Rats

Tuées pour l'essentiel à l'issue, environ 224 d'entre elles réutilisées dans d'autres protocoles, 2 610 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cornée est désensibilisée par application de capsaïcine, parfois doublée d'un grattage de l'épithélium, pour reproduire une atteinte des nerfs de l'œil pouvant mener à la cécité chez l'humain. Le projet teste des composés censés préserver ou restaurer la sensibilité de la cornée. Le porteur décrit l'application de capsaïcine comme douloureuse sur animal vigile et prévoit une anesthésie pendant l'induction.

Objectifs

Notre objectif est de mettre en place un modèle de dénervation cornéenne chimique chez le rongeur. La cornée possède une innervation abondante provenant du ganglion trijumeau qui est impliquée dans la régulation de la sensibilité cornéenne, la sécrétion des larmes, le réflexe de clignement des paupières, et la cicatrisation. Des dysfonctionnements de ces nerfs afférents peuvent survenir à la suite de dommages du ganglion trijumeau, d’herpes oculaire, de diabète ou d’intervention chirurgicale et peuvent entrainer une dénervation cornéenne partielle ou complète. Chez l’homme la maladie est rare mais elle conduit à une altération sévère de la cornée si elle n’est pas diagnostiquée rapidement avec un risque de cécité. Les premiers signes sont une perte de la sensibilité cornéenne : hypoesthésie ou anesthésie, puis des altérations de l’épithélium de la cornée, couche de cellules la plus externe. Le processus naturel de cicatrisation n’étant plus assuré correctement, ces altérations évoluent en ulcères plus ou moins profond, qui peuvent s'accompagner d’un envahissement anormal de néovaisseaux alors que la cornée est un tissu complètement transparent. La diminution des clignements de paupières et de la sécrétion de larmes amplifie le processus. La désensibilisation chimique permettra d’étudier la contribution des fibres afférentes à la trophicité de la cornée, et les conséquences sur la cicatrisation, mais aussi de tester des composés agissant sur la préservation des fibres nerveuses et la restauration de la sensibilité cornéenne.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la mise au point de modèles expérimentaux robustes permettant d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à préserver ou restaurer la sensibilité et l’intégrité cornéenne après une dénervation.

Procédures

L'induction de la dénervation se fera par application d'un composé issu d'un piment la capsaïcine, connu pour insensibiliser les fibres nerveuses. Cette intervention a lieu une fois en début de l'étude, ou selon le protocole, deux fois à un jour d'intervalle, avec une concentration plus faible de produit. Dans le cas où le but sera d'étudier le retard de cicatrisation, un grattage de l'épithélium cornéen sera également pratiqué le jour de l'induction. Les examens ophtalmologiques ne sont pas invasifs et sont réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie ou sur l’animal en clinique vétérinaire. Pour notre projet, ces examens se feront pour une partie sur animaux vigiles (lampe à fente, mesure de la sensibilité cornéenne, ou mesure de production de larme) 4 fois par semaine sur une semaine. Certains examens nécessitant l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ils ne dureront que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil, soit par administration orale, par injection sous cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale ou intramusculaire (pour les anesthésies chez le rat). Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (en moyenne 4 fois 8 fois). Les injections de produit au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont limitées, une à deux fois par semaine. Elles sont un peu plus longues (environ 5min) et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Si le traitement est administré par voie orale ou intrapéritonéale, il peut être au maximum quotidien, par voie intraveineuse : au maximum 3 fois par semaine, par voie sous-cutanée : au maximum de 2 fois par jours. La durée d’une étude est 1 semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

L’administration de capsaïcine est douloureuse sur un animal vigile, mais dans le projet l’animal sera anesthésié pendant la phase d’induction, pendant environ 30 min, une analgésie sera mise en place. Après cette phase de douleur, la capsaïcine induit une insensibilisation prolongée des fibres nerveuses pendant laquelle l’animal ne ressentira pas de douleur. Des traitements à base de capsaïcine existent chez l’homme pour traiter la douleur des névralgies. Si l’étude inclut l’étape d’étude la cicatrisation cornéenne le grattage de l’épithélium cornéen se fera sous anesthésie et analgésie. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux ayant suivi l’intégralité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, pour réaliser des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de la kératopathie, ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Remplacement

