous utilisons le rat afin de compléter notre étude faite sur l'espèce cible (chien) et ainsi valider les effets de notre extrait végétal standardisé sur le comportement du rat tout en poussant les analyses sur des organes spécifiques (comme l'étude de la réactivité intestinale qui requiert l'analyse de l'intestin en chambre d'organes isolés ou encore le dosage d'un neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central, non prélevables chez le chien.
Effet d’un inhibiteur double des enkephalinases sur la depression corticale envahissante chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Ils subissent une ouverture du crâne et l'application d'un sel sur les méninges pour déclencher des ondes cérébrales associées à la migraine, avec enregistrement de l'activité électrique. Le porteur indique qu'aucun réveil n'est possible du fait de l'ouverture du crâne et des risques irréversibles. Il teste un inhibiteur d'enzymes comme piste contre la migraine, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à des travaux futurs.
Objectifs
L'objectif est d'evaluer la faculté d'un inhibiteur de certaines enzymes ( en favorisant l'action des opioïdes endogènes) à diminuer les ondes d'inhibition électrique corticale déclenchées par application meningée de chlorure de potassium. Ces ondes d'inhibition corticale sont caractéristiques des évenements survenant lors dudéclenchement des crises de migraine et constitue dans la littérature un modèle de migraine reconnu. Le produit étudié ici a montré dans une étude récente son efficacité dans un autre modele de migraine chez le rat vigile mesurant l'hypersensibilité cutanée à la douleur induite par injection systémique d'un donneur de monoxyde d'azote.
Bénéfices attendus
Par ce projet nous escomptons apporter de nouvelles données significatives sur le potentiel antimigraineux de cet inhibiteur d'enzymes pouvant ( avec les travaux antérieurs et futurs) à terme deboucher sur un traitement efficace de cette pathologie
Procédures
Une procedure chirurgicale sous anesthésie ( isoflurane) sans reveil est appliquée par animal.
Impact sur les animaux
Aucun effet indesirable n'est envisagé sachant que les animaux seront sous anesthésie générale avec un monitoring des parametres physiologiques (tout au long de la chirurgie préparatrice et de l'enregistrement électrophysiologique) et mis à mort avant reveil.
Devenir
impossibilité de récuperer les animaux du fait de la craniotomie effectuée et des risques irreversibles (infectieux traumatiques) en cas de reveil.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe pas dans la littérature aucune methode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique antimigraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégre , même sous anesthésie, est un préalable à une etude pertinente dans le domaine de la douleur. Une methode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux parametres (regulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine encore une étape encore trop primaire aujourd'hui.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Dans ce but, les animaux (rats adultes de la souche Sprague-Dawley) sont placés dans des cages enrichies (rouleaux permettant de se cacher) ce qui permet de réduire le stress des animaux tout le temps précédant la chiurugie et l'enregistrement électrophysiologique. Pendant six jours, ils serontacclimatés à l’animalerie. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pendant tout le temps de la chirurgie et leur cornée est protégée par une couche de vaseline. Statistiques : le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. D’après les données du laboratoire nous observons un maximum de 20 % de rats qui doivent être écartés de l'étude.
Raffinement
La douleur de la chirurgie est contrôlée car elle s'effectue sous anesthésie générale avec un contrôle permanent (capteurs et alarmes dédiés) des paramètres physiologiques (ventilation , taux de O2 , CO2 , température, fréquence cardiaque et pression artérielle) Pendant l'enregsitrement électrophysiologique, la cornée est protégée par de la vaseline. Pour améliorer le bien-être des animaux avant la chirurgie, les cages (logées dans des salles de stabulation pour lesquelles la température 22°C +/- 2 et l'hygrométrie 55% +/- 5 sont monitorées) sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher. Ils beneficient de l'enrichissement social reglementaire en respectant la taille des cages et la surface disponible par animal prevues par la directive européenne 2010 ( 3 animaux par cage de 800 cm2).
Choix des espèces
La souche Sprague Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur.
