Rats
Seconde administration de vecteur AAV pour pallier à une perte d’efficacité suite à une thérapie génique de la myopathie myotubulaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour tester une seconde injection de thérapie génique, avec un autre vecteur AAV, quand la première perd en efficacité, 168 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les malades, privés de myotubularine par modification génétique, développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements et leur accès à la nourriture, et les rats reçoivent jusqu'à deux injections intraveineuses du traitement, quatre prises de sang sous anesthésie et une séance d'imagerie. Tous sont mis à mort à 15 semaines, à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs tissus. Le porteur affirme que l'utilisation d'animaux non-humains est "indispensable" et préfère le rat à la souris pour une réponse immunitaire qu'il dit plus proche de celle de l'humain. Il annonce des points limites sans les décrire, et prévoit pour les rats malades une nourriture enrichie posée au sol.
Objectifs
Il n’existe aucun traitement disponible pour la myopathie myotubulaire lié au chromosome X, une maladie congénitale sévère affectant les garçons et entrainant la mort prématurée avant un an. Cette maladie est due à des mutations dans un gène exprimant une protéine, la myotubularine. Sa déficience implique une diminution de la taille des muscles et une faiblesse musculaire généralisées entrainant une faiblesse respiratoire. Dans un essai clinique en cours, un vecteur AAV (dérivé d’un virus associé à un adénovirus) thérapeutique ciblant les muscles des patients, est injecté par voie intraveineuse. L’espérance de vie étant faible, les patients doivent être traités dans les premiers mois voire premières années de vie. Leurs muscles vont alors se développer avec de nouvelles cellules qui n’auront pas été traitées par l’AAV. Il y a un risque de dilution de la protéine et donc de diminution de l’efficacité de la thérapie dans le temps. Pour des raisons immunitaires, il n’est pas possible actuellement de réinjecter le même vecteur de thérapie génique. Récemment, nous avons identifié un nouveau vecteur AAV qui ne génère pas la même réponse immune que les AAV couramment utilisés pour traiter les maladies neuromusculaires en préclinique et clinique. Ce vecteur pourrait donc être utilisé pour une réinjection. Dans ce projet, nous testerons cette réinjection dans un modèle de rat de la myopathie myotubulaire qui reproduit avec fidélité les caractéristiques pathologiques que l’on retrouve chez l’Homme. Plusieurs associations de vecteurs AAV seront testées avec une première injection d’un vecteur dès l’apparition des premiers symptômes, puis une deuxième injection avec un autre vecteur à un stade plus tardif.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait de proposer une solution à la perte d’efficacité d’un traitement dans le temps. En effet, la meilleure combinaison de deux vecteurs AAV permettrait de traiter les patients à un âge précoce avec un premier vecteur, et de réadministrer ce traitement avec un autre vecteur à un âge plus tardif si nécessaire, à l’adolescence par exemple. De plus, les bénéfices attendues dans ce projet pourraient s’étendre à d’autres pathologies neuromusculaires telles que la myopathie de Duchenne ou toute autre myopathie ou dystrophie touchant les muscles dans les premières années de vie. Si toutefois cette étude ne permettait pas de mettre en avant les bénéfices d’une ré-administration, ce travail permettrait de mieux comprendre les réponses immunes (production d’anticorps) générées par le vecteur nouvellement identifié, et proposer peut-être des alternatives pour réduire l’activation de ces anticorps qui empêchent l’efficacité d’une ré-injection d’AAV.
Procédures
Analyse d'imagerie sur animaux vivants anesthésiés avec injection intraveineuse: environ 20min par rats, 1 fois. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés: environ 5 min par rats, 4 fois. Injections intraveineuses du traitement : environ 1 min par rat, 2 fois. Injection d’anesthésiques : environ 1min, 2 fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine myotubularine. Les mâles malades développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les injections intraveineuses, intra-péritonéales ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever des tissus qui nous permettront de démontrer l’efficacité des traitements (état du muscle, présence de la protéine dans le muscle, non toxicité sur certains organes…).
Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour faire des preuves de concepts thérapeutiques, car les modèles cellulaires de la maladie ne permettent pas d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle (perte de force non mesurable sur des modèles cellulaires, pas de remplacement possible), et ne permettent pas non plus d’étudier la répartition d’un vecteur dans les différents organes et la réponse immunitaire générée par celui-ci. A l’opposé, le modèle de rat qui sera utilisé dans ce projet reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des tissus, la distribution du vecteur dans les différents organes et muscles, et la réponse immunitaire. A noter que la réponse des cellules immunitaires et la production d’anticorps suite au traitement avec un vecteur AAV est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de ce modèle plutôt que le modèle souris.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre les animaux traités à deux reprises et ceux traités une seule fois. Pour l’ensemble du projet, des groupes d’animaux servant de contrôles sont nécessaires (animal non traité, animal traité une seule fois); les actes exercés sur ces groupes ont été déterminés de façon à ce que certains groupes contrôles puissent servir de contrôle à différentes étapes du projet, ce qui réduit le nombre d’animaux total. De plus, si au cours de l’étude, certaines associations de vecteurs ne permettent pas d’obtenir un bénéfice suite à la deuxième injection, certains contrôles ou certaines étapes ne seront pas réalisés avec ces vecteurs. De même, si aucune association de vecteurs ne permet une ré-administration efficace à la première étape, le projet ne poursuivra pas.
Raffinement
Des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine en plus de l’observation quotidienne des animaux. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis. En cas de dégradation de l’état général de l’animal, des soins seront administrés. Des conditions d'hébergement particulières leur seront appliquées afin de garantir leur survie dans de bonnes conditions. Les animaux malades recevront un aliment spécifique, plus riche en nutriments, hydratant et posé au sol pour pallier aux éventuels problèmes moteurs. Les rats étant des animaux sociaux, un rat ne sera jamais seul dans sa cage. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant gazeux.
Choix des espèces
Les rats ont été choisis comme animaux modèles pour trois raisons : 1) La réponse immune cellulaire que l’on souhaite observer est plus similaire à l’Homme chez le rat que chez la souris d’où l’utilisation de cette espèce plutôt que l’espèce murine. Par exemple, les lymphocytes T ne vont pas interagir de la même façon avec l’antigène (antigène de l’AAV par exemple) entre le rat et la souris, alors qu’il y a peu de différence entre l’Homme et le rat. 2) Ces animaux peuvent être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène d’intérêt. Un modèle de rat de la myopathie myotubulaire a été caractérisé et reproduit avec fidélité les signes cliniques caractéristiques de la maladie humaine, ce qui permet d’évaluer l’efficacité thérapeutique des traitements. 3) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les rats mâles seront utilisés entre 3 et 4 semaines pour qu’ils soient sevrés et euthanasiés à 15 semaines. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie. La première injection d’AAV vise à corriger en partie les symptômes de la myopathie myotubulaire : les animaux mâles malades seront donc utilisés après l’apparition des premiers symptômes, en s’assurant que les points limites ne soient pas atteints.