L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques très diverses (cornée, cristallin, rétine, nerf optique...), interagissant de manière dynamique avec leur environnement local et systémique. Il est soumis à des variations mécaniques, physicochimiques et biologiques constantes, qui influencent directement sa fonction et sa réponse aux traitements. Bien que des méthodes alternatives aient été développées ces dernières années, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico, ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions fonctionnelles et pharmacocinétiques observées dans un œil vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de manière fiable les effets de la dénervation sensitive, les altérations de la cicatrisation cornéenne. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal reste actuellement indispensable pour reproduire les conditions pathologiques de dénervation cornéenne, et étudier l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats. Une analyse réalisée en amont de chaque série expérimentale, afin de déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, telles que l’imagerie cornéenne en temps réel (microscopie confocale), permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum) dans des cages incluant des abris et des objets à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. L’application de capsaïcine se fera sous anesthésie, et un traitement analgésique est prévu en complément. De même si le retard de cicatrisation de l’épithélium cornéen est envisagé, les animaux seront anesthésiés et une analgésie est prévue. Si l’immobilité est requise pour un examen (confocal) une anesthésié une anesthésie légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, notamment dans le contexte des pathologies cornéennes avec altération des fibres nerveuse. Ces deux espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de dénervation cornéenne et de régénération nerveuse, et leur emploi repose sur une expérience étendue au sein de la communauté scientifique. Leur utilisation permet une grande flexibilité expérimentale, notamment en termes de suivi longitudinal, d’imagerie cornéenne et de quantification des marqueurs moléculaires. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes, âgés d’au minimum 6 semaines pour les rats et d’environ 5 à 6 semaines pour les souris, correspondant à une maturité fonctionnelle et physiologique des structures cornéennes et nerveuses Ce stade de développement garantit une réponse cohérente aux protocoles d’induction de la pathologie, ainsi qu’une meilleure reproductibilité des résultats. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.

Jusqu'à sept séances d'imagerie TEP sous anesthésie et une chirurgie cérébrale pour le modèle de Parkinson: 156 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Une partie sont des rats SHR qui développent une hypertension avec l'âge, atteignant cœur, reins et cerveau. L'objectif est de valider de nouveaux radiotraceurs cholinergiques en vue d'un transfert vers la clinique humaine. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier et conclut au caractère indispensable du recours au rat.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer et d’évaluer de nouveaux traceurs utilisés en imagerie médicale afin de mieux observer le fonctionnement du cerveau et du système cardiovasculaire. Ces traceurs, appelés ont été conçus par notre équipe et seront utilisés en imagerie TEP (tomographie par émission de positons), une technique permettant de visualiser l’activité de certains systèmes biologiques dans l’organisme. L’étude se concentre sur le système cholinergique, un système de communication entre les cellules nerveuses qui repose sur une molécule appelée acétylcholine. Ce système joue un rôle essentiel dans la mémoire, l’apprentissage, les mouvements et la régulation de la pression artérielle. Son dysfonctionnement est impliqué dans plusieurs maladies, comme la maladie de Parkinson, le trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH) et certaines maladies cardiovasculaires. Dans la maladie de Parkinson, un déséquilibre entre différents systèmes de communication du cerveau contribue aux troubles moteurs. Dans le TDAH, des anomalies du système cholinergique ont également été mises en évidence. Par ailleurs, ce système intervient dans la dilatation des vaisseaux sanguins et le contrôle de la tension artérielle ; lorsqu’il fonctionne mal, il peut favoriser l’hypertension. Un traceur existe déjà pour étudier ce système chez l’homme, mais il est aujourd’hui utilisé uniquement en recherche. Un des traceurs développés par notre équipe, présente de meilleures performances et a déjà fait l’objet de tests de sécurité montrant qu’il est non toxique, même à des doses très supérieures à celles utilisées en imagerie. L’un des objectifs du projet est donc de finaliser sa validation afin de permettre son utilisation chez les patients. En parallèle, un second traceur, a été mis au point pour étudier un autre élément clé du système cholinergique, situé cette fois au niveau des cellules nerveuses qui reçoivent le message. Ce traceur est plus performant que ceux actuellement disponibles. Grâce à ces deux outils complémentaires, le projet vise à mieux comprendre les dysfonctionnements du système cholinergique dans des modèles de la maladie de Parkinson et du TDAH, ainsi que leurs liens avec l’hypertension et les maladies cardiaques, afin d’améliorer à terme le diagnostic et la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider des radiotraceurs, afin d’améliorer la compréhension des pathologies cérébrales et cardiaques liées au système cholinergique. Le but du financement est de pouvoir finaliser le transfert vers la clinique. Dans un objectif de réduction et raffinement, nous utiliserons les mêmes animaux pour poursuivre la validation de notre nouveau radiotraceur, pour pouvoir le transférer également en clinique humaine. Ces traceurs permettront un diagnostic clinique plus précis ainsi que le suivi thérapeutique des pathologies associées aux altérations cholinergiques.