Modélisation et évaluation de la prise compulsive de nourriture induite par des traitements anti-Parkinsoniens
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie cérébrale reproduisant la maladie de Parkinson, des injections quotidiennes pendant six semaines et un isolement de cinquante jours, avant une perfusion mortelle dans le cœur. Le porteur reconnaît que l'isolement rompt le groupe social et provoque un stress, et décrit un ralentissement des mouvements lié à la lésion. L'objectif est de créer un modèle de prise compulsive de nourriture, un effet secondaire des traitements chez une partie des patients parkinsoniens.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont multiples. Il s'agit donc de modéliser la prise compulsive de nourriture, un effet secondaire non moteur des traitements anti-Parkinsoniens retrouvé jusqu'à chez un tiers des patients, afin de mieux en comprendre la pathophysiologie. Pour cela, nous regarderons, d'une part les effets des traitements seuls, et d'autre part les effets des traitements cumulés à la lésion dopaminergique caractéristique de la maladie de Parkinson. Effectivement, aucun modèle animal de trouble de contrôle des impulsions (effet secondaire non-moteur des traitements) n'est actuellement disponible et l’étude de leurs développement et conséquences reste donc difficile. De plus, l’incidence de la maladie de Parkinson ne cesse d’augmenter du fait du vieillissement de la population. Les troubles du contrôle des impulsions affectent de façon non négligeable la qualité de vie des patients, notamment la prise compulsive de nourriture qui entraîne des perturbations importantes du sommeil (les patients grignottent beaucoup, notamment au cours de la nuit) et des difficultés sociales au sein de l'entourage proche. Les troubles du contrôle des impulsions touchant jusqu’à un tiers des patients parkinsoniens traités, la compréhension des causes et conséquences est un réel enjeu de santé publique.
Bénéfices attendus
Ce projet va avoir deux pans majeurs d’avancées scientifiques : il va permettre la création d'un modèle de prise compulsive de nourriture, à l’heure actuelle inexistant, par le biais d’une évaluation comportementale et va également permettre d’étayer les connaissances sur les causes biologiques, biochimiques de leur développement ainsi que les conséquences induites dans la maladie de Parkinson. Les analyses sanguines pourront permettre l'identification de biomarqueurs du développement des troubles du contrôle des impulsions. Au point de vue clinique la compréhension des causes et conséquences de l'apparition de troubles du contrôle des impulsions est cruciale pour adapter les stratégies thérapeutiques proposées aux patients parkinsoniens.
Procédures
Le projet est composé d'une procédure regroupant 5 interventions réalisées sur la totalité des animaux inclus dans le projet: une chirurgie cérébrale sous anesthésie gazeuse avec antalgique périphérique et locale (240 animaux), trois prélèvements sanguins sous anesthésie (240 animaux), une évaluation comportementale de 7 semaines (240 animaux) associé à un traitement par injection quotidienne intrapéritonéale sur animaux vigiles (1minute d'injection, 42 injections, 120 animaux) ou sous cutanée sur animaux vigiles (30secondes d'injection, 42 injections, 180 animaux) dépendamment de la molécule testée. Enfin, une perfusion intracardiaque après une injection létale d'anesthésique en fin de procédure (20minutes, 240 animaux).
Impact sur les animaux
- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil - L'induction de la dégénérescence neuronale permettant de modéliser la maladie de Parkinson va induire un léger ralentissement de la courbe de croissance des animaux ainsi qu'un ralentissement global de l'activité locomotrice - L’isolement de plusieurs semaines (50 jours d'isolement après 85 jours de vie en groupe) induira un stress dû à la rupture du groupe social pendant l'évaluation comportementale - Les prélèvements sanguins peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale - Les injections répétées quotidiennement du traitement au cours des 6 semaines d’expérimentation peuvent induire un stress potentiel de l’animal au moment de la piqûre ou un hématome à l'endroit de l'injection.
Devenir
Tous les animaux (n=240) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à coupler les résultats comportementaux à des analyses de biologie moléculaire sur les échantillons sanguins ainsi qu'à des anaylses histologiques et biochimiques des cerveaux.
