Souris
Validation en modèle murin de l’effet thérapeutique d’un vaccin muqueux anti-SARS-CoV2 contre les symptômes du covid-long (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.
Objectifs
Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.
Bénéfices attendus
Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.
Procédures
Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.
Exploration de la réponse immunitaire dirigée contre un virus dans le contexte de la transplantation cardiaque
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-sept injections dans le ventre et neuf prélèvements de sang par animal après une greffe de cœur cousue au niveau du cou: 1 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Près de la moitié sont utilisées comme donneuses, infectées par un cytomégalovirus, l'autre moitié recevant leur cœur sous traitement anti-rejet. Donneuses et receveuses sont génétiquement différentes pour reproduire l'incompatibilité entre un donneur d'organe et son receveur, et le porteur indique qu'amplifier le virus dans les glandes salivaires de souris vivantes reste "nécessaire", la culture cellulaire l'affaiblissant. Toutes sont tuées pour prélever poumons, foie, cœur, reins, rate et glandes salivaires.
Objectifs
Lorsqu’un patient subit une transplantation d’organe et qu’il reçoit un organe provenant d’un donneur, son système immunitaire peut alors reconnaître cet organe comme étranger et provoque son rejet. Pour l’éviter, les patients doivent prendre des traitements immnosuppresseurs (anti-rejet). Ces médicaments visent à réduire l’activité de l’ensemble du système immunitaire et protègent l’organe transplanté mais ils rendent aussi les patients plus vulnérables aux infections. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est celle causée par le cytomégalovirus. Ce virus est très répandu dans la population générale. Chez une personne en bonne santé qui s’infecte pour la première fois, les symptômes sont souvent légers voire absents, car le système immunitaire contrôle rapidement l’infection. Le virus reste ensuite dormant, en « latence », dans différents organes (les reins, le foie, le cœur, les poumons…). Le problème apparaît lorsqu’un patient receveur, n’ayant jamais été en contact avec ce virus, reçoit un organe provenant d’un donneur porteur du virus. Sous traitements anti-rejet, le receveur ne peut pas développer une réponse immunitaire efficace contre le virus. L’infection peut alors se réactiver et entraîner des complications graves, compromettant la santé du patient et la survie de l’organe transplanté. L’objectif de ce projet est d’étudier la manière dont le système immunitaire réagit contre le cytomégalovirus après transplantation, en particulier sous traitement anti-rejet. Nous analyserons aussi l’impact des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental de transplantation cardiaque chez la souris dans lequel le cœur de souris donneuses infectées de manière latente au cytomégalovirus sera transplanté à des souris receveuses n’ayant jamais été en contact avec le virus et traitées avec différents médicaments anti-rejet. Le choix du modèle de transplantation cardiaque se justifie par la taille plus importante des vaisseaux, rendant la procédure chirurgicale plus simple que pour d’autres organes. Les souris donneuses et receveuses seront génétiquement différentes afin de reproduire ce qui se passe lorsqu’un patient reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la propagation du virus seront analysés dans les différents organes des souris receveuses, ainsi que la réponse immunitaire développée par ces souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organe, ainsi que le rôle des principales cellules immunitaires impliquées dans le contrôle et la résolution de cette infection chez les patients transplantés. Les résultats obtenus permettront de également de préciser l’impact des traitements anti-rejet sur la réactivation et la dissémination du cytomégalovirus et de savoir comment moduler la réponse immunitaire du receveur afin de la rendre efficace contre le cytomégalovirus tout en limitant le risque de rejet, avec pour objectif de réduire la morbi-mortalité liée à ce virus et de prolonger la durée de vie des greffons.
Procédures
Toutes les souris donneuses de greffon cardiaque (soit près de la moitié du nombre total des animaux prévue pour ce projet) recevront une injection (du virus) dans le ventre sur animal vigile en début de procédure. 3 prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés sur les souris donneuses (avant infection, une semaine après infection et quelques jours avant la chirurgie pour confirmer l’état de latence du virus). En fin de procédure, les souris donneuses recevront une injection d’anesthésiques (anesthésie générale profonde) dans le ventre et une injection d’analgésique morphinique dans le ventre avant la chirurgie. La peau sera désinfectée et incisée afin de prélever le cœur des souris donneuses. Durée de l’opération chirurgicale : 1h. Toutes les souris receveuses de greffon cardiaque (l’autre moitié des animaux de ce projet) seront anesthésiées profondément via une injection d’anesthésiques dans le ventre et recevront au total 4 injections sous la peau d’analgésique morphinique sur une période de 2 jours. Ainsi, sous anesthésie profonde générale et analgésie, la peau sera désinfectée et incisée afin de greffer le cœur de la souris donneuse au niveau du cou, puis suturée. L’opération chirurgicale durera 2h maximum. De plus, elles seront également soumises à des injections dans le ventre répétées 3 fois par semaine sur animal vigile (soit au maximum 27 injections sur 63 jours maximum), et à des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit jusqu’à 9 prélèvements maximum). Les injections dans le ventre et les prélèvements sanguins dureront 30 secondes (contention comprise).
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements de sang répétés sont susceptibles d’entrainer un stress (lors de la contention) et une légère douleur lors de l’acte. La greffe de cœur correspond à une procédure bien documentée, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. L’intervention chirurgicale entrainera une gêne lors du réveil et une douleur malgré les analgésiques et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. L'infection à cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c’est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Pour les souris traitées avec le traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation hépatique non douloureuse), ou une colite (associée à des diarrhées). L’infection durera 4 mois (pour les souris donneuses immunocompétentes) ou 2 mois (pour les souris receveuses sous traitement anti-rejet) au maximum. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux. Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Les points limites propres à chaque procédure ont été décrits pour éviter toute souffrance.
Devenir
Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, rate et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe et les interactions cellulaires aboutissant à la réponse dirigée contre le cytomégalovirus font intervenir de multiples acteurs immunitaires présents dans différents tissus ou organes lymphoïdes, ce qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, le phénomène d’ischémie-reperfusion (lésions dues à l’arrêt puis retour du flux sanguin) est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés, nous avons donc besoin de toute la complexité vasculaire et inflammatoire de l’organisme vivant pour reproduire ce phénomène observé en transplantation d’organe. Dans certains cas, la génération du stock de virus peut être réalisée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de dimiuner la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir de glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous devons utiliser la souche non modifiée et peu virulente afin d’étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n’est pas possible avec les autres souches de virus modifiées plus virulentes), et que le virus doit être suffisamment virulent afin d’infecter des hôtes immunocompétents et d’obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe afin d’assurer la robustesse des analyses. Afin d’atteindre un effectif de 5-6 animaux par expérience, sachant que 2 types de protocoles expérimentaux incompatibles seront réalisés (soit 10-12 animaux par groupe), en prenant en compte le taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques, nous prévoyons 14 animaux par groupe. Au total, le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 1226 souris (mus musculus). Néanmoins, ce nombre est suceptible d’être revu à la baisse au cours du projet. L’étape de génération du stock de virus in vivo étant redondante avec un autre projet (déjà validé par le ministère), si la quantité de virus générée dans ce premier projet est également suffisante pour ce nouveau projet, nous ne réaliserons pas cette procédure. De même, le nombre d’animaux prévus pour l’entrainement technique à la greffe cardique correspond à un nombre maximal : ainsi, dès validation de la technique, nous passerons à l’étape suivante. Les différentes étapes de ce projet se feront séquentiellement afin de sélectionner au mieux les groupes les plus pertinents au fur et à mesure de l’avancée du projet, et ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le maximum d’échantillons biologiques sera extrait de chaque animal, et plusieurs expériences seront réalisées sur les mêmes échantillons, afin d’éviter d’avoir à reproduire ultérieurement l’expérience par manque de matériel biologique.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque acte ont été définis afin d’assurer une prise en charge adaptée. Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection et les sites de prélèvement. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Bien que la douleur lors des injections ou des prélèvements dans ce protocole sera réduite grâce à l'administration d'analgésiques/anesthésiques, des points limites ont tout de même été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité et de limiter la souffrance de l'animal. Après chaque chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et un suivi rapproché sera effectué. Le protocole chirurgical a été établi de façon à ce que le cœur de la souris receveuse est conservé et fonctionnel, ainsi, la perte du greffon cardiaque (issu de la souris donneuse) ne peut entrainer la mort et la souffrance de l’animal en soi. L'infection au cytomégalovirus des animaux traités sous traitement anti-rejet est susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du côlon. Un suivi quotidien de leur état général sera effectué, et la survenue de diarrhées sera contrôlée. À cela s'ajoute un monitoring spécifique permettant de doser les enzymes du foie grâce aux prélèvement sanguins réalisés de façon hebdomadaire. Ces prélèvements sanguins réguliers sont donc nécessaires afin de suivre l’état de santé des animaux et de réagir plus précocément en cas de résultats insatisfaisants. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.