Procédures

Pour la chirurgie du modèle de maladie de Parkinson (MP), les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d’environ 1 heure et recevront 2 injections (1 i.p. et 1 s.c.) de moins d’une minute chacune. Une partie des animaux auront deux séances d’imagerie TEP (environ 70-130 min/séance), réalisées avant et après la chirurgie, sous anesthésie gazeuse, avec une injection du traceur par voie i.v. (< 1min). Dans le modèle spontané de TDAH, les animaux auront au maximum 7 séances d’imagerie entre 6 et 14 semaines d’âge. Lors de la première séance, une injection i.p. (< 1 min) du traceur sera effectuée sous anesthésie gazeuse avant l’imagerie qui durera 30 min. Les imageries suivantes (traceur 1 et 2) se dérouleront également sous anesthésie, gazeuse avec une injection des traceur i.v. (< 1 min) en début d’acquisition. Chaque imagerie durera entre 60 à 120 minutes.

Impact sur les animaux

Pour tous les groupes, la manipulation/contention des animaux peut provoquer un léger stress, qui reste temporaire. Groupes 1, 2 et 3 : Après chirurgie, les animaux seront observés afin de vérifier l’absence de signes douloureux tels que : un changement de comportement, une agressivité inhabituelle, une diminution du toilettage, des difficultés à se déplacer, une perte de poids ou un état général affaibli. Groupes 2, 3, 4 et 5 : Après les examens d’imagerie, un petit hématome peut apparaître au niveau de la queue, à l’endroit où une veine a été utilisée pour l’injection. Cet effet est généralement léger et transitoire. Groupes 4 et 5 : Après certains examens d’imagerie, une gêne ou une légère douleur peut être ressentie au point d’injection pendant quelques minutes seulement. Groupe 4 (rats SHR) : Avec l’âge, ces rats développent naturellement une hypertension artérielle, qui peut affecter plusieurs organes comme le cœur, les reins et le cerveau, et s’accompagner de troubles métaboliques et cognitifs.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés pour des études in-vitro.

Remplacement

L'objectif du projet étant de développer des traceurs d'imagerie utilisables chez l'humain, aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier, étant donnée la complexité des processus mis en jeu telles que l'altération de la transmission cholinergique, les données pharmacocinétiques et de biodistribution et métabolisme multi-organes. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude du développement de nouveaux radiotraceurs d'imagerie.

Réduction

L’utilisation de techniques d’imagerie réalisées directement chez l’animal vivant permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude en utilisant le même animal pour mesurer plusieurs paramètres à différents âges. Malgré cette réduction, le nombre d’animaux par groupe reste déterminé par la nécessité d’obtenir des résultats fiables et suffisamment précis pour répondre correctement à la question scientifique étudiée. Le nombre d’animaux a été calculé à partir de résultats déjà publiés et de données précédemment obtenues au laboratoire. Ces calculs prennent en compte les différences naturelles entre les animaux ainsi que les effets attendus entre les groupes étudiés. Il a ainsi été estimé que 10 animaux par groupe pour le modèle de MP et 20 animaux par groupe pour le modèle de TDAH permet de détecter des différences d’environ 15 % entre les groupes, avec un haut niveau de fiabilité des résultats. Ce nombre offre également une marge de sécurité pour identifier des différences plus faibles ou faire face à une variabilité plus importante que prévue. Au total, cette étude utilisera 156 rats, répartis de manière équilibrée entre femelles et mâles. Parmi eux, certains seront utilisés pour l’apprentissage et la mise au point des techniques, tandis que d’autres feront partie des groupes expérimentaux, incluant des animaux présentant des atteintes ciblées dans différentes régions du cerveau, afin de comparer leurs effets.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions, conformes aux normes en vigueur, avec un environnement enrichi (tunnels, bâton à ronger, papier absorbant, etc…) pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés au moins une semaine avant le début des expériences et surveillés quotidiennement. Toutes les mesures nécessaires seront mises en place pour limiter la douleur et l’inconfort (antalgiques). Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse, avec une surveillance continue de la température corporelle et de la respiration. Les examens d’imagerie réalisés à différents moments chez un même animal permettent de mieux comprendre les mécanismes étudiés tout en réduisant le nombre total d’animaux utilisés. Après chirurgie, un traitement antidouleur et un complément alimentaire seront systématiquement proposés. L’état des animaux sera évalué chaque jour. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude en raison des similitudes entre son cerveau et le cerveau humain (circuits cholinergiques comparables entre les 2 espèces), ainsi qu’en raison de la taille de son cerveau qui est compatible avec la résolution spatiale de notre imageur. Les rats Wistar seront étudiés à l’âge adulte. Concernant les souches SHR et WKY, les animaux seront étudiés avant leur 8ème semaine de vie (avant apparition de l’hypertension) jusqu’à leur 14ème semaine de vie qui correspond aux premiers stades d’apparition de l’hypertension.