Remplacement
Certaines recherches sur la maladie de Parkinson peuvent être effectuées à l'aide de modélisation basée sur des cultures cellulaires (in vitro) dans le cadre d'études sur les causes de la mort neuronale observée dans la maladie de Parkinson. En revanche, cette approche n'est pas adaptée lorsque l'on s'intéresse aux modifications comportementales. Notre étude ayant pour objectif de modéliser des comportements de prise alimentaire ainsi que d'étudier leurs conséquences cérébrales, ne peut se faire que sur l’animal entier car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par traitement testé, par condition expérimentale, et par sexe soit 240 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables. De plus, trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal de façon à réaliser une étude longitudinale de la modification des facteurs sanguins par la lésion dopaminergique et/ou le traitement permettant une réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et prise de nourriture basés sur le comportement spontané des animaux dans leur cage d'hébergement et ne nécessitant pas d’intervention directe de l’expérimentateur). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec monotoring de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivie au lendemain de la chirurgie voire 48h post-opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis au bout de arbre décisionnel. Les rats sont hébergés deux par cage dès que possible, avec eau et nourriture ad libitum, sauf à partir de J85 et pendant 50 jours soit jusqu'à J135. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement par bâton de bois à rogner est disponible. Un tunnel sera également rajouté lorsque les animaux seront isolés. Les animaux sont manipulés de façon hebdomadaire dès la chirurgie puis quotidiennement au cours du protocole comportemental, leur permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Le rat possède des réponses neuronales proches de celles observées chez l'Homme. Aussi, la modélisation de la maladie de Parkinson est détaillée et maîtrisée chez cette espèce. Le rat est un animal couramment utilisé dans les évaluations comportementales, notamment dans ce test de prise compulsive de nourriture. Nous utiliserons des rats avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus afin de modéliser au mieux la variabilité interindividuelle humaine. Les animaux utilisés seront adultes, permettant de se rapprocher du stade de développement de la maladie de Parkinson.
Enseignement pratique de la physiologie sur le rat
- Enseignement supérieur
540 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal subit une chirurgie de trois heures avec pose de cathéters sur trois voies, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des étudiants de licence et de master. Le porteur décrit des incidents possibles quand un étudiant sectionne une artère ou provoque une détresse respiratoire, suivis de la mise à mort. Il justifie ces séances par la formation pratique des étudiants, alors qu'une part de son offre repose déjà sur des méthodes substitutives.
Objectifs
Les procédures expérimentales proposées sur le modèle rat permettent aux étudiants d'explorer in vivo les régulations de plusieurs grandes fonctions physiologiques dispensées lors d'enseignements théoriques, en complément des enseignements qui utilisent des méthodes substitutives et alternatives.
Bénéfices attendus
La formation des étudiants (de Licence 3 à Master 2) en Physiologie, science étudiant les mécanismes intégratifs de l’organisme, nécessite que ceux-ci acquièrent un minimum d’expérience dans le domaine de la manipulation des animaux vivants et la réalisation de manipulations courantes qu’ils seront amenés à reproduire ultérieurement dans leur carrière. C’est au cours de cette première expérience qu’ils vont pouvoir faire un choix murement réfléchi pour leur avenir. Cette mise en pratique leur permet d'acquérir des compétences comme la gestion de l’anesthésie-antalgie, le suivi du bien-être des animaux, les techniques de cathétérisations (mise en place d’une canule dans un canal ou un vaisseau sanguin) et de prélèvements de tissus in vivo avec l’aide du personnel formé, mais aussi de bien appréhender la réglementation et l’éthique indispensables pour leur future carrière.
Procédures
Quatre procédures expérimentales de gravité « sans réveil » indépendantes les unes des autres sont proposées dans l’enseignement. Dans chacune des procédures, les rats sont soumis à une intervention chirurgicale de 3 heures (cathétérisation de 3 voies d'accès sur un même animal) sous anesthésie générale avec antalgie préalable au moins trente minutes avant de réaliser l’anesthésie. Pendant l'anesthésie-antalgie, par l’intermédiaire des cathéters mis en place, les fluides sanguins peuvent être prélevés en plusieurs fois à temps régulier (cela peut aller jusqu’à 10 prélèvements de 40 µL sans jamais dépasser un volume total supérieur à 10% du poids corporel) ou la sécrétion pancréatique est prélevée en continu. A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort réglementairement.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1- La contention de l’animal au moment de l’antalgie puis de l’anesthésie, durée 1 minute d’intensité faible. 2- Réaction de l’animal au moment de la dissipation de l’effet anesthésique, intensité faible à moyenne (quelques minutes) 3- Hémorragie massive si l'étudiant sectionne l'artère carotide durant l'opération. Intensité moyenne à forte le temps de la mise à mort par surdosage d’anesthésique injecté par voie veineuse (quelques secondes). 4- Détresse respiratoire sévère malgré la trachéotomie. Intensité moyenne à forte le temps de la mise à mort par surdosage d’anesthésique injecté par voie veineuse (quelques secondes)
Devenir
les animaux entrent dans des procédures sans réveil et par conséquent, ils ne seront jamais réveillées à l'issue de l'expérimentation.
