Souris

Tatouées sous anesthésie à leur arrivée, mises au régime hyperlipidique pendant quatorze à seize semaines à partir de trois mois, puis injectées dans le muscle, 80 souris traversent à pied deux établissements dans des valises de transport avant l'expérimentation terminale. Celle-ci comprend un test de transport de glucose, une injection d'insuline et, pour la moitié d'entre elles, trois prélèvements sanguins pendant le test, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'obésité induite comme une source d'inconfort significatif, et les prélèvements répétés comme pouvant provoquer stress, douleurs légères, œdèmes et gonflements. Toutes sont nécropsiées à l'issue, leurs tissus prélevés pour analyses histologiques et génétiques, une partie étant proposée aux autres équipes du centre.

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

2 181 souris vont être utilisées, chacune greffée de cellules tumorales ovariennes humaines chimiorésistantes puis transportée entre deux sites distants de trois kilomètres pour environ 45 minutes d'imagerie TEP sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur écrivant qu'elles le seront "pour récupération et valorisation des tissus". Les procédures d'un niveau de souffrance modéré comprennent l'injection de radiotraceurs, des prélèvements sanguins à la veine saphène sous contention, et une irradiation localisée possible des organes où les traceurs s'accumulent, le seul suivi comportemental décrit étant une inspection quotidienne notant la prostration, la rupture du lien social et une grimace scale. Les retombées annoncées pour les patientes atteintes de cancer de l'ovaire séreux de haut grade sont formulées dans "l'espoir d'augmenter leurs perspectives de survie", quand le projet en est encore à vérifier où se distribuent quatre familles de molécules.

Objectifs

Dans le domaine de la médecine nucléaire, la thérapie par radioligand (TRL) représente une avancée majeure pour le traitement des cancers. Cette approche théranostique repose sur l’utilisation d’agents biologiques, tels que des peptides ou des anticorps, ciblant spécifiquement des protéines exprimées à la surface des cellules tumorales, couplés soit à un radioisotope d’imagerie pour le diagnostic, soit à un radioisotope thérapeutique. Cependant, aucun agent théranostique n’existe encore pour des cancers agressifs tels que le cancer de l’ovaire séreux de haut grade dont le sombre pronostic est généralement associé à des résistances à la chimiothérapie. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux radioligands, développés pour cibler de façon spécifique différentes protéines membranaires surexprimées à la surface des cellules tumorales ovariennes. À ce jour, quatre cibles dont les ligands naturels sont déjà bien caractérisés ont été identifiées. Le premier objectif de ce projet consistera à évaluer la biodistribution de différentes molécules dirigées contre ces quatre cibles d’intérêt, après couplage à un radioisotope d’imagerie, afin de vérifier leur spécificité. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique de ces molécules en les couplant avec un radioisotope thérapeutique émettant des rayonnements ionisants afin de créer des dommages à l’ADN des cellules tumorales ciblées et de provoquer leur mort. Des souris porteuses de tumeurs ovariennes humaines (chimiorésistantes) seront ainsi utilisées soit pour réaliser des imageries par Tomographie à Emission de Positron (TEP) après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope d’imagerie ; soit pour étudier le suivi de la croissance tumorale après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope thérapeutique. Cette étude a pour but d’évaluer la spécificité et l’efficacité thérapeutique de radioligands ciblant des protéines surexprimées dans les cancers de l’ovaire. Cela permettra de sélectionner les candidats les plus prometteurs qui pourraient avoir un intérêt dans le traitement de ces cancers.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de déterminer la faisabilité d’une approche théranostique, chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire, en fournissant de précieuses informations sur la distribution des radioligands au sein de l’organisme, son excrétion et stabilité dans le sang, connaissances indispensables pour le choix des radioligands possédant la meilleure efficacité thérapeutique, tout en minimisant les effets sur les tissus sains. Ainsi, cela permettrait d’envisager de nouvelles méthodes de prise en charge des patientes atteintes de cancer de l’ovaire grâce à la théranostique, dans l’espoir d’augmenter leurs perspectives de survie et d’améliorer leur qualité de vie pendant et après le traitement, par la diminution des effets secondaires. De plus, les 4 récepteurs d’intérêt étant également surexprimés dans d’autres types de cancers, cela pourrait étendre les bénéfices de ces composés innovants à d’autres patients.