Choix des espèces
Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Pour les expériences de transplantation, des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin de garantir un système immunitaire pleinement mature capable de répondre à l’infection. Pour la production virale in vivo, des souris immunocompétentes agées de 6 semaines, déjà sevrées, seront utilisées afin d’optimiser le rendement, tout en préservant leur bien-être.
Déterminants cellulaires et moléculaires des activités pathologiques dans un modèle expérimental murin d’épilepsie.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à six injections pour déclencher une épilepsie, une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau, puis des enregistrements dix heures par jour pendant vingt et un jours et jusqu'à quarante-deux injections: 846 souris vont être utilisées, dont 621 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À partir de la chirurgie, elles sont hébergées seules jusqu'à sept semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress pour une espèce vivant normalement en groupe. Le projet vise à identifier les cellules cérébrales actives pendant les crises pour les cibler ensuite par optogénétique ou chémogénétique. Le bien-être des animaux non-humains est présenté comme la "priorité" de l'équipe, laquelle indique aussi qu'il arrive que des crises très sévères leur soient fatales.
Objectifs
L'épilepsie est une maladie neurologique courante qui touche près de 1 pourcent de la population mondiale. L'une de ses formes les plus fréquentes chez l'adulte est l'épilepsie du lobe temporal mésial, souvent causée par la sclérose hippocampique, une cicatrice dans une partie du cerveau appelée hippocampe. Pour environ 30 pourcents de ces patients, les médicaments actuels ne parviennent pas à contrôler les crises. On parle alors d'épilepsie pharmacorésistante. Dans ces cas, une chirurgie pour enlever la zone cérébrale responsable des crises est souvent la seule solution. Notre objectif est d'améliorer la compréhension de cette forme d'épilepsie afin de trouver de nouveaux traitements. Pour cela, nous utilisons un modèle expérimental de l'épilepsie chez la souris, qui reproduit les caractéristiques de la maladie humaine. Notre recherche se déroule en plusieurs étapes. Nous allons tout d'abord essayer d’identifier les types de cellules cérébrales qui sont actives pendant les crises d'épilepsie. Puis nous les étudierons ensuite pour comprendre leurs caractéristiques (leur forme, leur activité et les gènes qu'elles expriment). Une fois ces cellules bien identifiées, nous pourrons essayer de moduler spécifiquement leur activité pour voir si cela permet de réduire la fréquence des crises. De plus, en nous basant sur les mécanismes que nous aurons identifiés, nous allons rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques et tester l'efficacité de molécules agissant sur ces mécanismes. Notre but est de trouver de nouveaux médicaments qui pourraient aider les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les traitements actuels. Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de l'épilepsie du lobe temporal pour développer de nouvelles thérapies. Notre travail, effectué sur un modèle de souris, vise à identifier les cellules à l'origine des crises pour pouvoir les cibler de manière plus précise et ainsi offrir de nouvelles options aux patients dont les crises ne peuvent pas être contrôlées par les médicaments.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à combler un manque de connaissances important : la compréhension précise des réseaux de neurones responsables du déclenchement et de l'évolution des crises d'épilepsie. Les informations que nous allons récolter pourraient aider à identifier avec plus de précision les cellules spécifiques impliquées dans l'activité épileptique. Ce projet pourrait permettre de découvrir de nouvelles pistes pour développer des médicaments plus efficaces, en ciblant directement les mécanismes responsables des crises. Par ailleurs il permettra également d'évaluer des techniques de pointe, comme l'optogénétique et la chémogénétique. Ces méthodes utilisent la lumière ou des molécules pour contrôler l'activité de cellules spécifiques. Elles pourraient, à terme, ouvrir la voie à des thérapies totalement nouvelles pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. En résumé, ce projet a pour objectif d'améliorer de manière significative notre compréhension de l'épilepsie, avec l'espoir de développer à plus long terme de nouvelles options de traitement pour les patients dont les crises ne sont pas contrôlées par les médicaments.
Procédures
Une partie des animaux recevra des injections de molécules pour induire la pathologie (vigile, 6 injections maximum, quelques secondes par injection). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Pour une partie de ces animaux leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur 1 journée pendant 10h environ et ils recevront une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, 1 fois, quelques secondes pour l’injection). Pour les autres l’enregistrement sera réalisé en continu pendant 21 jours et ils recevront 1 à 2 injections de composés chaque jour pour évaluer leur effet thérapeutique (vigile, quelques secondes par injection, 42 injections maximum). Une autre partie des animaux aura une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour injecter une molécule au niveau du cerveau afin d’induire la pathologie (1 fois, 1h maximum). 4 semaines après ils auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour implanter un dispositif permettant d’enregistrer et stimuler l’activité cérébrale (1 fois, 1 heure environ). Ils seront ensuite habitués à l’enregistrement de l’activité cérébrale (vigile, branchement du dispositif les laissant libre de se déplacer) pendant 2 à 4h par jour, 5 jours. Leur activité cérébrale sera ensuite enregistrée sur une journée pendant 10h environ au cours de laquelle ils reçoivent une injection d’un composé pour activer une mutation génétique (vigile, durée quelques secondes). 1 semaine après, les enregistrements (vigile) sont réitérés 10h par jour pendant 21 jours consécutifs. Au cours de ces enregistrements certains recevront une stimulation cérébrale (vigile, durée quelques secondes), les autres recevront une molécule modulant l’activité cérébrale dans leur eau de boisson (20 jours). A partir de la chirurgie d’implantation du dispositif tous les animaux seront hébergés seuls jusqu’à la fin de l’étude (7 semaines maximum). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure. Une partie d’entre eux sera euthanasiée au cours d’une chirurgie sans réveil, sous anesthésie générale et analgésie adaptée (durée inférieure à 10 minutes).
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'épilepsie pourra entraîner des effets secondaires comme une perte de poids et une réduction de la mobilité. La survenue des crises engendre un stress et une fatigue significatifs pour l’animal. L’injection des molécules pour mettre en place le modèle peut induire des effets périphériques (accélération du pouls, sudation, saignements). Il arrive que des crises très sévères soient fatales pour les animaux. Les chirurgies seront associées à un risque de douleur et d’inconfort pendant quelques jours, de plus il existe un risque de légère perte de poids, rapidement réversible. Le dispositif d’enregistrement implanté pourra générer un inconfort pour l’animal. Les souris implantées avec ce dispositif seront hébergées seules jusqu’à la fin de la procédure, s’agissant d’animaux vivant normalement en groupe cela génèrera un stress. L’anesthésie générale pour les chirurgies sera associée à un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque rare de difficultés cardiorespiratoires. Les différentes injections pourront induire une légère et brève douleur au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de prélever puis analyser leur cerveau dans le but de répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Pour comprendre l'épilepsie et trouver de nouveaux traitements, la recherche sur des modèles vivants est essentielle. Les mécanismes complexes d'une crise d'épilepsie ne peuvent pas être reproduits fidèlement en laboratoire sur des cellules isolées ou à l'aide de simulations informatiques. Nous utilisons déjà des modèles plus simples, comme des cultures de cellules ou des tissus humains obtenus après une chirurgie. Ces méthodes sont utiles pour tester des molécules, mais elles ne permettent pas d'étudier l'impact direct d'un traitement sur l'ensemble du cerveau et sur la survenue d'une crise. C'est pourquoi l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire. Il est le seul à pouvoir nous donner des informations sur la manière dont les crises se déclenchent et se propagent dans un cerveau vivant. Cela nous permet de tester l'efficacité de nouvelles thérapies de manière réaliste et de progresser vers des traitements pour les patients.
