Rats
Etudes courtes d’évaluation de la toxicité aiguë chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1500
4 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent par gavage une dose unique d'un produit dont la toxicité est inconnue, puis des prélèvements sanguins, pour classer les substances selon leur toxicité aiguë. Le porteur reconnaît des effets pouvant aller de l'hypersalivation aux tremblements, à la prostration et aux convulsions imposant la mise à mort. Il présente les modèles in silico et in vitro comme complémentaires, mais qualifie l'animal d'"incontournable" pour évaluer un produit sur un "organisme entier".
Objectifs
Ces premières études courtes d’évaluation de la toxicité aiguë in vivo permettent de confirmer la toxicité éventuelle du produit et d’éliminer du processus de développement des produits dont la toxicité est trop élevée et que les données provenant d’essais in vitro ou in silico n’auraient pas révélées. La toxicité aiguë désigne des effets nocifs résultant de l’administration d'une seule dose d'un produit ou d'une seule exposition à celui-ci. On évite ainsi d’utiliser des animaux de laboratoire pour des produits dont le développement ne pourrait arriver à son terme. Les études d’évaluation de la toxicité aiguë par voie orale chez la souris ou chez le rat : Acute Rat or Mouse Oral Screen (AROS or AMOS) ont pour objectifs de tester une dose de référence établie sur la base de la connaissance des produits déjà développés et de la famille chimique testée.
Bénéfices attendus
Les données générées permettent de caractériser le potentiel toxique d’un produit suite à une administration unique et ainsi de différencier et classer les produits en fonction de leur toxicité après une exposition aiguë (risque accidentel). Ceci permet d'éliminer, très rapidement et en utilisant peu d'animaux du processus de développement, des produits trop toxiques, d'éviter des études plus longues et donc l'utilisation d'un plus grand nombre d'animaux. Ces études sont nécessaires pour permettre le transport du produit testé vers d’autres installations d’essai en conformité avec la réglementation et garantir la sécurité des utilisateurs.
Procédures
Les animaux vigiles seront exposés oralement par gavage aux produits par une administration unique. Cette procédure est réalisée en moins de 15 secondes. Des prélèvements sanguins, de volumes très faibles pourront être pratiqués sans anesthésie au cours de l'étude. Chaque prélèvement prend moins de 2 minutes et sera réalisé au maximum 3 fois au cours de l'étude.
Impact sur les animaux
Les effets toxiques attendus sur ce projet peuvent être sévères car ce sont les premières études réalisées sur l'animal. Les signes cliniques les plus communs sont des augmentations de salivation, les signes cliniques les plus sévères qui nécessitent l'euthanasie de l'animal sont des baisses de température corporelle, des tremblements, de la prostration ou des convulsions. Les produits sont administrés une fois par gavage à l'aide de sondes souples (procédure qui peut induire un stress inférieur à 15 sec). En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits à la veine caudale ou saphène. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes, qui disparaissent rapidement. Avant traitement, les rats sont soumis à un jeûne de 20h maximum pouvant engendrer une perte de poids inférieure à 10% du poids corporel et réversible après la réintroduction de la nourriture.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort en fin d'étude. La réutilisation de ces animaux n'est pas possible car les effets induits par l'administration de substances chimiques pourraient affecter les résultats de toute étude ultérieure.
Remplacement
Pour évaluer la sécurité des produits chimiques sur la santé humaine, des études combinant des modélisations mathématiques par ordinateurs (études in silico) ainsi que des modèles cellulaires (tests in vitro) sont réalisées. Des modèles animaux (études in vivo) sont cependant incontournables pour appréhender les effets d’un produit chimique sur un organisme entier.
Réduction
La taille des groupes est réduite au minimum pour permettre une évaluation de la toxicité : 3 animaux par groupe, un seul sexe et pas de groupe témoin.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu pour leur bien-être. Les procédures (surveillance clinique, administration des substances chimiques, l'anesthésie, les prélèvements...) seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté pour éviter le stress et l'inconfort inutiles. Les animaux sont observés quotidiennement y compris le week-end, avec une attention plus particulière le jour du traitement. Des points limites appropriés et validés par le Comité d'éthique et la SBEA ont été mis en place, ainsi qu'un arbre décisionnel et de critères d'arrêt de souffrance. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la SBEA sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées : la dose maximale utilisée est en général 300 mg/kg. On utilise donc des doses inférieures aux doses limites préconisées dans les lignes directrices pour le calcul de la toxicité aiguë (Dose létale 50%). En fonction de la toxicité connue d'une famille, une dose inferieure sera testée en première intention et le choix de la 2eme dose dépendra des signes observés.
Choix des espèces
Ces études sont réalisées chez le rongeur car ce sont les modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur utilisation fréquente dans les études toxicologiques et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les études décrites dans ce projet utilisent de jeunes rongeurs adultes à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines, conformément aux études constitutives du dossier de mise sur le marché des produits.
Elaboration d’un modèle rongeur porteur d’un microbiote humain permettant de tester des stratégies nutritionnelles individualisées sur des pathologies liées au vieillissement
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dix étant proposés à l'adoption et les autres tués à l'issue pour prélèvements. Ils reçoivent un microbiote humain, un traitement au polyéthylène glycol qui provoque une forte diarrhée, puis de nombreux gavages et prélèvements sanguins, avec un hébergement individuel. Le porteur décrit une perte de poids et des troubles du comportement à surveiller, dont l'agressivité, l'arrachage de poils et l'automutilation. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit l'interaction entre microbiote et hôte et retient le rat comme modèle établi.
Objectifs
La proportion des personnes âgées (60 ans et +) représentera un tiers de la population française à l’horizon 2050. Cette population est très hétérogène et se caractérise, pour les extrêmes, par des individus en bonne santé, actifs, en bon état nutritionnel et vivant en général chez eux et par des individus dépendants, vivant parfois en institution et en état de sous-nutrition chronique (population fragile). Le déclin progressif des fonctions physiologiques et cognitives avec l’âge entraine cet état de fragilité qui favorise l’apparition de pathologies. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant dans l’intestin. Des études chez l’homme ont montré que la composition et les fonctions du microbiote intestinal jouent un rôle central dans de nombreuses pathologies. Des déséquilibres de la biodiversité du microbiote intestinal (dysbiose) apparaissent d’autant plus marqués que les sujets sont dans un état de santé fragile. Une corrélation étroite existe, chez les personnes âgées, entre état de santé et profil de microbiote. Des études de transfert de microbiote de rongeurs ont clairement identifié que ces dysbioses liées à l’âge peuvent jouer un rôle décisif vis-à-vis de pathologies ou complications liées au vieillissement : ainsi, il a été montré que le transfert d’un microbiote issu de souris âgées à des souris axéniques (sans microbiote) s’accompagne, chez les souris receveuses, de modifications mimant des caractéristiques métaboliques et immunitaires d’un organisme âgé. De nombreuses stratégies nutritionnelles ou pharmacologiques sont encouragées pour lutter contre ou ralentir le déclin physiologique au sens large lié à l’âge. Du fait de ces altérations du microbiote, des stratégies innovantes le prenant en compte doivent être maintenant considérées, nécessitant notamment des modèles animaux expérimentaux. Les rongeurs sont les modèles précliniques principaux, ainsi, notre projet consiste à développer et valider un modèle de rats à microbiote humain permettant ainsi d’étudier l’effet d’une dysbiose sur l’apparition de la fragilité liée à l’âge (pathologie et état de sous nutrition chronique). Nous allons implanter un microbiote de personnes âgées saines ou fragiles à des rats puis nous comparerons l’effet de cette transplantation sur la physiologie de l’hôte par rapport à des rats implantés avec un microbiote d’adulte jeune sain. Nous développerons ainsi un modèle préclinique original
Bénéfices attendus
La composition du microbiote, plus que l’âge, pourrait être un déterminant important d’un vieillissement sans pathologie. Des études se sont intéressées à des transferts de microbiote depuis des individus âgés vers des animaux sans microbiote et cela a permis de montrer l’apparition d’une partie du phénotype âgé, tel que l’inflammation de bas grade observée au cours du vieillissement ou de certains phénotypes associés au vieillissement. L’originalité de notre étude est que l’on s’intéresse aux différences majeures existant au sein des sujets âgés : c’est-à-dire comparer un microbiote de jeune avec un microbiote d’âgé en santé et un microbiote d’âgé présentant un syndrome de fragilité. Ce type d’étude qui s’intéresse à la diversité de phénotype et de microbiote n’a encore jamais été faite. Nous avons au préalable mené une étude clinique au cours de laquelle la fragilité d’individus âgés a été évaluée selon différents critères (questionnaires de dépendance, alimentaires, tests physiques et cognitifs). Au sein de cette population âgée nous avons pu déterminer quels étaient les plus représentatifs de la population âgée saine et de la population âgée fragile. Leur microbiote intestinal a été analysé quantitativement et qualitativement. En implantant à des rats le microbiote intestinal d’humains âgés en bonne santé ou en fragilité, nous souhaitons appréhender le lien causal des dérèglements du microbiote humain et des dérégulations métaboliques associées à la fragilité liée à l’âge. La mise en place d’un tel modèle est aujourd’hui indispensable pour prendre en compte de façon objective le microbiote dans les stratégies de prise en charge préventive de la fragilité des séniors. Ceci n’a, à notre connaissance, jamais été fait malgré la demande des partenaires socio-économiques. Nous aurons ici des échantillons d’origine clinique bien caractérisés qui seront transplantés aux animaux, participant ainsi à la validation du modèle. Le développement de ce modèle de rongeur, s’il permet de mettre en place une fragilité chez le rongeur âgé, nous permettra ensuite de tester des stratégies nutritionnelles innovantes et personnalisées ciblant spécifiquement les dérèglements du microbiote. Ces stratégies développées et testées chez les rongeurs permettront ensuite le développement de solutions de types probiotiques, prébiotiques ou symbiotiques à destination des séniors dans un but de préservation de leur autonomie.