Pour provoquer une défaillance aiguë du foie par une injection unique de produit toxique, 2 816 souris et 2 864 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Les traitements suivent dans les vingt-quatre heures, jusqu'à deux fois par jour par gavage ou par voie intraveineuse, ou en perfusion pendant six heures sur des animaux qui arrivent déjà implantés. Les prélèvements finaux se font sous anesthésie, sans réveil, pour analyser le foie par histologie et transcriptomique. Rien n'est dit des atteintes attendues chez les animaux: à la place, le texte redécrit le modèle et le qualifie d'altération "sévère mais maîtrisée" des fonctions du foie.

Objectifs

Notre laboratoire cherche à mieux comprendre pourquoi le foie peut soudainement cesser de fonctionner correctement après une exposition à des substances toxiques. Cette défaillance rapide du foie est une situation grave, qui s’accompagne souvent d’une forte inflammation et perturbe profondément l’équilibre de l’organisme. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons un modèle expérimental chez le rongeur qui permet de reproduire, de manière contrôlée, les lésions du foie observées dans ce type de situation. Ce modèle permet d’examiner comment le foie réagit à une agression aiguë et comment ses fonctions peuvent être altérées. L’objectif principal du projet est d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques visant à protéger le foie et à favoriser sa récupération après une agression. Ces approches reposent sur des systèmes naturels de transport de biomolécules, capables d’agir sur les processus inflammatoires et de soutenir la régénération des tissus. Grâce à ce modèle, nous cherchons à mieux comprendre comment ces traitements peuvent réduire l’inflammation du foie, favoriser la réparation des tissus endommagés et contribuer au rétablissement des fonctions hépatiques, avec pour finalité le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des situations cliniques graves.

Bénéfices attendus

Pour mieux comprendre cette maladie et trouver de nouveaux traitements, nous développons un modèle expérimental chez le rat et la souris. Ce modèle reproduit les principales caractéristiques de l’ALF humaine. Il permet d’étudier en détail les mécanismes biologiques et cellulaires qui mènent à la défaillance du foie, de suivre l’évolution des marqueurs dans le sang et les tissus, et surtout de tester des traitements innovants dans des conditions contrôlées. Ce modèle est une étape essentielle pour mieux comprendre comment l’ALF se développe, et pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de cette maladie.

Procédures

Les animaux subiront une administration unique d'un agent toxique pour le foie par voie intrapéritonéale réalisée sur animal vigile d’une durée courte (comprise en 5 et 10 secondes). Les traitements avec des composés pourront être réalisés au maximum en deux fois par jour soit par gavage sur animal vigile d’une durée courte (comprise en 5 et 10 secondes) soit par voie intraveineuse avec contention en tunnel et une durée de traitement entre 5 et 10 secondes soit en perfusion sur des animaux qui arriveront implantés et ce pendant au maximum 6 heures. Les traitements seront étalés sur les 24 heures qui suivent l'administration de l'agent inducteur. Les prélèvements finaux seront réalisés sous anesthésie avec mise à mort des animaux sans réveil des animaux.

Impact sur les animaux

Ce projet a pour objectif de mettre au point un modèle expérimental permettant d’étudier une défaillance aiguë du foie, comparable à celle observée chez l’être humain lors d’atteintes graves et soudaines de cet organe. Ce modèle repose sur une agression unique et contrôlée du foie, suffisante pour provoquer une altération sévère mais maîtrisée de ses fonctions. Une première phase du projet permettra de définir les conditions les plus adaptées pour reproduire cette atteinte de manière fiable et reproductible, tout en limitant au maximum les effets indésirables pour les animaux. Cette étape est essentielle pour s’assurer que le modèle est pertinent et utilisable pour la suite des travaux. L’évolution de l’atteinte hépatique sera suivie sur une courte période, afin d’observer à la fois les effets précoces et les conséquences plus tardives de l’agression. Cette approche permet d’identifier les différentes étapes du processus conduisant à la défaillance du foie et de mieux comprendre comment la maladie se met en place. Une fois le modèle validé, le projet vise à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques destinées à limiter les dommages au foie et à favoriser sa récupération. Ce modèle constitue ainsi un outil essentiel pour améliorer les connaissances sur les mécanismes de cette pathologie grave et contribuer au développement de nouvelles stratégies de prise en charge, dans un cadre rigoureux et respectueux du bien être animal.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les différentes procédures du projet seront mis à mort de manière éthique et conforme à la réglementation en vigueur, notamment selon les méthodes recommandées par la directive 2010/63/UE et les bonnes pratiques en matière de bien-être animal. Cette euthanasie interviendra à l’issue des protocoles expérimentaux, principalement pour permettre le prélèvement de sang et d’organes, en particulier le foie. Ces prélèvements sont indispensables pour réaliser des analyses histologiques et transcriptomiques, qui permettront d’évaluer l’efficacité des composés testés et de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Aucun animal ne sera conservé au-delà de la durée nécessaire à l’étude, et toutes les procédures seront réalisées dans le respect des principes de remplacement, réduction et raffinement (3R).