Réduction
Le nombre d'animaux que nous utilisons dans notre projet a été défini avec soin pour être le plus juste possible, en se basant sur nos expériences passées et les données de la littérature scientifique. Nous avons travaillé à améliorer notre modèle expérimental. Par exemple, nous avons réduit les doses des substances utilisées pour déclencher les crises, ce qui a permis de diminuer la mortalité et le nombre d'échecs. Cela nous permet d'obtenir les informations nécessaires avec moins d'animaux. Le chiffre total de 846 animaux a été calculé en tenant compte de plusieurs facteurs clés : Nombre de groupes : Chaque expérience nécessite des groupes d'animaux suffisants (entre 5 et 10 animaux par groupe) pour garantir la fiabilité des résultats. Nous avons des groupes de contrôle et des groupes qui reçoivent différents traitements ou sont soumis à des conditions variées (épilepsie vs. non épileptiques, différents médicaments, etc.). Taux d'échec et de perte : Nous devons prévoir les animaux qui ne développeront pas l'épilepsie, ceux qui ne survivront pas au déclenchement des crises, et ceux pour lesquels les données collectées seront inexploitables. Ces taux sont essentiels à prendre en compte pour s'assurer que nous aurons au final un nombre suffisant d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement valables. Pour valider nos résultats, nous utiliserons des tests statistiques reconnus afin de nous assurer que nos conclusions sont solides et ne sont pas dues au hasard.
Raffinement
Le bien-être des animaux est notre priorité. Nous nous engageons à respecter des règles très strictes pour garantir qu'ils soient dans les meilleures conditions possibles tout au long de notre étude. Les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation. Elles ont de l'eau et de la nourriture à volonté et bénéficient d’un enrichissement dans leur cage (carré de coton pour faire un nid, bâton de bois à ronger). Pour celles qui auront un dispositif implanté, un hébergement individuel est nécessaire pour éviter toute blessure, dans ce cas une maisonnette sera ajoutée dans leur cage et nous vérifierons que ces animaux ne présentent pas de signes de stress lié à cet hébergement. Les animaux seront observés quotidiennement. Ils sont pesés régulièrement et leur état général est contrôlé. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. Nous avons perfectionné notre méthode pour déclencher l'épilepsie, nous permettant d’améliorer la récupération et la survie des animaux. Les opérations chirurgies se déroulent sous anesthésie générale et locale, avec des antidouleurs. Nous surveillons la température des animaux et protégeons leurs yeux. Après l'opération, ils sont placés dans une zone de réveil chauffée jusqu'à ce qu'ils soient complètement remis. Pendant leur récupération, nous les surveillons de près, en vérifiant leur poids et leur comportement. Nous leur donnons une nourriture liquide spéciale et veillons à ce qu'ils soient bien hydratés, surtout après le déclenchement des crises. Les animaux sont habitués progressivement à l’enregistrement de l’activité cérébrale. Lors de ces enregistrements nous les surveillons à distance, limitant ainsi les interventions humaines directes. Lors de l’administration de composés nous alternons les zones d'injection pour éviter les risques d’irritation locale. Des critères d'arrêt clairs et éthiques ont été établis pour garantir qu'aucune souffrance inutile ne soit infligée aux animaux. Ces mesures strictes témoignent de notre engagement à mener cette recherche de manière responsable, tout en cherchant à faire progresser la connaissance pour le bien des patients humains.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour notre recherche est le résultat d'une démarche scientifique rigoureuse. C'est un modèle animal standard pour l'étude de l'épilepsie, pour plusieurs raisons clés. Procédures standardisées : Les méthodes d'anesthésie et d'analgésie (gestion de la douleur) chez la souris sont très bien établies et maîtrisées. Cela nous permet de garantir le bien-être des animaux tout au long des expériences. Modèles d'épilepsie bien connus : Les techniques pour déclencher des crises d'épilepsie chez la souris ont été largement étudiées et validées par la communauté scientifique. Cela assure la fiabilité de notre modèle. Outils génétiques uniques : Certaines de nos expériences les plus avancées nécessitent l'utilisation de souris génétiquement modifiées. Ces souris sont conçues pour permettre de marquer ou de contrôler l'activité de cellules spécifiques du cerveau, une méthode impossible à réaliser chez d'autres espèces. Stade de développement pertinent : Nous utiliserons des souris de 8 semaines, un stade de développement qui correspond à l'âge adulte. Cela est important car la forme d'épilepsie que nous étudions est la plus courante chez l'adulte humain. En résumé, la souris est le meilleur modèle pour cette étude car elle nous offre les outils nécessaires pour répondre à nos questions de recherche de manière précise, fiable et en minimisant les procédures invasives.
Rôle du circuit de Papez dans la consolidation de la mémoire en sommeil paradoxal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après une biopsie de génotypage sur animal conscient, elles subissent une chirurgie d'une à deux heures pour l'injection d'un vecteur dans le cerveau et la pose d'implants d'enregistrement, parfois de fibres lumineuses, puis des tests de mémoire spatiale et une privation ciblée de sommeil paradoxal de quarante-huit heures. Le porteur ramène les effets de cette privation à une "légère fatigue, sans signe de stress objectivable" et conclut qu'aucun effet secondaire majeur n'est attendu. Environ 35 souris sont tuées avant toute expérience, leur génotype ne correspondant pas à celui recherché.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une petite région du cerveau appelée noyau mamillaire médian dans deux fonctions importantes : le sommeil paradoxal (la phase de sommeil liée aux rêves) et la mémoire. Des études récentes suggèrent que cette zone pourrait être active pendant le sommeil paradoxal et participer à la consolidation des souvenirs. Pour explorer cette idée, nous allons manipuler l’activité de certains neurones spécifiques dans cette région chez la souris, en les activant ou en les inhibant grâce à deux techniques modernes : la chémogénétique (une molécule donnée à la souris active ou bloque les neurones ciblés) et l’optogénétique (de la lumière déclenche ou arrête l’activité des neurones à des moments précis). Les souris seront observées pendant leur sommeil et soumises à des tests de mémoire, afin de comprendre si ces neurones jouent un rôle dans l’architecture du sommeil paradoxal et dans le stockage des souvenirs.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment le sommeil paradoxal (REM) – la phase du sommeil où se produisent le plus de rêves – joue un rôle actif dans la consolidation de la mémoire. En identifiant la fonction exacte des neurones du mammilaire médians et de leurs connexions, ce projet pourrait faire émerger de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies touchant la mémoire ou le sommeil. Cela concerne notamment des maladies comme la dépression, les troubles du stress post-traumatique, ou encore les affections neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, où les circuits de la mémoire sont perturbés. Enfin, ce projet s’appuie sur des outils de pointe (stimulation cérébrale ciblée, enregistrements du sommeil, suivi comportemental) permettant une analyse fine, réversible et non douloureuse de ces fonctions chez l’animal.
Procédures
Les animaux feront d’abord l’objet d’un petit prélèvement de tissu afin de déterminer leur génotype. Ce prélèvement est réalisé une seule fois et dure quelques secondes, chez des animaux conscients. Les animaux subiront ensuite une intervention chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale. Cette chirurgie comprend l’injection d’un vecteur dans une zone précise du cerveau ainsi que la pose de dispositifs permettant d’enregistrer l’activité cérébrale et musculaire et, selon les groupes, de délivrer une stimulation lumineuse. Cette intervention dure environ 1 à 2 heures. Après leur récupération, les animaux participeront à plusieurs sessions d’enregistrement de l’activité cérébrale et musculaire, réparties sur toute la durée du protocole. Ils seront également soumis à des tests de mémoire spatiale comprenant une phase de découverte, une phase d’apprentissage et une phase de test. Enfin, les animaux seront soumis une seule fois à une privation ciblée du sommeil paradoxal pendant 48 heures, suivie d’une période de récupération.
Impact sur les animaux
Le prélèvement tissulaire réalisé pour le génotypage peut entraîner un inconfort léger et de courte durée au moment de la biopsie. Les animaux peuvent présenter une douleur postopératoire transitoire après la chirurgie, accompagnée éventuellement d’une baisse temporaire de l’appétit ou de l’activité. Une gêne locale temporaire liée aux implants utilisés pour l’enregistrement ou, selon les groupes, à l’implantation de dispositifs lumineux, peut survenir sans altérer la mobilité ni les comportements spontanés. La privation ciblée d’un stade de sommeil peut entraîner une légère fatigue, sans signe de stress objectivable. Aucun effet secondaire majeur n’est attendu durant l’ensemble du protocole. Les animaux font l’objet d’un suivi quotidien permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou de détresse, avec mise en place immédiate des mesures de prise en charge adaptées.
Devenir
À la fin des expérimentations, les animaux 105 seront mise à mort pour permettre le prélèvement des cerveaux pour les analyses nécessaires au projet. Les animaux ne présentant pas le génotype requis (environ 35 animaux) seront également euthanasiés, leur génotype ne permettant pas leur inclusion dans les procédures expérimentales.