Procédures
→Pour un premier groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang pour un test de tolérance au glucose. - 1 gavage d’une solution de glucose. - Chaque manipulation sera sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes. →Pour un second groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang dans pour l’étude de la perméabilité intestinale. - 1 gavage d’une molécule fluorescente destinée à mesurer la perméabilité intestinale. - Chaque manipulation sera sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes. → Pour un troisième groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang à la fin de l’étude. - 5 prélèvements de fèces au cours de la procédure. - 13 gavages au cours de la procédure - Chaque manipulation sera faite sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes pour les gavages et prélèvement de sang et 5 minutes pour les prélèvements de fèces. - Anesthésie générale gazeuse de tous les animaux par isoflurane à la fin de la procédure. - Injection unique d’analgésique à tous les animaux en fin de procédure. - 1 prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie. Tous les animaux sont concernés et cela durera 5 à 10 minutes maximum.
Impact sur les animaux
L’aspect le plus dommageable de ce protocole réside principalement dans le traitement au polyéthylène glycol, destiné à diminuer le microbiote, qui peut entrainer un inconfort lors des gavages. Suite au traitement, les rats développeront une forte diarrhée sur 1 à 2 jours et peuvent subir une légère perte de poids. De plus, les prises de sang peuvent s’accompagner de douleur et de stress. Dans le cadre de ce projet, aucune mortalité consécutive au traitement n’est attendue. Des nuisances peuvent aussi survenir lors de l’isolement des animaux. Des changements au niveau de leur comportement seront à surveiller (absence toilettage, hypoactivité, agressivité, trychophaghie, maigreur, hypo-réactivité, comportement de fuite, automutilation). Nous n’avons actuellement pas de recul sur les effets indésirables liés à la transplantation de matières fécales de personne âgée fragiles sur des rats. Les individus donneurs n’étaient pas porteurs de pathologie transmissible. Nous pouvons imaginer que les conséquences sur le rat se limiteront à une diminution de l’efficience des métabolismes protéique et énergétique et à la mise en place d’une inflammation chronique de bas grade.
Devenir
Dix animaux seront gardés en vie et placés à l'adoption. Les autres animaux seront mis à mort pour prélèvements sanguins nécessaires à la caractérisation de leur état physiologique.
Remplacement
La présente étude vise à comprendre les mécanismes complexes d’interaction entre le microbiote intestinal et l’hôte, son implantation chez le modèle rongeur et l’impact de différents microbiotes sur le métabolisme et l’immunité des animaux au niveau corporel d’une part et au niveau de tissus et organes spécifiques d’autre part. Ainsi, aucune méthode in vitro n’existe à ce jour permettant d’évaluer l’impact de ces microbiotes variés sur le métabolisme et l’immunité des rongeurs. Les mécanismes sous-jacents étant par ailleurs non entièrement élucidés, et l’interaction microbiote-hôte, dans le cadre du vieillissement, peu étudiée, il est difficile de pouvoir identifier des cibles prioritaires et donc un modèle in vitro fiable pour caractériser les interactions hôte-microbiote.
Réduction
Nous avons raisonné le nombre d’animaux selon une étude statistique permettant à la fois de mettre en évidence les potentiels effets des transferts de microbiote tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. La mesure de la masse musculaire, des activités enzymatiques, des paramètres biochimiques (insuline et glucose en particulier) et de l’expression de gènes dans divers tissus représentent une part importante des analyses que nous allons réaliser. Cette analyse détermine que 15 animaux minimum sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre les lots en prévoyant une possible perte de quelques animaux au cours de leur vieillissement. Par ailleurs, l’espérance de vie de cette souche de rat étant de 24 mois, nous ne pouvons pas exclure que quelques animaux puissent mourir naturellement durant notre protocole expérimental. En effet, nous achetons les rats à 12-13 mois et les faisons « vieillir » jusqu’à 18 mois dans nos installations pour des raisons de disponibilité auprès des fournisseurs et pour éviter le transport d’animaux âgés (plus sensibles à ce type de stress) et afin qu’ils s’adaptent au mieux à nos locaux avant l’étude. Les échantillons obtenus sur les animaux seront mutualisés entre plusieurs laboratoires. L’objectif est d’avoir une vue la plus complète possible du transfert du microbiote sur un panel le plus large possible de paramètres physiologiques, métaboliques et immunitaires des rats. Par ailleurs, des animaux « tests » seront utilisés au début de l’étude pour permettre un transfert de compétences entre 2 partenaires (notamment la réalisation des tests de tolérance au glucose) et éviter ainsi la duplication de l’étude.
Raffinement
Trois semaines avant la procédure, les animaux passeront de deux à un par cage car un suivi quotidien de leur consommation alimentaire individuelle est nécessaire. Nous avons besoin de faire un pair-feeding (PF). Les rats PF recevront une ration inférieure à leur ingéré spontané : à plusieurs par cage, le dominant mangera plus et laissera les restes aux autres. Aussi, la baisse de consommation d’un animal nous alerte rapidement sur son état de santé/stress. Les cages seront conformes à la réglementation (1800 cm3), transparentes placées côte à côte afin qu’ils puissent se voir, s’entendre et se sentir et nous inclurons des enrichissements (bâtons à ronger, matériel pour la nidification, maisons). Les animaux seront pesés tous les jours et seront observés 7j/7 par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite, l’animalier alertera les responsables de l’étude qui observeront l’animal et renseigneront le tableau des points limites. Si 3 points notables (réversibles) ou 1 point grave (irréversible) sont observés, selon les symptômes et l’arbre décisionnel, il pourra être apporté à l'animal des soins (nettoyage de plaie, prise d’antalgique, d’anti-inflammatoire). Si blessures, souffrance et stress ne peuvent être soulagés, l’animal sera euthanasié par inhalation de CO2. Les sondes de gavages sont fines (diamètre externe de 2,5 millimètres), à bords arrondis et adaptées (8cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. De plus, les animaux seront entrainés aux manipulations pour réduire le stress et améliorer le bien-être. Pour les gavages, ils seront habitués à être maintenus en contention et à voir une seringue arriver au niveau de leur bouche. Aussi, la sonde leur sera présentée plusieurs fois avant utilisation. Suite au traitement PEG, les animaux auront une forte diarrhée, une surveillance accrue sera mise en place durant les 2 jours suivant le traitement. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution saline sera réalisée. Pour les prélèvements de sang dans la veine caudale, un anesthésique local, la lidocaïne, sera utilisé pour anesthésier la zone de piqure. Les prélèvements seront réalisés par un manipulateur formé et expérimenté. Les animaux seront habitués à être maintenus en contention et à être manipulés afin de réduire le stress. Pour le prélèvement de sang terminal, les animaux recevront un traitement analgésique par injection sous-cutanée puis seront anesthésiés par voie gazeuse.
Choix des espèces
La présente étude vise à montrer l’impact d’un microbiote humain de jeune adulte, d’adulte âgé en bonne santé ou d’adulte âgé fragile, sur le métabolisme et l’immunité du receveur, le rat. Dans ce domaine, de nombreuses études ont prouvé l’intérêt de ce modèle rat pour appréhender le rôle causal du microbiote dans le développement de pathologies chroniques chez l’humain (ex : diabète, obésité). Le rongeur est ainsi le modèle animal le plus utilisé pour tester l’effet global d’un transfert de microbiote sur le métabolisme corporel et tissulaire. Le rat WISTAR est une lignée non consanguine polyvalente utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale et biologique. Sa longévité ainsi que sa pathologie tumorale en font un modèle de choix pour les études à long terme, notamment pour les études de vieillissement. C’est un rat albinos de manipulation aisée et réceptif aux entrainements aux manipulations. Par ailleurs, la lignée de rat Wistar a été utilisée dans de nombreux travaux des participants au projet présenté dans la saisine, dans le cadre d’études sur le vieillissement et les métabolismes impactés. L’étude concerne le vieillissement. Les animaux que nous utiliserons, au moment de l’expérimentation, seront donc des animaux âgés de 18 mois minimum ce qui correspond à 60 ans en age humain chez cette lignée, âge à partir duquel on considère qu’une personne est âgée selon l’OMS. Les rats seront achetés à 13-14 mois et nous les laissons « vieillir » dans nos installations pour des raisons de disponibilité auprès des fournisseurs, d’évitement d’un transport d’animaux âgés (plus sensibles à ce type de stress) et afin qu’ils s’adaptent au mieux à nos locaux avant l’étude.
Évaluation, dans un modèle de rat et chez le macaque, de l’efficacité et de la toxicité d’une stratégie de thérapie génique pour traiter la maladie de Stargardt.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Macaques à longue queue : 6
Les 70 rats de ce projet portent un gène ABCA4 non fonctionnel, une lignée de la maladie de Stargardt, et les 6 macaques à longue queue, des primates, sont sains. Ces 76 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Outre une injection de vecteurs viraux sous la rétine des deux yeux, chaque macaque peut subir en six mois jusqu'à 15 séances d'imagerie sous anesthésie, avec prise de sang, et jusqu'à 8 tests de la fonction rétinienne, eux aussi sous anesthésie, et le porteur indique que ces anesthésies répétées peuvent stresser rats et macaques. Il affirme qu'une toxicité immunitaire liée aux intéines ne peut être mise en évidence chez les rongeurs, et qu'il est donc "nécessaire de passer au modèle macaque". Tous sont tués pour prélever sang, yeux, foie, rate, nerf optique et cerveau.