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous utilisons d’abord des modèles in vitro, comme des cultures de cellules ou des mini-structures appelées sphéroïdes, pour tester et sélectionner des traitements potentiels. Ces méthodes permettent de limiter l’utilisation d’animaux, conformément aux principes éthiques de la recherche. Cependant, elles ont leurs limites : elles ne peuvent pas reproduire toute la complexité du corps humain, ni simuler les réactions globales d’un organisme face à une agression toxique. Par exemple, ces modèles ne permettent pas d’étudier correctement les effets sur le métabolisme, le système immunitaire ou la manière dont le corps absorbe et élimine un médicament. C’est pourquoi, à un certain stade, il devient nécessaire d’utiliser un modèle animal. Nous utilisons un modèle chez le rat et la souris, dans lequel une seule injection d’un produit toxique pour le foie provoque une atteinte aiguë similaire à celle observée chez les patients. Ce modèle est bien contrôlé et permet d’évaluer l’efficacité des traitements dans un organisme complet.

Réduction

Avant de tester un traitement sur des animaux, nous sélectionnons rigoureusement les molécules les plus prometteuses. Seules celles qui ont montré un effet positif dans des tests en laboratoire (sur des cellules et des mini-organes appelés sphéroïdes) sont retenues. Cela permet d’éviter d’utiliser des animaux inutilement, en ne poursuivant que les recherches indispensables. Dans ce projet, nous utilisons un modèle rapide d’atteinte du foie, provoqué par une seule injection d’un produit toxique. Les effets apparaissent en quelques heures, ce qui permet de limiter la durée d’exposition des animaux, de réduire les différences entre individus, et d’obtenir des résultats fiables avec moins d’animaux. Les paramètres étudiés (comme les marqueurs biologiques du foie, l’expression des gènes ou l’état des tissus) sont choisis pour leur fiabilité et leur pertinence scientifique. Grâce à des données déjà connues, nous pouvons calculer précisément le nombre d’animaux nécessaires, en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Cela garantit des résultats solides tout en évitant la surutilisation. Le protocole est simple : une seule injection, sans chirurgie ni manipulation répétée. Cela réduit les risques d’échec technique et contribue à limiter le nombre total d’animaux utilisés. Enfin, pour les tests par perfusion intraveineuse, les rats et souris arrivent déjà équipés d’un dispositif implanté. Comme leur état inflammatoire est différent de celui des animaux non traités, il faudra ajuster la dose du produit toxique pour chaque espèce. Ces études seront menées dans des procédures séparées, avec des doses spécifiques, afin de garantir des conditions adaptées et éthiques.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet sont hébergés dans des conditions optimisées pour leur bien-être. Les rongeurs sont logés par groupe compatible avec leur comportement social, dans des cages enrichies comprenant du coton compressé pour la construction de nids, des igloos ou des tunnels en polycarbonate teintés pour favoriser le comportement de dissimulation, et des éléments de stimulation tels que des blocs de bois. Un complément alimentaire de type diet gel boost, hautement nutritif et appétent, sera systématiquement mis à disposition après chaque administration de produit toxique pour le foie ou chaque prélèvement, afin de soutenir la récupération et limiter les effets secondaires liés au protocole. Le modèle expérimental mis en œuvre est modéré, basé sur une administration unique de produit toxique pour le foie par voie intrapéritonéale, sans intervention chirurgicale ni douleur attendue. Les effets observés sont principalement transitoires : réduction de l’activité spontanée, baisse de la prise alimentaire et hydrique, et perte de poids modérée. Ces signes sont suivis de manière rapprochée, et des points limites clairement définis permettront d’intervenir rapidement si un animal présente des signes de détérioration non attendus. Le protocole est conçu pour minimiser les manipulations et réduire le stress. L’ensemble de ces mesures vise à raffiner les conditions expérimentales, en assurant un niveau de bien-être élevé pour les animaux tout au long de l’étude, tout en garantissant la pertinence scientifique des observations.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont couramment utilisés pour étudier les maladies graves du foie, car leur fonctionnement général présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Les réactions du foie face à une agression, ainsi que sa capacité à se réparer, peuvent ainsi être étudiées de manière pertinente dans ces modèles. Les modèles utilisés permettent de reproduire les principales altérations observées lors d’une défaillance aiguë du foie, notamment les dommages aux cellules hépatiques et la réaction inflammatoire associée. Le recours à différents types d’animaux permet de mieux tenir compte de la variabilité naturelle des réponses biologiques et d’identifier les situations les plus représentatives de la maladie étudiée. Ces modèles offrent également la possibilité d’un suivi rigoureux de l’évolution de la maladie et de l’effet des approches thérapeutiques évaluées, dans des conditions contrôlées. Le choix de ces animaux et des conditions expérimentales vise à obtenir des résultats fiables et reproductibles, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés et en respectant leur bien être. Les animaux sont utilisés à un stade de développement où leur organisme est suffisamment mature et stable, ce qui permet de limiter les variations liées à la croissance ou à l’âge et d’assurer une meilleure comparabilité des résultats.