Remplacement
Les mécanismes étudiés dans ce projet, à savoir la modulation du sommeil paradoxal et la consolidation mnésique nécessitent un modèle intact, vivant, et capable de dormir. À ce jour, les alternatives in vitro (cultures neuronales, organoïdes) ou in silico (modélisation informatique) ne permettent pas de reproduire la complexité des cycles veille-sommeil ni l'interaction entre les différentes structures du circuit de Papez. Ainsi, aucune méthode de remplacement ne peut actuellement se substituer à l’utilisation de la souris pour répondre aux objectifs de ce projet. L’animal utilisé est le plus pertinent au regard des données disponibles, des outils génétiques existants, et des connaissances déjà acquises dans ce modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, indiquant qu’un minimum de 15 souris par groupe est nécessaire pour détecter un effet biologique significatif avec une puissance suffisante. Ce nombre garantit une interprétation fiable des résultats tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction. Ce nombre permet également de réaliser l’étude sur des souris mâles et femelles.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, certains traitements sont administrés sans injection, par ingestion volontaire sous forme de gelée, une méthode simple et bien acceptée. Les animaux sont observés chaque jour par l’expérimentateur afin de vérifier leur état général, y compris lorsqu’ils sont hébergés individuellement. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, ce qui permet d’endormir complètement les animaux pendant l’opération. Des traitements contre la douleur sont systématiquement administrés avant et après la chirurgie afin de réduire l’inconfort lié aux interventions. L’état de santé des animaux est évalué quotidiennement à l’aide d’une grille de suivi prenant en compte leur comportement, leur apparence et leur état général. Des critères précis ont été définis pour identifier toute situation anormale. Si l’un de ces critères est atteint, l’animal est immédiatement retiré de l’étude et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Notre projet repose sur l’utilisation de souris transgéniques associée à un modèle expérimental reconnu permettant d’étudier les liens entre le sommeil et la mémoire. La souris est largement utilisée en neurosciences pour l’étude du sommeil, de la mémoire et des comportements, car son fonctionnement cérébral et ses rythmes veille-sommeil présentent de nombreuses similitudes avec ceux de l’être humain. Ce modèle permet d’étudier des phénomènes complexes tels que la consolidation de la mémoire pendant le sommeil paradoxal. Les régions cérébrales impliquées dans la mémoire et les émotions sont bien conservées entre la souris et l’homme, ce qui rend les résultats pertinents pour une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux du cerveau humain. De plus, la souris offre un large éventail d’outils expérimentaux permettant d’observer et de moduler l’activité cérébrale de manière précise et fiable, ce qui est indispensable pour tester notre hypothèse sur le rôle du sommeil paradoxal dans la mémoire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), période à laquelle le cerveau est mature et les cycles de sommeil sont stabilisés, condition nécessaire à l’étude du sommeil et des fonctions de mémoire.
Implantation d’organoïdes de peau sur un modèle de souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
660 souris vont être utilisées, chacune recevant deux implants sous la peau du dos avant qu'ils ne soient retirés en deux temps, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les interventions sont brèves: deux injections de vingt secondes sous anesthésie générale, puis un à cinq minutes pour chaque retrait. Toutes les souris sont tuées après récupération des implants, chaque greffon partant en analyse histologique. Le bénéfice annoncé, une "avancée significative" vers de nouveaux bio-pansements pour les grands brûlés, est renvoyé à plus tard, l'objectif immédiat restant de vérifier que le greffon se vascularise.
Objectifs
La restauration permanente de large surface de peau par une greffe cutanée représente une application thérapeutique d’enjeu vital, qui constitue un fer de lance pour le domaine des biothérapies tissulaires notamment dans la prise de greffe des bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés). Des études en culture cellulaire ont permis de valider différentes cellules, leur potentiel de croissance à court et long terme et leur capacité à former un bio-pansement cutané. Suite à ces résultats très favorables, il est crucial de valider le potentiel régénératif des cellules cultivées dans ce milieu à savoir leur capacité à reformer une peau fonctionnelle. L’objectif du projet est donc de valider la fonctionnalité de notre bio-pansement cutané.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de la néo-vascularisation d’un greffon cutané, permettant l’obtention d’une bonne prise de greffe, ainsi que la maturation de la peau humaine reconstruite et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux bio-pansements cutanés vascularisés pouvant faciliter la prise de greffes de peaux chez l’homme (ex : grands brulés).
Procédures
Les souris sous anesthésie générale vont subir : - Une injection 2 fois 20 secondes - Le retrait des implants 2 fois, 1 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent avoir une douleur légère et de courte durée au point j'injection et lors du retrait des implants. Elles peuvent avoir un stress lors de l'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après la récupération des implants., une étude histologique est prévue pour chaque implant.
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée en culture cellulaire, les processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Les modèles de cicatrisation en culture cellulaire ne peuvent pas reproduire les mécanismes de coagulation, d’inflammation, et de néo-vascularisation. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire à la suite d’une greffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études en culture cellulaire ont été effectuées pour valider le modele de notre bio-pansement cutané. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi . De plus, l’injection et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale et nous donnons un analgésiques adaptés avant le retrait de l'implant. Les animaux seront surveillés trois fois par semaine avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance.
Choix des espèces
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée in vitro, les processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Les modèles de cicatrisation ex vivo ne peuvent pas reproduire les mécanismes physiologiques. Ici seul un modèle animal permet de reproduire ces effets physiologiques à la suite d’une greffe, permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet. Nous utiliserons des souris de 6-9 semaines pour que les animaux aient une taille suffisante pour permettre l'injection de deux implants sur le dos.
Evaluation du potentiel thérapeutique d’une molécule impliquée dans l’homéostasie musculaire dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Quatre-vingt-douze des souris utilisées sont dystrophiques, dépourvues de dystrophine, donc atteintes de dégénérescence musculaire, d'inflammation et de fibrose. Avec 32 souris témoins, 124 animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent jusqu'à six électrocardiogrammes sur animal vigile et six échocardiographies sous anesthésie, une partie courant en outre sur tapis roulant et passant des mesures de contractilité musculaire, le porteur indiquant qu'elles peuvent ressentir des douleurs musculaires et se déplacer difficilement en fin de vie. Toutes sont tuées pour prélever plusieurs muscles et le cœur.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, la molécule testée dans ce projet représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce la structure musculaire, la fonctionnalité des mitochondries et réduit l'inflammation. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité de ce traitement dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus à court terme, chez les souris dystrophiques, sont une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris seront traitées avec le candidat médicament. A long terme, cette molécule pourrait être envisagée comme traitement utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une évaluation de la fonction cardiaque par électrocardiogramme sur animal vigile (3 à 5 minutes, 6 fois maximum) et à une échocardiographie sur animal anesthésié (5 à 10 minutes, 6 fois maximum). Une partie des animaux sera soumis à un régime alimentaire particulier en prise spontanée dans l'alimentation (12 semaines). Une partie des animaux sera soumis à des tests d’endurance sur tapis roulant (20 minutes, 2 fois maximum), à des mesures de contractilité musculaire sur animal anesthésié et sous analgésie (20 minutes, 1 fois) et à un prélèvement de sang sur animal anesthésié et sous analgésie (20 secondes, 1 fois).
Impact sur les animaux
Les souris dystrophiques présentent une atteinte des muscles squelettiques, du diaphragme et du cœur. Elles ont une importante faiblesse musculaire, de l’inflammation, de la fibrose et de l’infiltration de tissu adipeux. Ces animaux peuvent donc ressentir des douleurs musculaires et présenter des difficultés à se déplacer en fin de vie. Les animaux pourront subir un stress de courte durée, lors du transfert d’une cage à une autre et pendant les premiers jours après leur arrivée. Au cours des différentes procédures, les animaux peuvent subir un stress de courte durée au moment des manipulations et lors de l’administration de l’anesthésie gazeuse. Au cours des procédures sous anesthésie, les souris pourraient risquer l’hypothermie. Pour les mesures de performance sur tapis roulant, les animaux peuvent ressentir de la fatigue. Le traitement dans la nourriture pourrait provoquer une diminution de la consommation alimentaire et des dérèglements intestinaux tels que des diarrhées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Le but de ce projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la DMD est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent recréer la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu et ne peuvent rendre compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Le modèle utilisé dans ce projet est un modèle de choix pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 8 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable. Nous prévoyons de répéter une deuxième fois les expériences pour confirmation des résultats. De plus, plusieurs muscles ainsi que le coeur seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 92 souris dystrophiques et 32 souris contrôles soit un total de 124 animaux. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Les animaliers procèdent à un contrôle quotidien des cages et à un changement régulier sous hotte aspirante. Les animaux sont 5 par cage maximum et l'hébergement individuel est évité. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent en hébergement individuel (causes: seul mâle d’une portée, agression entre congénères, dernier animal dans la cage..). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage ou en bouillie dans des coupelles. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Une semaine d’acclimatation sera mise en place lors de l'arrivée dans l'animalerie. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris sera maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante à 37 degrés. Lors des mesures de performance et d'évaluation de la fonction cardiaque, une habituation sera réalisée et les mesures se feront dans un environnement calme et par un manipulateur expérimenté. Dès que les animaux émettront des signes de fatigue, les tests seront interrompus et de l'eau sera proposée aux animaux après l'effort. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet a l’avantage de présenter un phénotype semblable aux patients. Les animaux utilisés seront âgés de 5 à 8 semaines en début de procédure et de 17 à 24 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie. Le démarrage du traitement peu de temps après le sevrage des animaux permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.
