Souris
Etude chez la souris du rôle joué par la neuroinflammation périnatale dans la progression de la tauopathie à l’âge adulte, une composante majeure de la maladie d’Alzheimer_modification
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une partie des souris utilisées porte des plaques amyloïdes et fait des crises d'épilepsie spontanées, avec une mortalité précoce de 6 % chez les mâles et 13 % chez les femelles dans la colonie du laboratoire, qui peut atteindre 30 % après une injection intracérébrale. 1 869 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dix injections d'une substance inflammatoire sur cinq jours, certains subissent ensuite une chirurgie du crâne de vingt à trente minutes, et celles destinées aux tests de mémoire sont hébergées en enrichissement minimal pour éviter les biais. Les reproducteurs sont tués en fin de fertilité et les souriceaux au génotype non voulu immédiatement après génotypage, le porteur écrivant que le fond génétique de ces lignées interdit de les réutiliser ailleurs.
Objectifs
Il n'existe pas actuellement de traitement curatif de la maladie d’Alzheimer (MA) dont le nombre de cas est amené à augmenter régulièrement au cours des prochaines décennies du fait du vieillissement de la population. L'amélioration de la connaissance de la MA permettra d'identifier de nouvelles possibilités de traitements et de marqueurs diagnostiques afin d'améliorer la prise en charge des patients, un enjeu crucial de santé publique. Cette maladie, causée par une lente dégénérescence des neurones, se caractérise par la présence dans le cerveau de plaques amyloïdes, et de dégénérescences neurofibrillaires, résultant de l’accumulation de la protéine Tau. La protéine Tau est exprimée dans les neurones, où elle régule la dynamique du réseau de microtubules (sortes d’armatures de soutien des cellules). Dans la MA, on assiste à une modification de la protéine Tau qui se traduit par une formation d'agrégats toxiques s’accumulant dans les neurones entrainant leur mort. Ce phénomène, appelé tauopathie, joue un rôle majeur dans la maladie d'Alzheimer, car il existe une très bonne corrélation entre la progression de la tauopathie et celle des symptômes. Les recherches récentes désignent la neuroinflammation comme acteur majeur parmi l’ensemble des causes de la MA. Il est bien établi que la microglie, cellule immunitaire cérébrale, joue un rôle dans l’élimination des plaques amyloïdes. Le rôle de la microglie dans la tauopathie est cependant moins étudié. Pourtant, des études récentes suggèrent que la microglie joue un rôle dans la propagation de la tauopathie entre neurones connectés. Il est donc crucial de déterminer quel état microglial favorise ou au contraire ralentit la progression de la tauopathie. Pour répondre à cette question nous utiliserons deux modèles murins de la maladie d’Alzheimer dans lequel un syndrome inflammatoire sera induit par des injections de protéines stimulant la réaction immunitaire. Ce protocole sera appliqué sur différents animaux modèles de la MA soit transgéniques, soit par transfert de gène à l'aide de vecteurs AAV. Cela permettra d'analyser l'effet de la modification à long terme de la microglie sur l'évolution de la tauopathie, et de déterminer quel état d'activation microgliale il faut favoriser pour lutter contre la progression de la tauopathie. MODIFICATION : Le projet est modifié pour que les conditions d’hébergement n’influent pas sur les tests comportementaux.
Bénéfices attendus
La maladie d’Alzheimer est une maladie incurable et mortelle causée par la dégénérescence progressive des neurones,ayant pour conséquence des déficits cognitifs importants évoluant invariablement jusqu’à la démence et la perte d’autonomie complète. Elle touche près d’une personne sur 5 au-delà de 75 ans. Les traitements disponibles actuellement ne font que ralentir très modérément la progression de la maladie. Il est donc nécessaire de mettre au point des nouveaux traitements qui représenteront de réelles avancées thérapeutiques pour les patients et leurs proches. Pour mettre au point ces nouveaux traitements, il est nécessaire de mieux comprendre quelles sont les causes de la maladie, ce qui permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. C’est l’objectif principal de ce projet qui vise à mieux comprendre l’implication d’un type de cellules cérébrales impliquées dans la réaction immunitaire, les cellules microgliales, dans la progression de la maladie d’Alzheimer. Ces cellules sont les macrophages résidents du cerveau et sont activées concomitamment à la neurodégénérescence. Nous utiliserons un modèle d’activation à long terme de la microglie obtenu par administration d’une cytokine pro-inflammatoire dans les jours qui suivent la naissance. Ce protocole sera combiné à des modèles murins de maladie d’Alzheimer. Afin de mieux cerner le rôle de la microglie dans le développement de la pathologie, les effets de l’injection de la substance activant la réaction inflammatoire sur l’évolution des symptômes cognitifs et des lésions tissulaires seront étudiés. Nous réaliserons également une étude des gènes exprimés par la microglie afin de caractériser les voies de signalisation et les processus métaboliques dérégulés. En plus de l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’activation microgliale en fonction des phases de la maladie d’Alzheimer, et quelle(s) stratégie(s) thérapeutique(s) adoptée(s) aux différents stades de la pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - L’ensemble des animaux inclus dans les cohortes expérimentales recevront une injection d’une substance inflammatoire) ou de solution saline (10 injections sur 5 jours sur souriceaux vigiles [30 secondes par injection]). - Une partie des animaux recevra une injection intracérébrale à l’âge adulte (entre 3 et 9 mois en fonction des groupes) par une technique de chirurgie spécifique au cerveau (durée de la chirurgie : 20 à 30 minutes. Cet acte est peu invasif et les animaux récupèrent généralement très rapidement dans un délai de l’ordre de quelques heures. - Une partie des animaux recevra une injection unique de vecteur utilisé pour apporter le gène d’intérêt aux cellules cibles à l’âge adulte (2-3 mois). Cet acte dure moins d’une minute et se pratique sous anesthésie légère. Une partie des animaux sera soumise à 5 tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacités cognitives et mnésiques. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris et par jour. L’ensemble des tests est effectué sur une période de 4 à 6 semaines en fonction du nombre de tests prévus (4 à 5).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui entraineront des effets indésirables différents : - L’injection de la substance inflammatoire aux souriceaux entraîne des effets secondaires minimes, principalement une inflammation périphérique et centrale, ainsi qu’une hypothermie transitoire. Tous ces effets cessent après l’administration. - Les effets secondaires liés à l’injection intracérébrale se limitent à une douleur transitoire au niveau de l’abord chirurgical (incision du scalp et pose d’agrafes). - Deux des trois modèles de souris utilisés ne présentent pas de symptômes plus invalidants que les déficits cognitifs décrits dans la littérature. - Les souris présentant des plaques amyloïdes ont un phénotype dommageable (présence d’un caractère qui altère gravement l’état général de l’animal) car elles présentent des crises d’épilepsie spontanées conduisant à une mortalité précoce avec un pic entre 1 et 3 mois d’âge. Dans notre colonie, la mortalité est de 6% chez les mâles et 13% chez les femelles, mais elle peut atteindre 30% suite à une injection intracérébrale. - L’injection intraveineuse peut entraîner une hémorragie légère qui se résorbe spontanément en quelques minutes. - Les tests comportementaux sont réalisés sur animaux vigiles et peuvent entraîner un stress léger. Le stress ponctuel dû au test sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. La diminution de l’enrichissement dans les cages d’hébergement peut engendre un léger stress des animaux.
Devenir
Tous les animaux qui seront inclus dans des cohortes expérimentales sont in fine destinés à une étude histologique (analyse des tissus) et/ou transcriptomique (analyse de l’expression des gènes) des régions atteintes du cerveau, ce qui nécessite leur euthanasie pour prélever cet organe. L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Les animaux reproducteurs des différentes lignées transgéniques utilisés pour générer les souris incluses dans les cohortes expérimentales seront euthanasiées en fin de période de fertilité. Ces animaux ne seront en effet plus utilisables dans le cadre du projet, et ne pourront pas non plus être recyclés dans d’autres projets du fait des potentiels biais expérimentaux induits par la période de reproduction active (effets des changements hormonaux chez les femelles et développement de l’agressivité envers les congénères chez les mâles). L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Afin de minimiser le temps d’élevage en captivité, les animaux issus de ces accouplements dont le génotype n’est pas souhaité pour le projet seront euthanasiés immédiatement à l’issue de la procédure de génotypage par les mêmes méthodes. Le fond génétique de ces différentes lignées, qui peut diverger de celui des souches de souris initiales, ne permet pas la reutilisation des animaux pour d’autres projets afin d’éviter tout risque de biais expérimental dû au fond génétique.
Remplacement
Ce projet fait appel à des modèles de souris déjà caractérisés de la maladie d’Alzheimer. A l’heure actuelle, ce projet ne peut ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles génétiques murins. Par ailleurs, les modifications de l’activation microgliale qui surviennent au cours du vieillissement normal et pathologique ne peuvent pas être reproduit dans des modèles cellulaires 2D ou organoïdes. Enfin, l’étude des relations entre cellules gliales et neurodégénérescence requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur une espèce modèle mammifère comme la souris, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est à dire possédant un cerveau complexe doté d’un système limbique permettant d’exprimer des comportements sophistiqués. De plus la proximité entre l’espèce humaine et la souris maximisera la pertinence des cibles thérapeutiques identifiées au cours de ce projet.