Un gavage quotidien pendant jusqu'à quarante jours chez les mâles, et des prélèvements sanguins pouvant atteindre 15 % du volume sanguin total: 1 760 rats juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'étude mesure l'ouverture vaginale et la séparation préputiale pour repérer les produits chimiques qui perturbent la puberté, selon des lignes directrices reconnues en Europe et aux États-Unis. Le porteur annonce des effets toxiques modérés, dont des pertes de poids, une salivation augmentée, des tremblements ou des variations de mobilité et de température corporelle. 1 610 rats seront tués pour prélever leurs organes, 100 réutilisés dans un projet de formation ou de prélèvement d'échantillons, et 50 gardés en vie pour être adoptés, à condition de ne présenter aucun signe de mal-être.

Objectifs

Le premier objectif de ce projet est de vérifier si un produit chimique peut agir comme certaines hormones naturelles, en particulier les œstrogènes (que ce soit de manière agoniste/en activant des récepteurs ou antagoniste en les bloquant). Certains produits peuvent en effet imiter ou bloquer l’action de ces hormones, ce qui peut perturber le fonctionnement normal de l’organisme. Cela peut avoir des conséquences négatives sur la santé, notamment sur la croissance et la reproduction. Le deuxième objectif du projet est d’identifier les produits chimiques qui pourraient perturber le système hormonal. Pour cela, on observe leur impact sur le développement de la puberté chez de jeunes rats, mâles et femelles. Ces tests précoces permettent de repérer rapidement les substances potentiellement problématiques et d’éviter des études plus longues impliquant davantage d’animaux. Ils fournissent de nombreuses informations et reposent sur des méthodes reconnues au niveau international, comme les tests utérotrophiques et pubertaires (lignes directrices en Europe et aux états unis).

Bénéfices attendus

Cette étude conduite précocement avec un nombre restreint d’animaux permet d’identifier très tôt dans le développement d’une molécule des effets sur l’équilibre hormonal ou la croissance d’un animal juvénile et d’arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes de perturbation endocrinienne importantes et ainsi éviter des études plus importantes avec plus d'animaux.

Procédures

Les animaux juvéniles seront gavés journalièrement à l’aide d’une sonde souple et flexible en plastique adaptée à leur taille et âge pendant 3 à 23 jours chez la femelle et maximum 40 jours chez le mâle. Cette technique est réalisée en moins de 15 secondes. Des prélèvements sanguins d’une durée inférieure à 2 minutes, pourront être réalisés sur animaux vigiles et/ou animaux anesthésiés. Ce prélèvement peut être unique ou répété en respectant les durées de la récupération physiologique ainsi que le volume maximal prélevable correspondant à 15 % du volume sanguin total. Pour les prélèvements d’organes, les animaux sont mis à mort à la fin de l'experimentation.

Impact sur les animaux

Un stress léger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des animaux. Le gavage effectué à l’aide d’une sonde souple peut induire un léger inconfort et très rarement une irritation de l’œsophage. Des micro-prélèvements peuvent être effectués par ponction à la veine saphène ou pour un volume plus important à la veine submentale ou à la veine sublinguale. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prélèvement. Les effets toxiques attendus sur ce projet sont modérés car une étude de tolérance et de choix de doses a déjà été réalisée. Certains signes de toxicité modérée peuvent néanmoins apparaître en cours d'études incluant des pertes de poids ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, augmentation ou diminution de la mobilité, tremblements ou impact sur la température corporelle.