Objectifs
La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs les vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.
Procédures
(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 4 animaux injectés avec le vecteur, et n=2 animaux injectés avec un tampon, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voir de décider d'une mise à mort prématurés.
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.
Astrocytes et vieillissement cognitif : étude de l’implication des astrocytes dans la régulation de l’état fonctionnel des neurones formés à l’âge adulte au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Après une craniotomie pour injecter un virus dans l'hippocampe, des rats sont placés dans une piscine où ils doivent trouver une plateforme immergée, à raison de quatre essais de 90 secondes au plus par jour pendant six jours. 1 360 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés pour certains jusqu'à 18 mois, puis tous tués à l'issue, sous anesthésie profonde suivie d'une perfusion intracardiaque, pour le prélèvement de leur cerveau. L'équipe cherche à savoir si les astrocytes aident les neurones formés à l'âge adulte à s'intégrer dans l'hippocampe, et si cela distingue les rats qui gardent leur mémoire en vieillissant de ceux qui la perdent. Le porteur exclut de l'étude les rats âgés qui développent arthrite, tumeurs, cécité ou cataracte, sans dire ce qu'il advient d'eux.
Objectifs
Au cours du vieillissement, certains individus voient leur mémoire décliner beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients qui conservent de bonnes capacités mnésiques. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. L’hippocampe est une structure cérébrale jouant un rôle clé dans les mécanismes de mémoire, qui reposent en partie sur la génération de nouveaux neurones tout au long de la vie, processus appelé neurogenèse adulte. Un des mécanismes permettant d’expliquer les différences inter-individuelles de mémoire au cours du vieillissement serait la capacité de ces nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer (individus résilients) ou pas (individus vulnérables) dans le réseau de l’hippocampe. Il est important de noter que les astrocytes, aussi appelés cellules gliales, sont des partenaires actifs des neurones, notamment au cours des processus de mémoire. En effet, les astrocytes sont capables de détecter l’activité neuronale et d’y répondre en libérant des messagers chimiques. Nous proposons d’identifier si la libération de ces messagers est importante pour l’intégration des nouveaux neurones dans le réseau de l’hippocampe et donc le maintien des capacités mnésiques au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences inter-individuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d'Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 7 : • Injections intra-hippocampiques : Les animaux seront sous anesthésie gaseuse durant toute la chirurgie (soit environ 1h par animal). Elle consiste en une incision de la peau au niveau du crâne, suivie d’une craniotomie permettant la descente d’une canule d’injection au niveau de l’hippocampe gauche, de l’injection de virus, et enfin de la suture de la peau. La totalité des animaux seront concernés par ces chirurgies. • Injections sous-cutanées d’un marqueur de prolifération cellulaire : Ces injections seront réalisées sur animal vigile. Les animaux recevront au total 4 injections sur 4 jours consécutifs. 400 animaux seront concernés. • Labyrinthe aquatique : Au cours de ce test, les rats nagent dans une piscine et doivent apprendre à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Lors de la phase d’habituation, ils passeront deux fois 60s dans la piscine sans la plateforme. Ensuite, lors de la phase l’apprentissage, les animaux seront soumis chaque jour à 4 essais consécutifs, pendant 6 jours. Pour chaque essai, les animaux passeront au maximum 90s dans l’eau (i.e temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s soit 6min). Au fil des jours, les animaux apprennent à localiser la plateforme et le temps passé dans l’eau diminue. Tous les animaux seront concernés, à l’exception des groupes contrôles (74 animaux), soit un total de 1286 animaux. • Anesthésie pour perfusion de fixateur ou de liquide cérébro-spinal artificiel : Avant de réaliser les perfusions intracardiaques, les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale unique d’un mélange d’anesthésique/euthanasiant (400 animaux, Procédure 1) ou d’un mélange d’analgésique/anesthésique (960 animaux, Procédure 2). • Perfusions intra-cardiaques de fixateur ou de liquide cérébro-spinal artificiel : Après obtention d’une anesthésie profonde, une perfusion intra-cardiaque de fixateur (400 animaux, Procédure 1) ou de liquide cérébro-spinal artificiel (960 animaux, Procédure 2) sera réalisée.
Impact sur les animaux
Comme lors de tout projet incluant des injections et des chirurgies stéréotaxiques, il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adpatées. En effet, même si cela est relativement rare, il se peut que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales s’infectent. De même dans les 2 jours suivant la chirurgie, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie). C’est pourquoi les animaux seront suivis quotidiennement au cours des 3 jours suivant ces actes afin de s’assurer de leur bien être. Au cours de ce suivi, l’expérimentateur en charge du projet remplit une fiche de suivi du bien-être animal avec une grille de score.
Devenir
Toutes les parties du projet nécessitent le prélèvement du cerveau des animaux afin de réaliser des analyses à l’échelle cellulaire. Les animaux seront de ce fait mis à mort à l’issue de chaque expérience pour réaliser ce prélèvement.
Remplacement
Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’interaction entre astrocytes et nouveaux neurones de l'hippocampe, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents de l’équipe, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales, des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus de l’étude), ainsi que du nombre minimum d’animaux nécessaires à l’observation de différences inter-individuelles au niveau comportemental (test d’apprentissage spatial) qui constituent l’objet de notre étude. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocément que prévu
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies (nids de fibres de peupliers compressées) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité, réactivité, aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. 10 à 30 min avant la chirurgie, un antalgique sera administré à l’animal afin de prévenir la douleur per-opératoire. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si besoin, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Nous utilisons des grilles d’évaluation permettant de scorer (0 à 15) de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera mis à mort par inhalation de gaz carbonique.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la neurogenèse adulte est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’homme. Enfin, cette étude vient compléter les investigations déjà menées sur cette espèce par notre équipe, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante pour contrôler les résultats. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intra-cérébrales. Ensuite, les différentes études seront réalisées 1 à 15 mois après les chirurgies. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : un groupe début de vie adulte (rats de 4 mois), deux groupes milieu de vie (rats de 8 et 12 mois) et un groupe fin de vie (rats de 18 mois). Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale de l’interaction entre astrocytes et néo-neurones en comparant les animaux âgés à des animaux plus jeunes.
Formation opérateurs pour évaluation cardiovasculaire sur échographe petit animal Vevo 3100
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 50
100 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis proposés à d'autres protocoles ou tués faute de réutilisation. Ils sont anesthésiés au gaz pour subir jusqu'à dix échographies chacun, non pour la recherche mais pour entraîner les opérateurs d'une plateforme à manipuler un nouvel échographe. Le porteur indique qu'aucune douleur n'est attendue, les examens ayant lieu sous anesthésie. Il affirme que ni simulateur ni modèle ne reproduit l'anatomie du petit animal et compte constituer une base d'images de référence pour de futurs protocoles.
Objectifs
L’échographie est une technique non invasive de choix afin de mesurer les dimensions d’organes ou de flux circulatoires sans sacrifier l’animal et ainsi de mesurer l’évolution d’une pathologie au cours du temps. L’acquisition récente du système Vevo 3100 de VisualSonics avec ses sondes hautes fréquences dédiées au rat et à la souris va permettre l’acquisition d’images de haute qualité permettant la visualisation des structures cardiaques et vasculaires en mode B (images anatomiques bidimensionnelles). Les volumes du cœur pendant sa contraction (diastole / systole) et de son ventricule gauche peuvent être calculés à partir d’algorithmes utilisant des repères reportés sur les images de l’organe acquises en mode TM (temps mouvement). Le mode TM et le mode Doppler Couleur temps réel peuvent aussi être utilisés pour mesurer diverses constantes qui évaluent le bon fonctionnement du myocarde. Il est enfin possible d’explorer les gros vaisseaux pour notamment caractériser les défauts au niveau de l’aorte (anévrisme, plaque d’athérome), mais aussi de la crosse aortique et de la carotide. Le but du projet est de former du personnel et des étudiants en vue de pouvoir acquérir des images en échographie correctes, ceci de façon à pouvoir évaluer les paramètres cardiovasculaires, cités ci-dessus, qui nous intéressent dans la routine du laboratoire et de pouvoir prospecter ensuite de nouveaux paramètres innovants. Une formation adaptée permettra d’obtenir des opérateurs fiables qui seront directement opérationnels sur les projets qui seront déposés par la suite nécessitant l’utilisation de l’échographe. L’entrainement des opérateurs se fera sur des souris ou des rats ne présentant pas de pathologies et permettra d’aboutir à une expertise dans le maniement de l’échographe, mais aussi, d’avoir une base de données sur animaux sains qui pourra servir à des fins d’apprentissage. Mais surtout, l’opérateur sera en capacité de mieux identifier les défauts d’animaux pathologiques et ce faisant de permettre une éventuelle réduction du nombre d’animaux dans les projets de recherche à venir.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer les compétences quant à l’utilisation de l’échographe petit animal Vevo 3100 présent sur la plateforme d'animalerie. Les données récoltées lors de ces entraînements permettront de réaliser une base de données d’animaux sains pour faciliter les comparaisons dans de futurs protocoles. La maîtrise des gestes facilitera les prochaines expérimentations et améliorera la fiabilité des résultats.
Procédures
Pour réaliser l’acquisition d’images par échographie, les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse. Les rats ou souris effectueront jusqu’à 10 échographies par animal. Ces échographies seront espacées au minimum à une semaine d’intervalle. La durée d'une échographie n'excédera pas 2h. Aucun geste invasif ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
L’échographie se faisant sous anesthésie gazeuse, aucune douleur n’est attendue. Afin d’éviter une contention physique, les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse avant d’être positionnés sur la plateforme d’échographie et ainsi d’éviter tout stress et de générer les meilleures acquisitions vidéos possibles.