Réduction
Une simulation statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu des valeurs attendues en fonction des analyses pratiquées pour chaque procédure. Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les valeurs que nous avons observées dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 1869 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum, qui comprend 66 groupes expérimentaux et 52 groupes témoins de référence qui seront étudiés tout au long des 5 années du projet, a été déterminé en fonction des expériences à réaliser pour pouvoir répondre à la question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous prévoyons que les cohortes incluses dans les différentes procédures puissent être étudiées sur différents paramètres. Par exemple certains animaux seront utilisés à la fois pour des études transcriptomiques et histologiques.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Afin d’éviter tout biais dans les résultats des tests comportementaux destinés à évaluer la mémoire des souris, les animaux destinés à ces tests seront hébergés en conditions minimales d’enrichissement. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. L’état de santé des souriceaux sera surveillé de manière biquotidienne tout au long de la période de traitement périnatal. Leur état de forme sera évalué grâce à une grille de score permettant de définir le point limite au-delà duquel le traitement ne pourra être poursuivi pour l’animal en question. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.
Choix des espèces
Choix de l’espèce modèle : L’objectif de ce projet est d’améliorer les connaissances sur la maladie d’Alzheimer afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. La région initialement et la plus gravement atteinte dans la MA est le système limbique (connu sous le nom de cerveau émotionnel) qui gère la mémoire et les émotions. Les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas de système limbique. Il est donc nécessaire de mener ce projet sur une espèce dotée d’un tel système, similaire à celui retrouvé dans l’espèce humaine. Les rongeurs, et la souris en particulier, possèdent un système limbique très proche de celui de l’espèce humaine. De plus, la grande proximité entre le génome de la souris et le génome humain assure une pertinence maximale des cibles thérapeutiques qui seront identifiées au cours de ce projet. Les souris qui seront utilisées reproduisent les différentes lésions anatomiques retrouvées dans le cerveau des patients atteints de MA. Elles présentent également des altérations cognitives (défauts de mémoire spatiale et de mémoire de travail) qui sont caractéristiques de la MA. Ces déficits peuvent être quantifiées par des tests comportementaux qui sont réalisés en routine au laboratoire. Choix du stade de développement étudié : Les administrations de cytokines seront réalisées à la période périnatale pour respecter le protocole d’activation microgliale à long terme largement validé et publié par nos collaborateurs. La MA se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits subtils apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les modèles animaux à un temps précoce et a un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin du processus pathologique, soit entre 5 et 14 mois selon les différents modèles de MA qui seront étudiés au cours du projet.
Etude chez la souris de l’efficacité de cinq agents immunostimulants sur trois modèles de cancer MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
Cent jours de croissance tumorale, mesurée au pied à coulisse jusqu'à trois fois par semaine : 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées sous la peau, ou des fragments de tumeur y sont implantés par chirurgie, puis les traitements sont administrés en intraveineuse ou dans l'abdomen une fois par semaine pendant trois semaines. Le porteur indique que la tumeur peut gêner la locomotion et que la peau qui la recouvre peut s'ulcérer voire se nécroser, et que le regroupement des cages impose un changement de groupe social. Les souris sont utilisées à 5 ou 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale, et le porteur chiffre son "besoin" à 10 animaux pour chacun des 12 groupes de traitement de chacun des trois modèles de cancer, plus 40 en marge.
Objectifs
Le projet présenté vise à étudier l’efficacité de molécules immunostimulantes, lorsqu’elles sont administrées seules ou en combinaison avec des traitements de référence en immunothérapie, dans différents types de cancers. L’immunothérapie consiste à activer le système immunitaire lorsque celui-ci est désactivé par la tumeur. Plusieurs anticorps ont ainsi été approuvés pour le traitement de diverses tumeurs, permettant au système immunitaire d’être à nouveau activé et fonctionnel pour détruire les cellules tumorales et constituant une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Cependant, un nombre croissant d’observations réalisées chez les patients mettent en évidence un phénomène de résistance aux anticorps, la recherche se concentre donc maintenant à contourner ou reverser cette résistance grâce à de nouveaux traitements. Les molécules que l’on souhaite tester sont dites immunostimulantes car elles ont été créées de façon à stimuler directement la réponse immunitaire afin d’engendrer une mort des cellules tumorales. Au sein de notre laboratoire nous possédons des modèles de cancer chez la souris, étant peu ou non répondeurs à l'immunothérapie : cancer colorectal, lymphome et cancer du sein triple négatif, c'est donc sur ces modèles que nous souhaitons travailler. Nous cherchons à voir si les molécules que l'on souhaite tester, seules sont capables de rétablir un mécanisme antitumorale et à quel point, et si en combinaison avec les anticorps de référence, ceux-ci sont plus efficaces.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patients atteints de cancer, étant peu ou non répondeurs aux traitements de référence.
Procédures
Injection de cellules cancéreuses en sous-cutané (réalisée une fois au début de l'expérimentation, quelques secondes) OU IMPLANTATION DE MORCEAUX DE TUMEURS PAR CHIRURGIE SOUS CUTANE (UNE FOIS AU DEBUT DE L'EXPERIMENTATION, QUELQUES MINUTES). Mesures tumorales au pied à coulisse et pesées 3x/semaine maxmimum pendant 100 jours (quelques secondes). Une homogénéisation des groupes de traitements sera réalisée lorsque le volume tumoral moyen de début de traitement sera atteint, celle-ci pouvant entrainer un changement de cage et de groupe social pour les individus, ceux-ci ne changeant plus jusqu'à la fin d'étude. Injection des traitements en intraveineux (quelques secondes, 1 fois par semaine pendant 3 semaines) et/ou injection de traitement en intrapéritonéal (quelques secondes, 1 fois par semaine pendant 3 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir une injection de cellules en sous cutané qui entraine un stress à la contention, une douleur à l’injection, la tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion. CERTAINS ANIMAUX VONT SUBIR UNE INJECTION D'ANALGESIE AVANT CHIRURGIE CE QUI PEUT GENERER UN STRESS A LA CONTENTION ET UNE DOULEUR A L'INJECTION SOUS CUTANE, PUIS UNE CHIRURGIE SOUS CUTANEE FAITE SOUS ANESTHESIE GAZEUSE GENERALE QUI ENTRAINE UN STRESS AU REVEIL. L'homogénéisation nécessite un réallotement des souris qui induit un changement d’environnement et de groupe social, ce qui peut provoquer un stress et une réacclimation durant la première semaine. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse. La peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. L’administration des traitements une fois par semaine par voie intraveineuse et/ou par voie intrapéritonéale va entrainer du stress à la contention, au contact de l'eau et de la douleur peut être ressentie à l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes, organes qui seront utilisés par la suite pour différentes analyses.
Remplacement
Les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.
Réduction
Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon statistiquement fiable à une meilleure efficacité de nos molécules administrées seules ou en combinaison avec les traitements de référence. Grâce à un outil statistique et connaissant nos modèles (ayant une réussite de prise tumorale de 75%), ceci nous a permis de savoir que nous avons besoin pour chaque modèle, pour étudier nos 12 groupes de traitement, de 10 souris par groupe, d'une marge de 40 souris en plus, ce qui nous amène à 480 animaux au total.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet en les pesant plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement (week-ends et jours fériés inclus) par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de surveillance de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé trois fois par semaine et si nécessaire, afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe clinique afin d’appliquer les meilleures mesures. Un analgésique sera administré aux souris si signes de douleur et lors du prélèvement sanguin terminal. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette).
Choix des espèces
Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développé dont ceux que l’on souhaite étudier. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Etude et amélioration de la réponse immunitaire induite lors de la greffe de moelle utilisée comme thérapie dans les leucémies aigüe myéloïde (cancer du sang) combinée à l’utilisation de molécules thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Irradiés éveillés pendant cinq minutes pour vider leur moelle osseuse, injectés de cellules leucémiques dans la veine de la queue, puis de lymphocytes T trois à cinq jours plus tard, 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent jusqu'à quatre prélèvements de sang à la mâchoire, jusqu'à trois ponctions de moelle dans le fémur sous anesthésie, et un traitement quotidien par gavage pendant sept jours ou par injection abdominale pendant cinq, parfois les deux le même jour. Le porteur indique que la leucémie greffée provoque au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, une prostration, une déshydratation ou une hypothermie. Trois jours après la fin du traitement, toutes sont tuées pour prélever la moelle osseuse et y observer la réaction des lymphocytes T contre la leucémie.
Objectifs
Les leucémies aigües myéloïdes (LAM) sont des maladies affectant la moelle osseuse puis d’autres organes par la suite comme la rate ou le foie. Afin de freiner cela, il existe le traitement par chimiothérapie qui peut permettre une rémission complète mais souvent va progresser vers une LAM récidivante réfractaire à de nouvelles tentatives de chimiothérapie. En plus de la chimiothérapie il est possible d’effectuer des greffes de moelle osseuse, provenant d’un donneur compatible. Ce traitement induit une réponse de la partie de l’organisme greffée (ici de la moelle osseuse) contre la leucémie (Greffon contre la leucémie, GVL) afin d’éliminer les cellules leucémiques résiduelles. Cependant, la greffe ne permet pas toujours de guérir le patient (i) lorsqu’il n’y a pas une réponse suffisamment forte de l’organisme contre la leucémie ou (ii) lorsqu’il y a une réaction de la partie greffée contre l’hôte. Le projet vise donc à comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse GVL dans les LAM. Pour cela un modèle a été mis en place, en injectant des cellules sanguines (ou blastes) leucémiques provenant de souris malades, suivi de lymphocyte T (globule blanc qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire) reconnaissant les blastes. Nous avons pu valider la réponse bénéfique GVL dans un modèle préclinique, de par l’amélioration de la survie des souris recevant cette double transplantation. Le modèle étant un modèle de souris ayant été irradié afin de « faire de la place » dans la moelle osseuse et permettre aux cellules leucémiques de s’y développer. Après l’étude de molécules utilisées chez les patients, nous avons pu mettre en place l’utilisation de celles-ci avec la réponse GVL dans les LAM. Nous souhaitons à présent les valider et les définir et pourraient améliorer l’efficacité de la réponse GVL.