Evaluation du potentiel ulcérogène gastrique de nouveaux composés et/ou de modulation des ulcères induits par des agents ulcérogènes usuels chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 3750
7500 rongeurs, 3750 souris et 3750 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une mise à jeun de quatorze heures sur grille, ils reçoivent par gavage ou injection les composés testés ou des agents ulcérogènes comme l'éthanol ou des anti-inflammatoires, avant le prélèvement de l'estomac après la mise à mort. Ces études réglementaires évaluent le potentiel de nouvelles molécules à provoquer ou atténuer des ulcères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative validée n'existe pour étudier un système digestif "intègre".
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer : - les effets potentiels ulcérogènes gastriques de nouveaux composés, - la capacité de modulation par de nouveaux composés des effets ulcérogènes gastriques de composés comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine), les acides (HCl). Les modèles expérimentaux développés chez le rongeur (principalement chez le rat) sont très largement décrits.
Bénéfices attendus
Dans le cadre d'étude de type pharmacologie de sécurité, ces études vont permettre de déterminer d'éventuels effets délétères sur la muqueuse gastrique de candidats médicament et fournir ainsi des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament. Dans le cadre d'étude d'efficacité/pharmacologie de sécurité de candidat médicament, ces études vont permettre de déterminer le potentiel de modulations par le candidat médicament des ulcères gastriques induits par des agents comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine). Cela apportera des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament ou en terme d'efficacité thérapeutique.
Procédures
Mise à jeun avec hébergement sur grille de 14h pour éviter les phénomènes de coprophagie (1 fois) avant traitements par gavage ou administration intra péritonéale (maximum deux traitements à 1h d'intervalle, durée d'un gavage ou d'une injection intrapéritonale de 15 secondes environ) suivi 6 heures au plus tard après le premier traitement d'une anesthésie pour prélèvement sanguin et prélèvement de l'estomac (et éventuellement d'autres tissus) après la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de déterminer les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Des nuisances peuvent être liées aux administrations (infection au site d’injection, lésion œsophagienne liée au gavage ou erreur de gavage). Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être des troubles du comportement ou les nuisances consécutives de l'ulcération qui peuvent in vivo être objectivées par la présence de traces de sang dans la région périanale. Enfin, la mise à jeun sur grille est également source de nuisance pour les animaux, mais est requise pour éviter les phénomènes de coprophagie.
Devenir
Mise à mort selon les procédures réglementaires pour prélèvements terminaux post mortem requis
Remplacement
L’utilisation de souris ou de rats pour l'évaluation d'effet sur la muqueuse gastrique est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système gastrointestinal intègre, y compris dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative connue et validée à ce jour.
Réduction
Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le choix de doses sera effectuée. L'analyse statistique évaluera les scores d'ulcérations comparant les effets des traitements.
Raffinement
La mise à mort des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors la mise à mort de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Les animaux resteront hébergés en groupe et des tunnels seront utilisés comme enrichissement.
Choix des espèces
L’évaluation de l’efficacité thérapeutique et de la sécurité pharmacologique des molécules destinées à devenir des médicaments est requise par les autorités. La 1ère évaluation préclinique des effets sur la sphère gastrique est généralement conduite chez les rongeurs (rats, souris). Le stade adulte sera généralement utilisé pour tester l’efficacité de nouvelles entités pharmacologiques, les applications thérapeutiques visant la population adulte. Néanmoins, des investigations pourront être réalisées sur des animaux après sevrage pour répondre à des besoins relatifs au plan d’investigation pédiatrique le cas échéant.
Mesure des paramètres cardiovasculaires après administration de candidats médicaments chez le rongeur démédulé.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 520
Cochons d'Inde : 280
1080 rongeurs, 520 rats, 280 souris et 280 cobayes, vont être utilisés dans des procédures menées sans réveil, sous anesthésie profonde jusqu'à la mort. Chaque animal subit une démédulation, la destruction du tronc cérébral et de la moelle épinière qui entraîne la mort cérébrale, puis est maintenu en survie artificielle sous assistance respiratoire pour une chirurgie et des mesures cardiovasculaires durant deux à trois heures. Ces essais réglementaires évaluent les effets d'un candidat-médicament sur le cœur avant tout passage chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode in vitro ou in silico suffisante pour cette évaluation sur "corps entier".
Objectifs
Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité et/ou les potentiels effets secondaires d'un futur médicament sur le système cardiovasculaire. En effet, avant la mise sur le marché d'un nouveau médicament, l'évaluation de ses effets hémodynamiques est indispensable. Ce projet est réalisé dans le cadre des études d'efficacité et/ou de pharmacologie de sécurité réglementaires.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le processus de mise sur le marché de nouveaux médicaments. L'évaluation de potentiels effets secondaires sur le système cardiovasculaire de l'animal est un passage important et obligatoire avant une administration chez l'Homme. Ainsi, ce projet permet de réaliser des études d'efficacité et/ou de pharmacologie de sécurité obligatoires et donc, de valider ou invalider des substances à effets secondaires nuls ou importants sur les fonctions cardiovasculaires. Ainsi, les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments efficaces et présentant le moins possible d'effets secondaires cardiovasculaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.
Procédures
La procédure de ce projet décrit différents types d'interventions. L'animal subira une démédulation (quelques secondes) (suppression du tronc cérébral et de la moelle épinière conduisant à la mort de l'animal) sous anesthésie gazeuse profonde (endormissement en 5 minutes), puis l'animal sera placé immédiatement sous assistance respiratoire de façon à maintenir l'animal en survie artificielle en conservant ses fonctions végétatives. Les animaux subiront une chirurgie (entre 30 et 60 minutes) , afin de pouvoir faire les mesures des paramètres cardiovasculaires (entre 2 et 3 heures). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant cette procédure. La durée totale d'une expérience n'excédera pas 4 heures.
Impact sur les animaux
Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint pour induire l'anesthésie; ceci pouvant engendrer un stress mineur à l'animal. L'animal subira une démédulation sous anesthésie gazeuse profonde induisant la mort cérabrale de l'animal, puis il sera placé immédiatement sous assistance respiratoire de façon à maintenir ses fonctions végétatives et une chirurgie d'instrumentation sera réalisée.