Devenir
A la fin de la formation, les animaux seront proposés aux autres utilisateurs de la plateforme. Ils pourront être proposés pour des TP ou des prélèvements d'organes. A défaut d'une utlisation secondaire, ils seront euthanasiés.
Remplacement
Le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle à l’heure actuelle. En effet, lors de l’exploration échographique d’un petit animal (souris / rats), les structures anatomiques, la topologie des organes internes ainsi que leur fonctionnement ne peut-être reproduit ou simulé. Au cours du projet, nous allons acquérir une méthodologie, des paramètres d’acquisition et de nombreuses images et vidéos qui pourront servir de référence dans le cadre de l’apprentissage de nouveaux opérateurs.
Réduction
Nous indiquons l’utilisation d’un certain nombre d’animaux pour réaliser ce projet. Malgré tout, ce nombre est un nombre maximum et le nombre sera certainement moindre à la fin du projet selon le nombre d’opérateurs formés. Le nombre nécessaire et suffisant ne peut pas être précisément calculé pour le moment puisqu’il dépendra fortement des projets mis en place, des étudiants à former dans les 5 années à suivre et du nombre de sessions nécessaires afin de former efficacement un opérateur. Nous n’avons pas encore le recul nécessaire afin d’établir une rêgle de calcul précise. Nous proposons d’utiliser au maximum 50 souris et 50 rats au cours de ces 5 ans. Ce nombre ne sera pas bloquant en cas de fortes demande de formation d’opérateurs et le nombre de souris utilisées réellement sera certainement moindre. Nous proposons d’utiliser essentiellement les animaux surnuméraires issus de nos élevages ou une utilisation d’animaux non impliqués dans d'autres protocoles. L’achat d’animaux chez un fournisseur sera la dernière option envisagée.
Raffinement
Tous les animaux inclus dans ce projet sont hébergés en groupe dans un environnement avec un enrichissement optimal (tube, dôme, roue, frisettes, bâtons à ronger éventuellement, etc…) afin d’éviter angoisse ou stress. Afin d’éviter une contention physique, les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse avant d’être positionnés sur la plateforme d’échographie et ainsi d’éviter tout stress et de générer les meilleures acquisitions vidéos possibles. Les constantes (température, rythmes cardiaque et respiratoire,…) de l’animal seront surveillées au cours de l’acquisition et adaptées au besoin. L’animal sera placé sur plaque chauffante dès sa perte de conscience pour limiter la déperdition de chaleur dûe à l’anesthésie. Un gel oculaire sera appliqué pour limiter l’inconfort de l’animal. Cette anesthésie gazeuse pourra être répétée jusqu’à 10 fois par animal. Les anesthésies seront espacées d’une semaine minimum pour permettre à l’animal de récupérer.
Choix des espèces
L’animalerie locale permet l’hébergement de souris et de rats. Les espèces ne seront utilisées qu’en fonction des besoins de recherche des équipes utilisatrices de la plateforme. L’âge des individus n’a pas d’importance dans ce projet, le but est d’apprendre à repérer les organes / structures d’intérêt de façon fiable et répétée. Nous utiliserons des animaux adultes et mâtures sexuellement qui ne seront pas utilisés pour la reproduction, ne seront pas inclus dans une étude ou en seront sortis après utilisation.
Modèles in vivo pour identifier des entités thérapeutiques dans le traitement des maladies rénales
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles urogénitaux
Rats : 900
2 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent l'ablation des cinq sixièmes de leurs reins en deux opérations chirurgicales, puis une exsanguination terminale, tandis que les souris reçoivent une injection de glycérol provoquant une destruction musculaire avant d'être décapitées sous sédation. Le porteur reconnaît une douleur modérée et continue liée à la chirurgie rénale. Il teste des molécules contre la maladie rénale chronique et présente les modèles in vivo comme "les plus adaptés et les plus prédictifs", écartant les cultures cellulaires limitées à un seul type de cellule.
Objectifs
La maladie rénale chronique est une détérioration lente et progressive de la capacité des reins à filtrer les déchets métaboliques du sang. Les causes majeures sont le diabète et l’hypertension artérielle. Les conséquences sont une acidification du sang, le développement d’une anémie, l’endommagement des nerfs, une détérioration du tissu osseux et un risque augmenté d’athérosclérose. De plus, une atteinte rénale aiguë peut devenir une maladie rénale chronique si la fonction rénale n’est pas rétablie après le traitement et dure plus de trois mois. Les traitements actuels visent à limiter les liquides, le sodium et le potassium dans l’alimentation ; la prise de médicaments destinés au traitement d’autres pathologies (telles que le diabète, l’hypertension artérielle, l’anémie et les déséquilibres électrolytiques) et, le cas échéant, à faire appel à la dialyse ou à une greffe de rein. Il existe un ensemble de données concordantes révélant que l’existence d’une atrophie continue et la diminution de la masse musculaire constituent des facteurs de risque indépendants de la mortalité chez les patients ayant une maladie rénale chronique. La lutte contre l’atrophie musculaire apparait donc comme une composante majeure pour améliorer le pronostic des patients ayant une altération de la fonction rénale. L’objet de ce projet est d’évaluer chez l’animal le potentiel de nouvelles molécules sur les fonctions musculaires et rénales, molécules dont on a démontré préalablement des effets bénéfiques sur le muscle squelettique in vitro. Deux modèles animaux ont été retenus ; le premier est un modèle aigu comparable à la rhabdomyolyse chez l’homme et le deuxième un modèle chronique avec une forte altération métabolique. • Quel est l’impact du muscle squelettique sur le bon fonctionnement du rein ? • Des molécules actives sur la fonction musculaire peuvent-elles préserver la fonction rénale ? • L’ensemble des données collectées permettront-elles de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans les maladies rénales afin de retarder et/ou diminuer le nombre de personnes dialysées ?
Bénéfices attendus
- Amélioration de la fonction musculaire - Amélioration de la fonction rénale - Retardement du moment de dialyse - Amélioration de la fonction d’autres organes. Pour l’homme, les molécules actives permettraient d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies rénales. La protection du muscle et du rein permettrait d’envisager un retardement du moment de la dialyse et de meilleures conditions de vie.
Procédures
Sur rats néphrectomisés, la procédure chirurgicale consiste à réaliser une résection au 5/6ème des 2 reins du rat. Elle est réalisée en 2 fois à une semaine d'intervalle; le rein droit est enlevé au cours de la 1ère opération, les 2/3 du rein gauche au cours de la 2nde opération. Chacune des opérations réalisées sous anesthésie a une durée moyenne par animal de 30 minutes. 2 prélèvements de sang de 500µl seront réalisés à l'extrémité caudale sur animaux vigiles (extrémité caudale après anesthésie locale) 2 semaines avant et 6 semaines après l'opération chirurgicale. Chaque prélèvement sanguin a une durée de 2 à 3 minutes. Une exsanguination terminale des rats et un prélèvement d'organes d'intérêt sont réalisés 10 à 12 semaines suivant l'opération après sédation à l'isoflurane 4%. Pour le modèle de souris présentant une atteinte rénale aigue, l'animal reçoit une injection (10 secondes) intramusculaire unique de glycérol sous anesthésie. 48 ou 72h après, chaque souris sera décapitée après sédation à l'isoflurane 4% pour permettre le recueil du sang terminal et des organes.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales entrainent une douleur modérée et continue. La chirurgie sous anesthésie générale et l'analgésie appropriée permettent d'atténuer cette douleur, la souffrance postopératoire et le trouble de l'état général. Aucune perte pondérale significative n'est attendue dans le modèle 5/6Nx ni aucun effet sur les paramètres comportementaux (activité motrice, anxiété, exploration, altération de la mémoire) malgré une forte variabilité et une fluctuation dans le temps de ces paramètres. Les différents travaux déjà réalisés sur ce modèle ne montre pas de lien entre l’aggravation des fonctions rénales et une baisse de l’activité motrice, de la cognition ou des émotions.
Devenir
Tous les rats ayant subi la procédure expérimentale de néphrectomie seront traités avec les molécules d'intérêt pendant 12 semaines minimum puis euthanasiés (prélèvement de sang + organes) Toutes les souris utilisée dans la procédure d'atteinte rénale aigue seront euthansiées au plus tard 72h après l'induction de la rhabdomyolyse (prélèvement de sang + organes)
Remplacement
Pour tester les molécules dans le cadre des pathologies rénales, les modèles vivo sont les plus adaptés et les plus prédictifs. En effet, le rein est un organe dont la structure tri-dimensionnelle est importante pour sa fonction de filtration et formé de plusieurs types cellulaires (podocytes, cellules mésangiales, cellules épithéliales). Les modèles in vitro sont restreints à l’observation d’un seul type cellulaire, sans prise en compte des interactions intercellulaires et environnementales caractéristiques d’un tissu dans son milieu d'origine. Il existe des organoïdes, cependant les structures obtenues ne sont pas organisées comme dans un rein et l’absence de l’uretère dans ces modèles empêche l’évaluation de l’ensemble des fonctions rénales. De plus, le but de ce projet est d’évaluer l’influence des muscles sur cette fonction rénale et les nouvelles thérapies envisagées sont de traiter le muscle. Ce but ne peut être atteint qu'en utilisant un modèle animal qui présente cette intégrité physique.