Bénéfices attendus
L’effet thérapeutique de la greffe de moelle osseuse est compromis dans plus de 40% des cas de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec une réponse immunitaire s’appelant : greffon contre la leucémie (GVL) insuffisante. Une meilleure compréhension des différents mécanismes est donc indispensable pour concevoir des immunothérapies (traitements) rationnelles et efficaces pour un traitement à long termes des LAM. Notre projet se propose d’identifier et de caractériser les potentiels acteurs de l’effet GVL afin d’optimiser la réponse immunitaire du greffon médiée par les lymphocytes T toxiques vis-à-vis des cellules leucémiques.
Procédures
Les animaux vigiles (c’est-à-dire non endormis) seront tout d’abord préconditionnés par irradiation (durée: 5 minutes) pour éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse (veine de la queue; durée: 1 minute). Trois à 5 jours après injection des blastes, les souris seront injectées en une seule fois les cellules T immunitaires par voie intraveineuse dans la veine de la queue (durée: 1 minute). Des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer l’évolution de croissance tumorale. Nous ferons également une ponction de cellules dans l’os du fémur d’environ 5 minutes (8 à 10 jours après l'injection des cellules cancéreuses et au maximum 3 prélèvements sur la durée de la procédure expérimentale) ; les animaux étant placés sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux recevront un traitement journalier par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs; durée du geste: 1 minute) ou bien par une injection dans la cavité abdominale (pendant 5 jours consécutifs; durée du geste: 30 secondes). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il peut y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage et injection dans la cavité abdominale. Trois jours après la fin du traitement, les souris seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Lorsqu’ils sont greffés, manipulés pour le suivi de prise de greffe, les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress et/ou une perte de poids. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement , une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. L'administration des traitements entrainera également un stress lié à la contention et une possible irritation du tube digestif dans le cas de l'administration par gavage.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et observer la réponse contre la leucémie des lymphocytes T (catégorie de leucocytes (globule blanc)) qui jouent un rôle dans la réponse immunitaire.
Remplacement
Pour identifier les molécules qui permettent une réponse contre la leucémie, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier vivant. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut modifier leur comportement. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles animaux, ici chez la souris.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender l'apparition des signes de douleur. La mise en place d'un traitement anti-douleur, l'ajout de nourriture dans la cage ou l'arrêt des traitements testés seront réalisés. En cas d'absence d'amélioration de l'état de l'animal, celui-ci sera euthanasié. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux et le suivi clinique réalisé deux fois par semaine.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Gestion des prélèvements pour le généotypage des rongeurs rats et souris
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 800
Tués si leur génotype ne convient pas, versés dans des protocoles de recherche s'il convient, 2 500 souris et 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit une biopsie de moins d'un millimètre à l'extrémité de la queue vers 15 jours, sur animal vigile, ou à l'oreille sous anesthésie générale à partir de 4 semaines. Le projet ne poursuit aucune question scientifique : il couvre l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement. Le porteur présente son bénéfice attendu comme statistique, faire figurer dans les comptes annuels les animaux génotypés de façon invasive, et indique que des techniques non invasives restent "en cours d'évaluation".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de couvrir l'ensemble des actes de génotypage de l'établissement de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de prendre en compte les animaux qui sont génotypés de manière invasive en plus de leur identification par tatouage dans les statistiques annuelles de l'établissement. Cela permet de continuer à travailler sur des mesures de raffinement de ce génotypage et d'encourager les équipes à développer des méthodes non invasives.
Procédures
les animaux sont soumis à une biopsie de tissu à l’extrémité de la queue ou à l’oreille, selon l’âge de l’animal, qui sera inférieure à 1mm. Pour les animaux de moins de 15jours l'intervention sera faite sur desanimaux vigiles et anesthésiés pour des animaux plus âgés. Cette intervention dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie de tissu pour génétypage sera réalisée à l’extrémité de la queue ou à l’oreille cela implique un stress léger lors de la contention de l'animal et une douleur de courte durée lors de la coupe de tissu.
Devenir
En fonction du génotype, les animaux seront soit euthanasiés soit incorporés dans des protocoles de recherche.
Remplacement
L’utilisation d’animaux transgéniques permet l’étude d’un gène de façon ciblée ou d’une fonction spécifique de l’organisme. Des techniques génétiques permettent de modifier le génome de façon très précise. De plus, la modification du génome peut induire la perte ou l’activation de l’expression d’un gène, et ceci de façon ciblée dans le temps ou dans un organe, constitutivement ou après induction. Ces modèles animaux sont précieux pour réaliser des recherches scientifiques fondamentales ou précliniques et ne peuvent souvent pas être remplacés car les fonctions étudiées mettent en jeu des interactions inter-organes essentielles au bon fonctionnement de l’organisme, impliquant des réponses hormonales, immunitaires et nerveuses.
Réduction
Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum pour garantir le fonds génétique et éviter la dérive génétique (environ 10 à 15 animaux maximum /lignée âgées de 6 mois au maximum pour garantir leur fertilité). L’élevage de lignées transgéniques est limité et restreint aux lignées utilisées dansles projets de recherche. En cas d’arrêt ou d’interruption de projets, les lignées sont cryoconservées par congélation de sperme. Les animaux de mauvais généotypes pourront être proposés en interne pour une utilisation par d'autres équipes.
Raffinement
La biopsie de la queue sera réalisée précocement, à l’âge de 15 jours, avant l’ossification de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, une biopsie de la pina de l’oreille sera privilégiée et sera réalisée sous anesthésie générale. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1 mm. Des techniques alternatives de biopsie non invasives sont en cours d’évaluation et pourront être utilisées lorsque le génotypage sera validé et si l’absence de contaminations croisées est démontrée.
Choix des espèces
La transgenèse est généralement réalisée chez la souris et depuis récemment chez le rat et l’établissement utilisateur possède à la fois un zone d’élevage et d’expérimentation sur les différents modèles de souris et rats transgéniques utilisées en recherche fondamentale et préclinique. La biopsie caudale sera réalisée à l’âge de 10-15 jours afin de limiter les nuisances du prélèvement. La biopsie de la pina de l’oreille sera réalisée à l’âge de 4 semaines pour éviter l’incision de la queue qui s’est ossifié.
Etude du rôle d’une protéine importante dans la guérison de la leucémie aiguë promyélocytaire (cancer du sang).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
La rate des souris est palpée chaque jour, et son grossissement déclenche une surveillance renforcée puis, selon le score obtenu, la mise à mort. 3 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules leucémiques leur sont injectées dans la veine de la queue sur animal éveillé, puis une molécule leur est injectée dans l'abdomen chaque jour pendant 21 jours, avec une capsule implantée sous la peau du dos et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse dans le fémur. L'objet est de déterminer quelle partie d'une protéine permet aux deux médicaments déjà utilisés en clinique d'éliminer les cellules leucémiques, les traitements eux-mêmes étant acquis.
Objectifs
Notre projet s’intéresse à un sous-type de cancer du sang appelé leucémie. Cette maladie est causée par une modification génétique présente dans les cellules à l’origine des globules rouges et blancs. On observe chez les patients atteints d’une leucémie un blocage de la production de globules blancs fonctionnels, qui s’accumulent dans la moelle osseuse. Les études menées sur des modèles souris de leucémie ont permis d’identifier le rôle essentiel d’un élément cellulaire (on parle de protéines) dans la réponse au traitement. En effet, en absence de traitement, cette protéine est déréglée dans les cellules leucémiques et ne contrôle donc plus leur survie et leurs fonctions. Deux médicaments permettent l’élimination de ces cellules leucémiques notamment en redonnant à cette protéine son rôle de régulateur de la survie des cellules. Nous cherchons maintenant à déterminer quelle partie de cette protéine permet d’éliminer les cellules leucémiques en réponse au traitement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples. En premier lieu, ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires liés à la protéine d'intérêt et comprendre comment la dégradation ciblée de la protéine modifiée contribue à l’éradication de la maladie. L’identification des mécanismes pourra ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques améliorées ou complémentaires, augmentant potentiellement le taux de rémission et la survie des patients. Ce projet devrait donc renforcer l’efficacité, la sécurité et la durabilité des traitements actuels, avec un impact direct sur la prise en charge clinique et la qualité de vie des malades atteints de cette leucémie.
Procédures
Dans ce projet, nous utilisons un modèle de souris pour étudier la leucémie. Pour cela, nous injectons à des souris des cellules leucémiques (injection par voie intra-veineuse dans la veine de la queue sur souris éveillée; durée de l'injection : 1 minute), ce qui permet de reproduire la maladie chez l’animal. Une fois la leucémie installée, nous testons différentes stratégies thérapeutiques en utilisant une combinaison de médicaments couramment utilisés pour traiter ce type de cancer. Cela correspond en l'administration quotidienne d'une molécule thérapeutique par injection dans l'abdomen de la souris éveillée (durée de l'injection : 10 secondes) pendant 21 jours maximum, pouvant être combiné à l’implantation sous la peau du dos de la souris d'une capsule permettant la libération continue du second médicament (réalisée sous anesthésie générale, l’opération dure une dizaine de minutes). Dans certaines expériences, d’autres traitements seront évalués en parallèle, ils seront administrés par injection intra-veineuse (1 à 2 injections dans la veine de la queue à 3 jours d'intervalle; durée de l'injection 1 minute). Le développement du cancer pourra être suivi par un prélèvement de la moelle osseuse au niveau du fémur. Pour cela les souris seront anesthésiées et recevront un traitement anti-douleur préventif (durée 3 minutes). Le prélèvement sera réalisé 2 fois maximum durant la vie des animaux (avant et après traitement, à au moins 2 semaines d’intervalle). Pour la production de cellules murines à l’origine de toutes les cellules du sang, et utilisées dans des tests in vitro (réalisés en dehors d'un organisme vivant entier), les souris recevront une unique injection lente par voie intraveineuse (veine de la queue sur souris éveillée ; durée : 3 minutes) d’un produit permettant de stimuler la production de cellules du sang au niveau de la moelle osseuse.