Devenir
Les procédures décrites dans ce projet sont des procédures sur animal en mort cérébrale dont les fonctions végétatives sont artificiellement conservées, donc sans réveil possible. La survie artificiellle des animaux sera arrêtée en fin d'expérience.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat, le cobaye ou la souris car il n'existe pas de méthode de substitution in silico ou in vitro pour étudier les effets d'un candidat médicament sur la fonction cardiovasculaire des animaux. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre à l'intégralité des objectifs scientifiques du projet. Or, avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation des effets secondaires sur la fonction cardiovasculaire, et de la pharmacocinétique, d'un candidat médicament. A ce jour, le rat, le cobaye et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Ce nombre (en général n=6 /groupe) est calculé pour pouvoir réaliser une analyse statistique robuste.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : La formation du personnel • La mise au point de procédures rigoureuses • Un protocole anesthésique adapté • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Des conditions d’hébergement (avant expérience) adaptées et optimisées pour améliorer le bien-être animal • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux.
Choix des espèces
Le rat, la souris et le cobaye sont trois espèces animales particulièrement adaptées et couramment utilisées pour évaluer le profil hémodynamique d'un candidat médicament. Animaux adultes : Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
ONCO-Disséminé. Evaluation de composés thérapeutiques sur les animaux porteurs de tumeurs disséminées
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 300
6500 rongeurs, 6200 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une induction tumorale, parfois une irradiation et un implant, puis des traitements répétés et des prélèvements de sang et de moelle osseuse, pour évaluer des composés contre des leucémies et des métastases. Le développement tumoral provoque une perte de poids et des difficultés à se déplacer. Le porteur reprend mot pour mot son argumentaire de remplacement pour justifier le nombre d'animaux, et affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).
Impact sur les animaux
Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.
Devenir
Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Raffinement
Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.
Modèles précliniques in vivo pour l’exploration de la fonction rénale
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles urogénitaux
Rats : 150
600 rongeurs, 450 souris et 150 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. 150 souris subissent une obstruction chirurgicale de l'uretère pour provoquer une fibrose du rein, avec traitements quotidiens et séjours en cage métabolique, sur des animaux rendus diabétiques ou hypertendus. Le porteur signale que l'anesthésie profonde peut entraîner la mort chez ces animaux fragilisés. Les reins sont prélevés après la mise à mort, et il affirme que ses modèles in vitro ne peuvent "substituer" les observations chez l'animal.
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale induit une perte de fonction de l’organe et le décès prématuré des patients due à des problèmes cardiovasculaires. Ces problèmes rénaux sont particulièrement exacerbés chez les personnes présentant des désordres métaboliques. Il a été démontré que le vieillissement, le diabètes ou la prise chronique de médicaments accélère le développement de maladies rénales chroniques à la suite de lésions aigües de l’organe. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles couramment utilisés ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique notament par l'absence de pathologies associées comme l'obésité, le diabètes ou le vieillssement. L'objectif de ce projet est de mettre en place de nouveaux modèles expérimentaux de rongeurs (souris, rats) afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant le rein. Les modèles de rongeurs développés dans ce projet permettront d'améliorer la prédiction d'efficacité et de toxicité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer de nouveaux modèles expérimentaux in vivo qui expriment une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur des modèles pertinents d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques. Enfin, comme les désordres métaboliques accélèrent l’établissement de maladie rénal chronique, ces nouveaux modèles in vivo permettront de réduire considérablement les délais d’expérimentations et les contraintes associés subit par les animaux.
Procédures
Les animaux utilisés dans ces procédures pourront être soumis à des prélevements de sang (20-50 ul) par légère incision au niveau de la queue afin de réaliser des dosages de marqueurs sanguin. Ces prélevements pourront se faire de manière répété avec un temps minimal de 48h entre 2 prises sur une durée de 7 jours, ou de façon hebdomadaire sur une durée de 4 semaines. 150 souris seront soumises à une obstruction de l'uretère par micro-chirurgie afin d'induire le développement rapide d'une fibrose rénale et de tester l'efficacité de composés anti-fibrotiques. Cette procédure chirurgicale est effectuée sous anesthésie pour une durée de 15-30 min. Les animaux utilisés dans ce projet seront aussi soumis à des traitements par des candidats médicaments (par voie oral, ou intra-péritonéal, ou intra-veineux) allant de 15 jours à 4 semaines. Ces traitements seront réalisés quotidiennement. Enfin, afin d'évaluer l'efficacité des candidats médicaments, les animaux pourront être placés en cages métabolique afin de collecter les urines et feces ainsi que mesurer la consommationd e nourriture et d'eau. Cette procédure nécessite le placement des animaux en cage individuelle avec fond en grille pendant 24h.
Impact sur les animaux
Certains animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à des procédures de microchirurgie rénale. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure chirurgicale d’obturation de l'uretère. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à opérer - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux ayant des problèmes métaboliques (obéses, diabétiques, hypertension) - Perte de poids à l'acte chirurgical
Devenir
Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons sur le développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations physiologiques réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiopathologique et les réponses systémiques ne peuvent pas être reproduites sur nos modèles in vitro.
Réduction
Dans la première phase de mise au point de chacun des modèles, un nombre restreint de souris sera utilisé (environ 20) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Ces procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la deuxième phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (100mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture. Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime.
Choix des espèces
Les souris C57/Bl6 wild-type ou génétiquement modifée db/db (présentant un phénotype diabétique), ainsi que le modèle de rat spontanément hypertendu (SHR) sont largement utilisés par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale. L’avantage des lignées de souris sélectionnées est qu’elles répondent très bien à la procédure de micro-chirurgie permettant une ligature de l'uretère afin d'induire une fibrose rénale et ils constituent un excellent mime des conditions de pathologies rénales retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, ces animaux ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. Les rats SHR présentent spontanément une hypertension artérielle, et les effets des médicaments pour la prévention des désordres rénaux peuvent être étudiés sans procédure additionnelle. Les procédures seront réalisées sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées. Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines pour les souris et 7 semaines chez le rat. Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines pour les souris et 7 semaines chez le rat. Les souris diabétiques db/db seront plus agées (environ 12 semaines) afin qu'elles puissent présenter des déréglements rénaux suffisant pour pouvoir les traiter et observer la restauration des fonctions rénales normales.
Effet d’un entraînement intensif sur des paramètres in vivo chez un modèle de rat spontanément obèse.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
12 rats spontanément obèses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sept d'entre eux suivent un entraînement intensif sur tapis cinq jours par semaine pendant six semaines, et tous subissent un test d'effort maximal classé sévère, répété jusqu'à trois fois, ainsi que des prélèvements sanguins sous anesthésie. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme ne pouvoir remplacer l'animal par des cellules ou des modèles informatiques, ces méthodes n'apportant selon lui pas de réponse "intégrative".
