Souris

Greffées de cellules tumorales sous la peau, puis soumises à quatre injections d'un virus dans la tumeur, à des irradiations localisées et à quatre injections d'anticorps, 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour examiner leurs tissus. Il s'agit de mesurer si l'association de la radiothérapie, d'un virus oncolytique et d'une immunothérapie freine la croissance des tumeurs. Le porteur indique que ces tumeurs nécrosent "malgré leur petite taille", avec une douleur modérée possible. Parmi les raisons du choix de l'espèce, il cite l'agrément de son animalerie, qui autorise l'hébergement "des souris seulement".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité préclinique du traitement combiné: radiothérapie et virus oncolytique, avec ou sans immunothérapie sur le contrôle tumoral.

Bénéfices attendus

En adoptant cette approche, nous visons à minimiser les limitations des thérapies utilisées seules, à améliorer les résultats thérapeutiques et à augmenter la réponse globale des tumeurs en limitant les toxicités liées aux traitements. Cette stratégie de traitement à multiples facettes non seulement promet d'améliorer les résultats thérapeutiques actuels mais pourrait également nous conduire à développer de nouvelles stratégies de traitement antitumoral plus efficaces et moins toxique en particulier pour la prise en charge des cancers résistants. Ce projet espère fournir une base solide et des nouvelles perspectives pour optimiser les traitements cliniques futurs tout en réduisant les effets secondaires des thérapies en question. L’association d’un virus oncolytique avec la radiothérapie constitue une approche prometteuse pour surmonter les limitations liées à la résistance des tumeurs et améliorer l’efficacité tumoricide.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections en sous cutanée (une fois, durée environ 10-20 secondes) et à des injections en intra-tumoral (quatre fois, durée environ 20 secondes) sous anesthésie générale. Les animaux recevront des irradiations localisées des tumeurs (un cycle d'irradiation dure environ 1-5 minutes en fonction de la dose) sous anesthésie générale. L’anticorps sera injecté quatre fois, durée environ 10-20 secondes, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir une légère douleur et inconfort transitoires liés à l’injection des cellules tumorale et aussi à l’injection de l’immunothérapie. Les animaux peuvent également ressentir du stress léger et transitoire lié à leur immobilisation dans les caches de contention pendant le temps d’irradiation. L’injection intra-tumorale du virus peut entrainer la formation d’une très petite croûte à l’endroit de l’injection. Ceci pourra entraîner un léger prurit temporaire. En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit et/ou une réduction de l'activité. Les modèles utilisés sont réputés pour produire des tumeurs qui nécrosent, malgré leur petite taille. Cette nécrose peut entraîner une douleur modérée.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour examen post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique d’un modulateur de l’immunité dans les tumeurs, combinés à la radiothérapie. Ceci exige donc un système biologique dynamique et complet en interaction direct avec le stroma tumoral. Ceci nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico. Les modèles in vitro et in silico ne peuvent pas fournir ou assurer l’ensemble des voies biologiques ainsi que toutes les interactions physiologiques essentielle dans la réponse des tissus et des cellules aux traitements notamment à l’irradiation. Il est à noter que la réponse d’un tissu ou d’une tumeur à l’irradiation implique l’activation de plusieurs voies de signalisations et de plusieurs systèmes dont le système immunitaire. Ce dernier étant composé de plusieurs populations (lymphocytes, macrophages, monocytes, neutrophiles…) localisées dans des organes différents (rate, ganglions lymphatiques, et autres) et assurant des fonctions différentes, ne peut être reproduit ni in vitro ni in silico.

Réduction

Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale.Ces calculs nous ont permis de déterminer la taille des lots à traiter, et les résultats seront étudiés par analyse de variance.

Raffinement

Une anesthésie générale sera faite lors des injections ainsi que lors des irradiations. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Un aliment appétent et énergétique sera proposé en cas de nécessité (diminution de l'appétie, perte de poids).

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, des études impliquants des immunomodulateurs (comme les inhibiteurs de PD1/PD-L1/CTLA-4 et les virus oncolytiques) et l'étude de la croissance tumorale. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. De plus, l’agrément de notre animalerie autorise l’hébergement des souris seulement. Et pour des raisons de taille et de capacité d’hébergement, la souris reste le choix premier. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 à 9 semaines, âge auquel elles sont considérées comme adultes. À cet âge, le système immunitaire des animaux a atteint sa maturité, ce qui constitue un point critique pour les études en immunologie.

2 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont castrées par chirurgie, greffées de cellules ou de fragments de tumeurs de prostate humaine, parfois irradiées sur tout le corps, transportées cinq à six heures d'un établissement à l'autre et soumises jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie. Le bénéfice annoncé se limite à évaluer de "nouveaux composés de radiothérapie interne vectorisée", face à des tumeurs qui peuvent nécroser et provoquer une cachexie. Sur le remplacement, le porteur affirme ne pas pouvoir se passer d'un "organisme entier" et juge les "modèles animaux" "indispensables".

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies ciblées couplées à des radioéléments. Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement une protéine surexprimée par les cellules tumorales prostatiques. Pour la thérapie, on utilise des molécules radioactives puissantes sur une distance très courtes (de l’ordre du millimètre ou micromètre), détruisant ainsi les cellules tumorales à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée, tout en limitant la toxicité sur les tissus sains environnant la tumeur. Dans ce projet, l’objectif principal est d’évaluer l’activité antitumorale de nouveaux traitements ciblés. Dans le cas où aucune donnée de toxicité ne serait disponible, une étude de la toxicité de ces thérapies ciblées pourra être réalisée au préalable dans le cadre de ce projet. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le développement de la radiothérapie interne vectorisée est actuellement en plein essor. En effet, cette thérapie cible de façon spécifique la tumeur de chaque patient, et permet un traitement personnalisé. Notre projet permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés de radiothérapie interne vectorisée.