Remplacement
Sur notre offre de formation complète en TP de Physiologie animale (licence à master), 17 séances de TP différentes sont proposées. 24% des séances utilisent des méthodes substitutives, 42% sont réalisées ex-vivo (mise à mort pour prélèvement d’organes) et 24% concernent des procédures expérimentales, ne pouvant pas être remplacées car elles permettent d’étudier des mécanismes intégratifs qui n’ont pas leur équivalent en méthodes alternatives aujourd’hui.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux (total prévu 540 rats pour 5 ans) porte sur deux points : 1 – les étudiants travaillent sur un même animal en binômes/trinômes. 2 - Le nombre d’animaux est calculé au minima pour chaque séance de Travaux Pratiques (TP). Une séance de TP = 8 binômes (=8 rats) mais nous prévoyons un rat supplémentaire soit 9 rats par séance au maximum. Par rapport à notre projet précédent, nous n’avons pas eu de diminution des effectifs étudiants en Biologie, et par conséquent du nombre de groupe en licence. Nous avons modifié notre offre de formation en supprimant les TP de physiologie dans une des filières, en donnant la possibilité de choix d’option entre la physiologie animale et végétale, en réduisant le nombre de procédures proposées et en déplaçant les procédures expérimentales au semestre paire dans une unité d’enseignement (UE) optionnelle. Les étudiants concernés par ces TP ont choisi de les réaliser avec un objectif professionnel clairement affiché vers la physiologie. Nous allons ainsi diminuer le nombre d’animaux que nous aurions dû envisager avec l’ancienne maquette.
Raffinement
Le raffinement est mis en place dans la pratique de l’antalgie et de l’anesthésie, nos procédures expérimentales étant sans réveil. Les étudiants ont préalablement été sensibilisés au suivi de l’anesthésie. Ils sont donc responsabilisés à la surveillance rapprochée toutes les 5 minutes et au bien-être de l’animal. Chaque rat est analgésié une heure avant la séance de TP par un personnel compétent. Puis il est anesthésié-analgésié dans une pièce prévue à cet effet, isolé des animaux « en attente » par un personnel formé. Au cours de la procédure, les étudiants appellent l’enseignant dès qu’un signe de réveil apparait et c’est toujours le personnel compétent qui fait les réinjections. La température corporelle du rat est maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffants.
Choix des espèces
Ce modèle se rapproche fortement de la physiologie humaine. Il est possible de réaliser une anesthésie adéquate et de pratiquer des cathétérisations, de réaliser des prélèvements de fluides (sang, bile…), ce qui est plus difficile à réaliser sur la souris en travaux pratiques, étant donné la petite taille de l’animal. Rats adultes, à partir de 225g soit un âge de 8 semaines.La souche de rat peut-être du wistar ou Sprague-Dawley L’utilisation d’animaux adultes rend plus facile la mise en place des canules par les étudiants et permet de réaliser des prélèvements sanguins suffisants pour obtenir des données exploitables d’un point de vue quantitatif.
Effet d’une série de composés anti-obésité sur le métabolisme énergétique chez le rat sauvage
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
104 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant dix-sept jours, reçoivent des administrations orales quotidiennes puis un composé anti-obésité, et passent en cage à calorimétrie avant d'être tués pour prélever le foie et le tissu adipeux. Le porteur qualifie l'isolement d'"incontournable" au nom de la "nécessité" de mesurer individuellement les dépenses énergétiques, alors que le rat est un animal social. Les composés testés relèvent d'un développement commercial visant une éventuelle mise sur le marché.
Objectifs
Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de composés développés en tant que traitements anti-obésité sur le métabolisme énergétique chez le rat sauvage.