Objectifs
Notre étude a pour objectif d’évaluer les effets d’un entraînement intensif de haute intensité sur la communication in vitro entre le muscle strié squelettique et le tissu adipeux chez un modèle de rat spontanément obèse.. Ce travail sur un modèle animal pathologique est la suite de notre précédent projet qui a porté sur le rat sain.
Bénéfices attendus
Tous les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dans les bénéfices de l’entraînement intensif sur l’organisme au profit de la santé humaine. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension des mécanismes in vivo du métabolisme aérobie/anaérobie (test de VO2max et prélèvements sanguins). Nous suivons individuellement chaque animal qui est son propre témoin (suivi longitudinal) en plus de comparer nos deux groupes d’animaux. Ces mécanismes sont aussi explorés sur les tissus prélevés après mise à mort. A moyen terme, la mise en place de co-cultures muscles-adipocytes à partir d’animaux entraînés et obèses, permettra de vérifier la durabilité des effets de l’exercice et d’explorer la communication de ces populations de cellules en dupliquant les mesures sur les cellules uniquement. A plus long terme, ces données sur cellules seront une vraie plus-value sur la compréhension des mécanismes induits par l’entraînement intensif, surtout sur le tissu adipeux car les données bibliographiques sont contradictoires chez les individus obèses.
Procédures
Tous les animaux (n = 12) sont soumis à deux prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse au niveau de la veine latérale caudale aux âges de 7 et 12 semaines. La mesure de leur pression artérielle et la mesure de la microcirculation cutanée se feront à l’aide de méthodes non invasives sous anesthésie gazeuse l’une à la suite de l’autre. La durée de l’anesthésie sera de 45 minutes. Cette analyse sera réalisée deux fois aux âges de 7 et 13 semaines. Ils réalisent tous un test de capacité maximale aérobie (appelé test de VO2max) à l’âge de 8 semaines et seuls les animaux entraînés en intermittent intensif (n=7) referont ce test (à 11 et 14 semaines) pour réajuster l’entraînement à leurs capacités individuelles. Le jour du test, ils ne feront pas leur séance d’entraînement et récupèreront 48 heures avant de reprendre l’entraînement. durée du test entre 5 et 20 minutes en fonction des capacités maximales individuelles de chaque rat. L’entraînement individualisé (n = 7) débute à l’âge de 9 semaines et perdure 6 semaines consécutives à raison de 5 séances/semaine d’une durée de 36 min/jour. Les animaux non entraînés (n = 5) ne courent pas mais sont manipulés quotidiennement de la même façon que les animaux entraînés.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : - le stress lié à la manipulation quotidienne des animaux : acte de gravité légère, tous les jours, pendant 8 semaines consécutives. - le stress lié à la contention lors de l’anesthésie gazeuse pour permettre la réalisation des prélèvements sanguins : acte de gravité légère, 2 fois sur l’ensemble du projet aux âges de 7 et 12 semaines, durée estimée de 6 minutes. -le stress lié au test d’évaluation des capacités maximales du rat (VO2 max) : acte de gravité sévère, durée entre 5 et 20 minutes en fonction des capacités maximales des individus. Ce test est réalisé 3 fois dans le projet avec un repos de 2 semaines entre chaque test. - le stress lié à la course journalière sur le tapis de course calorimétrique ou le tapis non calorimétrique : acte de gravité modérée, durée 45 min par jour, 5 fois par semaine, pendant 6 semaines consécutives. - le stress lors de la contention lors de l’anesthésie gazeuse réalisée avant la mesure de microcirculation cutanée et la pression artérielle en non invasif, acte de gravité légère, durée estimée de 6 minutes, 2 fois dans le projet aux âges de 7 et 13 semaines.
Devenir
Nous devons travailler sur des prélèvements d’organes et c’est la raison pour laquelle, à l’issue de notre projet, tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Notre travail porte sur une étude intégrative et non invasive des effets de l’entraînement physique intensif sur le métabolisme aérobie/anaérobie chez des individus obèses. A l’heure actuelle, les mesures de VO2 max sont réalisées chez l’homme mais nous ne pouvons pas récupérer tous ses organes pour étudier les mécanismes physiologiques à l’issue d’une période d’entraînement. Il n’est pas non plus possible de remplacer le modèle animal actuel par des cellules ou des modèles bio-informatiques car ces méthodes alternatives n’apportent pas de réponses intégratives.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au strict minimum pour que les résultats soient statistiquement exploitables par rapport à nos projets précédents. Nous avons aussi prévu un pourcentage d’échec maximal de 28% en lien avec le refus de courir uniquement dans le groupe entraîné, soit 2 rats sur 7 au départ. De plus, après mise à mort des animaux, la mise en place de co-cultures primaires muscle-tissu adipeux duplique les expériences. Cette technique nous permet, dès à présent, de réduire le nombre d’animaux à utiliser par rapport à nos projets précédents qui portent sur la même thématique.
Raffinement
Tout au long de la procédure, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et ils sont suivis quotidiennement à l’aide de tables de suivi de soin. Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire, surtout sur l’entraînement sur tapis roulant. Avant de démarrer le protocole d’entraînement intensif, les animaux sont habitués sur le tapis roulant à marcher, puis à courir jusqu’à atteindre 30 min de course quotidienne environ, pendant au minimum 4 jours. Cette étape est primordiale : elle permet à l’expérimentateur et à l’animal de créer une confiance qui conditionne la réussite de la tâche à accomplir. Les vitesses sont maintenues sur des durées adaptées à l’aptitude des rats et leur compréhension de l’exercice. Le test de capacité maximale aérobie (VO2 max) est toujours réalisé seul le vendredi (pas de séance d’entraînement ce jour-là) pour que les animaux soient au repos pendant 2 jours avant de reprendre l’entraînement le lundi suivant. A l’issue de chaque séance d’entraînement, les animaux sont récompensés par un petit morceau de pomme. L’insertion de la puce d'identification en sous-cutané, les mesures de pression artérielle et de microcirculation cutanée et les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse et la ponction cardiaque terminale sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le rat est un animal doué et intelligent qui peut être conditionné à l’activité physique. Les mécanismes physiologiques de l’activité physique sur le modèle de rat spontanément obèse sont très proches de ce qui se déroule chez l’homme obèse. Tous les protocoles démarrent à l’âge de 6 semaines et se terminent à 15 semaines. Nous travaillons sur des animaux jeunes pour qu’ils s’habituent à être manipulés par l’homme sans occasionner de stress ou d’angoisse lors de la course sur tapis roulant.