Procédures

Une induction tumorale : sous anesthésie (

Impact sur les animaux

- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires sur une courte période et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu dans des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait, si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, selon le modèle tumoral, que la progression tumorale entraîne une cachexie (amaigrissement et fatigue) constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - lors de la répartition en groupes homogènes selon les critères de volume tumoral et de poids corporel, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés intraveineux qui pourront induire un stress léger. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.

Devenir

Différentes analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes ; les modèles animaux sont ainsi indispensables. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. Les effectifs d’animaux dans les groupes expérimentaux ont été adaptés pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant au maximum les effectifs des groupes. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle permet d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

La chirurgie pour la greffe de fragments tumoraux et la castration sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse sur lit chauffant afin de réduire l’inconfort potentiel et permettre ainsi le raffinement de l’étude. La chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une couverture analgésique. Une surveillance post opératoire et des soins post opératoires adaptés sont appliqués si nécessaires.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix en pharmacologie car son génome est connu et ses principales fonctions physiologiques (fonction rénale, hépatique) sont comparables à l’Homme. D’autre part, les souris sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation des molécules utilisées pour cibler et visualiser les tumeurs chez l’homme. Du point de vue scientifique, la souris porteuse de tumeur reste le modèle de choix dans les études d’évaluation de l’efficacité des nouvelles thérapies contre le cancer. Les animaux pourront être utilisés pour l’induction tumorale à un âge minimum de 5 semaines (jeune adulte), et pourront ensuite être traités à partir de l’âge de 7 semaines (adulte), les modèles de tumeur de prostate humaine nécessitant au moins 2 semaines post implantation pour commencer à pousser. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de traiter des animaux possédant les fonctions physiologiques correspondant au stade adulte.

Les souris de ce projet portent une modification ciblée des récepteurs cannabinoïdes CB1 dans certaines régions du cerveau, issues de lignées dont le porteur indique vouloir réduire la "production excédentaire". 3 008 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies de 45 à 60 minutes à vingt jours d'intervalle, avec pose d'implants d'enregistrement, des injections sans anesthésie, puis jusqu'à deux tests de locomotion que le résumé ne nomme pas. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les comportements moteurs regroupent l’ensemble des mouvements et actions permettant à un organisme d’interagir avec son environnement. Ils reposent sur des mécanismes biologiques, en partie innés et en partie acquis, qui organisent et adaptent les mouvements en fonction des besoins et des contraintes du milieu. Cela inclut aussi bien des actions rapides et orientées vers un but, comme se déplacer ou atteindre un objet, que des ajustements plus fins permettant de maintenir l’équilibre ou la posture. Ces différentes formes de mouvement s’articulent en permanence pour assurer une adaptation flexible aux situations. Le contrôle du mouvement est assuré par des circuits cérébraux spécialisés impliqués dans la sélection et la coordination des actions. Dans ce cadre, certaines molécules naturelles présentes dans le cerveau contribuent à ajuster finement la communication entre neurones et à moduler la manière dont les comportements moteurs sont initiés et exécutés. Bien que leur action soit souvent associée à une diminution de l’activité neuronale, elles peuvent également jouer un rôle important dans la fluidité et la flexibilité des mouvements. L’objectif de ce travail est d’étudier le rôle de ces mécanismes biologiques dans le contrôle du comportement moteur, dans une région cérébrale impliquée dans la régulation des actions et des habitudes motrices. L’hypothèse est que ces mécanismes, présents dans différents types de cellules cérébrales, participent à la transition entre différents états moteurs et à l’adaptation du comportement. Ces processus pourraient être altérés dans certaines maladies neurologiques responsables de troubles du mouvement, comme la maladie de Parkinson. Pour tester cette hypothèse, des souris présentant une modification ciblée de ces mécanismes dans certaines régions du cerveau seront étudiées lors de tâches motrices standardisées. Ces tâches permettent d’évaluer la coordination et l’adaptation des mouvements dans des conditions contrôlées. Des approches complémentaires en biologie moléculaire, en enregistrement de l’activité cérébrale et en analyse comportementale seront utilisées afin de comprendre comment ces mécanismes influencent le comportement moteur.

Bénéfices attendus

Les substances actives du cannabis agissent sur des mécanismes naturels présents dans le cerveau, impliqués dans la régulation de l’activité des cellules nerveuses. Dans des conditions normales, ces mécanismes sont activés par des molécules produites par l’organisme lui-même et participent à l’équilibre de la communication entre neurones ainsi qu’à certains processus de protection du système nerveux. Certaines substances dérivées du cannabis ont également été étudiées pour leurs effets potentiels sur le cerveau, notamment dans des pathologies affectant les fonctions motrices et comportementales. Comprendre le fonctionnement de ces mécanismes naturels permet de mieux expliquer comment ces substances modifient l’activité cérébrale. Ce projet vise à clarifier comment ces processus biologiques régulent des circuits cérébraux impliqués dans le contrôle du mouvement et du comportement. L’objectif est de contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour des troubles liés à des altérations du comportement et du mouvement, notamment dans certaines maladies neurodégénératives et psychiatriques. Les premiers résultats pourront être présentés lors de réunions scientifiques publiques environ un an après le début des analyses. La publication dans une revue scientifique est envisagée dans un délai de 4 à 5 ans.

Procédures

Les animaux recevront des injections sur animaux vigiles (nombre d'injections défini selon le protocole expérimental ; durée d'environ 20 secondes par injection). Deux interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec prise en charge antalgique. Chaque intervention chirurgicale durera, dans son ensemble, environ 45 à 60 minutes, et les deux chirurgies seront espacées d'environ 20 jours. Cinq semaines après les interventions chirurgicales, les animaux seront soumis, au maximum, aux deux tests comportementaux destinés à évaluer leur locomotion, réalisés successivement à une distance d'une semaine entre eux. La durée totale des tests sera d'environ 30 minutes par animal, répartie sur plusieurs jours selon le protocole expérimental.