Impact sur les animaux
Dans les modèles de souris développant une leucémie, des signes cliniques de la maladie peuvent apparaître durant sa progression. Ces signes incluent des modifications de l’apparence (manque de toilettage, yeux clos…) ou du comportement (mobilité, agitation) et une augmentation de la taille de la rate. Les prélèvements de la moelle osseuse avant et après traitement peuvent induire une douleur pendant quelques heures après l’intervention. Les traitements médicamenteux utilisés dans ce projet peuvent induire du stress lié à la manipulation de la souris et des douleurs. L’implantation de la capsule sous la peau du dos peut entraîner une gêne dans le déplacement. Ensuite, les injections dans l'abdomen sont réalisées quotidiennement jusqu’à 21 jours consécutifs, pouvant générer une douleur localisée au site d'injection et un stress lié à la manipulation quotidienne des souris. Enfin, les différents traitements peuvent conduire à une perte de poids des animaux (poids regagné aussitôt le traitement terminé) pour les souris dont la survie est étudiée après la fin du traitement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever un maximum d’organes et ainsi évaluer les mécanismes d'action des molécules thérapeutiques dans le cas des cancers du sang.
Remplacement
Un grand nombre de tests a déjà été effectué sur des cultures de cellules. Mais ces modèles sont limités car ils ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant (absence d'interaction entre cellules saines et cancéreuses). De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Enfin, les souris disposent d’un système immunitaire proche de celui de l’humain qui permet d’étudier les interactions entre les cellules immunitaires et la leucémie. Toutefois, le développement de modèle cellulaire en culture pour certains aspects de notre projet devrait nous permettre, à terme, de diminuer le nombre d’animaux engagés dans des procédures expérimentales.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au maximum tout en nous assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger) et un suivi quotidien (par les zootechniciens et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Une fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant d’évaluer les points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. Dès la détection, par palpation quotidienne de la rate, des premiers signes de maladie (augmentation de la taille de la rate comme critère d'alerte), nous renforcerons cette surveillance (scoring 2 à 3 fois/semaine). Une anesthésie et un traitement anti-douleur seront administrés avant chaque geste pouvant générer une douleur (prélèvement de la moelle osseuse dans le fémur). De plus, le développement de modèle cellulaire en culture pour certains aspects de notre projet devrait nous permettre de minimiser le nombre de procédures pouvant induire de la souffrance.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs traitements. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes afin de reproduire le plus fidèlement possible la pathologie humaine et d’analyser l'effet des traitements.
Etude d’un géne impliqué dans la formation osseuse et le système cognitif et évaluation de molécules thérapeutiques contre cette pathologie chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
10 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 7 328 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à 22 injections. Elles passent six types de tests comportementaux, dont un test de mémoire spatiale répété douze fois, et subissent un prélèvement d'oreille et une prise de sang sous anesthésie. Les mutantes développent une mâchoire proéminente et des dents qui poussent trop, coupées quand c'est nécessaire, et les souriceaux sont séparés chaque jour de leur mère. La pathologie visée touche un enfant sur 50 000, et le porteur justifie l'effectif de 10 200 souris par les données de la littérature et l'expérience du laboratoire, sans autre précision.
Objectifs
Ce projet porte sur une pathologie osseuse rare qui touche 1 enfant sur 50 000. Les patients présentent des malformations craniofaciales dues à la fusion prématurée des sutures crâniennes, des anomalies oculaires, des troubles neurologiques, des troubles auditifs et respiratoires, ainsi que des anomalies dentaires. Cette pathologie est due à une mutation génétique. L'objectif est de mieux comprendre la pathologie humaine pour ensuite corriger le phénotype par un traitement thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre la pathologie grâce à un modèle animal mimant la pathologie humaine. L'étude du phénotype ainsi que la mise en place d'approches thérapeutiques, que ce soit au niveau du développement squelettique ou cognitif, permettra à long terme d'envisager une nouvelle approche thérapeutique pour les patients.
Procédures
Prélèvement à l'oreille sur animal vigile (une fois, 5 secondes). Injections (maximum 22 fois, une minute). Contention pour les injections (maximum 22 fois, une minute). Tests de comportement : test du comportement exploratoire (une fois, 30min), test de la mémoire épisodique (3 fois, maximun 15min), test de la mémoire spatiale 1 (3 fois, maximun 15min), test du comportement d'abandon (1 fois, 5 minutes), test d'anxiété (1 fois, 10min), test de la mémoire spatiale 2 (12 fois, maximun 2 minutes). Prélèvement de sang sous anesthésie (une fois, 4 minutes)
Impact sur les animaux
Les injections induisent une douleur légère et brève. La biopsie à d'oreille entraine une douleur légére et brève. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent provoquer également un stress chez l’animal. Les souris mutantes peuvent avoir une proéminence anormale de la mâchoire vers l’avant avec pour conséquence des dents longues. Les tests de comportement peuvent induire du stress également. La séparation quotidienne des souriceaux peut causer un stress pour la mère et les souriceaux. L'hébergement individuel des souris mâles adultes peut représenter un stress de courte durée.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à fin de récupérer les différents tissus permettant l'analyse du phénotype.
Remplacement
L'objectif est d'étudier le développement squelettique et le système cognitif chez la souris. À ce jour, il n’existe pas dans la littérature de modèle de remplacement pour étudier le développement du squelette et pour réaliser des tests de comportement ; l'utilisation des modèles in vivo est donc nécessaire.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris générera donc de nombreuses informations. Les effectifs sont déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. Le nombre de souris a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après l'expérience du laboratoire sur le modèle souris.
Raffinement
Les souris seront sous surveillance quotidienne et des points limites ont été établis. lles vivront en groupe avec des matériaux pour construire un nid. Elles peuvent recevoir un analgésique adapté. Elles seront anesthésiées avec des produits adaptés. Afin de limiter l'impact de l'avancement des dents, les souris seront observées tous les trois jours et une coupe des dents sera réalisée si nécessaire. Pour les tests de comportement les souris auront 3 jours minimum entre chaque test pour réduire le stress.
Choix des espèces
L'objectif est de comprendre la pathologie humaine au niveau du développement squelettique et du système cognitif, afin d'apporter ensuite une approche thérapeutique. Seuls les modèles animaux peuvent apporter des réponses aux hypothèses de travail. La souris est particulièrement adapté pour étudier le développement squelettique, de la période anténatale à l’âge adulte. En effet, les processus d’ossification chez l’homme et la souris sont similaires. Le projet implique des approches intégrées sur l'animal entier, ainsi que des explorations comportementales sur des animaux vigiles, qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro. En ce qui concerne l'étude du développement squelettique, le phénotype des souris sera analysé à la période post-natale, de 1 jour à 18 mois. Ces études doivent être réalisées à ces différentes périodes, car la croissance squelettique est étudiée au cours du développement et le squelette est aussi étudié à l'âge adulte. Les approches thérapeutiques seront ensuite réalisées en période anténatale et post-natale. Pour les études de comportement, des souris adultes âgées de 1 à 4 mois seront utilisées.
Développement de modèles murins humanisés de lupus pour l’évaluation préniclinique de nouvelles thérapies
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées de système immunitaire puis greffées de cellules humaines, elles reçoivent du pristane qui déclenche un lupus, et subissent jusqu'à 51 injections, 25 prélèvements urinaires et 9 prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur décrit ce qui les attend à partir du deuxième mois : ganglions gonflés, douleurs articulaires gênant le déplacement, dos voussé, mise à l'écart des congénères, puis dermite avec perte de poils et insuffisance rénale à partir du quatrième mois. Après avoir listé les cultures de cellules humaines déjà utilisées en amont, il conclut qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour observer les réponses immunitaires dans un "organisme entier".
Objectifs
Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie autoimmune grave dans laquelle le système immunitaire s’attaque à l’organisme. Cette réaction est causée par des anticorps anormaux (appelés autoanticorps) produits par des cellules appelées lymphocytes B. Les traitements actuels réduisent l’inflammation mais ne guérissent pas la maladie et peuvent avoir des effets secondaires importants. Une approche prometteuse serait d’éliminer uniquement les lymphocytes B responsables de la maladie, sans toucher au reste du système immunitaire. Pour mettre au point ce type de thérapie, il faut un modèle expérimental qui reproduise fidèlement le lupus humain. Des recherches récentes ont permis de développer des souris « humanisées », c’est-à-dire dépourvues de leur système immunitaire et greffées avec des cellules humaines. Après traitement par deux molécules (estradiol et pristane), ces souris présentent des signes proches de ceux observés chez les patients lupiques : production d’anticorps pathologiques et atteintes de la peau et des reins. Le projet consiste à développer ce modèle de souris humanisées présentant un lupus, et de tester de nouvelles thérapies dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à établir et caractériser un modèle de lupus chez une souris développant un système immunitaire humain. Il permettra de mieux comprendre le rôle des cellules pathogènes dans le développement du lupus, et de tester de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement ces cellules. Ce modèle ouvrira ainsi la voie à des traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients atteints de lupus.