Les techniques d’embryologie réalisées sur des modèles génétiquement modifiés
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 12000
87 000 rongeurs, 75 000 souris et 12 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie tuée en fin de procédure et les femelles réimplantées avec succès transférées en élevage. Ils subissent vasectomies, réimplantations d'embryons et chirurgies sous anesthésie, avec prélèvements sanguins et injections, pour créer, congeler et régénérer des lignées génétiquement modifiées destinées à la communauté scientifique. Le porteur présente la cryoconservation et la fécondation in vitro comme des avancées réduisant le nombre d'individus utilisés. Il affirme que seul le recours à des "organismes entiers" vivants permet d'étudier les conséquences d'une modification génétique.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la création, la cryoconservation et la redérivation de lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche ou pour le développement de médicaments. À la vue du nombre croissant de modèles génétiquement modifiés, la cryoconservation de ceux-ci est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux vivants utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle …
Bénéfices attendus
La création de lignées par réimplantation d’embryons permet l’obtention de modèles génétiquement modifiés ciblant un ou des gênes d’intérêt, modèle capital dans la compréhension des mécanismes physiologiques et physiopathologies des maladies, des médicaments et autres domaines de recherche. La cryoconservation des modèles génétiquement modifiés est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle… La redérivation de lignées génétiquement modifiées par réimplantation d’embryons permettra aux chercheurs d’avoir des animaux dont le statut sanitaire sera maitrisé et évitera ainsi tout éventuel impact du statut sanitaire sur l’expression du phénotype. Les résultats des essais réalisés sur cette lignée redérivée seront alors plus précis et limiteront donc le nombre d’animaux utilisés. La stimulation des femelles par traitement hormonal permet de synchroniser les individus et augmenter le nombre d’ovocytes collectés par femelle. Cette approche présente une avancée éthique considérable.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans le cadre de vasectomie ou de réimplantation d’embryons seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée de 20 minutes à 1 heure sous anesthésie générale. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Selon le besoin des projets, les animaux pourront être soumis à des injections intrapéritonales. Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions,aux injections de stimulations (72h max) et aux transferts entre les différentes zones. Douleur, stress et perte de poids dûs aux procédures chirurgicales et à la récupération post-opératoire (12h max).
Devenir
Les animaux sont transférés en zone d’élevage interne pour les femelles réimplantées avec succès. Tous les autres animaux sont mis à morts en fin de procédure expérimentale ou dans le cas d’atteinte d’un point limite.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne peut remplacer ce projet qui vise à fournir aux scientifiques les animaux qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. L’intérêt de disposer d’organismes vivants et entiers est de pouvoir observer ceci dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques.
Réduction
Basé sur nos données historiques, nous évaluons le nombre d’animaux requis pour répondre aux besoins des scientifiques. La technique de production d’embryons par Fécondation In Vitro pour les souris présente une avancée éthique considérable pour la réduction du nombre d’individus utilisés comparée à une technique d’accouplement naturel. La cryoconservation du potentiel génétique permet de réduire le nombre d’animaux requis pour la conservation ou la redérivation d’une lignée. La réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet repose sur : l'expertise de l’équipe embryologie et sa maitrise des procédures, les conditions expérimentales, le suivi des données techniques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé lors des procédures chirurgicales par une administration d’analgésique avant et après la chirurgie ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée après la chirurgie pour tous les animaux. La technique chirurgicale est régulièrement raffinée (dilacération plan musculaire vs incision …) afin de minimiser les nuisances liées à l’acte. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes Pour la stimulation hormonale, sont concernés que les animaux de 3 semaines minimum, dont la taille et le poids sont compatibles avec l’injection d’hormones, selon les recommandations éthiques en vigueur. Pour la vasectomie, sont concernés des animaux de 3 à 10 semaines. Pour la réimplantation d’embryons, sont concernés des animaux de 7 à 14 semaines
Evaluation de la tolérabilité d’un candidat médicament chez le rongeur.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
750 souris et 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un candidat médicament leur est administré par différentes voies, dont une injection dans le cerveau après chirurgie sous anesthésie, avec des prélèvements de sang, un isolement après opération et un jeûne de dix-huit à vingt heures. Le porteur indique s'attendre à des effets secondaires liés à la molécule testée et justifie la mise à mort par des prélèvements d'organes incompatibles avec la survie. Il affirme que l'animal est un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain et qu'aucune méthode de substitution n'est suffisante.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'évaluer la tolérabilité de futurs candidats médicaments après leur administration chez le rongeur (rat et souris). Dans le cadre de développement de nouveaux candidats médicaments, une modification de la formulation, de la voie d'administration ou un ajustement de la dose thérapeutique peut amener à étudier les effets sur l'état général de l'animal ou les effets uniquement en local vis à vis du composé dans ces nouvelles conditions. Le projet consiste donc à évaluer sur un petit groupe d'animaux ces effets avant de continuer sur une étude avec un nombre plus grand d'animaux. Après administration du composé, une observation régulière des animaux sera réalisée grâce à un outil de surveillance spécifique (par exemple observations du comportement, des réflexes, de la température) à chaque espèce utilisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Suivant la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire.
Procédures
Afin d'administrer les candidats médicament aux animaux, différentes voies d'administration pourront être utilisées (2 minutes ou moins). Pour réaliser l'administration du produit dans le cerveau, les animaux pourront être soumis à une anesthésie et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes), des administrations d'anti-douleur (jusqu'à 5 administrations, moins de 30 secondes pour chaque administration), des prélèvements de sang sur animaux vigiles (2 minutes) ou anesthésiés (environ 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une injection du candidat médicament par différentes voies d'administration. Les animaux seront anesthésiés pour réaliser l'injection des candidats médicaments dans le cerveau et ils recevront jusqu'à 5 injections d'anti-douleur. Selon le mécanisme d'action de la/des substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet, on s'attend à observer des effets secondaires qui disparaitront une fois que la substance sera éliminée par l'organisme. Egalement, les animaux pourront être isolés dès après la chirurgie, jusqu'à la fin de l'étude pour les souris, et jusqu'à la cicatrisation avancée des plaies pour les rats. Les animaux pourront également être mis à jeun pour une période de 18-20h avec complémentation en glucose ou non.
Devenir
Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'organisme. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces qui sont la plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Une analyse statistique pourra éventuellement être envisagée et sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont parmi les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer la tolérabilité d'un candidat médicament. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 150
300 rongeurs, 150 souris et 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés d'une séance à l'autre. Les animaux sont utilisés lors de travaux pratiques où des stagiaires apprennent la préhension, la contention, les injections sous-cutanées et intra-gastriques et la surveillance sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique une douleur légère liée aux injections et un stress de manipulation, les gestes étant d'abord répétés sur mannequins et cadavres. Il présente cette formation réglementaire à l'expérimentation comme "indispensable" et met en avant la sensibilisation au "bien-être" des animaux non-humains.