Impact sur les animaux

Les douleurs post-opératoires et la possible perte de poids liées à l’acte chirurgical sont prévues. Des nuisances liées à la cicatrisation des implants d'enregistrement sont également attendues, pouvant se traduire par un inconfort local transitoire au niveau du site d'implantation ainsi qu'un risque d'irritation ou d'inflammation locale pendant la période de cicatrisation. Un stress mineur est attendu lors des tests comportementaux utilisés, en raison du placement dans la salle expérimentale et du déplacement depuis la cage d’hébergement. Les tests comportementaux peuvent entraîner des nuisances globalement légères et transitoires. Elles sont principalement liées, d’une part, à l’exposition à un environnement nouveau, à la manipulation et à l’isolement temporaire pendant l’enregistrement comportemental, pouvant induire un stress modéré et de courte durée, et d’autre part, à l’effort locomoteur répété associé aux essais.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures pour prélèvement des cerveaux pour analyses.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance du comportement et de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations fiables afin d’étudier les changements qui se produisent. En outre, l'utilisation d'invertébrés, dont le système nerveux est complètement différent, serait inappropriée. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur les mammifères reste nécessaire. Le but du projet est d'étudier un phénomène comportemental qui ne peut pas être reproduit par des études in-vitro (dans des cultures cellulaires) car il s’agit de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est fixé au minimum permettant d'obtenir des résultats fiables et comparables à la littérature scientifique, compte tenu de la variabilité importante des mesures comportementales locomotrices. Des estimations préalables de taille d'échantillon garantissent une puissance statistique suffisante pour détecter des effets biologiquement pertinents, avec des analyses adaptées à la nature des mesures et à la taille des groupes. Le nombre total d'animaux prévu pour l'ensemble du projet est d'environ 3008 souris sur 5 ans, en raison de la combinaison de plusieurs approches expérimentales et de l'utilisation de différentes lignées de souris. Pour les analyses combinant comportement et mesures biologiques, un maximum d'environ 16 animaux par groupe est prévu, ce nombre pouvant être réduit si les données montrent qu'un effectif plus faible suffit. Plusieurs approches permettent de limiter le nombre d'animaux utilisés : une gestion adaptée des accouplements et des colonies évite les étapes inutiles, l'identification précoce des animaux pertinents réduit leur production excédentaire, et la conservation/le partage de lignées validées évite leur production répétée.

Raffinement

Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Toutes les procédures chirurgicales, tant préopératoires que postopératoires, comprennent également l'utilisation d'analgésiques pour la gestion de la douleur et des mesures d'analgésie prises immédiatement si nécessaires. L'établissement des points limites est basé sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux. Si un point est atteint, le vétérinaire en sera informé et nous prendrons une décision ensemble soit des soins comservatoires, soit une mise à mort, afin d’éviter toute souffrance des animaux. Nous définissons les points limites par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs. Une habituation à la préhension sera réalisée avant chaque protocoles expérimentaux.

Choix des espèces

La souris est utilisée comme modèle de référence en raison de sa forte utilité expérimentale, de la possibilité de comparer les résultats avec des travaux antérieurs réalisés au sein du laboratoire et dans la littérature scientifique, ainsi que de la disponibilité de modèles permettant d’étudier des altérations ciblées de certaines protéines d’intérêt. Les expériences sont réalisées chez des animaux adultes afin d’éviter les effets liés au développement et de limiter la variabilité interindividuelle. Ce choix permet également une meilleure comparabilité avec les études existantes. Les interventions chirurgicales sont effectuées vers l’âge de 8 semaines, suivies d’une période de récupération de plusieurs semaines avant les évaluations comportementales. Les tests sont ensuite réalisés lorsque les animaux ont atteint l’âge adulte stabilisé, soit entre 12 et 16 semaines.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut être mise à jeun jusqu'à six fois, gavée sans anesthésie et soumise jusqu'à six prises de sang sous anesthésie, avec des isolements de trente minutes pour recueillir ses fèces. Il s'agit de vérifier si des nanoparticules d'ARN messager avalées déclenchent une réponse immunitaire dans l'intestin, le vaccin oral restant un bénéfice "à long terme". Des essais sur cellules et sur un intestin reconstitué en trois dimensions ont précédé, mais le porteur écrit que ces méthodes "ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant".

Objectifs

Développer des vaccins plus efficaces contre les infections au niveau des muqueuses est un enjeu important, notamment celles qui commencent au niveau des muqueuses. Les muqueuses sont en effet la porte d’entrée de nombreux virus et bactéries. Parmi elles, la muqueuse intestinale est particulièrement intéressante, car elle contient de nombreux éléments du système immunitaire et peut déclencher une forte défense directement à l’endroit où l’infection débute. Cependant, administrer un vaccin par voie orale est difficile à cause de l’acidité de l’estomac, des enzymes digestives et de la couche de mucus qui protège l’intestin. La pandémie du Covid-19 a permis le développement de nouveaux vaccins utilisant l’ARN messager (ARNm), une molécule naturellement présente dans notre organisme qui donne aux cellules les instructions pour fabriquer des protéines. Cet ARNm est transporté par des nanoparticules composées de lipides. Néanmoins, il n’existe encore aucun vaccin à ARNm pouvant être pris par voie orale. Pour relever ce défi, des nanoparticules combinant des lipides et des polymères pourrait offrir une meilleure protection de l’ARNm et faciliter son passage jusqu’à la muqueuse intestinale. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer si ces nanoparticules peuvent induire une réponse immunitaire après administration par voie orale.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’évaluer les capacités d’immunisation des nanoparticules d’ARNm chez la souris. Les bénéfices scientifiques du projet portent principalement sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l’induction d’une réponse immunitaire au niveau de l’intestin (cinétique d’apparition des anticorps, acteurs immunitaires, chimie et composition des nanoparticules utilisées). Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à ARNm administré par voie orale, pouvant être adapté à différents agents infectieux touchant le système digestif.