Procédures
Dans certaines procédures, les souris immunodéficientes seront injectées avec des cellules humaines pour développer un système immunitaire humain (humanisation). De plus, dans certaines procédures, les souris seront injectées avec une molécule (pristane) qui induit le développement d'un lupus. Plusieurs prélèvements sanguins (9 maximum) seront réalisés sous anesthésie. Plusieurs prélèvements urinaires (25 maximum) seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ. Certains animaux seront soumis à des injections (51 maximum) sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les souris traitées par du pristane développent une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une faible perte d'appétit et donc une perte de poids. D’après la littérature, les souris injectées avec du pristane développent, à partir de 2-3 mois post-injection, un gonflement des ganglions, ainsi que des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement, une mise à l'écart du/des individus et un dos voussé. A partir de 4 mois post-injection, les souris développent une dermite, entrainant une dépilation, ainsi qu’une insuffisance rénale, matérialisée par une augmentation de la protéinurie mesurable à l'aide de bandelettes urinaires. Les prélèvements sanguins répétés peuvent potentiellement générer une anémie (pâleur des muqueuses), une respiration plus rapide ainsi qu'une plaie éventuelle au site de prélèvement. Les nuisances liées aux anesthésies répétées (léger stress) sont inhérentes à toute anesthésie (l'anesthésie est cependant ici de courte durée pour un prélèvement sanguin). Les effets indésirables pendant le processus d'humanisation (jusqu'à la reconstitution complète d'un système immunitaire) des souris peuvent comprendre une sensibilité accrue aux infections liée à l’immunodéficience.
Devenir
Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvement de tissus (ou s’ils atteignent les points limites justifiant leur mise à mort).
Remplacement
Des approches in vitro sont utilisées en amont de ce projet pour évaluer l’efficacité et la sécurité des molécules thérapeutiques, notamment sur des cellules humaines isolées et des systèmes de culture. Toutefois, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions cellulaires et des réponses immunes systémiques impliquant la moelle osseuse, le thymus, la rate et les tissus cibles de l’inflammation lupique. Un modèle in vivo est donc indispensable pour étudier la dynamique des réponses immunitaires et l’impact global des traitements dans un organisme entier. La souris est l’espèce la plus appropriée pour ces études, car son système immunitaire et sa physiologie sont bien caractérisés, et son utilisation est largement validée dans la littérature.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment dans des publications utilisant des modèles expérimentaux similaires et/ou sur des outils statistiques pour estimer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages comportant des enrichissements (bâtons, frisures de kraft, tunnels), dans des conditions les empêchant de développer des infections. Le phénotype des animaux sera examiné de façon bi-hebdomadaire à l'aide de grilles de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. A la livraison des souris, les animaux seront acclimatés aux nouvelles conditions d'hébergement pendant une semaine. Pour les procédures pouvant conduire au développement d’une atteinte cutanée type dermite, une pommade cicatrisante sera administrée.
Choix des espèces
En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. De plus, la souris est un modèle adapté pour la reconstitution d’un système immunitaire humain suite à l’injection de cellules souches hématopoïétiques humaines, modèle pertinent pour le projet présenté dans cette demande. En ce qui concerne le stade de développement, les souris seront étudiées entre un âge de 8 à 10 semaines (âge minimum de début de l'expérimentation) et de 12 mois (âge maximum de fin de lexpérimentation).
Étude du rôle d’une protéine d’intérêt dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
7 009 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 439 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 4 060 un niveau léger. Elles subissent une biopsie de queue pour génotypage, deux prélèvements sur animal vigile, deux anesthésies et sept injections, et celles chez qui l'encéphalomyélite auto-immune est induite développent une paralysie partielle que le porteur qualifie de transitoire. Le bénéfice annoncé tient à la compréhension du rôle d'une protéine et au développement d'approches thérapeutiques fondées sur sa biologie, sans traitement curatif de la sclérose en plaques en vue. Le porteur affirme que les migrations de cellules immunitaires vers le système nerveux central ne sont pas étudiables in vitro et conclut qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'expérimentation animale.
Objectifs
L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d'une protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaque chez la souris. La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central. Elle est la première cause de déficit neurologique chez le jeune adulte. Les femmes sont atteintes deux fois plus que les hommes et le coût socio-économique de la sclérose en plaques est le second après les traumatismes dans ce groupe d’âge. Il n’y a actuellement pas de traitement curatif pour la sclérose en plaques qui est donc une maladie chronique persistant tout au long de la vie du patient. Certains traitements permettent d’en ralentir la progression chez certains patients. La sclérose en plaques implique des cellules du système immunitaire qui attaquent le système nerveux central. Il y a un grand espoir que la protéine d'intérêt, qui module le système immunitaire, puisse contribuer à l’amélioration de cette maladie. La sclérose en plaques peut être modélisée chez la souris. En utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, ce projet analysera le mode d'action de la protéine d'intérêt en prenant en compte sa production par différents types cellulaires au cours de cette maladie. Il testera également des approches thérapeutiques basées sur la biologie de cette protéine d'intérêt.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la compréhension du rôle de la protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris, et le développement de nouvelles aproches thérapeutiques basées sur la biologie de cette protéine. Le modèle de sclérose en plaques utilisé dans ce projet est prédictif de la sclérose en plaques, et a déjà servi à la mise en place des traitements principaux aujourd'hui utilisés pour cette maladie chez l’homme.
Procédures
biopsie à la queue (génotypage invasif) pour prélèvement de la biopsie: ~10 secondes. Prélèvements (x2 sur animaux vigiles): 1x~5 secondes + 1x~15 secondes. Anesthésie (x2): ~15 minutes/anesthésie. Injections: ~30 secondes (x2 sur animaux anesthésiés) + ~10 secondes (x4 sur animaux vigiles) + ~45 secondes (x1 sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Injection = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement = douleur légère à moyenne, de courte durée et localisée. Biopsie à la queue (génotypage invasif) pour prélèvement de la biopsie = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale=paralysie partielle et transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser l’effet de la protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaques. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires entre différents organes qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du systèmes nerveux central impliquent également la migration des cellules du système immunitaire dans le système nerveux central, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du système nerveux central. Ces processus ne sont actuellement pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez l'animal.
Réduction
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec un programme d'analyse de puissance statistique. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission après un court épisode de paralysie afin de réduire la souffrance des animaux. Nous avons établi des points limites adaptés qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable et inutile des souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal ainsi que par le/les expérimentateur(s). La gravité des symptômes et le poids sont mesurés quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux et dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le modèle expérimental de sclérose en plaques chez la souris a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients. Il s'agit donc d'un modèle pertinent pour le développement et la compréhension de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. Utilisation de souris à partir de l’âge de 10 jours pour effectuer les gestes d'identification ainsi que la biopsie. Utilisation des souris à partir de 4 semaines pour effectuer un prélèvement pour génotypage. Cet âge est requis afin de s’assurer que les souris aient une taille appropriée et suffisante pour effectuer ces gestes sans porter atteinte à leur intégrité physique. A partir de 6 semaines d’âge et jusqu'à 16 semaines d’âge, les souris pourront être immunisées pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale parce que cela correspond à l'âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est adaptée pour étudier la pathogenèse de la maladie. Ce modèle permet l'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées qui sont nécessaires pour définir de manière robuste le rôle de chaque type cellulaire dans les processus étudiés et pour conduire les études mécanistiques.
Modèle murin de maltraitance physique infantile : syndrome du bébé secoué
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux de 7 jours sont séparés de leur mère, anesthésiés, puis secoués horizontalement, une première fois seuls puis à dix reprises à 24 heures d'intervalle. 1 306 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, seule gravité déclarée pour ce projet. Le porteur annonce des douleurs cérébrales, des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et de développement psychomoteur, une rigidité corporelle, des mouvements convulsifs et des troubles respiratoires, et écrit par ailleurs que les animaux "ne ressentiront aucune souffrance supplémentaire, car toutes les analyses seront effectuées après leur euthanasie". Les cerveaux et les rétines sont prélevés après la mise à mort pour y chercher des hémorragies, l'objet étant de reproduire chez la souris nouveau-née le syndrome du bébé secoué.