Objectifs
Notre formation a pour vocation à former des personnels à la manipulation et la réalisation de procédures expérimentales sur animaux de laboratoire. Cette formation est ouverte aux techniciens des laboratoires publics et privés dans le cadre de la formation continue, ainsi qu’à des étudiants en cursus initial de licence professionnelle. Ce type de formation réglementaire à l’expérimentation animale doit permettre l’acquisition de compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation d’animaux dans le respect de leur bien-être. Au cours d’une procédure, le technicien doit ainsi être en mesure d’évaluer le degré de mal-être causé à l’animal et d'adapter ses pratiques afin de prévenir et de limiter ce mal-être au maximum. Cela nécessite un apprentissage, réalisé durant plusieurs séances de travaux pratiques. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont multiples : familiarisation des stagiaires avec les animaux et sensibilisation au respect du bien-être animal ; apprentissage des règles d’hygiène et de sécurité propres à la pratique de l’expérimentation animale ; apprentissage des calculs de dilution et de dose à injecter, connaissance du matériel nécessaire aux injections et aux prélèvements, préparation de ce matériel, notions d’asepsie ; acquisition des compétences techniques de préhension, contention et d'injections (sous-cutanée, intra-gastrique) ; acquisition de connaissances théoriques sur l’anesthésie et apprentissage des paramètres à prendre en compte et à surveiller pour assurer le confort de l’animal sous anesthésie ; acquisition de connaissance sur les cycles de reproduction et les méthodes d'élevage des rongeurs et lagomorphes. Pour répondre à ces objectifs, les travaux pratiques que nous souhaitons réaliser permettent une familiarisation progressive des techniciens avec les rongeurs de laboratoire. Ils sont réalisés en effectif réduit, sous la tutelle d’enseignants qualifiés et expérimentés portant grande attention au bien-être animal. Des enseignements plus théoriques de réglementation et d’éthique, d’éthologie, de physiologie du stress et de la douleur viennent compléter ces connaissances afin que les étudiants soient en mesure d’adapter leur pratique au comportement de l’animal qu’ils manipulent.
Bénéfices attendus
A l’issue de notre formation, il est attendu que les stagiaires se soient familiarisés avec les rongeurs de laboratoire (souris et rats), et qu’ils aient acquis des gestes techniques couramment utilisés en expérimentation animale (préhension/contention, injections, surveillance et soins pendant l'anesthésie). Nous souhaitons avant tout les sensibiliser au bien-être animal et à l’importance de l’éthique en expérimentation animale.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. La première consistera uniquement à de la préhension-contention, et les stagiaires se seront préalablement entraînés sur des mannequins rats. Pour ce faire, chaque animal sera manipulé par un stagiaire quelques minutes, pour familiarisation, puis redéposé dans sa cage. Après un temps de pause, l’animal sera à nouveau manipulé, cette fois dans le but d’acquérir la technique de contention. Cette nouvelle manipulation pourra durer plus longtemps que la première, mais sans toutefois excéder 10 min, dans l’éventualité où le stagiaire éprouverait des difficultés à réaliser le geste correctement dès le premier essai. La seconde intervention impliquera jusqu’à deux types d’injection : sous-cutanée et intra-gastrique. Chaque injection ne sera réalisée que si la contention de l’animal est maîtrisée, et sous supervision par l’enseignant. Seule l’injection sous-cutanée sera obligatoire. Les stagiaires s’entraineront une première fois sur cadavre (lors de la séance de TP anatomie), puis pratiqueront le geste sur l’animal une première fois avec une seringue sans aiguille, avant de réaliser l’injection. L’injection intra-gastrique sera facultative, en fonction des attentes et des besoins de formation des stagiaires. Les stagiaires s’entraîneront préalablement sur des mannequins rats. Dans les deux cas, la réalisation de la procédure (contention suivie de l’injection) ne devra pas dépasser 1 min. Enfin, un nombre très limité d’animaux subira une anesthésie gazeuse, qui constituera la troisième intervention. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par l’enseignant et les stagiaires seront chargés de surveiller l’animal et de tester ses réflexes pendant la narcose (sous la supervision de l’enseignant). L’anesthésie gazeuse ne sera pas maintenue au-delà du temps nécessaire pour que chaque stagiaire puisse réaliser les contrôles, et sera limitée à 20 min maximum. Chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des interventions, à l’exception de la contention dont l’apprentissage pourra nécessiter que certains stagiaires réalisent plusieurs tentatives avant de maîtriser la technique.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures appliquées lors des séances de TP sont de degré de sévérité modéré. Pour chaque procédure, il est prévu que l’enseignant en explique le principe et les étapes, puis qu’il réalise une démonstration avant que les stagiaires s’y exercent, toujours sous sa surveillance. Il n’est donc pas attendu que les animaux souffrent au-delà du stress induit par la manipulation et de la douleur légère liée à une injection. Si un accident venait toutefois à se produire, lors d’une mauvaise manipulation par un stagiaire malhabile et/ou stressé par exemple, l’enseignant veillera au bien-être immédiat de l’animal et les zootechniciens le prendront en charge. Ils surveilleront quotidiennement les animaux à l’animalerie, via l’emploi d’une grille d’évaluation du bien-être, et un traitement antalgique sera administré si besoin.
Devenir
Les procédures réalisées étant de sévérité modérée, les animaux peuvent être réutilisés au sein de ce même projet d'une séance de TP à l'autre (TP préhensions/contention, puis injections, puis anesthésie), après rétablissement complet (délai de quelques jours entre les séances de TP), ou pour d’autres projets se déroulant au sein de notre établissement (TP d'apprentissage de préhension/contention et d’injections, TP de physiologie-pharmacologie), après vérification de leur rétablissement complet si jamais ils avaient présenté des signes de souffrance.
Remplacement
Le recours à la pratique de l’expérimentation animale est nécessaire à la formation des personnes qui appliqueront des procédures expérimentales sur animaux, et conforme à l’agrément de cette formation réglementaire. Il apparaît indispensable que les stagiaires se familiarisent avec les animaux et qu'ils maîtrisent des gestes techniques classiquement utilisés lors de procédures expérimentales. Toutefois, les stagiaires commenceront par s’entraîner aux gestes techniques sur des modèles inertes (cadavres et/ou mannequins), afin de remplacer l’animal au stade le plus critique de l’apprentissage.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est limité au strict nécessaire, à savoir un animal de chacune des deux espèces considérées (c'est-à-dire un rat et une souris) par stagiaire et par séance, afin que les stagiaires soient en mesure de s'entraîner et d'acquérir les gestes techniques dispensés au cours des séances de TP de la formation. Cependant, les mêmes animaux seront réutilisés d'une séance à l'autre, afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. De plus, chaque animal ne sera soumis qu’une seule fois à chacune des procédures (à l’exception de la contention), et le nombre de procédures est très limité (certains actes ne sont abordés que par des vidéos de démonstration).