Procédures

560 souris seront soumises à des mises à jeun (6 fois par animal maximum) et à des injections et/ou administrations (6 fois/animal maximum, durée moins d’une minute par administration), dont 370 maximum seront administrées sous anesthésie (1 fois/animal, durée 5min). Un groupe de 285 souris sera soumis à des prélèvements sanguins (3 fois/animal, durée 1 min) sous anesthésie (3 fois/animal, durée 5 min), prélèvement de fèces (6 fois/animal, durée maximal de l'isolement : 30 min) et des prélèvements de salive (2 fois/animal, durée 1 min). Un autre groupe de 275 souris sera soumis à des prélèvements sanguins (6 fois/animal, durée 1 min) sous anesthésie (6 fois/animal, durée 5 min), prélèvement de fèces (6 fois/animal, durée maximal de l'isolement : 30 min) et des prélèvements de salive (2 fois/animal, durée 1 min).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : - Contention : la manipulation des animaux peut entraîner un stress léger et transitoire. - Anesthésie gazeuse : la phase d’induction peut générer un stress modéré en raison du bruit, de l’odeur et d’une sensation respiratoire désagréable. - Mise à jeun : les souris seront mises à jeun six heures avant l’administration par gavage oral, ce qui peut entraîner une hypoglycémie transitoire, une augmentation du stress et une légère hypothermie. - Administration dans le muscle : l’injection peut induire un inconfort léger au site d’injection. - Administration orale par gavage : ce geste réalisé sur animal vigile entraîne un stress léger lié à la contention et un inconfort transitoire post-administration. - Prélèvement de sang : un risque de lésion des vaisseaux sanguins et des nerfs oculaires existe (risque faible lorsque le geste est maîtrisé). - Prélèvement des fèces : l’isolement temporaire des animaux est indispensable pour prélever les fèces et peut être à l’origine d’un stress léger. - Administration dans le ventre : réalisée sur animal vigile, ce geste peut entrainer un stress léger dû à la contention et un inconfort léger au site d’injection (procédure de classe légère). - Administration d'une molécule qui peut induire des effets transitoires tels que des tremblements, une diarrhée, une piloérection et une augmentation du toilettage.

Devenir

A l’issu des procédures, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêts.

Remplacement

Avant de tester les nanoparticules chez l’animal, des expériences ont été réalisées sur des cellules intestinales et immunitaires, ainsi que sur un modèle en trois dimensions reproduisant partiellement l’intestin humain. Cependant, ces modèles ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant et ne possèdent pas certaines structures de la paroi intestinale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en garantissant des résultats fiables. Au total, le projet prévoit l’utilisation de 560 souris sur une période de 5 ans. Des tests préliminaires ont permis de sélectionner uniquement les formulations les plus prometteuses, ce qui réduit fortement le nombre d’animaux nécessaires. Les formulations seront évaluées et comparées progressivement. Celles ne donnant pas de résultats satisfaisants seront écartées, afin de concentrer les études sur un nombre restreints de candidats. A terme, seules quatre formulations seront retenues pour les étapes finales. De plus, un schéma vaccinal optimisé sera sélectionné afin de réduire davantage le nombre d’animaux utilisés. Cette approche progressive et sélective permettra de limiter au maximum le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans l’ensemble du projet, des mesures seront appliquées afin de limiter la souffrance et le stress des animaux tels que l’ajout d’enrichissement dans le milieu en cas de stress, une mise à jeun de jour ce qui correspond à une période où les animaux sont moins actifs et ont l'habitude de moins manger, des administrations réalisées sous anesthésie générale, des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale et locale et un suivi accru des souris après chaque manipulation. Des points limites sont définis afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou de problème chez les animaux. Si l’un de ces critères est atteint, des mesures seront prises immédiatement, et si nécessaire, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé dans le développement de vaccin. Dans ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées afin d’analyser la réponse immunitaire induire par des nanoparticules. Des souris de plus de 8 semaines seront utilisées afin d’assurer un système immunitaire mature.

1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser tumeurs et cellules immunitaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules tumorales sous la peau, elles reçoivent de trois à onze injections d'un composé oncolytique associé à des hydrogels de chitosan, et leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Les tumeurs peuvent provoquer des douleurs locales, les traitements une perte d'appétit et de poids, pour des retombées cliniques que le porteur renvoie au "plus long terme". Il juge "indispensable" de confirmer in vivo des données obtenues in vitro, et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier l'activation immunitaire.

Objectifs

Les approches d’immunothérapie anticancéreuse ont profondément modifié la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, seule une fraction des patients présente une réponse durable, en particulier lorsque les tumeurs sont peu infiltrées par les cellules immunitaires. Notre composé est un composé oncolytique membranolytique conçu pour induire localement la mort des cellules tumorales. Cette lyse provoque la libération simultanée d’antigènes tumoraux et de signaux de danger, susceptibles d’activer le système immunitaire. Le projet vise à optimiser cette stratégie en combinant notre composé à différents hydrogels de chitosan. Le chitosan présente un double intérêt scientifique : il augmente la rétention intratumorale du composé grâce à ses propriétés de gel visqueux et mucoadhésif, et il possède des propriétés immunostimulantes/adjuvantes susceptibles de « primer » le microenvironnement tumoral en faveur d’une immunité anticancéreuse. Il existe différentes formulations de Chitosan qui influencent la viscosité, la libération locale du composé et l’immunomodulation. Nous commencerons par déterminer les formulations les plus aptes à potentialiser l’effet antitumoral de notre composé. Puis, les procédures suivantes nous permettront de définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. Nous utiliserons d’abord une approche vaccinale qui pourrait permettre d’exploiter l’effet oncolytique et immunogène de de notre composé sans dépendre uniquement d’une injection intratumorale directe, ce qui serait pertinent pour les lésions non injectables ou les maladies disséminées/métastatiques. Nous vérifierons ensuite si le blocage du point de contrôle immunitaire PD-1 améliore l’effet antitumoral du composé avec son chitosan et définirons plus précisément quels types de cellules immunitaires (Cellules T et/ou cellules dendritiques) sont à l’origine de cet effet.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra d’identifier les formulations de chitosan les plus aptes à potentialiser l’activité antitumorale de notre composé. L’étude fournira des informations importantes sur l’impact des propriétés physicochimiques du Chitosan, son efficacité thérapeutique et sa capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Elle permettra également de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés à cette combinaison. Ces connaissances contribueront à optimiser l’utilisation de notre molécule et à définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. À plus long terme, les résultats pourraient soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée translationnelle, notamment l’optimisation d’une formulation locale de notre composé destinée au traitement de tumeurs accessibles à une injection intratumorale, avec l’objectif d’améliorer l’efficacité clinique tout en limitant les administrations répétées.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis trois à onze injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements, par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Ces différentes manipulations pouvant entraîner du stress chez l’animal. Les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Les traitements médicamenteux peuvent entraîner une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée chez la souris ainsi qu’un possible changement léger de température.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs et des cellules immunitaires après traitement.