Réduction
Modèle de pathologie aigue (rhabdomyolyse) Une à deux études pilotes seront réalisées pour confirmer l’obtention du modèle avec un taux de réussite estimé proche de 100%. Il est donc envisagé d’injecter 10 souris par lot sur les 2 premières cohortes pour lesquelles les paramètres d’atteinte rénale et musculaire seront mesurés afin d’évaluer la robustesse du modèle obtenu (48 à 72h après induction) Les 2 lots de chacune de ces 2 premières cohortes seront des animaux contrôles injectés en intramusculaire avec du sérum physiologique (sham) et des animaux pathologiques injectés avec du glycérol 50%. Par la suite, si la mise au point est conforme aux attentes, les cohortes seront constituées de 5 à 6 lots de 10 souris pour permettre le test de 2 à 3 molécules. Il est prévu de réduire le nombre d’animaux induits à n=6 dans les lots sham et référence (quinacrine) en consolidant les données obtenues avec celles générées à l’occasion des études pilotes. Seules les molécules présentant une activité sur le modèle de rhabdomyolyse (pathologie rénale aiguë) seront évaluées sur un modèle de pathologie rénale chronique. Modèle de pathologie chronique (néphrectomie) Une à deux études pilotes seront réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires dans chaque lot test. L’induction de la pathologie rénale par néphrectomie pouvant présenter une légère variabilité, il est estimé nécessaire d’opérer 12 rats/lot pour obtenir 8 à 10 animaux présentant les signes cliniques de la maladie rénale chronique. A l’issue de la mise au point, les lots envisagés dans chaque cohorte d’étude d’un composé sont Contrôle Sham, Contrôle pathologique, référence (MnTBAP), molécules à tester. Chaque lot sera constitué de 8 à 10 animaux pour mettre en évidence des effets statistiques interprétables. Les molécules seront évaluées sur une période de 12 semaines et les cohortes seront constituées au minimum de 5 à 6 lots d’animaux pour permettre de tester 2 à 3 molécules. L’objectif est de réduire le recours à l’opération systématique d’animaux pour les lots sham, contrôle pathologique et référence. A l’issue des 2 premières études, il est prévu de ramener entre 6 et 8 le nombre d’animaux affectés au groupe sham et référence, les résultats sur ces 2 groupes seront consolidés avec les données obtenues lors des tests pilotes.
Raffinement
Pour le modèle de néphrectomie 5/6Nx, 48h avant l’opération, une analgésie pré-opératoire sera réalisée par voie orale L'anesthésie et l'analgésie pour l'opération chirurgicale seront obtenues avec l'association d'un sédatif, d'un analgésique et d'un anesthésique. Pendant l’opération, la température corporelle sera suivie et les animaux maintenus sous lampe chauffante. En fin de chirurgie, les rats recevront 2 fois/jour une dose d'antalgique pendant 3 jours. Les rats seront mis en boite individuelle jusqu'à cicatrisation complète. L'aliment dans la mangeoire sera également disposé dans la cage et un enrichissement type sizzle dry sera disposé avec la litière. La surveillance post opératoire sera quotidienne avec une grille de score associée à une feuille d'observation individuelle.
Choix des espèces
Les espèces choisies, souris pour l'atteinte rénale aigue (rhabdomyolyse), rat pour l'atteinte rénale chronique (néphrectomie) sont celles les plus couramment utilisées pour étudier ces pathologies et l'effet de nouvelles molécules permettant un traitement potentiel. Ces modèles permettent l’étude conjointe de l’atteinte musculaire et rénale. Les animaux sont des rats adultes (6-7 semaines) pour la néphrectomie et des souris adultes (7-8 semaines) pour le modèle de rhabdomyolyse. Pour ces 2 modèles, l'âge retenu permet d'inclure des animaux n'ayant pas une atteinte rénale spontanée et d'éviter une variabilité des paramètres biochimiques rénaux et plasmatiques liée à l'âge qui pourrait interférer avec l’effet attendu du traitement.
Evaluation de la susceptibilité à la fibrillation atriale dans un modèle de rongeur de vieillissement cardiaque accéléré
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
195 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant huit semaines pour induire un vieillissement cardiaque accéléré, un médicament ou un placebo par gavage, un suivi par IRM, puis une étude électrophysiologique de deux heures sous anesthésie sans réveil avant le prélèvement des organes. Le porteur indique un stress lié aux injections sur animal vigile et au gavage, et n'attend pas d'effet indésirable des médicaments. Il affirme que l'étude du remodelage lié à la sénescence exige l'"organisme entier" et écarte le remplacement, présentant comme "nécessaire" d'investiguer un vieillissement de la population.
Objectifs
L’âge reste le premier facteur de risque de la fibrillation atriale. Cette maladie cardiaque est due au trouble du rythme cardiaque et peut engendrer des palpitations, douleurs à la poitrine, essoufflement, fatigue... ainsi que le décès de la personne. L’incidence augmente dans la population de plus de 70 ans (17/1000) et cela est particulièrement frappant sachant que l’incidence chez les personnes de moins de 50 ans est estimée à 0.9/1000. En considérant le taux de vieillissement prévu de la population (le nombre de personnes de plus de 65 ans doublera d’ici à 2040), il est nécessaire d’investiguer les causes reliant le processus complexe du vieillissement à la vulnérabilité à développer la fibrillation atriale, afin de développer la prévention et/ou d’améliorer les thérapies existantes. Actuellement, les facteurs qui déterminent la corrélation entre le vieillissement cardiaque et la susceptibilité à développer la fibrillation atriale ne sont pas bien connus. Dans ce projet nous souhaitons mettre en place un modèle de vieillissement chez le rongeur (rat) déjà validé par la communauté scientifique afin de pouvoir étudier les facteurs liés vieillissement influençant l’installation de la fibrillation atriale. Le projet vise à décrire la différence entre un groupe d’animaux possédant un vieillissement accéléré et des groupes contrôles, 195 rats maximum seraient inclus dans le projet pour répondre aux objectifs de recherche . Le point de comparaison sera la sensibilité des animaux à développer de la fibrillation atriale par stimulation cardiaque. L’objectif sera d’essayer de corréler la susceptibilité à la fibrillation atriale avec les modifications tissulaires afin de faire émerger de nouveaux mécanismes qui pourront être testés ultérieurement dans le cadre du développement de nouvelles orientations thérapeutiques pour la prise en charge et le traitement de la fibrillation atriale chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Le modèle de rat avec vieillissement accéléré permettra d’évaluer le lien direct entre l’installation de la sénescence, qui est un processus physiologique qui entraîne une lente dégradation des fonctions de la cellule à l'origine du vieillissement des organismes, qui fait partie des processus du vieillissement, et la sensibilité aux arythmies atriales, notamment la fibrillation atriale. L’induction de la sénescence chez de jeunes animaux permettra de corréler directement ce processus aux arythmies atriales en comparaison avec des animaux âgés. L’utilisation de médicaments qui agissent en tuant les cellules sénescentes (dégradées), permettra d’évaluer les bénéfices potentiels de ces médicaments pour prévenir ou traiter la fibrillation atriale.
Procédures
Les rats auront des injections journalières de dix secondes maximales sur une période de huit semaines. Ensuite, les animaux auront une administration journalière de médicament ou de placebo par voie orale pendant cinq jours. Le suivi des animaux se fera par imagerie non invasive (IRM - Imagerie par résonance magnétique). En fin de projet, ces derniers subiront une étude électrophysiologique pour une durée de deux heures sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liés aux actes réalisés, notamment lors des injections quotidiennes, celles-ci seront effectuées sur les animaux vigiles ce qui peut induire un stress lors de la manipulation ainsi qu'une faible douleur au site de l'injection. La prise par voie orale pendant 5 jours se fera par gavage, ce geste engendrera également un stress le temps de la manipulation. Les médicaments utilisés ne devraient pas avoir d'effets indésirables sur les animaux. La procédure d’imagerie, ainsi que la procédure de stimulation cardiaque, n'engendreront pas d'effets indésirables, les animaux étant sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée, et la dernière expérimentation étant sans réveil de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie et couverture analgésique adaptée, pour permettre le prélèvement des organes afin de caractériser les marqueurs de senescence ainsi que les changements structurels et métaboliques des tissus et des cellules.
Remplacement
Le remplacement des animaux est impossible pour ce type d’étude car l’hypothèse nécessite de pouvoir étudier les réponses physiologiques et le remodelage induit par la senescence et le vieillissement précoce sur l’organisme entier. Cependant, les résultats des études ex vivo permettront la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la vulnérabilité des tissus sénescents à la fibrillation auriculaire. Cela nous permettra de dessiner de nouvelles études in vitro sur des cellules de patients avec ou sans FA et/ou sur des lignées cellulaires cardiaques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est calculé sur la base du test statistique de contingence concernant l’objectif primaire (quantifier et comparer la susceptibilité à la fibrillation atriale entre les groupes). Nous recalculerons régulièrement la taille des échantillons nécessaire permettant de discerner les différences statistiques avec l’intervalle de confiance souhaité, et éventuellement réduire le nombre d’animaux utilisé dans le projet. L’utilisation des tissus explantés pour la réalisation de multiples analyses enrichira le contenu d’information scientifique disponible pour chaque animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les conditions adaptées en groupes sociaux, disposeront de l'espace nécessaire et de stimulation avec la mise à disposition d'un enrichissement environnemental régulièrement changé. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie, formé et soucieux du bien-être des animaux. Lors de l'opération, les animax seront sous anesthésie générale avec une couverture analgésique adaptée et une surveillance constante des paramêtres vitaux.
Choix des espèces
Le modèle de vieillissement accéléré chez le rat induit est décrit dans la littérature scientifique. Le modèle de rat permet une évaluation fiable de la vulnérabilité de la fibrillation atriale secondairement à la stimulation cardiaque. Des rats adultes seront inclus au projet afin d’avoir des animaux dont la croissance est achevée. Plusieurs stades de vieillisement seront étudiés : 10 semaines (jeune adultes), 19 semaines (adultes), 18/24 mois (âgés), permettant ainsi de comparer les différents groupes et l'impact du vieillissement sur l'apparition de la fibrillation atriale.