Bénéfices attendus
Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les dépenses énergétiques, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
Les animaux recevront des administrations quotidiennes de véhicule pendant 7 jours avant traitement pour les habituer à la procédure d'administration. Le traitement en lui-même est aigu et donc limité à une seule administration. Le poids corporel des animaux sera mesuré 7 fois au cours de l'étude. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d'un système de mesure par calorimétrie indirecte pendant 72h (24h d'habituation suivies de 48h de mesure).
Impact sur les animaux
L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les rats qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer les dépenses énergétiques, l'activité locomotrice et la prise alimentaire individuels lors du passage dans les cages métaboliques. Si les animaux n’étaient isolés que pendant les mesures en cages métaboliques, cet isolement soudain pourraient induire un stress sur les animaux et perturber la validité des mesures. C’est pourquoi nous préférons isoler les animaux dès réception, et les laisser s’habituer à cet état pendant ls 14 jours que précèdent la mesure en cages métaboliques. . Il est à noter que pour ces dernières, les méthodes d'enregistrement employées sont totalement non-invasives. Les traitements par voie orale et les mesures de poids corporel à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances. Enfin, à l'issue de l'étude, les rats seront mis à mort par administration d'Euthasol (Virbac).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes prélevés (tissus adipeux, foie) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur les dépenses énergétiques, le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant les 17 jours de l'étde du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes spécifiques pour rongeurs. Les expérimentateurs en charge de la manipulation des animaux et des administrations orales sont rodés à ce type de pratique. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Dans ce cadre, en cas de besoin, une analgésie sera mise en place par administration de buprénorphine.
Choix des espèces
Le modèle rat Sprague Dawley a été choisi afin de conserver le même modèle que celui employé dans des études précédentes réalisées par le client, notamment des études préalables de pharmacocinétiques. Les animaux seront utilisés à l'âge jeune adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Etude comportementale d’un modèle de neuro-inflammation périnatale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Une inflammation cérébrale est provoquée chez le raton entre le premier et le cinquième jour de vie, puis les animaux passent à l'adolescence une série de tests comportementaux, activité spontanée, activité locomotrice et mémoire de travail, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur présente l'isolement de deux heures comme "indispensable" pour mesurer l'activité de chaque individu. Le modèle reproduit les lésions cérébrales du grand prématuré, avec l'espoir de tester à terme des thérapies cellulaires.
Objectifs
Lorsque le cerveau est en développement et qu'il subit un stress inflammatoire des lésions peuvent apparaître. Cela peut être délétère pour son développement. La conception de thérapies est donc une priorité. Chez le rat, l’injection d’une protéine entre les jours 1 et 5 induit une inflammation du cerveau à un stade du développement cérébral correspondant au 3° trimestre de grossesse chez l’homme. Le modèle constitue donc un outil efficace de compréhension des processus inflammatoires affectant le cerveau du prématuré et permet d’évaluer de nouvelles stratégies protectrices. Ce modèle a été mis au point dans le cadre d’une collaboration par un autre établissement utilisateur. Dans ce projet nous allons caractériser le comportement des ratons à l’adolescence. Nous étudierons l’activité spontanée des animaux, leur activité locomotrice ainsi que leur mémoire de travail. L’objectif sera de déterminer l’impact des lésions cérébrales sur le comportement des rats. A la fin de ce projet les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser leurs cerveaux en IRM.
Bénéfices attendus
La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Les lésions cérébrales sont majoritairement la conséquence de la présence d’une inflammation, qui peut être induite par différentes causes, par exemple une infection, pendant la fin de la grossesse et dans les jours suivant la naissance. Ce stress inflammatoire périnatal, subi par une grande majorité des enfants prématurés, atteint les cellules cérébrales qui sont encore en développement, et donc particulièrement vulnérables. Les lésions cérébrales induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte. Malheureusement, aucune thérapie spécifique de ces lésions n’existe à ce jour. L’amélioration du pronostic de cette pathologie repose donc sur la découverte de nouvelles stratégies. Ce projet vise à tester les effets potentiellement thérapeutiques des cellules capables d’agir sur la réparation et la régénération des tissus, dans les lésions cérébrales induites par la neuro-inflammation. Pour cela, nous utiliserons un modèle de neuro-inflammation chez le raton. Ce modèle reproduit la pathologie humaine de l’enfant prématuré. Nous pourrons ensuite dans ce projet tester l’effet d’administration des cellules sur le comportement des animaux. Cela permettra à long terme d’améliorer les futures thérapies pour ces lésions cérébrales.