Remplacement

Il est indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire et son effet sur la croissance tumorale.

Réduction

Chaque groupe comprendra 10 souris, soit 9 animaux nécessaires définis par un logiciel de statistique spécifique et 1 animal supplémentaire pour tenir compte des exclusions possibles (tumeurs hétérogènes au moment du traitement, problème comportemental, atteinte précoce d’un point limite ou mortalité non liée au traitement). Les deux sexes seront utilisés, avec des lots non mixtes, afin de détecter d’éventuelles différences liées au sexe sans risque d’accouplement ni agressivité liée au mélange des animaux. Les expériences seront conduites de manière séquentielle : seules les meilleures formulations identifiées dans les procédures initiales seront poursuivies dans les procédures mécanistiques ultérieures, ce qui limite le nombre d’animaux exposés. Les contrôles seront mutualisés lorsque cela est possible et l’étude sera arrêtée si les premières expériences ne soutiennent pas l’hypothèse scientifique.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Deux séances d'imagerie par bioluminescence sous anesthésie chaque semaine, jusqu'à douze semaines, et autant de contentions pour des injections dans le péritoine : 128 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et d'autres organes. Certaines subissent une chirurgie pour recevoir des cellules cancéreuses dans la prostate, avec un risque d'inflammation chronique et d'incontinence urinaire, d'autres une injection sous la peau dont la tumeur peut devenir nécrotique et douloureuse. Ce projet pilote sert à mettre au point des greffes tumorales, avant de futures études sur les macrophages. Le porteur présente l'effectif comme "le minimum requis", tout en écrivant que l'étude se passe de toute analyse statistique.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) représente le premier cancer chez l'homme en France. La majorité des patients CaP évolue favorablement, mais environ 20% de ces patients développent une maladie agressive avec l’apparition de métastases. Pour ces patients, des hormonothérapies visant à bloquer la voie du récepteur des androgènes (RA) et de la chimiothérapie sont proposées, mais des résistances apparaissent amenant au décès de près de 8700 patients chaque année. La compréhension des mécanismes de résistance thérapeutique est donc l’un des grands enjeux dans le domaine du CaP. Il a été montré ces dernières années que les cellules non cancéreuses comme les macrophages associés aux cellules tumorales (TAM) participent au développement du CaP et à sa résistance aux traitements. Nous souhaitons étudier l’impact des différents traitements, dont l’hormonothérapie, sur ces TAM dans un contexte tumoral. L’objectif de ce projet est de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique utilisant des cellules cancéreuses murines. Ces lignées seront injectées chez des souris ayant un système immunitaire fonctionnel. Ces cellules proviennent de la même souche de souris ce qui permet à la tumeur de se développer. Les cellules tumorales seront injectées dans deux conditions : en sous-cutanée ou en intra-prostatique. Plusieurs lignées cellulaires et plusieurs quantités de cellules seront testées pour mettre au point les modèles. Enfin la mise en place de ces modèles sera également testée dans une lignée de souris possédant des macrophages de fluorescences différentes selon leur provenance ce qui permet d’étudier l’hétérogénéité des macrophages au sein des tissus.

Bénéfices attendus

Les études récentes montrent une implication de plus en plus importante des cellules immunitaires et en particulier des macrophages dans de nombreuses pathologies, notamment le cancer et les maladies inflammatoires. La mise en place de ces modèles est un départ essentiel qui permettra d’étudier par la suite le rôle des macrophages dans un contexte de tumeur prostatique et permettra à moyen terme de mieux comprendre leur hétérogénéité et leur complexité notamment lors des différents traitements de chimiothérapie et d’hormonothérapie. A plus long terme ce projet permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cancer de la prostate afin d’éviter la résistance aux traitements.

Procédures

Les animaux au cours de ce projet seront soumis à des injections dans le péritoine et des contentions régulières (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum). Certaines souris subiront une chirurgie pour une injection de cellules cancéreuses de la prostate. Elles subiront également des prises d’images de bioluminescence sous anesthésie (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus seront dus à l’acte chirurgical et à la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sous-cutanée peut engendrer un inconfort de déplacement, parfois des nécroses et des douleurs chroniques si la taille tumorale devient trop importante. La croissance tumorale intra-prostatique peut engendrer une inflammation chronique et une incontinence urinaire. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer une légère douleur transitoire. Tous les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de prélever la tumeur et différents organes pour étudier le système immunitaire dans ces différents organes.