Validation de l’effet neuroprotecteur d’un traitement combiné DOX et ATT dans un modèle lésionnel murin de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré pour 24 d'entre eux et sévère pour 24. Ils reçoivent une injection intracérébrale de toxine reproduisant la maladie de Parkinson sous anesthésie, subissent un test locomoteur cinq fois après injection d'apomorphine, et 24 d'entre eux un gavage deux fois par jour pendant 19 jours. Le porteur teste une association d'un antibiotique et d'un anti-oxydant censée protéger les neurones, après des résultats obtenus in vitro. Il affirme que la validation dans un modèle animal est "indispensable" pour un passage en clinique.
Objectifs
La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente chez l’homme après la maladie d’Alzheimer. Elle est causée par la dégénérescente progressive des neurones dopaminergiques (qui synthétisent la dopamine) dans une structure cérébale (substance noire pars compacta). Cette perte de neurones dopaminergiques a pour effet de réduire considérablement la quantité de dopamine dans une autre structure du cerveau (striatum). Cette absence de dopamine est à l’origine de l’apparition des symptômes moteurs. Le traitement de la maladie de Parkinson a pour objectif de rétablir la quantité de dopamine dans le cerveau et dans la majorité des cas permettent de corriger les symptômes. Toutefois, l’efficacité des traitements est limitée dans le temps et de nombreux effets indésirables apparaissent rapidement. Ces traitements n’ont d’effets que sur les symptômes et ne corrigent pas les causes de la maladie et sa progression. La possibilité de protéger les neurones de la dégénérescence constitue une des pistes prometteuses pour le développement de nouveau traitements de la maladie de Parkinson. Dans ce projet, nous testerons la capacité d’une combinaison de 2 molécules : antibiotique et anti-oxydant pour protéger les neurones dopaminergiques de la dégénérescence dans un modèle lésionnel de la maladie de Parkinson. Cette étude fait suite à une étude in vitro démontrant en culture les effets protecteurs de cette combinaison de molécules. La validation in vivo dans un modèle animal de la maladie est indispensable pour développer cette approche de protection en clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration combinée de la molécule anti-oxydante par gavage avec un antibiotique dans l’eau de boisson, en utilisant un mode d’administration le moins invasif possible, afin de pouvoir l’appliquer chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Le projet inclut les interventions suivantes : l'injection intracérébrale d’une toxine permettant de reproduire un modèle de maladie de Parkinson pratiqué sur 48 rats une seule fois par animal, sous anesthésie générale de 30 minutes, avec prise en charge de la douleur par administration d'analgésique avant, après la chirurgie et un suivi pendant 48 heures après le jour de la chirurgie. Le test comportemental (test locomoteur) pratiqué sur 48 animaux 5 fois par rat sur animaux vigiles pour une durée de 30 minutes par session précédé d’une injection apomorphine en sous cutanée (moins d’une minute par animal). Le gavage 2 fois par jour (moins d’une minute par animal) pratiqué sur 24 animaux pendant 19 jours sur animal vigile. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Pour la partie comportementale : un stress peut être mis en évidence lors du test locomoteur et une douleur peut survenir au point d’injection intrapéritonéale d’apomorphine. Pour la partie chirugie : une douleur peut être provoquée par la mise en barre d’oreille des animaux, un risque de saignement au moment de la craniotomie, un traumatisme mecanique locale relativement faible au moment de l’insertion de l’aiguille au site d’injection, un risque d’hypothermie et anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. Une perte de poids suite à la chirurgie peut être observée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par méthode autorisée afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques.
Remplacement
La combinaison du traitement anti-oxydant associé à un antibiotique de la famille des tétracycline a déjà montré son efficacité de neuroprotection in vitro dans des cultures primaires de neurones dopaminergiques de souris. Dans cette démonstration l’effet de la combinaison est largement supérieur à l’effet observé pour chaque molécule individuellement. L’étape suivante est de réaliser in vivo cette étude dans un modèle lésionnel de rat de la maladie de Parkinson.
Réduction
La conception des procédures permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, à 48 au total, en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque temps post-lésion étudié. En effet, des études précédentes sur la réalisation de la lésion dopaminergique ont montré une grande efficacité à réaliser le modèle Parkinsionien et des données publiées sur le traitement antibiotique nous permet de connaitre les procédures expérimentales à utiliser afin d’étudier notre combinaison de molécules dans ce projet. Finalement, le nombre d’animaux inclus dans les procédures expérimentales pour chaque condition, 12 animaux par condition, a été établi sur la base de calcul de puissance statistique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques en fin d'expérimentation pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h (8h - 20h). L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un tunnel et du kraft sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Une surveillance accrue sera mise en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés par inhalation de gaz anesthésiant et recevront une injection d'analgésie avant, après l’injection intracérébrale ainsi qu'un suivi pendant 48 heures post-chirurgie. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis retrocontrolé via la sonde rectale. Des larmes artificielles seront placées sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique sera également appliquée au niveau des points de contact entre les oreilles et le cadre stéréotaxique.
Choix des espèces
Le modèle lésionnel chez le rat est le modèle de référence pour la maladie de Parkinson car il permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson Tous les animaux utilisés auront deux mois au début des procédures correspondant au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection du neurotoxique et pour la réalisation du test comportemental
Etude de la relation entre la réponse anti-transgène et la toxicité cardiaque dans le transfert de gène
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une pastille immunosuppressive implantée sous la peau sous anesthésie, puis une injection intraveineuse de thérapie génique et plusieurs prélèvements sanguins, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si la toxicité cardiaque observée à forte dose de vecteur est liée à une réponse immunitaire contre le transgène. Le porteur passe en revue les méthodes in silico et in vitro puis affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier les liens entre système immunitaire et système cardiaque.
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitements présentant des signes histologiques et fonctionnels avec une réduction de la force musculaire, et parfois une atteinte cardiaque, respiratoire et cérébral. La thérapie génique est une stratégie envisagée dans ces pathologies d’origine génétique et des approches utilisant des vecteurs dérivés du virus associé à l’adénovirus sont déjà à l’étape clinique. Lors des injections des produits de thérapie génique chez l’homme, Il a été observé des réactions immunitaires contre le vecteur et contre le transgène (produit protéique exprimé à partir du gène apporté par le vecteur), ainsi qu’un certain nombre de réactions adverses. Dans ces cas, des traitements à base de produits immunosuppresseurs sont donnés aux patients et permettent une résolution des problèmes la plupart du temps. Dans nos études précliniques de transfert de gène dans un groupe de pathologies musculaires, les sarcoglycanopathies, nous avons également observé une toxicité cardiaque à des doses élevées de vecteur chez le rat. Nous avons observé de façon concomitante une réponse immune contre le transgène-médicament, sans qu’il soit possible de déterminer si cette réaction immune était en parallèle ou à l’origine de la cardiotoxicité. L’objectif de ce projet est de répondre à cette question en utilisant un régime immunosuppresseur qui va prévenir la réponse contre le transgène et de quantifier une potentielle diminution de la cardiotoxicité.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous définirons si la cardiotoxicité observée à de forte doses de vecteurs est liée ou non à une réponse anti-transgène. La réponse à cette question nous orientera vers la génération de vecteur ayant un profil de sécurité plus élevé car nous saurons si nous devons privilégier des vecteurs ne conduisant pas à une réponse anti-transgène ou au contraire rechercher l’origine de la cardiotoxicité pour définir comment générer des vecteurs.
Procédures
Le traitement immunosuppresseur se fait par injection sous-cutanée de pastilles à l’aide d’une canule une seule fois au cours du protocole sur des animaux sous anesthésie gazeuse. Le transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois sur animaux vigiles avec injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se feront un jour avant l’injection de la thérapie génique, à 14 jours post-injection et à la fin (J21) du protocole. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés : - Douleur de piqûres pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui sont susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie gazeuse, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. Effets immunosuppresseurs des drogues et l’effet toxique des doses élevées des injections de thérapie génique peuvent également entrainer des nuisances, comme une atteinte cardiaque et un dérèglement du système immunitaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les relations entre la réponse immunitaire et la toxicité cardiaque pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle permettant d’étudier les relations entre le système immunitaire et les système cardiaque..
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le découpage en 2 lots va permettre de définir le meilleure traitement immunosuppresseur dans le premier lot et de ne faire que le meilleur dans le deuxième lot. Le groupe contrôle injecté avec placebo sera mutualisé entre les 2 lots. Nos données suggérant que les observations de toxicité et de réponse immune sont globalement les mêmes entre les deux sexes, nous n’évaluerons la question que sur un seul sexe, ce qui nous permet une réduction d’animaux.
Raffinement
Nous avons choisi d’administrer les molécules à l’aide de pastilles sous-cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 21 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter la manipulation des animaux avec une seule manipulation au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux. L’administration systémique des vecteurs se fera 2 à 3 jours après de l’implantation de la pastille évitant un stress supplémentaire l’animal. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle que l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce rat car c’est sur cette espèce que nous avons observé la plus grande sensibilité à la toxicité cardiaque induite par l’injection des AAV à forte doses. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte à un âge permettant le montage d’une réponse immune.