Raffinement
Le respect du bien-être animal est au cœur de l'approche pédagogique employée pendant les séances de TP, et les encadrants veillent à enseigner les bonnes pratiques pour la réalisation des gestes techniques dans un cadre éthique et réglementaire. Avant de pratiquer les procédures sur les animaux, les stagiaires doivent s’entrainer en répétant les gestes sur des mannequins (contention, injection intra-gastrique) ou des cadavres (injection sous-cutanée). Dans le cadre des injections, ils doivent également réaliser le geste une première fois sans aiguille ou sans sonde, avant de procéder à l’injection. Enfin, dans le cadre de l’anesthésie, le bien-être de l’animal est assuré par l’application d’un gel hydratant sur les yeux et l’utilisation d’un tapis chauffant pour prévenir l’hypothermie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux de laboratoire les plus utilisés. La souris et le rat représentent ainsi les modèles animaux que les stagiaires seront le plus susceptibles de rencontrer dans leurs activités professionnelles. Nous utiliserons des adultes de plus de 6 semaines, plus faciles à manipuler que de jeunes animaux. Pour les rats, nous utiliserons des femelles afin de permettre la réalisation de frottis vaginaux lors de la 3ème séance de TP. Pour les souris, nous utiliserons également des femelles, plus dociles que les mâles.
Evaluation chez le rongeur, de la dose maximale tolérée (MTD) de composés biologiques ou chimiques d’intérêt.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 500
Gerbilles de Mongolie : 200
25 700 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie réutilisée, 20 gerbilles placées et la grande majorité tuée. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques par toutes les voies possibles, jusqu'à des administrations intracérébrales et par minipompe implantée, sur une période pouvant aller jusqu'à un an, pour déterminer la dose maximale tolérée. Le porteur décrit perte de poids, posture voûtée, cyanose et détérioration de l'état général, avec mise à mort dès 20 % de perte de poids ou lorsque 20 % des animaux d'un groupe ont dû être euthanasiés. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire la toxicité réelle et que la vérification chez le rongeur reste nécessaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un composé biologique ou chimique après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale aprés une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer toxicité et la tolérabilité in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 1 an . Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Afin d’évaluer la tolérabilité de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 1 an. Des effets secondaires des traitements (toxicité) pourront être observés et une grille de scoring et des points limites adaptés à l’objectif de l’étude ont été mis en place. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés.. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Les animaux ayant subi une administration unique de produit n’ayant pas présenté d’effets secondaires ou de signes cliniques et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine pourront être gardés en vies sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection pour la première fois d’un composé les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie… Pour certaines administrations intravésicales, il pourra être nécessaire de priver les animaux d’eau au maximum 4h, cela pourra engendrer une sensation de soif. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.
Devenir
Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la toxicité et la tolérabilité seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (toxicité et efficacité cellulaire) afin d’éviter l’administration des composés présentant un mauvais index thérapeutique. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules. La toxicité et la tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal recevra des doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigüe avec différents groupes pour les différentes doses, dans la mesure du possible, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au minimum 24h, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes qui auraient dû recevoir une dose supérieure à celle du premier groupe dans lequel des effets secondaires seront observés. En pratique, si 20% c ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées dans notre centre, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure a été déterminé : 3 à 5 animaux par groupe seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 10 si nécessaire pour obtenir une puissance statistique différente, compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.
Raffinement
Une grille de scoring clinique a été mise en place (voir procédure). Les animaux seront pesés tous les jours dès l’administration de composés. Une perte de poids de plus de 20% constituera un point limite. Dans le contexte de première administration de composé non testé in vivo, les animaux sont scorés toutes les deux heures pendant les 6 premières heures post-administration. Un scoring clinique sera réalisé quotidiennement dès l’administration des composés. Si 20% iou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernaent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie, une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la toxicité/tolérabilité des composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Pour certaines études pré-réglementaires le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Etudes des mécanismes cellulaires et moléculaires de la mémoire associée au contexte de consommation d’alcool et cibler ces mécanismes avec la psilocybine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 802
320 souris et 802 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont entraînés à consommer de l'alcool pendant plusieurs semaines, reçoivent des injections répétées d'alcool, de lithium ou de psilocybine, une partie subissant une chirurgie cérébrale pour implanter des cannules ou injecter un vecteur viral, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un isolement sans enrichissement pour certains animaux. Il affirme que l'addiction est un mécanisme trop complexe pour être remplacé par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle de la mémoire associée au contexte de la consommation d'alcool sur l'efficacité de la psilocybine à réduire la consommation d'alcool. Les objectifs secondaires seront d'étudier l'implication des récepteurs à la sérotonine et à la dopamine dans la réponse à la psilocybine en fonction des différents contextes de consommation d'alcool.
Bénéfices attendus
L'utilisation des psychédéliques dans le traitement de maladies psychiatriques est en plein renouveau depuis une petite dizaine d'années. Notre projet se place dans ce contexte et vise à mieux identifier les cibles moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de l'effet bénéfique de la psilocybine, un psychédélique issue de champignons, sur la réduction de la consommation d'alcool et sur la rechute après une période d'abstinence.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections répétées (x 3) d'alcool ou de chlorure de lithium et une injection supplémentaire de psilocybine. Les rats recevront des injections de psilocybine et certains rats seront soumis à une chirurgie (30 minutes environ) visant soit à injecter un vecteur viral directement dans les structures cérébrales ciblées, soit à implanter des cannules d'enregistrement de l'activité dopaminergique. Les animaux seront également entrainés à consommer de l'alcool volontairement sur une période de 8 semaines à 4 mois.