greffe d’organoide de peau vascularisé sur un modèle de souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
426 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour que les greffons soient récupérés et analysés. Chacune subit une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale puis reçoit neuf injections d'analgésiques, certaines étant hébergées seules. Il s'agit de vérifier qu'un organoïde de peau humaine cultivé en laboratoire reforme une peau fonctionnelle sur le dos d'une souris, avant d'envisager des bio-pansements pour les grands brûlés. Le porteur ramène les atteintes attendues à une douleur modérée de moyenne durée et affirme que seul un modèle animal rend compte de la complexité de la réparation tissulaire.
Objectifs
En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base sur l’utilisation de substituts cutanés préparé avec les cellules du patient. Des études en cultures cellulaires ont permis de valider différentes cellules, leur potentiel de croissance à court et long terme et leur capacité à former un organoïde cutané. Suite à ces résultats très favorables, il est crucial de valider le potentiel régénératif de cet organoide cutané à savoir sa capacité à reformer une peau fonctionnelle sur un modèle animal. L’objectif du projet est donc de valider la fonctionnalité d’un organoïde cutané humain, issu d’une culture cellulaire pouvant servir de bio-pansements lors de greffe de peau.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’une part, de sélectionner un milieu de culture chimiquement défini répondant aux exigences règlementaires d’un médicament et d'autre part de valider la capacité d'un organoide de peau à favoriser d’une bonne prise de greffe, la maturation de la peau et son auto-renouvèlement. Cette étape permettra une avancée significative vers la conception de nouveaux substituts cutanés pouvant servir de bio-pansements lors de greffes de peaux chez l’Homme (ex : grands brulés).
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à 1 chirurgie de 15 minutes à 20 minutes par souris avec 3 injections d'analgésique. Les jours suivant la chirurgie, les animaux recevront 6 injections d'analgésiques.
Impact sur les animaux
L’anesthésie peut provoquer chez les animaux un stress. La chirurgie peut provoquer une douleur modérée de moyenne durée. L'animal peut subir un stress lié à son hébergement individuel.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort, les greffons sont récupérés pour analyse histologique et immunohistochimique
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée en culture cellulaire les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe ne peuvent être répliqués en laboratoire. Par exemple, les modèles de cicatrisation in vitro sont limités par l’absence de mécanismes de coagulation, d’inflammation, de vascularisation et de réponse métabolique. Seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire permettant ainsi d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi. Les animaux seront surveillés avec mise en place de points limites stricts et spécifiques au projet. La greffe sera faite sous anesthesie général avec des analgésiques adaptés.
Choix des espèces
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules et des reconstructions de substituts cutanés en 3D, les mécanismes physiopathologiques mis en jeu lors d’une greffe, de sa maturation et des processus de cicatrisation ne peuvent être répliqués en laboratoire. Nous avons donc choisit comme modèle la souris qui est un modèle connu nous garantissant des résultats homogènes et rapides. Nous avons choisit le modèle d'une souris adulte afin que les animaux aient une taille suffisante pour permettre de faire une greffe de l'organoide cutanée.
Impact de la température corporelle sur la réponse inflammatoire dans des modèles stériles d’infection dans un modèle murin 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection dans l'abdomen déclenche une réaction inflammatoire, puis les souris sont placées dans des environnements froids ou chauds pour reproduire une hypothermie ou une fièvre, avec échographies du cœur et prélèvements de sang sous anesthésie à 6, 24 et 48 heures. 500 souris vont être utilisées, dont 428 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'ensemble des interventions est pourtant décrit comme "conçu pour être le moins stressant possible", et les atteintes annoncées se limitent à une baisse d'activité, une perte d'appétit, un amaigrissement et des poils hérissés. Toutes sont tuées à la fin, cœur, poumons, foie, reins et cerveau étant prélevés immédiatement après la mise à mort.
Objectifs
Quand une personne est gravement malade, comme lors d’une infection sévère, son corps peut réagir par une forte inflammation et un changement de température (fièvre ou hypothermie). Ce projet cherche à comprendre si le fait d’avoir trop chaud ou trop froid influence la façon dont le corps réagit à cette situation critique. Pour cela, nous allons provoquer une inflammation contrôlée chez des souris, puis les placer dans des environnements plus ou moins chauds. Nous suivrons leur état général, leur température corporelle, et la santé de leur cœur. L’objectif est de savoir si la température du corps aggrave ou améliore la réaction du corps à l’inflammation, pour aider à mieux soigner les patients à l’hôpital. Le projet se déroule dans les 2 établissements utilisateurs: EU570 et EU0543 (uniquement les échographies).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la température du corps influence la réaction du système immunitaire lors d’une inflammation sévère, comme on en observe chez les patients en réanimation. En identifiant si le fait d’avoir de la fièvre ou au contraire d’être en hypothermie aggrave ou améliore l’état général, nous pourrons mieux adapter les soins, en particulier le contrôle de la température corporelle dans les situations critiques. À long terme, ces résultats pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints d'infections graves ou de chocs inflammatoires, en évitant des traitements inutiles ou contre-productifs, et en guidant des stratégies plus ciblées.
Procédures
Les souris reçoivent une injection au niveau de l’abdomen pour déclencher une réaction inflammatoire contrôlée (5 secondes). Elles sont ensuite placées dans des environnements plus ou moins chauds, pour simuler différents états : hypothermie (corps froid), température normale, ou fièvre. Elles portent une petite puce sous la peau permettant de suivre leur température corporelle sans les manipuler. À plusieurs moments (6h, 24h, 48h), leur état général est suivi, une échographie du cœur est réalisée sous anesthésie, et un petit prélèvement de sang est effectué sous anesthésie pour analyser leur réaction (10 secondes). L’ensemble des interventions est conçu pour être le moins stressant possible, avec des soins attentifs, des médicaments contre la douleur, et un hébergement adapté à leur confort. L'ensemble de ces interventions se déroulera dans l'unité du chercheur, sauf les échographies qui auront lieu dans une unité voisine (durée 5 minute par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de malaise temporaire à la suite de l’injection et de la réaction inflammatoire : baisse d’activité, perte d’appétit, amaigrissement, respiration ralentie, ou poils hérissés. Ces effets sont attendus et suivis de près. Ils varient selon la température ambiante et la sensibilité individuelle de chaque animal. Tous les signes sont évalués plusieurs fois par jour, à l’aide d’une grille d’observation clinique standardisée. Les procédures (injection, prélèvements, examens) sont conçues pour minimiser le stress et la douleur, grâce à l’anesthésie et à des soins de soutien adaptés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas de signes de souffrance dépassant les seuils définis. Un prélèvement sanguin ainsi que des organes (cœur, poumons, foie, reins, cerveau) seront réalisés immédiatement après l’euthanasie, à des fins d’analyse.