Procédures

Injection de cellules tumorale (5minutes sous anesthésie gazeuse). Transfert entre les deux sites : moins de 3 km (environ 10 minutes). Injection de radiotraceurs (2 minutes) sous anesthésie gazeuse suivi d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse : environ 45 minutes. Prélèvements sanguin (veine saphèene) sous contention : 1 minute.

Impact sur les animaux

Une inspection détaillée et quotidienne dans les périodes critiques, i.e. après implantation et après traitement, de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal : rupture du lien social, prostration, grimace scale. De plus, de l’aliment gélifié leur sera proposé Les animaux ressentiront de l’inconfort, voire de la douleur, en raison de la nécessité de procéder à des injections de cellules tumorales ou de radiotraceurs : - stress de la préhension des souris pour l'implantation des tumeurs : environ 2 minutes - inconfort associé au développement tumoral : légère gêne au niveau moteur : maximum 2 semaines - au moment du tranfert des animaux : stress du au changement d'environnement : environ 3 jours - injection des radiotraceurs sous anesthésie : pas de stress en dehors de celui de la préhension pour sédation - imagerie TEP : pas de stress ni douleur prévu, car non invasif et réalisé sous anesthésie. Les signes de toxicité possibles des radio ligands sont principalement liés à l’accumulation des radiotraceurs dans certains organes qui peut entrainer une irradiation localisée. Ces toxicités seront évaluées via les études de bio distribution (et comptage gamma après prélèvements d’organes). Nous serons tout de même attentifs aux pertes d’appétit, de diarrhée et de perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération et valorisation des tissus.

Remplacement

Bien que de nombreux modèles in vitro, de plus en plus poussés, existent et qu’il s’agisse d’un champ de la biologie en essor, il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer un organisme vivant par une puce microfluidique ou un organoïde. En effet, dans le cadre de l’étude présentée ici, il est nécessaire d’évaluer des paramètres tels que la distribution au sein d’un organisme entier ainsi que l’excrétion des radioligands. Tout ceci nécessite des systèmes circulatoires et excrétoires, dont toute la complexité ne saurait encore être retranscrite artificiellement. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle murin. Les étapes de recherche de récepteurs cibles ont été menées in silico. Par ailleurs, les étapes de validation des cibles ainsi qu’une première sélection des ligands présentant les meilleures caractéristiques (liaison spécifique au récepteur cible et capacité d’internalisation) ont été réalisées in vitro, sur des lignées cellulaires de cancer ovarien. Cela permet ainsi de réduire l’utilisation d’animaux et leur utilisation n’arrive qu’à la fin d’un processus réfléchi et optimisé, de sorte à en minimiser l’usage.

Réduction

Les différents tests in vitro permettent de sélectionner uniquement les composés ayant montré les meilleures caractéristiques pharmacologiques avant l’utilisation d’animaux. La quantité d’animaux utilisée a été réduite au minimum nécessaire, en limitant la quantité de ligands testés grâce à une analyse « en entonnoir ». Ainsi, le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum est pourra être réduit si un des radioligands testés répond à tous les paramètres étudiés. De plus, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Concernant l'hébergement les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et leurs yeux lubrifiés afin d’éviter toute sècheresse ou irritation oculaire. Les conditions d’anesthésie sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de aliment gélifié est placé dans les cages après chaque anesthésie (il aura été présenté en amont aux souris pour les habituer et passer l’étape de néophobie alimentaire). En fin de protocole, les souris seront placées dans une salle isolée du reste des souris pour la mise à mort et les manipulations post-euthanasies seront également réalisées dans une autre pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements (3 km) suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens sont prévus et pourront être utilisés si nécessaire. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris demeure un modèle de choix pour les études précliniques en oncologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme permet d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre deux et six mois. Les expériences sur adultes permettent de garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.