Objectifs
Le syndrome du bébé secoué, forme grave de maltraitance, provoque des lésions cérébrales sévères et des séquelles durables (troubles moteurs, cognitifs, langagiers ou comportementaux). Malgré son impact, ses mécanismes biologiques restent mal connus, freinant le développement de traitements ciblés. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes cérébraux et biologiques impliqués dans le syndrome du bébé secoué, en développant un modèle expérimental chez la souris nouveau-née, dont le développement cérébral présente des similarités avec celui du nourrisson humain. Ce modèle est nécessaire car les phénomènes étudiés impliquent des interactions complexes entre le cerveau, le système vasculaire et les réponses inflammatoires, qui ne peuvent pas être reproduites par des méthodes alternatives in vitro. La procédure expérimentale consistera à appliquer des secouements contrôlés et standardisés, réalisés une première fois de manière isolée, puis répétés à intervalles de 24 heures, pour un total de dix secouements. Cette approche vise à reproduire, de façon reproductible et encadrée, des conditions compatibles avec celles décrites chez les nourrissons victimes de ce syndrome. Les conséquences de ces secouements seront étudiées à différents stades du développement. Les analyses porteront sur le cerveau et la rétine afin d’identifier d’éventuelles lésions, notamment des hémorragies, à l’aide de techniques d’imagerie et d’analyses histologiques. Les réponses inflammatoires et certaines modifications biologiques seront également évaluées. Le développement et le comportement des animaux seront analysés à l’aide de tests adaptés à l’âge, permettant d’évaluer la motricité, la communication précoce, l’activité, l’anxiété et les interactions sociales. Ces évaluations permettront de relier les lésions cérébrales observées à d’éventuelles altérations fonctionnelles. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive tout au long du projet, et toutes les procédures seront réalisées en appliquant strictement les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) afin de limiter le nombre d’animaux utilisés et de minimiser les contraintes qui leur sont imposées. À terme, ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité de traitements existants et d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des enfants victimes.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une compréhension détaillée et intégrée des mécanismes cellulaires, moléculaires et comportementaux liés au traumatisme crânien non accidentel du syndrome du bébé secoué. En analysant les altérations cérébrales à différents stades du développement, de l’enfance à l’âge adulte, il permettra d’identifier les périodes clés de vulnérabilité et les moments les plus favorables à des interventions thérapeutiques ciblées. Ces résultats seront essentiels pour développer des approches adaptées aux enfants et adolescents victimes, et contribueront à mettre au point des stratégies de prévention secondaire efficaces, personnalisées et basées sur des données biologiques objectives.
Procédures
Après le traumatisme, des groupes d’animaux d’âges différents seront euthanasiés par surdosage d’anesthésiant. Une fois l’anesthésie confirmée (absence de réaction au pincement), les cerveaux sont prélevés en vue des analyses (lot 4 et 7 = 288 animaux). Pour certains animaux, une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie permettra de réaliser des mesures d’imagerie cérébrale (durée : 1 heure). Ces animaux seront euthanasiés sans réveil (lot 5= 100 animaux)
Impact sur les animaux
Le jour du traumatisme crânien par secouement : • Séparation d’avec la mère lors de l’anesthésie par inhalation. • Risque d’hypothermie lié à l’isolement maternel. • Application du traumatisme par secouement horizontal. Conséquences post-traumatiques : • Douleurs cérébrales dues aux lésions provoquées par le secouement. • Difficultés d’alimentation entraînant un retard de croissance pondérale. • Retard du développement psychomoteur. • Tension musculaire anormalement élevée, rigidité corporelle, mouvements anormaux ou convulsifs. • Troubles respiratoires. • Altérations du comportement. Lors des tests de comportement : • Le stress de manipulation et la séparation temporaire du groupe peuvent induire une anxiété passagère ou une agitation motrice. • Fatigue transitoire lors du test du niveau d’anxiété ou l’évaluation motrice Test IRM (photo détaillée du cerveau) et fUS (vidéo de l’activité cérébrale en direct) : • Une injection d’anesthésiant sera réalisée pour permettre ces deux tests. Les animaux ne ressentiront aucune souffrance supplémentaire, car toutes les analyses seront effectuées après leur euthanasie. • Les prélèvements seront réalisés après la mise à mort
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral après le traumatisme, ainsi que l’inflammation cérébrale.
Remplacement
Dans le domaine de l’étude des traumatismes crâniens non accidentels et de leurs conséquences sur le développement cérébral et comportemental, plusieurs alternatives aux modèles animaux ont été explorées, notamment les cultures cellulaires, les organoïdes cérébraux, mini-cerveaux sans pensée ni conscience crées en laboratoire à partir de cellules souches humaines, et les modèles informatiques. Les cultures cellulaires permettent d’étudier certains mécanismes moléculaires et cellulaires, comme l’inflammation ou les hormones, mais elles ne reproduisent pas la complexité de l’architecture cérébrale, des réseaux neuronaux et des interactions entre différents types de cellules dans un cerveau en développement. Les organoïdes cérébraux offrent une approche tridimensionnelle plus proche de l’organisation du cerveau humain, mais ils ne permettent pas de modéliser des fonctions comportementales, les interactions sociales ou les réponses du cerveau à un traumatisme physique. Les modèles informatiques et les simulations sont utiles pour tester des hypothèses ou analyser des données, mais ils reposent sur des informations expérimentales obtenues sur des modèles animaux vivant et ne permettent pas de prédire de manière fiable l’impact d’un traumatisme crânien sur le développement cérébral et comportemental.
Réduction
Pour mettre au point le modèle, nous utiliserons le moins d’animaux possible. Si le nombre minimal de secouements nécessaire pour provoquer les lésions caractéristiques est atteint, les expérimentations seront arrêtées. Les cerveaux des animaux participant aux analyses de la connexion entre les neurones et aux tests comportementaux seront également utilisés pour les analyses du tissus cérébral. Cette approche permet d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire le nombre total nécessaire. Toutes les mesures seront mises en œuvre pour réduire au maximum l’utilisation d’animaux. Grâce aux méthodes expérimentales régulièrement appliquées dans les laboratoires, nous disposons déjà de données préliminaires solides. Celles-ci nous permettent de calculer précisément le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs entre les groupes. Les comparaisons entre groupes seront réalisées à l’aide de tests statistiques. Le plan expérimental a été optimisé afin de garantir la robustesse et la reproductibilité des résultats, tout en respectant strictement le principe de réduction, le nombre d’animaux étant limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
L’environnement des animaux sera enrichi avec du papier doux absorbant permettant la fabrication de nids, reproduisant ainsi un comportement naturel de nidification. Lors des manipulations (secouements), les souriceaux seront maintenus au chaud à l’aide d’une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement à l’aide d’un arbre décisionnel, permettant une observation attentive au sein de la portée sans perturber la relation mère-petits, essentielle à leur développement. Principe de l’arbre décisionnel : Un animal en difficulté est rapidement repéré grâce à des signes cliniques caractéristiques. En cas de détresse physiologique (troubles respiratoires, hypothermie sévère, variation importante de la fréquence cardiaque), la procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal euthanasié. Enfin, avant les prélèvements de tissus cérébraux, les animaux recevront un analgésique.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est scientifiquement pertinent en raison de la reproductibilité des résultats, de la connaissance approfondie de sa biologie, et de son cycle de reproduction court, qui permet des études développementales efficaces. Le protocole de secouement sera appliqué à 7 jours de vie, stade qui correspond au début de la petite enfance chez l’humain en termes de développement cérébral. L’objectif étant d’étudier les interactions cellulaires dans un cerveau en développement, dans un contexte de traumatisme crânien, il est essentiel d’utiliser une espèce dont le système nerveux central présente des similarités structurales et fonctionnelles avec celui de l’humain. La souris répond à ces critères et constitue un modèle validé pour les études en neurosciences. Le modèle murin est ici particulièrement adapté : sa robustesse face aux manipulations, la richesse des données précliniques disponibles, et la possibilité d’explorer les effets du secouement sur des périodes développementales bien définies justifient pleinement son utilisation. Le traumatisme crânien par secouement sera induit à 7 jours de vie, âge correspondant au début de l’enfance chez l’humain, afin de mimer la survenue précoce de lésions cérébrales. L’évolution des lésions et l’analyse des différents types de cellules du système nerveux seront étudiées à plusieurs étapes importantes du développement: • 8 et 9 jours de vie : stades précoces correspondant à l’enfance, • 14 et 21 jours de vie : stades intermédiaires évoquant l’adolescence, • 1 mois 1/2 et 6 mois : stades tardifs correspondant à l’âge adulte.
Evaluation de l’efficacité de composés dans un modèle de stress induit, chez le rongeur, par l’exposition chronique à la corticostérone
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 840
Manipulés deux à trois fois par semaine pendant quinze jours, habitués une semaine aux gestes d'injection, puis traités un à sept jours de suite par piqûre intrapéritonéale, sous-cutanée ou gavage : 840 souris et 840 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La corticostérone administrée par voie orale leur fait prendre du poids et déclenche anxiété et stress, et le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer infections, inflammations et irritations au point de piqûre, les gavages des fausses routes et des irritations de l'œsophage. Aucune mesure n'est faite sur l'animal vivant : les 1 680 rongeurs sont anesthésiés à l'isoflurane puis décapités, et c'est sur des tranches de leur cerveau que l'activité électrique est enregistrée. Le porteur écrit avoir besoin de réseaux neuronaux "natifs et connectés", ce que seule la mise à mort permet d'obtenir.
Objectifs
L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules destinées à réduire les effets du stress chronique. Pour cela, nous utiliserons un modèle chez le rongeur dans lequel un état de stress prolongé sera reproduit en administrant une hormone du stress, la corticostérone. Grâce à ce modèle et à nos mesures d’activité électrique du tissus nerveux nous pourrons mieux comprendre si les molécules testées peuvent corriger les effets du stress chronique, et d’identifier les traitements potentiels les plus prometteurs pour des études ultérieures.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments dans ce modèle. Nos techniques, mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation de leurs effets sur le tissu nerveux vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie chronique une analyse fine de l’effet de la molécule ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons, ex vivo); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.
Procédures
Les animaux sont manipulés 2 à 3 fois par semaine les 15 premiers jours puis habitué aux futures manipulations d’injection pendant une semaine et enfin à chaque injection les jours suivants. Ils sont traités entre une fois par jour pendant un jour ou 7 jours maximum soit 1 à 7 injections. Ces traitements peuvent être soit une injection intrapéritonéale, soit une injection sous cutanée ou soit un gavage oral. Chacun dure moins d’une minute. Et enfin une anesthésie à l’isoflurane durant 5 min maximum.