Procédures
Les tests comportementaux auront les durées suivantes : -Activité spontanée des animaux durée du test : 2h - Activité locomotrice durée du test : 30 minutes - Test de la mémoire de travail : 5 minutes Les animaux seront anesthésiés avec des anesthésiques (durée de l’injection moins d’une minute) avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon afin de prélever leurs cerveaux pour réaliser des analyses IRM (durée 30 minutes).
Impact sur les animaux
Pour connaitre l’activité spontanée des animaux, ils seront isolés pour une période de 2h. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses IRM.
Remplacement
Le remplacement total des analyses in vivo par des stratégies in vitro n’est pas envisageable actuellement, car les mécanismes impliqués dans les lésions cérébrales mettent en jeu l’interaction de plusieurs types cellulaires au cours du développement cérébral qu’il est impossible de reproduire en culture. Il est donc indispensable d’associer, aux études in vitro, des études chez l’animal soumis à un stress inflammatoire qui reproduit ces lésions.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 15 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. En fonction de la répartition des données nous utiliserons un test statistique paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (Lésions cérébrales, contrôles, Lésions cérébrales+ traitement) : activité exploratoire, locomotrice, mémorisation.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération, d’au minimum une semaine, entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Au vu de la littérature, le rat est une espèce très utilisée pour la réalisation des modèles de neuro-inflammation et de lésions cérébrales. L’étude au sein de laquelle ce projet est intégré regroupe par ailleurs d’autres modèles animaux (2 modèles chez le rongeur et deux modèles chez le mouton). L’inflammation du cerveau sera induite chez le raton entre le jour 1 et le jour 5, stade correspondant au 3ème trimestre de grossesse chez l’homme, soit la période de naissance prématurée. Les animaux seront ensuite testés autour du 40 ème jour de vie afin d’analyser les effets comportementaux des lésions et les effets du traitement.
Etude des effets d’un édulcorant diffusé dans le cerveau sur le métabolisme glucidique et la prise alimentaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
29 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour implanter une mini-pompe qui diffuse un édulcorant directement dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins répétés sur animal vigile lors de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur signale une perte de poids après l'opération et prévoit la mise à mort de tout animal perdant plus de 10 % de son poids. L'objectif reste de comprendre pourquoi les édulcorants dérèglent le métabolisme du glucose, sans application thérapeutique annoncée.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de décès des personnes atteintes de diabète de type 2 ou d’obésité. Plusieurs études scientifiques ont montré un lien de cause à effet entre l’apparition de ces pathologies et la consommation excessive de sucre. C’est pourquoi, l’utilisation de substituts de sucre, les édulcorants (sucres non nutritifs : SNNs) est en augmentation. L’utilisation de ces édulcorants tout en remplaçant la saveur sucrée n’entraine pas d’augmentation de la glycémie à court terme. Cependant, consommés régulièrement, les substituts de sucres non nutritifs (SNNs) peuvent provoquer une augmentation de la prise alimentaire et une augmentation de la glycémie. Il a été montré que la consommation de SNN sur une courte période pouvait diminuer la sensibilité à l’insuline en réponse à un test de tolérance au glucose réalisé chez des sujets sains. Ces dysfonctionnements métaboliques seraient dus aux récepteurs au goût sucré qui lient ces SNNs. Ces récepteurs sont retrouvés sur la langue mais aussi dans tout l’organisme et en particulier dans le cerveau, au niveau de l’hypothalamus. L’objectif de ce projet sera d’étudier l’effet (les effets) d’un édulcorant à long terme sur la (les) réponse(s) de l’hypothalamus, en particulier de déterminer si les SNNs diffusés dans le cerveau induisent une augmentation de la glycémie, augmentent l’expression des récepteurs liant les SNNs dans l’hypothalamus et si l’hypothalamus joue un rôle primaire ou secondaire dans la commande qui entraîne le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline et la prise alimentaire. Un ensemble de marqueurs sanguins pouvant également affecter la réactivité des vaisseaux sanguins sera dosé. Ce projet sera réalisé chez 29 rats.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations nous permettront de mieux comprendre pourquoi et comment la consommation d’édulcorants entraine un dysfonctionnement du métabolisme du glucose et quel est le rôle de l’hypothalamus.