Radiothérapie par rayons X des tumeurs cérébrales de haut grade
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 300
300 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis des séances de radiothérapie et d'IRM, la tumeur pouvant provoquer des troubles neurologiques, une perte d'appétit et des troubles du mouvement en phase terminale avant le prélèvement du cerveau. Le projet teste une source de rayons X expérimentale contre les gliomes, avec un transfert en clinique humaine présenté comme un objectif. Le porteur affirme qu'il est "impossible" d'étudier ces réponses sur des expériences in vitro.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 14 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. Notre projet s’inscrit dans ce contexte en utilisant une source de rayons X très particulière et encore expérimentale, de basse énergie mais de haut flux, permettant (i) de sélectionner au mieux les énergies intéressantes (ii) de faire un microfractionnement spatial de la dose. Ces deux spécificités ne sont pas techniquement possibles sur les sources classiques hospitalières à l’heure actuelle. Le potentiel de cette technique est étudié depuis une vingtaine d’années déjà, selon différentes approches expérimentale comme l'irradiation de cellules en culture ou des calculs dosimétriques. Ces approches bien qu’indispensables restent très limitées car elles ne prennent pas en compte la complexité du tissu tumoral, se développant de façon autonome, possédant sa propre vascularisation. L’objectif de notre projet vise à tester les modalités d’imagerie (diagnostique) et les modalités d’irradiation (géométrie, balistique, dose) sur des tumeurs proches des tumeurs humaines grâce à l’utilisation de modèles précliniques de rongeurs porteurs de tumeurs (souris et rats). Ce projet portant sur la physiologie tumorale, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d'acquérir un ensemble de données précliniques de haute qualité sur des animaux porteurs de tumeurs cérébrales pour des protocoles de radiothérapie par rayonnements X de haute énergie. Les études réalisées pendant les 5 ans du projet permettront d’élargir nos connaissances sur les réponses biologiques du tissu tumoral et du tissu sain exposés aux microfaisceaux, d’évaluer le rôle du microenvironnement tumoral par rapport à l’efficacité du traitement, d’analyser les effets des rayonnements sur la vascularisation tumorale et saine, sur le comportement des animaux. L'objectif est également de pouvoir proposer un schéma d'irradiation optimal (nombre d'incidences, dose, géométrie) avec une préservation efficace des tissus sains pour un transfert réaliste vers un essai clinique. En effet, la radiothérapie par microfaisceaux est une méthode innovante et prometteuse, permettant de détruire efficacement le tissu tumoral tout en préservant le tissu sain environnant. Elle répresente donc une bonne alternative de la radiothérapie conventionnelle et ses effets secondaires. Ce projet est un facteur clé pour promouvoir notre méthode en clinique humaine et pour pouvoir proposer aux patients de tumeur cérébrale un meilleur rapport entre l'efficacité thérapeutique et effets secondaires, une meilleure qualité de vie et une survie prolongée.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : implantation de cellules tumorales sous anesthésie générale et locale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; radiothérapie par microfaisceaux ou par irradiation conventionnelle sous anesthésie générale, sur 500 animaux (250 rats, 250 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; imagerie par resonnance magnetique sous anesthésie générale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), 3 à 4 fois par animal, pendant environ 1 heure
Impact sur les animaux
Le changement d'environnement et le transport des animaux de l'animalerie jusqu'au lieu d'irradiation représente du stress et de l'angoisse. La procédure de radiothérapie n'induit pas de douleur mais du stress et de l'angoisse. L'inoculation tumorale répresente une douleur locale et du stress. Il peut y avoir l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 2 semaines après l'implantation (troubles du mouvement, perte d'appétit). Dans des rares cas la radiothérapie elle-même peut induire une perte d'appétit. Une alopécie et, plus rarement, une dermatite radio-induite transitoire peuvent apparaitre dans le champ d'irradiation environ 2 semaines après l'exposition. La procédure d’imagerie implique du stress pour les animaux et l’injection de l’agent de contraste induit une douleur locale.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. D’après les connaissances actuelles (littérature) et notre expertise, un délai de 2 semaines entre la radiothérapie et le prélèvement cérébral pour analyse histologique permet une bonne évaluation des réponses tissulaires différentielles entre l’irradiation par microfaisceaux ou champ plein auxquelles nous nous attendons. Cette analyse histologique est complémentée par la courbe de suivi long terme qui est indispensable pour évaluer l’efficacité de notre traitement et pour pouvoir proposer un protocole d’irradiation optimisé et transférable à un futur essai clinique.
Remplacement
La thérapie anticancéreuse a pour but d’éradiquer la tumeur ou de ralentir sa croissance tout en préservant au maximum les tissus sains avoisinants. La seule alternative aux études animales est l’étude in vitro (cellules). Cependant, il est impossible d'étudier la réponse tumorale et les effets secondaires sur la fonction cérébrale, l'irradiation de la peau et des os du crâne avec des expériences in vitro. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme vivant, reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale et d’un système immunitaire, le microenvironnement tumoral et l’index thérapeutique. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique est l’établissement de courbes de suivi long terme permettant de calculer des moyennes et médiane de survie. Parallèlement, certains animaux sont mis à mort à temps fixes pour la réalisation d’études visant à obtenir une ‘image’ de la tumeur ou de l’organe à un moment donné afin d’appréhender les interactions rayonnement-matière spécifiques de la technique. Par ailleurs, des études ex vivo ont déjà été menées dans le passé mais elles ne correspondent pas suffisamment aux buts recherchés lors d'irradiations d'un organisme vivant comme mentionné ci-dessus. Ces études incluent des simulations informatiques pour simuler les interactions entre photons et matière et des irradiations de cellules en culture.
Réduction
Pour le calcul du nombre d'animaux, il faut prendre en considération la variabilité intra- et inter-tumorale pour une population de rongeurs implantés suivant un même protocole. Tous les groupes seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés et reconnus pour chaque étude. Nos précédentes expériences montrent qu’un nombre d’animaux de 7-8 animaux suffit à obtenir des résultats robustes. Nous prévoyons donc des groupes d’animaux n=10 du aux problèmes éventuels rencontrés durant les différentes étapes de l’expérience. Ce calcul mène à utiliser 60 animaux par expérience, 2 expériences par an, sur 5 ans, 600 animaux au total.
Raffinement
Les animaux arrivent à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Ils sont hébergés dans des grandes cages. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par le SBEA et l’animalerie. Nous allons réduire le stress du transport par un enrichissement (litière de la cage d’hébergement, cachettes etc), transport groupés en cage filtrée, hydrogel. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie soit (i) par inhalation (ii) soit par induction gazeuse suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange d'anesthésiques/antalgiques et d’une injection sous-cutanée d'un anesthésique local au-dessus du site d’implantation des cellules tumorales. Une injection postopératoire d'antalgique sera administrée lors de l’implantation tumorale. Les animaux sont observés quotidiennement par le responsable du projet après chaque procédure et seront hébergés en cage isolée dès que les premiers signes cliniques apparaissent (perte d'appétit, perte de poids, prostration, convulsions). Les animaux disposent alors de nourriture humide à l’assiette et/ou d’un aliment riche en nutriment (« boost »). L'administration d'antalgiques sera considérée pour soulager la douleur (décision prise par le responsable du projet). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés (examen clinique (EC) 2 fois par jour après chaque procédure et en cas de symptômes cliniques, EC quotidien pendant les 3 premières semaines post irradiation en cas de bonne santé générale, ensuite EC un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la mis à mort). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort quand les points limites, definis dans la grille de symptômes et basés à la fois sur le comportement et le poids, sont atteints.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur de plus petits nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. L'utilisation de rongeurs d'un même patrimoine génétique permet une grande réproductibilité de résultats. Les souris sont favorisées car elles sont adaptées à notre installation et peuvent être manipulées et hébergées facilement. Les rats sont importants dans notre cas, car du fait de leur taille plus importante, les irradiations et la dosimétrie sont plus faciles à mettre en oeuvre de façon fiable et reproductible. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. Nous validerons nos protocoles d'irradiations (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) chez 2 espèces d'animaux et plusieurs modèles tumoraux différents, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Les animaux sont utilisés entre 4 à 12 semaines après la naissance (4 à 8 semaines pour les souris, 8 à 12 semaines pour les rats), ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés. Les modèles tumoraux ont été développés dans les animaux à cet âge quand le cerveau est encore en cours de développement, ce qui nous mène à choisir le même stade de développement pour rester reproductible dans nos résultats. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficile à gérer en animalerie. Enfin, les courbes de suivi long terme durent environ 6 mois (pour certains animaux seulement), justifiant aussi l’utilisation de cette tranche d’âge.
ONCOLOGIE-OS : Evaluation de thérapies anti-cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en intra-osseux
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 200
2 000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une greffe de tumeur dans l'os du tibia ou du fémur, puis des traitements par voies multiples, des irradiations, des séances d'imagerie et des prélèvements de moelle osseuse à l'aiguille, la tumeur pouvant provoquer douleurs, fractures et métastases pulmonaires. Le projet est mené par une société prestataire de services en recherche préclinique qui propose ces modèles à des clients du secteur pharmaceutique. Le porteur affirme que les méthodes alternatives "ne permettent pas" de prévoir l'efficacité des candidats-médicaments in vivo.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer d’origine osseuse ou induisant métastases osseuses, avec ou sans métastases, déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers d’origine osseuse ou induisant des métastases osseuses. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (
Impact sur les animaux
Deux types de greffe pourront être réalisées (sous anesthésie générale et analgésie): intra tibiale et intra fémorale. Cela pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur, une gêne, des problèmes de mobilité (liés au membre greffé et au volume tumoral), le développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Les animaux recevront des traitements par voie IM, ID, SC, IV (bolus), orale, IN, IT, IP et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Il pourra aussi être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.
Devenir
Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traitéet/ou traité avec le véhicule et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu du taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, et pour prendre en compte l’exclusion d’animaux chez lesquels la tumeur se développerait excessivement dans le mauvais tissu (sous cutané, musculaire, au lieu d’intra-osseux) il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 30% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 15 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.