Remplacement

Des modèles cellulaires permettent d’étudier les macrophages dans des systèmes simples et l’étude des tissus de patients permettent d’intégrer ces données à des moments définis. Cependant l’étude dynamique de la complexité des populations de macrophages et notamment de l’impact des systèmes hormonaux et de leur inhibition (hormonothérapie) sur ces populations nécessite l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Ce projet est une étude pilote qui permettra de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique chez la souris présentant un système immunitaire fonctionnel. Cette étude ne nécessite pas d’analyse statistique. Le nombre d’animaux présenté est le minimum requis pour s’assurer de la mise en place du modèle. Il permettra d’obtenir des données sur la variabilité de la croissance tumorale qui serviront par la suite à calculer le nombre d’animaux nécessaire aux prochaines études. Pour la greffe intra-prostatique, l’utilisation d’une imagerie du petit animal par bioluminescence permettant de suivre de manière non invasive dans le temps la croissance tumorale et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

L’environnement d’hébergement sera enrichi par l’ajout systématique d’au moins deux éléments parmi du papier kraft, des carrées de coton, une maison en cellulose et un bout de bois à ronger accroché à la cage. Ces enrichissements permettront de diminuer fortement le stress et de favoriser les comportements naturels des souris. Un suivi quotidien des souris tout au long des procédures sera effectué et une évaluation bihebdomadaire de leur état sera effectuée à l’aide d’une grille de score. Cette grille permettra de détecter précocement tout signe de souffrance. L’injection intra-prostatique se fera sous anesthésie générale. Une analgésie pré- et post-opératoire sera administrée systématiquement afin de contrôler la douleur.

Choix des espèces

L'étude de la complexité des populations de macrophages lors de la croissance tumorale et particulièrement de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations sont des éléments importants pour comprendre le fonctionnement et le rôle du système immunitaire dans le cancer. Dans la littérature scientifique, la souris est l’espèce la plus largement utilisée comme modèle du cancer en général et plus particulièrement du cancer de la prostate. Elles sont un moyen unique de suivre et d'étudier les cellules immunitaire d'intérêts dans le cadre du cancer. Les souris de ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines (matures d’un point de vue hormonal) et seront uniquement des mâles car seuls les mâles possèdent une prostate et les cellules tumorales prostatiques ont besoin des androgènes (testostérone) pour croitre.

4 300 rongeurs, 2 150 souris et 2 150 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectés par le SARS-CoV-2 par le nez sous anesthésie, ils reçoivent ensuite des composés candidats, jusqu'à 84 fois par voie orale en six semaines ou par injection, et peuvent perdre du poids ou présenter des difficultés respiratoires. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter la protéine humaine ACE2, et tous finissent par une ponction intracardiaque sous anesthésie profonde. Pour écarter les méthodes sans animaux non-humains, le porteur invoque "les exigences réglementaires de tous les pays de destination des produits".

Objectifs

Dans ce projet, nous voulons évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques contre le virus SARS-CoV-2, responsable de la COVID-19. Ces composés pourraient empêcher le virus d’entrer dans les cellules ou limiter sa multiplication dans l’organisme. Nous souhaitons également étudier la réponse immunitaire de l’organisme face à l’infection et déterminer si ces composés peuvent la moduler afin d’aider à éliminer plus rapidement le virus. La présence du virus sera mesurée grâce à des méthodes permettant de détecter son matériel génétique et sa capacité à infecter des cellules en laboratoire. Les différentes variantes circulantes du virus pourront également être étudiées. Les modèles d’infection utilisés chez le hamster reproduisent plusieurs caractéristiques observées chez l’Homme lors d’une infection par le SARS-CoV-2 et permettent ainsi d’évaluer l’efficacité potentielle des traitements. Les études pourront également être réalisées chez des souris génétiquement modifiées afin de rendre leur sensibilité au virus plus proche de celle de l’Homme. Dans ce projet, le virus SARS-CoV-2 est administré par voie intra-nasale sur animal anesthésié. Après l’infection, le virus se développe principalement dans les voies respiratoires et les poumons, ce qui permet d’étudier l’évolution de la maladie et l’effet des traitements testés. Dans ce projet, il est anticipé un total de de 40 études et 4300 animaux pour les 5 prochains années.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité de composés candidats dans des modèles animaux d’infection par le SARS-CoV-2. Les études réalisées permettront d’obtenir des données précliniques essentielles sur l’activité antivirale et l’impact des traitements sur la progression de l’infection. Plus largement, ces études permettront de produire des données précliniques d’efficacité dans des modèles pertinents de la maladie, nécessaires à l’évaluation et au développement de candidats thérapeutiques. À terme, ces données pourront contribuer au développement de traitements visant à réduire la sévérité de l’infection et ses complications chez l’humain.

Procédures

Aucune procédure chirurgicale ne sera mis en œuvre sur les animaux. Selon les procédures appliquées : • Infection des souris ou hamsters : Injection intra-nasale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes • Administration de composés thérapeutiques sur une durée de 24h à 2 semaines. Par voie orale (20mL/kg/dose), vigile, 1 à 2 fois par jour par animal maximum 84 administration pour une étude de 6 semaines avec deux administration par jour, 1 minute OU Par voie sous-cutanée (10mL/kg/dose) : anesthésie générale, 1 fois par jour maximum sur 5 jours maximum, durée 1 minute OU par voie intramusculaire (0.05ML/site): anesthésie générale, administration unique quel que soit la durée de l’étude donc 2 maximum, une pour chaque patte arrière, durée 1 minute OU par voie intrapéritonéale (20mL/kg/dose) : vigile, 1 fois maximum, durée 1minute OU par voie intrathécale (20µl max) : anesthésie générale, 1 fois maximum, durée 1minute OU par voie intraveineuse (5ml/kg) : vigile, 1 fois par jour maximum sur 5 jours maximum),, durée 1minute • Suivi clinique et pondéral : Pesée et bilan clinique tous les jours par animal sur la durée de l’étude, sur animal vigile. La périodicité sera adaptée en fonction des signes cliniques et des recommandations du vétérinaire. • Prélèvement sanguin : À la veine submandibulaire (1×/2 semaines, 1 prélèvement maximum par animal sur 2 semaines) ou à la queue chez la souris (avec une période de récupération adaptée), sur animal vigile, pendant 2 semaines maximum au cours de l’étude. Prélèvement terminal sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, durée 2 minutes, sur tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, les souris et les hamsters sont infectés par le virus responsable de la COVID-19 afin d'évaluer de nouveaux traitements. Au cours de l'infection, certains animaux peuvent présenter des signes de maladie, tels qu'une perte de poids temporaire, une baisse d'activité, un aspect plus fatigué ou des difficultés respiratoires généralement modérées. Les traitements testés dans cette étude ont pour objectif de limiter la multiplication du virus et de diminuer l'inflammation provoquée par l'infection. Ils sont donc susceptibles de réduire l'intensité et la durée des signes de la maladie chez les animaux. Les composés évalués ayant pour objectif de limiter la réplication virale et la réponse inflammatoire, leur administration devrait contribuer à réduire la sévérité et la durée des signes cliniques observés, mais dans la phase de développement de candidat-médicament, des effets secondaires imprévus ne sont jamais totalement exclus. Cependant, par expérience du Projet autorisé précédent, cela est pas/peu attendu avec les molécules testées. Cependant, par expérience du projet autorisé précédent, la survenue d’effets indésirables est peu attendue avec les molécules testées, notamment au regard des données de tolérance et des études PK/PD préalablement réalisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin d’étude pour les nécessités scientifiques des études (prélèvements tissulaires terminaux). Dans le contexte infectieux, les règles de biosécurité ne nous permettent pas de garder ou d’envisager un autre devenir pour les animaux.