Remplacement
Des expériences sur cellules isolées en laboratoire (par exemple des cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins, appelées cellules endothéliales) sont réalisées en parallèle pour mieux comprendre certaines réactions inflammatoires. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier ce qui se passe dans un organisme vivant entier, où plusieurs organes interagissent en permanence. Ils ne reproduisent pas la complexité du fonctionnement global du corps (appelé homéostasie), en particulier la régulation de la température, les réactions immunitaires, ou les effets sur le cœur et les autres organes. C’est pourquoi le recours à l’animal reste nécessaire dans ce projet pour étudier ces mécanismes de manière intégrée.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict nécessaire. Les expériences sont conçues pour recueillir un maximum d’informations sur chaque souris (par exemple : température, sang, échographie, organes), ce qui évite de multiplier les groupes. Les conditions expérimentales sont réparties dans le temps pour permettre la réutilisation des équipements et limiter les pertes. Si les résultats sont clairs avant d’avoir utilisé tous les animaux prévus, les expériences seront arrêtées plus tôt. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique
Raffinement
Tout est mis en œuvre pour limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long de l’expérience. Les souris reçoivent des médicaments contre la douleur de manière préventive et régulière. Elles sont surveillées plusieurs fois par jour avec une grille d’observation précise (état général, comportement, respiration, apparence). Si une souris montre des signes de souffrance trop importants, elle est immédiatement retirée de l’étude. Les souris vivent en groupe, dans des cages enrichies avec de la nourriture adaptée, du matériel pour faire leur nid, et des conditions de température contrôlées. Les manipulations sont faites par du personnel formé et expérimenté, avec un souci constant du bien-être animal. Les animaux seront transportés entre les deux unités (5 minutes) dans une cage de transport homologuée.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris adultes, car elles permettent d'étudier de façon fiable les effets de l’inflammation et de la température sur l’organisme. Elles sont de taille adaptée pour réaliser les examens (température, échographie du cœur, prise de sang) de manière précise, sans stress inutile. De plus, la souris est une espèce bien connue en recherche médicale : on dispose de beaucoup de connaissances et d’outils pour analyser ce qu’il se passe dans son corps, ce qui facilite la compréhension des résultats. Enfin, notre équipe a une solide expérience avec ce modèle, ce qui garantit des manipulations maîtrisées et respectueuses du bien-être animal.
Photomodulation de la douleur par la lumière dans un contexte de migraine induite par un neuropeptide (1/2)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Cinq injections sous-cutanées d'un neuropeptide déclenchant la migraine, un jour sur deux, puis des mesures du seuil de douleur à la patte et à la face, une sensation de brûlure provoquée sur la queue, l'implantation d'électrodes sur la cornée et d'une caméra vissée sur le crâne: 3 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique attendre une hypersensibilité sensorielle et une hypersensibilité à la douleur, ainsi qu'un inconfort lié au surpoids de l'endoscope fixé sur la tête. L'objectif déclaré est d'évaluer l'effet analgésique de la lumière verte dans un modèle de migraine, une piste qu'il présente comme non invasive et peu coûteuse. Toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leur vieillissement au cours de l'expérience.
Objectifs
Il est estimé qu’une personne sur 7 dans le monde souffre de migraine représentant plus de 1 milliard d’individus. La prévalence de la migraine a augmenté de 732,56 millions à 1,16 milliard de cas entre 1990 et 2021. En France, 12 millions de personnes sont concernées. La migraine affecte environ 15 % de la population. Alors que les femmes ont une incidence et prévalence globale plus élevée que les hommes, les hommes présentent une augmentation 4 à 5 fois plus. La migraine est plus courante chez les individus âgés de 20 à 50 ans qui correspond à la population active. Elle représente la 6ème cause de handicap dans le monde. Alors que la lumière bleue peut aggraver ou déclencher la migraine, la lumière verte présenterait un effet bénéfique (analgésique). Dans un contexte de nécessité de développement de nouvelle approches thérapeutiques sans effet secondaire, la thérapie par la lumière apparait comme une option intéressante, non invasive et peu couteuse. L’exposition à des lumière de longueur d’onde spécifique ont déjà montré des effets bénéfiques dans différentes conditions pathologique tels que les cancers, les maladies de peau, les perturbations du sommeil et de l’humeur. Récemment, la thérapie utilisant de la lumière LASER ou de faible intensité a été utilisée dans le cadre de la douleur incluant des douleurs dorsales, fibromyalgies, neuropathique ou migraineuse. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les mécanismes impliqués dans l’analgésie induite par une exposition à la lumière verte dans un modèle de migraine et définir la meilleure stratégie d’exposition pour un efficacité optimale. Le projet se déroulera sur 2 EU (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Nous partons de l’hypothèse que les crises répétées de migraine induisent une altération du traitement de l’information somato-sensorielle et visuelle au niveau de la rétine, des noyaux thalamiques et du cortex. Cette étude envisage donc d’apporter des résultats innovants en mettant en évidence la capacité de la lumière à moduler la sensibilité à la douleur. L'objectif étant en particulier de mettre en évidence la capacité analgéqiue de la lumière verte qui pourrait alors être évaluer en clinique et apporter une approches compémentaires du traitment de la douleur.
Procédures
injections sous cutanées de neuropeptides une fois par jour tous les 2 jours avec au total 5 injections par animal; durée de l'injection
Impact sur les animaux
hypersensibilité sensorielle; hypersensbilité à la douleur; la pose de l'électrode sur la cornée peut entrainer des irritations post-enregistrement (très rarement observé par expérience car l'éectrode est légèrement posée sur la cornée sans déplacement; Inconfort lié à la présence de l'endoscope sur la tête de l'animal qui génère un léger surpoids; Normalement le neuropeptide n'induit pas de stress et d'anxiété mais certaines souris peuvent avoir une réaction différente à la généralité; Douleur légère (piqûre) lors des injections; Inconfort lié à la présence des vis pour les VEP et de l'endoscope.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés du fait de leur vieillissement au cours de la procédure.
Remplacement
Le projet prend en compte les interactions complexes entre la rétine (la lumière) et le cerveau, impliquées dans la migraine et ses symptômes associés. Il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal afin d’avoir une vision générale du système et de pouvoir étudier les mécanismes de régulation et d’intégration de la douleur migraineuse.
Réduction
Notre expertise dans les domaines techniques utilisés dans ce projet nous permet d’établir le nombre d’animaux par groupe de manière fiable pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre indiqué dans les différentes procédures correspond au maximum d’animaux mais nous procédons par série de manière à ce que si tout se passe de manière optimale nous puissions réduire le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux tout au long des procédures, les souris seront surveillées par les personnes compétentes et manipulées tous les jours par l’expérimentateur pour permettre une habituation optimale. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, sauf pendant la récupération suite à une anesthésie, elles auront un environnement enrichi avec accès libre à la nourriture et l’eau. Pour les stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), elles sont limitées en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour le test de sensibilité thermique, pour limiter le ressenti d'une sensation de brulure par les animaux, la température est augmentée le plus progressivement possible pour atteindre le seuil le plus précis et limiter cette sensation sans compromettre le test. Après les enregistrements électrorétinographiques, l'oeil est réhydraté. La nourriture est placée dans la cage pour faciliter l'accès en particulier pour les animaux avec l'endoscope et ceux avec les vis pour les enregistrements. Lors de l'implantation des électrodes, les animaux seront placés sous médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) utilisé pour traiter la douleur et l'inflammation, pendant 3 jours (jours de la chirurgie + 2 jours). Avant chaque test les animaux suivront une phase d'habituation. Pour le transport, les animaux seront préalablement habitués aux conditions de transport à savoir placés dans leur cage dans un carton de transport ventillé qui sera soulevé et légèrement manipuler quotidiennement. Les animaux seront placés dans des cages propres la veille du transport et auront des croquettes humidifiées dans la cages. Des points limites sont mis en place afin de limiter la douleur ou la souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez le rat. Le choix de travailler chez l'adulte vient du fait que la migraine est plus fréquente chez l'adulte que chez l'enfant. De plus les symptômes et les mécanismes chez l'enfant peuvent être différents. Aussi dans le cadre de ce projet nous nous limiterons à l'étude chez l'adulte.
Rôles d’éléments régulateurs dans le remodelage et la régénération cardiaque post-infarctus chez la souris adulte et le nouveau-né
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Deux âges servent à la même opération, des nouveau-nées de 1 à 3 jours dont le cœur se régénère et des adultes de plus de huit semaines dont le cœur ne se régénère pas : 3 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit le blocage d'une artère du cœur pour provoquer un infarctus, opération de quinze à vingt minutes, plus une injection dans le cœur ou dans l'abdomen et une échocardiographie. Le porteur décrit une douleur modérée de courte durée après l'infarctus provoqué, avec baisse d'activité ou d'appétit possible. Il écrit que les souris dont l'état ne s'améliore pas sont "endormies de manière définitive" pour éviter une souffrance prolongée, formule qui désigne leur mise à mort.