Procédures
Les 29 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d’antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles sont prévus : 5 fois 55 à 105 µl durant deux heures pour le test de tolérance au glucose pour les 29 rats, quatre jours plus tard, 5 fois 5 µl durant deux heures pour le test de sensibilité à l’insuline pour 20 rats, 5 fois 55 à 105 µl pendant 10 minutes à la fin de la procédure 2.
Impact sur les animaux
Les 29 rats subiront des chirurgies. Des injections ainsi que des prélèvements de sang sur animaux vigiles sont prévus. L’effet indésirable attendu est la perte de poids après chirurgie : c’est pourquoi les rats seront observés quotidiennement, pesés tous les 2 jours après la chirurgie et la consommation de nourriture et de boisson mesurées tous les deux jours. L’état général des animaux sera examiné minutieusement (poids, posture, comportement, cicatrisation, état de la plaie). Dans le cas de signes de douleur (posture, mobilité) le traitement analgésique pourra être prolongé et le début des tests retardés. Si un animal présentait une perte de poids persistante pendant plus de deux jours (10% du poids initial), il sera écarté de l’étude et mis à mort (par inhalation progressive de CO2) si son état ne s’améliorait pas.
Devenir
Les 29 rats ayant subi une chirurgie pour la mise en place d’une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez le rat, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Les analyses simultanées des groupes expérimentaux seront réalisées par. Les conditions d’application des analyses seront vérifiées (seront réalisés selon ces conditions. Des études précédentes ont servi à définir le nombre d’animaux par groupe. Les expériences à mener imposent de tester différentes doses d’édulcorants. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, la dose la plus faible sera étudiée en premier. Si celle-ci s’avérait suffisante pour induire une hyperglycémie(différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à bâtonnet de bois et rouleaux de carton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent le bien-être des animaux. Le personnel a été formé et maîtrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les chirurgies seront réalisées par des personnes compétentes sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une injection d’anesthésique local sous cutanée sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection dans la cavité abdominale de liquide physiologique réchauffé sera donnée en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (rouleau de carton et bâtonnet de bois). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.
Choix des espèces
Le rat est une espèce très étudiée par la communauté scientifique, la bibliographie est abondante nous apportant des données d’intérêt dans notre projet, et permettant ainsi la réduction du nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront réalisées sur des rats jeunes adultes, âgés de 8 semaines lors de la chirurgie, cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique du rat, et de 12 semaines à la fin des tests ce qui nous permettra de comparer ces résultats à ceux des rats ayant consommés les édulcorants par voie orale que nous avons obtenus dans un autre projet.
Evaluation de la migraine, induite par injection répétée de Nitroglycérine, à l’aide de différents tests précliniques réalisés chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent cinq injections de nitroglycérine pour déclencher des crises de migraine, puis des composés fournis par des clients, et subissent des tests de douleur provoquée, allodynie et hyperalgie thermiques et mécaniques. Le porteur décrit des crampes abdominales, une douleur aiguë à l'injection et le stress de l'isolement, et précise qu'aucun antidouleur n'accompagne le modèle. Ce modèle "s'inscrit dans l'offre de service de l'entreprise", qui le propose à ses clients pour tester des candidats médicaments.
Objectifs
La migraine chronique est une maladie invalidante qui touche des centaines de millions de personnes à l'échelle mondiale. Le développement de nouveaux traitements contre la migraine est lent. Il existe de nombreux modèles mimant les phases aigues de la migraine. Ici, nous souhaitons évaluer un modèle de migraine chez l’animal par différents tests. La Nitroglycérine est un déclencheur de migraine connu chez l’homme et est donc un bon candidat pour ce modèle. Afin d’évaluer la migraine, différents tests sont réalisés. La migraine induite par la Nitroglycérine provoque de l’hypersensitivité thermique qui sera évalué par des tests thermique. De plus, une composante de douleur mécanique a aussi été démontrée et sera mis en évidence par des tests adéquats.
Bénéfices attendus
Ce modèle s’inscrit dans l’offre de service de l’entreprise. Elle peut ainsi offrir à ses clients un choix varié de tests pour évaluer la migraine dans le but de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs causés par l’administration répétées de Nitroglycérine.