Impact sur les animaux
La projet peut générer des effets indésirables. : *-Du stress peut être induit par la manipulation régulière d’un animal ; *-la prise de poids importante, l’anxiété et le stress sont déclenchés par la prise orale de corticostérone ; *-des infections, inflammations, irritations peuvent apparaitre lors des administrations répétées au site d’injections. *-de fausses routes et irritations de l’œsophage peuvent apparaitre lors des gavages répétés.
Devenir
Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des molécules à tester sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle.
Remplacement
Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions anormales ou perturbées observées lors d’un état de stress chroniques.
Réduction
Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 84 animaux maximums pour la réalisation de ce protocole lors d’une étude. Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, une analyse précise à l’échelle du tissu tout en s’affranchissant des problèmes de passage dans le système nerveux et des problèmes de disponibilité dans l’organisme, mais aussi d’analyser rapidement l’impact sur le fonctionnement électrique du tissus nerveux d’un composé dans ce modèle de stress chronique.
Raffinement
Tous les animaux bénéficient de trois groupes d’enrichissement tournants adaptés pour contrecarrer l’anxiété des animaux. Les animaux utilisés seront habitués, dès le départ, aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Une attention particulière sera portée aux animaux pour repérer chaque signe de dispute/bagarre et isoler au plus tôt les agresseurs. Une vigilance spéciale autour des animaux injectés de façon répétée est posée, pour que lors de ces injections répétées, les sites d’injection soient modifiés dans la zone cible en surveillant tout problème éventuel d’inflammation, au lieu d’injection. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à cette induction de stress. Lors de la mise à mort par décapitation rapide, les animaux adultes sont au préalable anesthésiés grâce à une induction à l’isoflurane par du personnel qualifié et formé.
Choix des espèces
Le développement de ce modèle inductible de stress et la grande quantité d’informations scientifiques disponibles sur le fonctionnement du système nerveux des souris et rats, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique et au développement de techniques d’enregistrement de l’activité cérébrale sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour la préparation de tranches de tissu nerveux et l’évaluation de l’efficacité de futur médicament. Pour ces raisons, nous n’utilisons que ces rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 6 et 16 semaines post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Développement et validation de biomarqueurs IRMf permettant de distinguer les altérations vasculaires et astrocytaires dans des conditions neurologiques spécifiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 60
Jusqu'à trois heures d'acquisition par séance sous sédation continue, et trois séances par souris à 3, 6 et 12 mois : 260 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une chirurgie de la tête d'une à deux heures pour marquer, lire puis inactiver les cellules qui relient les neurones aux vaisseaux sanguins, geste dont le porteur indique qu'il peut provoquer des douleurs et une perte de poids les jours suivants. L'objet est de calibrer des marqueurs d'IRM fonctionnelle capables de suivre l'évolution des maladies des petits vaisseaux cérébraux, que l'imagerie anatomique ne renseigne pas sur la gravité. Le porteur retient des rongeurs de 8 semaines à 18 mois pour couvrir tous les stades, du jeune adulte à l'animal vieillissant, et les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour examen au microscope.
Objectifs
Les maladies des petits vaisseaux cérébraux (MPVC), qui affectent les vaisseaux intracrâniens de moins de 500 microns de diamètre, sont responsables de 20 à 30 % des accidents vasculaires cérébraux ischémiques (mauvaise irrigation du cerveau) et de 90 % des hémorragies intracérébrales. Elles peuvent entraîner un déclin cognitif allant de légères altérations des fonctions exécutives jusqu'à une démence sévère. À un stade avancé, elles favorisent également des difficultés de marche et d'équilibre, des troubles de l'humeur et des changements de comportement. Comme d'autres maladies neurodégénératives, les MPVC n'ont actuellement pas de traitements pharmacologiques. Le diagnostic de ces maladies repose sur l'identification de lésions caractéristiques par imagerie par résonance magnétique (IRM) anatomique. Bien que l'IRM soit utile pour le diagnostic, elle ne permet pas de définir la gravité de la pathologie, étant donné que le nombre et l'étendue des lésions varient dans le temps de manière quasi indépendante de la gravité. Elle ne permet donc pas de suivre l’évolution de la maladie. Notre premier objectif est de voir si une modalité d’IRM cette fois-ci dynamique, l’IRM fonctionnelle cérébrale (IRMf), pourrait permettre de collecter des données renseignant finement sur l’évolution de la maladie, en mesurant presque en temps réel les changements locaux de flux sanguin. Chez les souris, en alternative à l'IRM fonctionnelle, nous utiliserons l'écho-encéphalographie fonctionnelle, qui a démontré une meilleure sensibilité et une résolution temporelle supérieure, tout en fournissant des signaux similaires à ceux de l'IRMf. Pour y parvenir, nous aurons recours à plusieurs modèles animaux des MPVC qui ont été développés au cours des dernières décennies. Ces modèles génétiques ou pharmacologiques, nous permettront de comprendre l’origine des altérations vasculaires et notamment de faire la différence entre des altérations des vaisseaux eux-mêmes et des altérations de l’environnement cellulaire de ces vaisseaux.
Bénéfices attendus
Nos recherches visent à identifier et calibrer de nouveaux outils diagnostiques basés sur l'IRMf pour évaluer la présence et la gravité des MPVC. Actuellement, le diagnostic de ces maladies ne s'effectue qu'à partir des symptômes ou par analyses génétiques. Ces approches ne répondent pas aux besoins des patients, car elles ne fournissent pas d'éléments sur la gravité de la maladie et n'informent que sur les stades les plus avancés de celle-ci. Des outils diagnostiques capables de détecter les phases précoces et de produire des données quantitatives sur la gravité ouvriront la voie aux tests de différents traitements pharmacologiques déjà validés sur des modèles de souris. A plus long terme, l’obtention de marqueurs fins de la maladie et de son évolution devrait permettre de développer des premiers traitements efficaces pour ces maladies.
Procédures
Les animaux recevront un antidouleur et une anesthésie générale avant de subir une quelconque intervention. Certaines souris avec des mutations transgéniques activables via l'administration de substances spécifiques, recevront le traitement par applications transdermiques de la durée de quelques minutes, le temps pour faire absorber la solution sur la peau, pendant 5 jours consécutifs. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ une heure (et pas plus de 2 heures) réalisée au niveau de la tête– pour : I) marquer les cellules qui participent aux interactions entre les neurones et les vaisseaux sanguins, II) pour "lire" les signaux provenant des cellules marquées, III) pour « inactiver » ces cellules avec des substances spécifiques, déjà largement utilisées dans des expériences précédentes sur des rongeurs. La lecture et l'inactivation des cellules d'intérêt seront effectuées pendant les séances d’IRM ou par l'écho-encéphalographie, mais ces imageries ne provoquent aucune douleur ni gêne aux animaux, d’autant plus qu’ils seront sédatés. Avant les sessions d'imagerie un cathéter sera posé sur le dos de animaux pour leur administrer en continue une molécule qui induit une sédation. Une fois le cathéter positionné, les animaux seront ensuite positionnés dans un berceau compatible avec l’IRM ou avec les ultrasons fonctionnels pour 3h maximum d’acquisition. Il n’y aura pas plus de 3 séances d’acquisition par souris, à 3, 6 et 12 mois. Une seule séance pour les rats.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour préparer les animaux aux expériences d'IRM pourra entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. L’anesthésie mise en place lors du protocole d’acquisition IRM pourra fragiliser les animaux en induisant une modification de leur comportement et/ou une perte de poids. Pendant les applications sur la peau des substances d’intérêts, les souris peuvent réagir brièvement à la sensation de froid de l'éthanol, mais aucune douleur durable ni lésion tissulaire n'a été observée par des études précédents. Les animaux seront gardés isolés pendant quelques minutes dans une cage, au chaud, après chaque session d'IRM pour qu'ils se réveillent. Dans ce cas, un mouchoir en papier sera ajouté à la cage pour servir de nid et une partie de la litière de la cage d'origine sera ajoutée pour rendre l'environnement moins étranger à l'animal.
Devenir
La suite du projet prévoit des analyses approfondies des différents tissus du cerveau. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure pour prélever leurs cerveaux et pour les étudier par microscopie.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier la dynamique vasculaire grâce à l’IRM fonctionnelle et de mettre en place de nouvelles méthodes diagnostiques de la MPVC chez l’humain. Il n’existe pour l’instant pas de modèles in vitro suffisamment robustes et complexes pour reproduire la dynamique vasculaire cérébrale. Seul un organisme vivant suffisamment proche de l’humain possède les mêmes caractéristiques d’organisation et de complexité. Cette caractéristique du cerveau n’est présente que dans le cerveau vivant au repos. C’est pour cette raison qu’il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre alternative non animale.
Réduction
Nous effectuerons des recherches constantes dans la littérature scientifique pour vérifier que des études similaires à la nôtre soient publiées entre-temps. Dans ce cas, nous suspendrons les investigations qui pourraient dupliquer inutilement des résultats déjà publiés, sauf s'il y a des besoins évidents de vérification des résultats ou des doutes fondés sur la qualité des résultats publiés. En outre, tous les groupes expérimentaux ont été soigneusement calculés a priori, sur la base d'études antérieures similaires, dans le but d'utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en permettant une analyse statistique rigoureuse des résultats.