Objectifs
Ce projet vise à développer une thérapie génique pour aider le cœur à se réparer après un infarctus. L’objectif est de stimuler la multiplication des cellules cardiaques afin d’améliorer la régénération du tissu endommagé. Des outils de thérapie génique sont injectés dans le cœur de souris pour tester leur capacité à réactiver des mécanismes de réparation. Des modèles génétiques innovants permettent de suivre la division des cellules cardiaques et d’évaluer l’efficacité des traitements. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour restaurer la fonction cardiaque après un infarctus.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait avoir plusieurs retombées majeures dans le domaine de la santé cardiovasculaire : - Progrès thérapeutiques : En testant des vecteurs de thérapie génique ciblant les cellules du cœur, le projet explore des pistes innovantes pour stimuler la régénération cardiaque après un infarctus, une pathologie très fréquente et actuellement incurable sur le plan tissulaire. Ces approches pourraient à terme compléter ou améliorer les traitements existants (médicaments, chirurgie, dispositifs médicaux). - Application à d'autres pathologies : Les stratégies développées ici, telles que la modulation de séquences régulatrices, pourraient également être transposables à d’autres organes ou maladies dégénératives, ouvrant la voie à des approches plus larges en médecine régénérative. - Réduction de la charge socio-économique : L’infarctus du myocarde est l’une des principales causes de décès et d’invalidité dans le monde. Améliorer la capacité du cœur à se réparer permettrait de réduire les séquelles, les ré-hospitalisations et le recours à des traitements lourds, avec un impact significatif pour les patients et les systèmes de santé
Procédures
Injection ciblée dans le cœur ou injection intrapéritonéale, durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chirurgie cardiaque simulant un infarctus du myocarde, durée approximative 15 à 20 minutes par animal. Échocardiographie : durée approximative 5 à 10 minutes par animal. Chaque intervention est réalisée une seule fois par animal. Après l’intervention, les animaux sont surveillés et maintenus avec leurs congénères dans des conditions adaptées.
Impact sur les animaux
Ce projet implique des interventions cardiaques qui peuvent provoquer : • Une gêne légère et passagère au point d’injection. • Un stress temporaire lié à la manipulation. • Une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. • Une gêne très brève lors des échographies. Les animaux sont observés attentivement après chaque intervention. Si leur état ne s’améliore pas rapidement, ils sont retirés de l’étude et endormis de manière définitive pour éviter toute souffrance prolongée.
Devenir
L'ensemble des souris de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été́ réalisées soit au court des procédures soit seront réalisées en post mortem.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle in vitro (organoïdes, culture de cardiomyocytes, co-cultures) ne permet de reproduire la complexité de la réponse tissulaire et systémique à un infarctus du myocarde. Des modèles cellulaires sont utilisés en complément pour l’étude de mécanismes spécifiques, mais ne peuvent remplacer l’expérimentation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Des comparaisons intra-individuelles et des suivis longitudinaux (imagerie non-invasive, mesures répétées) seront privilégiés autant que possible pour réduire le nombre de souris par groupe.
Raffinement
Deux protocoles d’anesthésie/analgésie (Xylazine/Kétamine ou Isoflurane/Buprénorphine) sont proposés, permettant une adaptation aux besoins expérimentaux et au confort animal. La chirurgie est réalisée par un personnel formé et expérimenté, avec un protocole stéréotypé et rigoureux. Le contrôle de la douleur est assuré pendant et après l’intervention, avec une surveillance étroite post-opératoire. Les conditions d’hébergement sont optimisées : cages chauffées, enrichies, récupération en groupe. Des points limites sont définis et des critères de mise à mort sont appliqués en cas de souffrance non contrôlable
Choix des espèces
Ce projet utilise la souris comme modèle, car elle est aujourd’hui l’animal de référence pour l’étude de l’infarctus du myocarde. La technique employée consiste à bloquer une petite artère du cœur afin de reproduire les principales étapes observées chez l’humain : destruction d’une partie du muscle cardiaque, réaction inflammatoire, formation de cicatrice et perte partielle de fonction. La souris a été choisie car : • Elle permet d’observer et de suivre précisément les cellules du cœur. • Sa petite taille facilite l’étude du cœur avec des méthodes d’imagerie et d’analyse détaillées. • Les réactions de son système cardiovasculaire sont bien connues et stables. • L’équipe possède une grande expérience dans la réalisation de ce type de chirurgie. • Il n’existe pas de méthode en laboratoire permettant de reproduire l’ensemble des réactions de l’organisme après un infarctus. Deux âges sont étudiés : • Les nouveau-nés (1 à 3 jours) : leur cœur se régénère naturellement. • Les adultes (plus de 8 semaines) : leur cœur ne se régénère pas, ce qui correspond mieux à la situation humaine.
Résolution de l’inflammation dans un modèle de lésion endovasculaire fémorale
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
88 souris vont subir une chirurgie unique de vingt minutes, ouverture de la peau, insertion puis retrait d'un guide dans l'artère de la patte gauche, suture : 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, quatre opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Le porteur chiffre à environ 10 % la mortalité liée à cette opération, et signale que l'artère peut se déchirer et provoquer une hémorragie au moment où le guide y pénètre. Le geste reproduit la lésion que laisse un cathéter ou un ressort chez les patients dont les artères se rebouchent, l'équipe voulant montrer que l'épaississement de la paroi vient en partie d'un défaut de résolution de l'inflammation. Toutes sont tuées pour prélever les artères fémorales, le porteur notant que ce prélèvement risque d'induire une mort des tissus.
Objectifs
Les lésions internes des artères causées par le débouchage des artères malades avec un ballonnet et l'implantation d'un ressort gardant les parois artérielles dilatées, contribuent souvent à l'épaississement de la paroi artérielle altérant le passage de sang. Dans ces cas, cela nécessite la ré-opération des patients par d’autres interventions plus lourdes comme les pontages. En mimant le phénomène dans des souris normales et dépourvues d'un système impliqué dans la résolution de l’inflammation, nous souhaitons montrer que l'épaississement de la paroi artérielle est dû en partie à un défaut de résolution de l'inflammation. Nous voulons également décortiquer les mécanismes mis en jeux dans le rebouchage des artères après une première intervention.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettrons de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans le rebouchage des artères après intervention. Il permettront également d’utiliser le nouveau concept d’activation de la résolution de l'inflammation pour l’amélioration de la prise en charge après le débouchage des artères ou la pose d'un ressort gardant les parois artérielles ouvertes. Si ces résultats sont concluants, de nouveaux traitements pourraient être développés pour limiter l'épaissement de la paroi artérielle et favoriser la cicatrisation vasculaire lors du débouchage des artères ou la pose de ressorts. Les essais chez l'animal se font le plus souvent chez les mâles, nous proposons de compléter ces données chez la femelle pour voir si il faut adapter les traitements différemment chez l'homme et la femme.
Procédures
les 88 animaux seront soumis à un anti-douleur pré-opératoire et post-opératoire par injection sous cutanée et une procédure chirurgicale (ouverture de la peau, insertion et enlèvement d'un guide dans l'artère de la patte gauche et suture de la peau) qui durent 20 minutes en tout.
Impact sur les animaux
L’injection d'antidouleur sous la peau induit une légère douleur de quelques secondes ; L’anesthésie pour la chirurgie, de 20 minutes; La mortalité due à la chirurgie est possible. Basée sur l’expérience, celle-ci est d’environ 10%. Au moment de l’entrée du guide dans l’artère, celle-ci peut se déchirer et provoquer une hémorragie. La zone d’intervention peut provoquer un gonflement ou une ecchymose dans les premières heures suivant l'intervention.
Devenir
A la fin de la procédure unique, tous les animaux sont mis à mort puisque les artères femorales seront prélevées. Ceci risque d'induire une mort des tissus.
Remplacement
Des études in vitro sur les cellules musculaires d’artère issues de souris dépourvues d’un système impliqué dans la résolution de l’inflammation ont montré qu’elles avaient une capacité de migration in vitro plus importante que les cellules issues de souris sauvages. Ce phénomène est observée après le débouchage d’un d’une artère par un cathéter. De plus, le rôle de ce système de résolution de l’inflammation dans les maladies qui induisent le retrécissement voir l'obstruction des artères par des plaques de gras (athérosclérose) a été montré in vitro et in vivo au laboratoire. Cependant, nous ne pouvons pas reproduire la lésion engendrée par la pose d’un ressort ou le débouchage de l’artère par un cathéter in vitro car cela nécessite une composante inflammatoire apportant d’autres types cellulaires comme les globules blancs ainsi que plusieurs couches de l’artère, non modélisable actuellement. Nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo rendant le remplacement impossible pour l’heure.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, l'effectif du nombre d'animaux requis pour la procédure a été calculée avec un logiciel de statistique adapté sur la base d'une étude préliminaire menée par nos collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront surveillées étroitement pendant l’heure suivant l’opération. Un anti-douleur pré- et post-opératoire et une anesthésie pendant la chirurgie seront réalisées. Du gel ophtalmique sera déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement lors de l’anesthésie. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étape de la procédure. Après l’étape de réveil, les souris sont replacées avec leurs congénères initiaux.