Devenir

En raison du but de l’étude qui est d’évaluer les effets sur la maturité sexuelle, les animaux sont généralement mis à mort pour prélèvements d’organes. Si aucun prélèvement n’est réalisé (exemple : femelles de la partie pubertaire), les animaux témoins ne présentant aucun signe de mal être en fin de procédure pourront être gardés pour être réutilisés dans le projet formation ou sample par exemple ou gardés en vie pour être adoptés.

Remplacement

Avant de réaliser cette étude sur le modèle animal, de nombreux essais in vitro (exemple : Aromatase, steroidogenesis, androgen/oestrogen receptor binding affinity) ou in silico - réalisé par ordinateur à partir de données déjà acquises - sont utilisés pour prédire le potentiel effet de perturbation endocrinienne (sur les hormones) d’une substance, mais ils ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire ou la composition biologique complète d’un organisme entier, conduisant - ou pas - à l’induction d’effets de perturbation endocrinienne, ni la gravité des effets induits par l'exposition au produit. De plus, certains paramètres comme le développement de la puberté par évaluation du début de l’ouverture vaginale ou de la séparation préputiale ne peuvent pas être mesurés in vitro.

Réduction

Ce projet se fait dans le respect des 3Rs avec un nombre minimal d'animaux basé sur l’expérience du laboratoire et permettant une évaluation biologique et statistique suffisantes : 8 animaux/groupe (6 femelles/groupe seulement pour la partie utérotrophique). Deux molécules peuvent être testées dans une seule étude afin de réduire le nombre d’animaux utilisés (1 seul groupe témoin). Après plus de 5 années d'expérience, le nombre d’animaux par groupe a été redéfini et est le minimum d’animaux nécessaires compte tenu de la sensibilité et de la variabilité du test, afin de faire une évaluation correcte des paramètres enregistrés. L’objectif reste également de ne tester chez l’animal que des molécules sélectionnées comme non toxiques par des méthodes alternatives et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le processus de recherche et développement.

Raffinement

Les conditions d’hébergement enrichies et adaptées aux animaux juvéniles (exemple : gel de nutrition ajouté pour le sevrage des femelles à l'age de 18 jours), le personnel formé ainsi que l’utilisation d’une manipulation douce des animaux permettent de réduire le stress pré-procédural au strict minimum. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particulière pendant la première phase de traitement (au moins 2 observations dans la journée). Ils sont pesés quotidiennement pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Des points limites suffisamment prédictifs et adaptées aux animaux juvéniles seront appliqués. Des micro-prélèvements sanguins seront privilégiés. Lors des prises de sang, l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Le jour précédent leur mise à mort, les animaux juvéniles sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Pour la partie utérotrophique le test aurait pu être réalisé sur des femelles adultes ovariectomisées par (retrait chirurgical des ovaires) (OECD 440). Cette méthode n’a pas été retenue au laboratoire afin d’éviter le prétraitement chirurgical des animaux.

Choix des espèces

Le rat est le modèle expérimental choisi en raison de son utilisation fréquente dans les études de toxicologie du développement et de la disponibilité de la souche suffisamment caractérisée. Les modèles rongeurs et notamment le rat est recommandé par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précédemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l’espèce et la souche choisie (Rat Wistar). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Ces études visent à étudier les effets d’un composé d’essai sur différents paramètres de la puberté. Ainsi, de jeunes rats immatures agés de 18 et 23 jours au début de l’étude sont utilisés dans ce projet conformément aux recommandations des lignes directrices internationales. Cela nécessite donc l’utilisation d’animaux sexuellement immatures. Des mesures seront prises pour garantir que seuls les animaux sevrés à un âge bien précis soient utilisés dans l'étude, car la sensibilité du test varie en fonction de l'âge de l'animal. L’utilisation de jeunes femelles dont dont le systeme hormonal n'est pas encore actif (axe hypothalamo-pituito-ovarien non fonctionnel) est nécessaire afin d’avoir de faibles niveaux d’œstrogènes endogènes/naturels en circulation. La partie uterotrophique devant s’arrêter au jour 21 après la naissance et le traitement étant de 3 jours consécutifs (lignes directrices internationales), des femelles immatures au jour 18 après la naissance seront utilisées.