Procédures
Injection (environ 15 secondes) de NTG en intrapéritonéale (5 injections par études) Administration de composés clients via différentes voies et sous différents schémas d’administration (environ 15 secondes par administration) Prélèvements sanguins répétés selon les besoins (1 à 2 minutes par prélèvement)
Impact sur les animaux
Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Lors de nos précédentes études, nous n’avons observé aucun signe clinique inquiétant mais nous avons observé des crampes abdominales dans la minute suivant l'injection de NTG ou son véhicule. Nous serons quand même particulièrement attentifs aux signes cliniques notables et sévères. Certaines nuisances sont connues : - Douleur aigue de courte durée lors de l’injection intrapéritonéale de NTG ou de son véhicule (5 fois), - Stress des animaux lors de leur isolement en rack lors des tests (à J1, 3, 5, 7 et 9) durant 30 min à 2h30, - Douleur liée aux tests d’allodynie (douleur provoquée par un stimulus qui ne cause habituellement pas de douleur), d’allodynie thermique et d’hyperalgie (douleur anormalement amplifiée suscitée par un stimulus douloureux) thermique à J1, 3, 5, 7 et 9, - Douleur aigue lors de l’injection des composés clients ou molécules pharmacologiques de référence.
Devenir
Les effets de l’injection répétée de nitroglycérine chez le rat (5 injections) ne sont pas connus sur le long terme (après J11). De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité selon les bonnes pratiques recommandées.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat.
Raffinement
Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise de l'entreprise (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique et briquettes en bois à ronger)
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein de l'entreprise. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Lors de l’induction (J1), des rats de 200-250g (âge = 5-6 semaines) seront utilisés afin de rester en accord avec les articles étudiés. Ces mêmes rats atteindront un poids d’environ 250-300g le dernier jour de test (J9).
Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques par des méthodes froides ou radioactives
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 300
Gerbilles de Mongolie : 200
Un rongeur qui perd plus de 15 % de son poids, ou plus de 10 % pendant plus de trois jours, atteint le point limite de ce projet. 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie. Pour suivre l'absorption et l'élimination de composés chimiques ou biologiques, parfois radioactifs, l'équipe administre ces composés par toutes les voies possibles, jusque dans le cerveau ou la vessie, ou par minipompe posée en chirurgie, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures, une privation d'eau jusqu'à quatre heures, un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, et des phases in vivo jusqu'à douze mois. Le porteur annonce pourtant "pas d'effets indésirables particuliers", avant d'admettre que les composés peuvent se révéler toxiques. 10 220 rongeurs sont déclarés réutilisés, une possibilité que le porteur réserve à ceux restés moins d'une semaine après une dose unique non radioactive, et les autres sont tués pour récupérer organes et grands volumes de sang.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. La deuxième procédure aura le même objectif mais avec recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Afin d’évaluer la pharmacocinétique de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h, Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité, ce qui sera surveillée.
Devenir
Après la procédure numéro 2, et dans une grande partie des cas pour la procédure 1, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux de la procédure 1 ayant reçu une administration unique de composé et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids , les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Induction de maladie démyélinisante chez le petit animal de laboratoire à la Cuprizone. Et évaluation de l’action de cellules thérapeutiques par injection intracérébrale dans ce modèle animal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1125
Les cellules injectées dans le cerveau des souris et des rats de ce projet sont fournies par un client, et les effets indésirables à prévoir seront anticipés d'après les informations que transmettront les donneurs d'ordre. 2 250 rongeurs, 1 125 souris et 1 125 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue puis autopsiés pour prélever leurs organes. Nourris chaque jour d'un aliment contenant 0,2 % de cuprizone pour provoquer une maladie démyélinisante, ils reçoivent selon les groupes une injection unique de cellules par stéréotaxie sous anesthésie, pour des protocoles de deux jours à six mois. Le porteur évoque des phases de douleur aiguë puis chronique, des points limites et un suivi de la locomotion et de la sensibilité mécanique deux ou trois fois par semaine. Sur le remplacement, il recopie mot pour mot son paragraphe sur les effets indésirables, sans citer aucune méthode de substitution.
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)
Procédures
L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.