Choix des espèces
Les données préliminaires et connaissances de la biologie vasculaires ont été obtenues sur des souris. Les mécanismes moléculaires d'épaississement de la paroi artérielle après le passage d'un cathéter pour déboucher l'artère malade ou la pose d'un ressort chez la souris sont très proches de ceux observés chez l’homme. D’autre part, le modèle génétiquement modifié n’est disponible que chez la souris. Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet. Il s’agit de l’âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Prévoir l’efficacité de la radiothérapie dans les cancers ORL grâce à l’imagerie médicale et l’analyse biologique EU1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toute altération de l'état de santé déclenche une injection anti-inflammatoire, et une injection d'analgésique si la douleur dure plus de 24 heures. 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour l'analyse des tumeurs, des ganglions, du foie et des poumons. Une tumeur ORL est implantée dans leur patte arrière gauche, puis viennent une ou deux IRM de 45 minutes et, pour la moitié d'entre elles, une séance de radiothérapie de cinq minutes, chaque acte sous anesthésie gazeuse. Le porteur annonce que l'irradiation peut brûler la peau 24 à 48 heures après la séance, puis ajoute n'avoir jamais observé ces nuisances à cette dose, sans indiquer sur combien d'animaux.
Objectifs
Les cancers de la tête et du cou (comme ceux de la bouche ou de la gorge) sont parmi les plus fréquents dans le monde. Chaque année, ils sont responsables de plus de 440 000 décès. L’un des traitements les plus utilisés est la radiothérapie, qui consiste à envoyer des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Mais ce traitement ne fonctionne pas toujours aussi bien : certaines parties de la tumeur résistent, ce qui complique la guérison. Pourquoi certaines cellules cancéreuses survivent-elles à la radiothérapie ? C’est la question à laquelle notre projet veut répondre. Pour cela, nous allons utiliser une nouvelle méthode appelée radiomique. Elle permet d’analyser très finement les images médicales (IRM) des tumeurs. Grâce à des outils informatiques, on peut extraire des informations que l’œil humain ne voit pas. Cela pourrait nous aider à repérer, à l’avance, les zones d’une tumeur qui risquent de ne pas bien réagir au traitement. Mais pour l’instant, on ne sait pas encore si ce que l’on voit sur les images correspond bien à la réalité des tissus malades. Notre étude va donc tester cette idée dans un modèle animal (des souris). Des cellules cancéreuses humaines seront implantées dans la patte des souris. Ensuite, elles recevront une radiothérapie, et passeront des examens IRM avant et après le traitement. On analysera ensuite les tumeurs pour comparer ce que montrent les images avec ce qu’on observe réellement dans les tissus. Ce projet se déroulera sur 3 EU différents : pour des fins d’hébergement, de radiothérapie et d’imagerie. Le projet se déroule en deux grandes étapes. La première servira à mettre au point les bonnes conditions expérimentales (taille des tumeurs, bons moments pour les IRM, méthode d’analyse des tissus, etc.). Dans la deuxième étape, nous comparerons deux groupes de souris (traitées ou non) pour vérifier si certaines caractéristiques visibles à l’IRM permettent de prédire la réponse à la radiothérapie. Si cette méthode fonctionne, elle sera testée ensuite chez l’humain. À long terme, l’objectif est de mieux personnaliser les traitements : si on sait à l’avance qu’une tumeur va mal réagir à la radiothérapie, on pourra adapter la stratégie, par exemple en augmentant la dose ou en ajoutant un autre traitement. Cela permettrait d’améliorer les chances de guérison tout en réduisant les effets secondaires.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique sur la souris sera suivi par la validation des résultats sur pièces chirurgicales de patients (biopsies), suivi d’une étude clinique de phase II de radiothérapie adaptative en fonction des résultats de ce projet.
Procédures
70 souris recevront une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche. Ces 70 souris recevront différentes interventions : 14 souris recevront 2 IRM (45 minutes chaque séance) espacées d’au moins 5 jours (EU imagerie). 28 souris recevront une séance unique de radiothérapie (5 minutes) (EU radiothérapie), dont 14 seulement recevront une IRM (EU hébergement et EU imagerie). 28 souris recevront une séance d’IRM de 45 minutes (EU imagerie), dont 14 souris recevront une séance unique de radiothérapie qui dure 5 minutes (EU radiothérapie). Avant toute injection de cellules tumorales, IRM, radiothérapie : les souris sont anesthésiées par un gaz volatile anesthésiant.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut générer une inconfort local léger et transitoire. La masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération. La radiothérapie peut causer des brûlures autour du site irradié 24 à 48 heures post-irradiation. Néanmoins, nous n’avons jamais observé ces nuisances à cette dose.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour analyses histologiques de la tumeur. De plus, d’autres organes comme les ganglions, le foie et les poumons seront prélever pour des expérimentations ultérieures afin d’étudier la dissémination tumorale.
Remplacement
A l’heure actuelle, aucun modèle informatique, in vitro ou organoïde ne permet de reproduire fidèlement la complexité des zones résistantes et la réponse aux radiations ionisantes in vivo. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc incontournable pour garantir la pertinence des résultats avant une transposition à l’Homme.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été rigoureusement calculé afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux engagés dans l’étude. Chaque groupe expérimental comporte ainsi un effectif restreint, mais suffisant pour assurer la validité scientifique des conclusions. Selon l’expérience de l’équipe et les équipes qui travaillent en collaboration sur ce projet, 12 souris par groupe sont nécessaires afin de mener l’étude et de garantir une puissance statistique suffisante. Sur la base de l’expérience de l’équipe, un taux d’échec de pousse tumorale d’environ 15 % est observé, donc . Pour compenser ces pertes et disposer d’un nombre suffisant de données exploitables, 14 souris par groupe sont prévues.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, tout en garantissant la validité scientifique des données recueillies. Une habituation à la manipulation sera réalisée progressivement. Le choix du site d’injection des cellules tumorales (patte postérieure gauche, en sous-cutanée) a été réfléchi pour limiter la gêne fonctionnelle et éviter l’exposition des organes internes sensibles lors de la radiothérapie. Ce site permet également une croissance tumorale plus homogène et plus facilement mesurable, tout en étant bien maîtrisé par l’équipe. Le suivi des animaux est rigoureux : les animaux sont observés au minimum trois fois par semaine, et quotidiennement à partir de l’apparition de la tumeur. Toute altération de leur état de santé entraînera l’administration d’antalgiques : injection en sous-cutanée d’anti-inflammatoire. Si la douleur persiste plus que 24h, une injection d’analgésique sera effectuée. Si nécessaire, l’expérimentation sera arrêtée selon les points limites mis en place. Les anesthésies nécessaires aux injections de cellules, examens IRM et à l’irradiation sont réalisées avec un apport en oxygène, pour une induction et un réveil rapide. Un tapis chauffant est utilisé pour éviter l’hypothermie, et une surveillance post-anesthésique est assurée jusqu’au retour complet à l’état de veille. Le transport des animaux entre les sites d’hébergement et d’imagerie est limité au strict nécessaire (5 minutes sur un chariot adapté) et le transport entre le site de radiothérapie et d’imagerie sera effectué dans des véhicules à température contrôlée, avec des caisses ventilées adaptées (25 minutes). Les trajets sont courts et les animaux sont replacés rapidement dans un environnement familier.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été choisi pour sa pertinence biologique, sa robustesse et son large usage en recherche préclinique en oncologie. Son génome est entièrement connu, avec une forte similarité fonctionnelle avec celui de l’Homme. Ce modèle permet une vision intégrée de la tumeur et de son microenvironnement. Le modèle tumoral utilisé, basé sur l’injection de cellules tumorales issues de carcinomes oraux chimiquement induits, est bien documenté et reproduit les caractéristiques des cancers ORL humains. L’utilisation de souris immunocompétentes permet d’étudier les interactions entre tumeur, radiothérapie et système immunitaire. Leur petite taille les rend compatibles avec les plateformes d’IRM préclinique et d’irradiation ciblée. Ce choix favorise ainsi une cohérence entre les données d’imagerie et histologiques animales, et celles prévues chez l’Homme, renforçant la validité translationnelle du modèle. Les souris seront âgées de 7 semaines à la réception afin qu’elles aient atteint le stade adulte et un système immunitaire mature lors de la séquence thérapeutique.