216 rats génétiquement modifiés, obèses et hypertendus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue. Ils subissent des jeûnes de seize heures, des injections de glucose ou d'insuline avec mesure de la glycémie tous les quinze minutes, des échographies cardiaques sous anesthésie à dix et vingt semaines, puis une mesure de pression intracardiaque par sonde avant la mise à mort et le prélèvement des organes. L'objectif déclaré est d'établir la carte d'identité de cellules sanguines qui pourraient devenir un marqueur de la cardiomyopathie diabétique, testable ensuite chez les patients par une simple prise de sang. Le texte situe cette mesure de pression intracardiaque chez des souris, alors que le projet ne porte que sur des rats.

Objectifs

La cardiomyopathie diabétique est une maladie du muscle du coeur qui touche particulièrement les patients diabétiques de type 2, ayant souvent un syndrome métabolique. Elle est associée à un mauvais fonctionnement du coeur qui peut engendrer le développement d’autres maladies cardiovasculaires dont l’insuffisance cardiaque. L’insuffisance cardiaque se définit par une mauvaise distribution du sang dans le corps par le coeur et cliniquement aboutit à une fatigue et un essoufflement dans les gestes de la vie courante. Actuellement, les techniques d’analyses/identifications de cette maladie ne sont pas spécifiques du diabète de type 2 et sont souvent tardives, impliquant que la maladie est déjà bien installée. Récemment, des cellules circulantes du sang (PBMC) ont été identifiées comme des indicateurs biologiques potentiels de plusieurs maladies dont certaines en lien avec le diabète de type 2 et des maladies cardiaques. Ces biomarqueurs peuvent être isolés et étudiés à partir d’une simple prise de sang. Notre objectif est d’établir la carte d’identité des PBMC que nous pourrions associer à l’insuffisance cardiaque dans un modèle de rat diabétique, obèse et hypertendu, pour identifier un indicateur biologique spécifique de la cardiomyopathie diabétique dans le sang qui pourra ensuite être testé chez les patients.

Bénéfices attendus

Notre étude pourrait permettre d’identifier un indicateur biologique spécifique de la cardiomyopathie diabétique dans le sang qui pourra ensuite être testé chez les patients par simple prise de sang.

Procédures

Sur un groupe d’animaux, un test de raffinement du mode d’injection de l’insuline sera effectué pour le suivi de la glycémie afin de déterminer le statut du diabète. Après une période de repos (minimum une semaine), un jeun de 16h sera réalisé avant la mise à mort pour avoir un état nourri similaire pour les analyses ultérieures. Le lendemain matin, sous anesthésie profonde, un prélèvement de sang sera réalisé, entrainant la mort de l’animal. Les organes seront ensuite prélevés post-mortem pour les analyses. Sur un autre groupe, le suivi sera de 5 ou 10 semaines chez des rats génétiquement modifiés obèses ou minces, avec suivi de la glycémie toutes les deux semaines. Le développement du diabète chez les rats sera mesuré par un test à 8 ou 18 semaines. Pour cela, les rats seront mis à jeun pendant 16 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Une échographie sera effectuée à 10 et 20 semaines sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie générale :30min) pour étudier la fonction contractile du cœur. La pression du sang dans le cœur sera mesurée à l’aide d’une sonde sur des souris sous anesthésie et sous analgésie avant la mise à mort pour prélèvements des organes à analyser.

Impact sur les animaux

Ce type de rats obèses et hypertendus développe une insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée, c’est-à-dire un remplissage en sang diminué du cœur, mais une éjection normale du sang par le cœur. Comme chez les patients, face à un effort, ces rats sont plus fatigués. L’obésité peut entrainer un inconfort avec une diminution des mouvements. Les tests de tolérance au glucose ou à l’insuline peuvent entrainer une légère douleur de courte durée due à l’injection et au prélèvement de sang. La mise à jeun peut entrainer un risque d’hypoglycémie. Les prélèvements de gouttes de sang peuvent entrainer une légère douleur et un court stress.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse des différents organes.

Remplacement

Cette maladie comporte un dérèglement métabolique qui altère plusieurs organes, avec une communication par le sang entre eux : notre objectif étant d’identifier un marqueur circulant de cette maladie, le recours à l’animal est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les prélèvements (sang et tissus) seront utilisés sur d’autres projets (analyses des molécules circulantes du sang, fonction des cellules du cœur et du foie).

Raffinement

Notre projet comporte un test de raffinement du mode d’injection de l’insuline (sc versus iv) au cours d’un test de tolérance. Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous médication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis

Choix des espèces

Ce type de rats obèses et hypertendus est à ce jour considéré comme l’un des meilleurs modèles précliniques de l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée d’origine métabolique. Des rats ZSF1 obèses et minces seront utilisés à 10 et 20 semaines pour étudier la progression de la maladie.