Remplacement

Aucune méthode évitant totalement le recours à l’animal selon les exigences réglementaires de tous les pays de destination des produits n’est développée à ce jour pour les procédures expérimentales décrites. A l’heure actuelle, les tests in vitro, effectués préalablement pour valider l’intérêt des cibles identifiées et l’efficacité de nouvelles molécules, ne permettent pas d’appréhender l’intégralité des mécanismes de l’infection et de l’interaction hôtes/pathogènes. C’est pourquoi, le recours à des modèles expérimentaux in vivo s’avère nécessaire pour la compréhension et l’évaluation des mécanismes d’actions des composés candidats. Ces modèles in vivo permettent également d’anticiper l’éventuelle toxicité des molécules thérapeutiques dans ces conditions complexes de relation hôte/pathogène (implication du système immunitaire).

Réduction

Le schéma expérimental des procédures de ce projet s’appuie sur les données bibliographiques actualisées ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus au sein du laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires est déterminé au plus juste à l’aide de calculs de puissance statistique réalisés en collaboration avec un biostatisticien, afin de garantir la robustesse scientifique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Une stratégie de sélection en amont est systématiquement mise en œuvre. Les candidats sont d’abord évalués au moyen de tests in vitro et d’approches in silico permettant de prioriser les molécules les plus pertinentes. Seuls les composés présentant un profil compatible avec une évaluation in vivo sont retenus, ce qui permet de réduire significativement le nombre d’animaux exposés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe social de 3 à 5 animaux pour les souris et de 2 pour les hamsters compatibles dans des cages conformes aux normes réglementaires en vigueur et bénéficiant d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, abris). Les locaux d’hébergement et d’expérimentation sont suivis par un personnel spécifiquement formé et habilité. Les procédures mises en œuvre sont classées de gravité modérée et s’étendent de quelques heures à deux à quatre semaines selon le modèle étudié. Un suivi clinique quotidien est assuré et renforcé durant la phase aiguë post-infection si nécessaire. Lorsque cela est possible, une anesthésie générale ou locale est pratiquée pour les gestes techniques susceptibles d’induire une douleur. Des mesures analgésiques adaptées sont mises en place si la procédure le justifie. Les manipulateurs sont spécifiquement formés et régulièrement évalués dans leurs pratiques, ce qui permet de limiter le stress, la durée des manipulations et les risques de douleur ou de détresse pour les animaux.

Choix des espèces

Les études sont réalisées chez la souris et le hamster syrien, deux espèces couramment utilisées dans la recherche biomédicale. Certaines souris utilisées ont été modifiées afin de posséder une protéine humaine appelée ACE2, qui est le point d'entrée utilisé par le virus responsable de la COVID-19 pour infecter les cellules. Ce modèle permet de mieux comprendre le déroulement de l'infection et d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. D'autres lignées de souris présentant des caractéristiques génétiques particulières sont également utilisées afin d'étudier le fonctionnement du système immunitaire et la manière dont l'organisme réagit à l'infection. La souris est un modèle de référence en recherche, car de nombreux outils permettent d'analyser précisément les réponses biologiques observées. Le hamster syrien est également largement utilisé pour l'étude de la COVID-19, car il développe une maladie présentant des similitudes avec celle observée chez l'Homme. Il constitue donc un modèle pertinent pour évaluer l'efficacité de futurs traitements antiviraux avant leur utilisation dans des essais cliniques. La maturité du système immunitaire diffère selon l’âge et peut influencer le déroulement de l’infection. Pour les études d’infection par le SARS-CoV-2 réalisées chez le hamster et la souris transgénique K18-hACE2, des animaux adultes seront privilégiés, afin de disposer d’un système immunitaire mature et d’un modèle d’infection reproductible et représentatif. L’âge pourra toutefois être adapté en fonction du modèle utilisé, des données bibliographiques disponibles et des objectifs scientifiques de l’étude.

Porteuses de gènes humains, ces souris développent dès douze semaines une maladie rénale auto-immune, avec du sang et des protéines dans les urines, puis subissent des prises de sang à la joue deux fois par mois, des injections dans la veine de la queue, des gavages et, pour un petit groupe, une biopsie du rein sous anesthésie générale. 492 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticorps, des ARN messagers et des nanoparticules, dans des études sollicitées par l'industrie pharmaceutique. Le porteur affirme qu'"Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger", celle-là même qu'il décrit chez ces souris. Toutes sont tuées après chaque traitement pour analyser l'inflammation de leurs reins.