Impact sur les animaux
Au cours des différentes expériences, les animaux ne subiront que des nuisances légères (injections uniques) ou modérées de courte durée (injections répétées - douleurs post-chirurgicales de palier 1-2). Les animaux consommeront volontairement de l'alcool pendant plusieurs semaines, certains animaux seront intégrés dans un protocole chirurgical visant à injecter un vecteur viral dans différentes structures du cerveau (durée de la nuisance: 3-4 jours). Les rats recevront 4 injections (3 de solution saline et une de psilocybine) au total. Les souris recevront entre 7 et 12 injections au cours des expériences de conditionnement de place. Dans certaines procédures, les animaux seront isolés et stabulés sans enrichissement du milieu. Ce manque d'enrichissement du milieu sera contrebalancé par des manipulations régulières voire quotidienne pour la majorité des animaux et par l'exposition à des contextes environnementaux différents aux cours des procédures fournissant ainsi un enricissement cognitif et psychomoteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience. En effet, nous aurons besoin de récupérer les cerveaux pour effectuer des vérifications histologiques des sites d'injections et d'implantation, ou nous effectuerons des études de biochimie et de biologie moléculaire sur les tissus collectés.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Nous utiliserons une échelle de suivi du bien-être animl par espèce. Ces 2 échelles sont mondialement reconnues pour être suffisament prédictive de tout mal-être/douleur ou souffrance perçue par l'animal. En fonction des scores obtenus à ces échelles nous apporterons une réponse antalgique adaptée (dose croissante d'antalgique en fonction du score observé) et dose modérée immédiate pour les périodes post-opératoires chez le rat. Les animaux seront stabulés à plusieurs (sauf période transitoire de mesure de la consommation d'alcool individuelle pour certains rats), ils seront manipulés quotidiennement (enrichissement inter-espèces) et différents contextes environnementaux (texture du sol, décoration des murs, appuis sur des leviers conduisant à l'apparition de stimuli visuels et sonores) leur seront présentés (enrichissement environnemental).
Choix des espèces
Le rat est actuellement le modèle animal le plus couramment utilisé dans les études utilisant le paradigme de l'auto-administration opérante. Néanmoins, pour les études de préférence de place conditionné, le rat n'est pas le modèle idéal. En effet le rat ne développe pas de préférence de place conditionnée pour l'alcool. Donc pour les quelques expériences utilisant ce paradigme spécifique nous utiliserons la souris et plus précisemment la souche DBA /2J qui est connue pour présenter un comportement de préférence de place pour l'alcool supérieur à celui d'autres souches commes les C57Bl/6J ou encore les Swiss. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.
Role des ganglions de la base dans l’acte moteur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent jusqu'à deux chirurgies cérébrales, l'une pouvant durer quatre heures, puis des manipulations optogénétiques, des enregistrements électrophysiologiques et des injections intracérébrales, sous restriction d'eau et récompensés au sucrose pour apprendre à appuyer sur un levier à un signal sonore. Une partie subit une induction de la maladie de Parkinson, avec réduction de l'activité motrice et comportement de rotation. Le porteur revendique le rat comme "espèce de choix" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire la complexité des ganglions de la base.
Objectifs
La mise en œuvre de ces protocoles expérimentaux vise la compréhension et l’identification des activités neuronales impliquées au cours de l’exécution d’un mouvement volontaire chez des rats en situations physiologique ou lors de maladies motrices graves comme la maladie de Parkinson et une des complications motrices associées telle que les dyskinésies levodopa induite. Pour ce projet, nous utiliserons soit des rats de souche sauvage (Long Evans, ou GAERS) ou modifiés génétiquement (11 lignées différentes de rats transgéniques). Les objectifs principaux de ces protocoles sont l'identification et la manipulation de large ensembles et circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs. Pour réaliser ces objectifs, nous utilisons des approches technologiques de pointes chez l'animal combinant manipulations optogénétiques, enregistrements électrophysiologiques, et manipulations pharmacologiques (par injection intracérébrale). La tâche comportementale que nous avons mis au point consiste à entrainés des rats à effectuer un mouvement d’appuie sur un levier avec leur patte avant en réponse à un stimulus sonore ‘Go !’. L’accès à l’eau sera rationalisé pour ces animaux (restriction hydrique) et pour chaque essai réussi, ils recevront une dose de 40μL de solution de sucrose à 5%. Les expériences optogénétiques, d’enregistrement électrophysiologiques, et de manipulations pharmacologiques commenceront après apprentissage de la tâche chez des animaux normaux ou après induction de la maladie de Parkinson. Les effets de nos manipulations optogénétiques/pharmacologiques seront évalués sur les niveaux de performance moteurs liés à notre tâche et sur l’activité électrophysiologique enregistré en parallèle.
Bénéfices attendus
Ce projet original permettra d’amener des connaissances nouvelles et fondamentales sur le mode de fonctionnement normal et pathologique des ganglions de la base. Il permettra de définir les circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs et ainsi de mieux comprendre le mode d’action de stratégies thérapeutiques utilisées quotidiennement en clinique.
Procédures
Nos procédures expérimentales comportent aux maximum deux chirurgies, la première aura une durée maximale de 4 heures, la deuxième sera inférieure à 1 heure. Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux enregistrements électrophysiologiques. 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. 4/ des effets indésirables moteurs unilatéraux inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson (réduction de l'activité locomotrice et comportement rotatoire).
Devenir
Toutes les procédures sont terminales car les cerveaux des animaux seront prélevés pour analyse immunohistochimique.
Remplacement
Le but de se projet est de comprendre la physiologie et physiopathologie du réseau des ganglions de la base dans le contrôle de la motrivité volontaire. La seule manière d'atteindre nos objectifs est d'utiliser des approches in vivo mises en place chez l'animal se comportant ce qui nécessite donc le recours à l'utilisation d'animaux. A l'heure actuel, aucun modèle "in vitro" ou "in silico" ne peuvent reproduire la complexité et le mode de fonctionnement des ganglions de la base.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux et ont à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. Lors de la partie comportementale, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur pour diminuer leur niveau de stress lors des tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après chirurgie, et accrue dès qu’un signe d’appel est constaté. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances prolongées aux animaux avec des mesures de soulagement mis en place (réhydratation, réchauffement, et traitements vétérinaires si nécessaire).
Choix des espèces
Le rat est une espèces de choix car l’organisation des ganglions de base est inchangée au cours de l'évolution ce qui nous permet d'extrapoler les résultats que nous observerons à l'espèce humaine et donc de mieux comprendre le rôle de ces circuits dans certains troubles moteurs comme la maladie de Parkinson. Les rats sont des sujets de choix (par rapport au souris) pour toutes les expériences de comportements car ils sont moins sujet au stress et peuvent apprendre des tâches motrices plus complexes. La disponibilité et l'utilisation de rats transgéniques représente un outil précieux pour nos expériences d'optogénétique car elles permettent de manipuler de manière sélective des populations neuronales cibles. Dans ce projet nous utiliserons des rats génétiquement modifiés de type afin de manipuler différentes populations neuronales des ganglions de la bases. Le projet sera réalisé sur des rats agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des sites d’injection