Raffinement
Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et reçoivent un analgésique ainsi que des injections d’anesthésique locales. Pour le suivi post chirurgie des modèles pharmacologiques, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés. Les IRM seront réalisées par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous anesthésie générale. Un monitoring de la respiration et température est prévu tout au long de la séance IRM. Si un animal présente un signe de douleur persistant il sera retiré du protocole et euthanasié. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement avec des balles de papiers pour réaliser un nid et une maisonnette en plastique seront prévus pour chaque cage. De par notre expérience passée sur des protocoles similaires, la probabilité qu’un animal présente des signes importants de stress ou de souffrance (à cause d’une blessure par exemple) sera très faible. Néanmoins, un système d’observation rigoureux des animaux sera mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
Notre projet repose sur l'utilisation des modèles suffisamment proches de l’humain d’un point de vue organisation générale (des organes, des tissus, des types cellulaires et des fonctions). Les rongeurs constituent un modèle adapté pour les expériences proposées, où l'unité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise. Nous utiliserons également des modèles de souris issus de lignées génétiquement modifiées disponibles, ayant une reproduction bien maitrisée. Les souris et les rats sont très couramment utilisés en recherche sur les MPVC, et de nombreux modèles expérimentaux existent déjà. Les MPVC sont des maladies qui se déclenchent à l’âge adulte. Cependant, l’intérêt de cette étude est de pouvoir mettre en place des biomarqueurs détectables à tous les stades de la maladie (d’un stade précoce à un stade âgé). Les animaux utilisés seront donc des animaux adultes âgés de 8 semaines à 18 mois afin d’avoir un panel élargit allant de jeunes adultes à rongeurs âgés.
Etude de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules pour la délivrance d’ARN chez un modèle murin d’inflammation intestinales aigüe et chronique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
591 souris vont être utilisées, dont 555 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir jusqu'à six administrations intra-rectales sous anesthésie et six gavages. Un agent chimique leur provoque une inflammation intestinale qui se traduit par une perte de poids, des selles anormales et du sang dans les selles, l'état de chaque animal étant noté chaque jour sur une grille de 0 à 4. Toutes sont tuées, à la fin de l'étude ou à des points intermédiaires, pour des analyses post mortem. Les bénéfices annoncés, une nouvelle génération de traitements ciblés contre la maladie de Crohn et la rectocolite, sont renvoyés au long terme et au conditionnel, quand l'inflammation infligée aux souris est le point de départ du protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de vérifier si des nanoparticules biodégradables à base d’ARN peuvent atténuer efficacement l’inflammation intestinale, un problème majeur dans des maladies comme la colite. En induisant artificiellement une inflammation chez la souris, puis en administrant ces nanoparticules, nous pourrons mesurer leur impact sur les symptômes et l’évolution de l’inflammation. Si les résultats sont positifs, cela ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les personnes souffrant de maladies inflammatoires de l’intestin. Les maladies inflammatoires de l’intestin sont des troubles auto-immuns caractérisés par une inflammation sévère et récurrente de la paroi du tube digestif. Ces maladies, en augmentation dans les sociétés modernes, sont graves et les traitements actuels peinent à offrir une efficacité durable, entraînant souvent des effets secondaires pour les patients. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques nouvelles et mieux ciblées. Ce projet de recherche a pour but de mettre au point une approche thérapeutique innovante, utilisant une nanoparticule capable d’améliorer la prise en charge de ces pathologies inflammatoires. Ce projet d’expérimentation sur un modèle animal vise précisément à étudier l’efficacité thérapeutique de nanoparticules à base d’ARN, biodégradables et biocompatibles, dans un modèle de maladie intestinale inflammatoire (comme celles de type Crohn et colite ulcéreuse). Le projet s’inscrit dans une démarche scientifique et médicale visant à répondre aux interrogations suivantes : 1. Déterminer si les nanoparticules à base d’ARN, administrées par voie orale, sont capables de réduire efficacement l’inflammation intestinale. 2. Comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les nanoparticules à base d’ARN modulent la réponse inflammatoire dans l'intestin.
Bénéfices attendus
À court terme, le projet apportera des réponses sur l’efficacité des nanoparticules à base d’ARN pour traiter l'inflammation intestinale dans des modèles murins, tout en améliorant la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués. Il jettera également les bases pour de futures applications thérapeutiques en médecine humaine. À long terme, ces nanoparticules pourraient représenter une nouvelle génération de traitements ciblés pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, avec moins d'effets secondaires et un potentiel pour des thérapies personnalisées. Ainsi, ce projet pourrait significativement faire progresser les connaissances scientifiques tout en ayant un impact majeur sur le développement de nouvelles thérapies cliniques pour les maladies inflammatoires.
Procédures
Dans les différentes procédures : - les animaux seront rasées sur une petite zone du dos (1,5x1,5cm, une seule fois en début de procédure, 1 minute) - les animaux recevront une ou plusieurs (6 maximum) administrations intra-rectale (5 minutes maximum pour l’ensemble du geste), sous anesthésie et plusieurs administrations (6 maximum) par gavage oral (moins d’une minute pour le geste), sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux (contention, pesée et anesthésie) pourra entraîner un état de stress. La rasage (tondeuse) nécessaire à la pré-sensibilisation au produit peut créer une légère irritation. L’injection d’un agent chimique va induire une inflammation au niveau de l’intestin peut se traduire par une perte de poids, une consistance des selles particulière et une présence de sang dans les selles. L’administration par voie orale est un geste rapide (moins d’une minute). Toutefois, cela pourrait éventuellement provoquer une légère irritation au niveau de l’œsophage.
Devenir
Pour chacune des procédures : Tous les animaux seront mis à mort soit à la fin de l’étude soit à différents points temporels afin de réaliser des études ex-vivo post mortem.
Remplacement
Bien que les tests en laboratoire (in vitro) soient utiles pour des études préliminaires, ils ne peuvent pas simuler toute la complexité des interactions biologiques qui existent dans un organisme complet. Ces études en laboratoire nous ont déjà permis de démontrer que nos nanoparticules sont stables dans des conditions physiologiques variées (milieux qui simulent les fluides gastrique et intestinal) et qu'elles sont compatibles avec des cellules immunitaires et intestinales. Cependant, pour évaluer efficacement notre traitement dans le cadre de l’inflammation intestinale, il est indispensable d’avoir recours à des tests sur organisme vivant (in vivo). 1. Tolérance et sécurité globales : Pour garantir que le traitement ne déclenche pas de réactions indésirables ou toxiques dans un organisme entier, un modèle vivant est essentiel. 2. Interaction avec le microbiote intestinal : Le microbiote joue un rôle clé dans l’inflammation intestinale. Un modèle in vivo permet d’examiner comment les nanoparticules interagissent avec cette communauté complexe de micro-organismes, un élément qui ne peut être simulé de manière fiable en laboratoire. 3. Réalité des conditions de maladie : Les organismes vivants reproduisent les conditions pathologiques réelles, permettant ainsi de tester la réponse au traitement dans des conditions proches de celles rencontrées par les patients. 4. Effets dynamiques dans l’intestin : L’inflammation intestinale modifie des processus comme la perméabilité de l’intestin et son activité motrice, qui influencent directement l’efficacité des traitements oraux. Un modèle in vivo est donc nécessaire pour vérifier si nos nanoparticules parviennent à atteindre la cible thérapeutique. En somme, l’utilisation d’un modèle vivant permet de recréer un environnement biologique complet et complexe, essentiel pour confirmer l’efficacité, la biocompatibilité, et la sécurité de notre traitement dans des conditions proches de celles de l’humain.
Réduction
Dans l’ensemble de notre projet, le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.
Raffinement
Pour préparer les souris au projet, nous les acclimaterons pendant une semaine pour réduire leur stress. Pendant tout le protocole, nous veillerons à leur bien-être et prendrons des précautions pour minimiser toute souffrance ou stress. Dans leurs cages, elles auront des objets comme des petites maisons et du paillage pour les distraire, et seront placées en groupes de cinq car elles sont sociables. Les souris seront transportées en toute sécurité dans des boîtes fermées et isolées du bruit. Toutes les souris seront observées pendant chaque pesée (tous les jours) afin de détecter une éventuelle apparition de signes de souffrance. Quand cela sera nécessaire, des experts montreront les techniques spécifiques pour minimiser le stress des souris. Si elles perdent trop de poids, nous ajouterons de la nourriture humide et de l'eau gélifiée pour les aider à s'alimenter. Si le rasage (tondeuse) provoque une irritation, la litière pourra être adoucie. Avant l’administration intra-rectale, les souris recevront une anesthésie légère, et nous humidifierons leurs yeux pour les protéger. Les points limites seront évalués quotidiennement à partir de l’induction de la pathologie, selon une grille de score : il varie de 0 à 4. De plus les critères comportementaux et apparences seront également pris en compte. Un traitement palliatif sera mis en place dès lors que la situation nécessaire et possible laissant une possibilité de rémission et non mise à mort systématique après 24h.
Choix des espèces
Le développement de nouvelles thérapies types nanoparticules nécessite une évaluation chez le petit animal en complément des études in vitro pour déterminer leur devenir et leur efficacité in vivo. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour mimer la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales. Le modèle d’inflammation intestinale induite par l’agent chimique d’intérêt est déjà bien établi et mime la pathologie humaine que nous ciblons. Le modèle choisi est décrit dans la littérature pour être sensible à l’induction d’une inflammation intestinale, contrairement à d’autres. Ce modèle nous permettra donc d’acquérir les données nécessaires pour démontrer l’efficacité thérapeutique notre nanoparticule. Les animaux utilisés auront environ 6 semaines au début des procédures, conformément aux données de la littérature indiquant que les souris de cet âge sont plus réceptives au développement d'une inflammation intestinale après administration de l’agent chimique. Au-delà de cet âge, l'induction d'une inflammation intestinale devient plus difficile.