Objectifs

Nous disposons d'un modèle unique dans le monde, le modèle de souris avec des gènes humains exprimant des anticorps spécifiques et un récepteur pour les anticorps spécifiques. Ces souris développent une maladie auto-immune rénale (c'est à dire qui résulte d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s'attaquer à l'organisme) et ainsi cause l'accumulation anormale des anticorps dans les reins avec de la protéinurie (présence de protéines dans les urines) et d'hématurie (présence de sang dans les urines) à partir de 12 semaines. Comme il n'existe pas de traitement curatif pour cette maladie, notre laboratoire cherche à développer des nouveaux traitements. Nous avons généré cinq anticorps anti-inflammatoires et l'industrie pharmaceutique nous a sollicité pour des études sur l'animal basées sur nos recherches précèdentes . En effet, nous avons démontré une belle efficacité d'une enzyme, une protéine capable de couper les anticorps et ainsi réduire l'inflammation liée à la maladie. Le problème était que comme il s'agit d'une protéine d'origine bactérienne, il y a une réponse immunitaire contre cette enzyme , des anticorps anti-enzymes bloquant son activité. L'objectif de notre étude est de traiter les souris exprimant la maladie avec les anticorps anti-inflammatoires, des ARN messagers (molécule capable d'induire la production d'une protéase qui est une enzyme (=protéine) capable de cliver les anticorps responsable de la maladie) ou avec des nanoparticules (particules de petite taille) permettant d'induire une tolérance au traitement avec la protéase recombinante d'origine bactérienne. Ces traitements sont bien tolérés sans aucun dommage chez la souris (résultats obtenus au laboratoire). L'objectif est d'évaluer l'action de ces traitements sur les anticorps circulants, sur les dépôts rénauxd'anticorps, l'inflammation tissulaire rénale et sur la protéinurie.

Bénéfices attendus

La néphropathie (ou maladie de Berger) est l'une des premières causes d'insuffisance rénale en France et dans le monde. Cette maladie est causée par une accumulation anormale d'anticorps dans les reins. Il n'existe actuellement pas de traitement spécifique de cette maladie, les patients n'ont que des traitements de suppléance (dialyse, greffe). Le développement d'un traitement pourrait éliminer la cause de la maladie et ainsi pouvoir proposer un traitement curatif. Les traitements proposés chez les souris qui développent la maladie seront une étape pré-clinique cruciale avant le passage à l'homme pour des essais cliniques.

Procédures

Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les anticorps anti-inflammatoires : les souris seront soumises à des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (deux fois par mois). Des prélèvements d'urines (2 fois par mois) les prélèvements seront faits sur animaux non anesthésiés, lors de l'immobilisation de la souris, le jet d'urine est en général spontanée . Des injections d'anticorps par voie intraveineuse (une fois par semaine pendant 1 mois) seront faites principalement par la veine caudale qui est située sur la queue de l'animal. Le gavage par une sonde gastrique (1 fois par mois pendant 1 mois). Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les ARNmessagers (ARNm) : les souris seront soumises à des injections d'ARNm (une molécule retrouvée dans toutes les cellules qui sera traduite en protéine) principalement par la veine caudale (veine sur la queue) une fois par semaine pendant un mois puis une fois par mois pendant 6 mois. Les prélèvements de sang (au niveau de la veine de la joue) se feront à J0 puis une fois par mois pendant 6 mois, en même temps que les urines. Afin d'évaluer la traitement de la maladie par les nanoparticules : les souris seront soumises à des injections par voie intraveineuse (veine de la queue) 3 fois pendant 1 mois puis à des prélèvements sanguins et d'urines à J0, J1 et J7. De plus, une fois la dose et la voie optimale de traitement déterminée pour les anticorps et l'ARNm, une biopsie rénale sera faite, ce qui consite à prelever un petit fragment de tissu rénal (1mm) sous anesthésie générale avant traitement sur un petit groupe de souris afin de confirmer définitivement l'efficacité du traitement à la dose optimale.

Impact sur les animaux

Les traitements donnés sont très bien tolérés et bénéfiques pour cette maladie de Berger. Les seules nuisances attendues sont celles liées à la biopsie rénale, aux injections intraveineuse des produits, au gavage et aux prélèvements de sanguins et d'urines. Ceux-ci pourraient occasionner un stress et un inconfort pour la souris de courte durée lors de la contention et de l'injection et de quelques jours pour la biopsie. Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger.

Devenir

A l'issue de chaque traitement, les animaux seront euthanasiés et des analyses complementaires post mortem seront réalisées au niveau des reins afin d'évaluer l'inflammation rénale.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un organe en entier dans le cas du developpement de la nephropathie. Le travail à l'échelle de l'organisme en entier est nécessaire, compte tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire et de la fonction rénale. Il est indispensable de travailler sur l'organisme entier, vivant et proche de l'homme pour pouvoir ensuite envisager un traitement curatif chez l'homme.

Réduction

Nous avons estimé qu'il faudra 6 animaux par groupe afin obtenir des résultats statistiquement exploitables et mener à bien notre projet. En effet, nos expériences précèdentes nous ont permis de préciser ce nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Dans le but de répondre à la loi des 3R (Raffiner) et dans un souci de bien-être animal de l'enrichissement (coton, Kraft, tunnels) sera mis en place pour les animaux tout au long de l'expérience pour que les animaux puissent faire des nids. Les souris sont placées sur des portoirs ventilés par groupe de 5 individus. L'environnement , la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours par le personnel technique. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour anticiper toute douleur ou angoisse infligée aux animaux. Les gestes experimentaux seront effectués par une personne compétente. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés 1 fois par semaine par l'expérimentateur ( état général, comportement et pesées). Un analgésique sera administré si l'état de l'animal le nécessite et toutes les 12heures et de façon systématique pendant 3 jours après chirurgie. Si l'animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour développer la maladie de Berger car elle n'exprime pas la maladie, ce qui permet après transgénese c'est à dire la fait d'incorporer des gènes humains dans son génome d'induire et d'exprimer cette maladie en question chez ces souris transgéniques. De plus, son comportement et sa génétique sont largement connus ce qui nous permet une meilleure évaluation et prise en charge de son bien-être tout au long du projet. Il est donc indispensable pour nous d'utiliser ce modèle de souris transgéniques exprimant la maladie pour évaluer l'action et l'efficacité des traitements que nous proposons. A 12 semaines d'âge car c'est à cet âge là que les souris développent la maladie rénale.