Raffinement
Les animaux seront monitorés au minimum 2 fois par semaine. Cette fréquence sera augmentée pour les tumeurs à pousse rapide. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids >15% sera observée sur certains animaux. La greffe intra osseuse, les prélèvements de moelle osseuse, la pose d’implants hormonaux, ou la thoracotomie, seront réalisés sous anesthésie profonde avec opiacé. Un alpha2 agoniste sera administré pour la thoracotomie. Pour la greffe intra osseuse, une analgésie locale avec dépôt d’anesthésiques locaux en sous-cutané au niveau du genou sera réalisée et les animaux recevront un anti inflammatoire non stéroïdien. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (IM, ID) seront réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Les prélèvements de moelle osseuse seront limités à 3 fois par patte (2 sur la patte greffée) dans la vie de l’animal et systématiquement espacés de 2 semaines (y compris intervalle avec la greffe pour la patte greffée). Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus, pouvant donc théoriquement causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Les points limites précoces du modèle seront les suivants : fracture osseuse, incapacité de se maintenir debout ou de se déplacer, perte de poids >20%. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Également, la littérature décrit l’utilisation d’animaux adulte pour ce type de modèle.
Utilisation de modèles d’hypertrophie bénigne de prostate pour l’étude de composés pharmacologiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une supplémentation hormonale quotidienne pendant une à douze semaines, avec parfois une castration, pour induire une hypertrophie de la prostate, puis subissent des mesures de pression artérielle, une cystométrie par cathéter implanté dans la vessie et une mesure de la fonction érectile par chirurgie du nerf caverneux réalisée sans réveil. Le projet, mené dans le cadre d'un partenariat avec une entreprise pharmaceutique, teste des composés contre cette pathologie masculine fréquente. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro pertinent n'existe et que l'interaction des mécanismes en jeu "nécessite un modèle animal".
Objectifs
L’hypertrophie bénigne de la prostate (HBP) est la forme de tumeur (bénigne) la plus fréquente chez l’homme. Des changements pathologiques de ce trouble peuvent être rencontrés chez quasiment la moitié des hommes âgés de 50 ans, et l’incidence augmente avec l’âge. L’HBP se caractérise par une augmentation de la taille de la prostate. Cette tumeur bénigne va ainsi exercer plus de pression sur l’urètre et la vessie et interférer avec l’écoulement normal de l’urine. L’HBP est une histopathologie caractérisée par une hyperplasie stromale et épithéliale et par un dysfonctionnement de la vessie. Bien que les causes de l’HBP soient encore peu déterminées, les symptômes peuvent être classifiés en deux types : irritatifs, du fait du dysfonctionnement de la vessie et obstructifs, au niveau de l’urètre et de la prostate. Ces derniers découlent à la fois d’une prolifération anormale de la prostate et de l’augmentation du tonus basal contractile du muscle lisse urétral et prostatique. Bien que les traitements pharmacologiques existants soient le plus souvent efficaces à court et moyen terme (alpha-bloquant, anticholinergique, inhibiteur de la 5-alpha réductase etc…), ils n’en restent pas moins symptomatiques et le traitement chirurgical reste inévitable à terme, accompagné d’effets secondaires souvent lourds (dysfonction érectile, infertilité masculine, dépression). Ainsi, les effets secondaires de ces différentes options de traitement continuent de poser des difficultés thérapeutiques et encouragent le développement de nouvelles thérapeutiques plus efficaces qui permettraient idéalement d’éviter le traitement chirurgical. En raison de l'étiologie inconnue de la pathologie, il est nécessaire de conduire une recherche visant tout d’abord à développer et optimiser un modèle animal reproduisant les signes histologiques et cliniques de cette pathologie, pour ensuite permettre la réalisation de tests précliniques sur ce modèle visant à inverser le phénotype pathologique induit.
Bénéfices attendus
L’HBP entraînant des symptômes du bas appareil urinaires (SBUA) est une pathologie définie par des symptômes et ainsi, difficile à appréhender hors d’une situation physiologique. La mise en place d’un modèle animal est donc indispensable pour pouvoir trouver des traitements sûrs et efficaces. Sachant que l’étiologie de l’HBP est encore mal connue, ce projet permettrait d’une part de mettre en évidence et d’optimiser un modèle animal qui mimerait, de manière pertinente, en même temps l’augmentation de taille de la prostate et les SBUA observés chez les patients. D’autre part, ce projet permettrait de sélectionner les nouveaux candidats médicaments pour le traitement de l’HBP. En effet, le projet pourra fournir une preuve de concept pour une nouvelle molécule ou un nouveau traitement, en donnant des indications sur son efficacité pour soigner l’HBP. Et selon le type de protocole suivi, des analyses supplémentaires peuvent aussi être réalisés, qui vont renseigner sur ses effets (bénéfique ou délétère) sur la pression artérielle et la fonction érectile.
Procédures
Les interventions que vont avoir les animaux sont : - Une administration sous-cutanée ou intrapéritonéale d’hormone une fois par jour, pendant 1 à 12 semaines, avec ou sans orchidectomie, pour induire le modèle d’HBP, concomitant ou précédant leur traitement. Et après l’induction du modèle ou de manière concomitante, une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute ; tandis que l’orchidectomie, si elle a lieu, dure environ 30 minutes. - Mesure de la pression artérielle de manière non invasive au niveau de la queue. Elle sera réalisée en début (2 mesures) et en fin de traitement (2 mesures), précédée d’entraînements (3 entraînements avant les 2 mesures). Chaque mesure ou entraînement dure entre 5 et 20 minutes. - Une cystométrie suite à l’implantation d’un cathéter par chirurgie au niveau de la vessie, est réalisée sur animal conscient, placé dans une cage à métabolisme. La cystométrie consiste à évaluer la fonction vésicale de l’animale par perfusion de sérum physiologique dans la vessie et un suivi de la pression intravésicale et des cycles urinaires. Cette mesure est réalisée une seule fois pour chaque animal, et les animaux sont placés dans la cage métabolique pendant une période maximale de 4 heures. - Mesure de la fonction érectile suite à une chirurgie permettant la stimulation du nerf caverneux et l’installation d’un cathéter au niveau du tissu érectile afin d’enregistrer l’augmentation de la pression intracaverneuse (signe de l’érection). Cette mesure est sans réveil, donc réalisée une fois par animal, et la mesure dure environ 2 heures incluant le temps de chirurgie. - Si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ses interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Impact sur les animaux
La supplémentation hormonale est un modèle largement utilisé chez les rongeurs dans la littérature pour étudier l’hypertrophie bénigne de la prostate. Selon l’expérience de notre laboratoire, les rats supplémentés en testostérone et/ou œstrogène (pendant 1-12 semaines) ne présentent pas des signes de douleur ni de comportement anormal durant le traitement. Une légère perte de poids peut être observée chez les rats pendant la semaine après la procédure d’orchidectomie, leur courbe de poids reprend normalement par la suite. Les procédures d’évaluation des différents symptômes, qui vont durer le temps de la mesure, sont soit indolore, soit réalisée de manière à diminuer la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal.
Devenir
Tous les animaux vont avoir une supplémentation hormonale permettant d’induire le modèle d’HBP, suivi d’un traitement par le composé à tester et des composés témoins. Ensuite, une mesure de la pression artérielle, cystométrie, et une mesure de la fonction érectile peuvent être réalisées. Ainsi, au vu des traitements réalisés sur les animaux, ils seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant l’étude de l’HBP associée aux SBUA, qui est donc une pathologie définie par des symptômes et ainsi, difficile à appréhender hors d’une situation physiologique. De plus, l’étiologie de l’HBP est encore mal connue, mais pourrait être la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques qui serait initiée par une dérégulation hormonale. Ainsi, l’interaction entre les différents mécanismes impliqués nécessite un modèle animal.
Réduction
Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. Ce calcul est basé sur la sensibilité du modèle, ainsi que sur les effets attendus lors d’un traitement par une molécule de référence. Ainsi, notre expérience au laboratoire a permis de définir ces paramètres, et donc d’estimer un nombre minimal de 12 animaux par groupe, afin d'avoir une puissance statistique satisfaisante pour conclure sur le potentiel efficacité et la sûreté des composés testés. Les tests statistiques utilisés pour une petite population sont le t-test non apparié pour les comparaisons 2 à 2, et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence. De même, quand le composé étudié nécessite en même temps l’analyse des effets sur la cystométrie, la pression artérielle et/ou la fonction érectile, ces paramètres seront évalués sur tous les animaux d’un groupe afin de limiter le nombre de groupes.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible: - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - La procédure d’orchidectomie se fait sous analgésie et anesthésie générale. - la méthode choisie pour l’évaluation de la pression artérielle (PA) est une méthode non-invasive. La mesure de la PA étant particulièrement sensible au stress et à la douleur, aucune douleur de l’animal n’intervient au cours de cette mesure. Cette méthode est basée sur la même technique sphygmomanométrique utilisée pour mesurer la PA chez l’homme. De plus, afin de limiter le stress potentiel des animaux lors de leur contention, les rats sont entraînés avant le début de la mesure de leur PA. - l’évaluation fonctionnelle de la vessie est un modèle qui a été développé pour être réalisé sur animal conscient. - - l’évaluation de la réponse érectile se fait sous analgésie et anesthésie générale et les animaux sont euthanasiés avant leur réveil. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien ou le chimpanzé. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Pour l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Enfin, la littérature montre que les souches de rats choisis pour le projet (Wistar, WKY et SHR) sont plus susceptibles de développer une HBP après supplémentation hormonale. Les animaux seront utilisés adulte, à partir de 8 semaines d’âge. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.