Le choix entre le rat et la souris dépend des demandes des clients de l'entreprise : 3 140 souris et 3 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un inducteur chimique ou une exposition hormonale déclenche chez les femelles un syndrome des ovaires polykystiques, avec des administrations jusqu'à deux fois par jour pendant dix-huit semaines, un régime gras pendant dix semaines, des frottis vaginaux quotidiens et des chirurgies de trente minutes, ovariectomies, implantation de pellets, injections intra-ovariennes ou intracérébroventriculaires. Le porteur indique que ces dernières peuvent entraîner des lésions, que des composés sont administrés à des nouveau-nés non sevrés au risque que la mère les rejette, et que le syndrome induit peut faire apparaître insulinorésistance, diabète et hypertension artérielle. Rien ne fonde l'effectif de ces 6 280 souris et rats, il écrit : "Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n'a été fait".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patientes atteintes du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique. L’UTILISATION DE DIFFÉRENTS INDUCTEURS DANS LES MODÈLES EXPÉRIMENTAUX DE SYNDROME DES OVAIRES POLYKYSTIQUES (SOPK) CHEZ LE RONGEUR PRÉSENTE UN INTÉRÊT MAJEUR, CAR AUCUN MODÈLE NE REPRODUIT À LUI SEUL L’ENSEMBLE DES COMPOSANTES ENDOCRINIENNES, REPRODUCTIVES, OVARIENNES ET MÉTABOLIQUES DU SYNDROME HUMAIN. LE PHÉNOTYPE OBTENU DÉPEND NOTAMMENT DE LA NATURE ET DE LA DOSE DE L’INDUCTEUR, DE SA VOIE D’ADMINISTRATION, DE L’ÂGE AUQUEL DÉBUTE L’EXPOSITION, DE LA DURÉE DU TRAITEMENT, AINSI QUE DE L’ESPÈCE, DE LA SOUCHE ET DU RÉGIME ALIMENTAIRE UTILISÉS. CES PARAMÈTRES DOIVENT DONC ÊTRE PRIS EN COMPTE LORS DE LA SÉLECTION ET DE L’INTERPRÉTATION D’UN MODÈLE EXPÉRIMENTAL.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et/ou D’INDUCTEUR DE LA PATHOLOGIE par différentes voies d’administration pendant maximum 18 semaines de façon biquotidienne AU MAXIMUM POUR LES VOIES D’ADMINISTRATION CLASSIQUES. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. CERTAINES ADMINISTRATIONS NECESSITERONT UNE CHIRURGIE SOUS COUVERTURE ANESTHESIQUE ET ANALGESIQUE ADAPTEE (ENVIRON 30 MIN DE CHIRURGIE). Les animaux seront pesés régulièrement (à chaque administration à minima, 30 SEC POUR REALISER CE GESTE) et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir DES CHIRURGIES selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 GOUTTE POUR DES ANALYSES BIOLOGIQUES) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique PAR EXEMPLE OU AUTRE. Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Ce modèle agit essentiellement sur le système endocrinien des animaux pouvant provoquer un dérèglement hormonal influençant leur comportement. De plus, dans ce modèle, une insulinorésistance, du diabète ainsi qu’une hypertension artérielle peuvent apparaître, augmentant ainsi le risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires. Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies (implantation de pellets, ADMINISTRATIONS INTRA-OVARIENNE OU INTRACEREBROVENTRICULAIRE, ovariectomie). L’ADMINISTRATION DE COMPOSES CHEZ DES NOUVEAU-NES NON SEVRES PEUT INDUIRE UN STRESS AUX ANIMAUX, UN MAL-ETRE POUR LA FEMELLE ALLAITANTE QUI PEUT REJETER LES NOUVEAU-NES. L’ADMINISTRATION INTRACEREBROVENTRICULAIRE PEUT ENTRAINER DES LESIONS SUR LES ANIMAUX. UNE OBSERVATION RENFORCEE DU COMPORTEMENT DES ANIMAUX SERA REALISEE POUR DETECTER TOUT SIGNE D’ATTEINTE NEUROLOGIQUE.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8-10 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet nécessite l’utilisation de femelles gestantes et seuls les nouveau-nés femelles seront gardés pour la suite des procédures expérimentales. Les nouveau-nés mâles pourront être utilisés pour d’autres dap (formation aux gestes techniques par exemple), permettant ainsi de diminuer l’utilisation du nombre d’animaux. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. L’ADMINISTRATION DE COMPOSES CHEZ DES NOUVEAU-NES NON SEVRES PEUT INDUIRE UN STRESS AUX ANIMAUX, UN MAL-ETRE POUR LA FEMELLE ALLAITANTE QUI PEUT REJETER LES NOUVEAU-NES. UNE MANIPULATION PARTICULIERE DES NOUVEAU-NES SERA REALISEE AFIN DE LIMITER AU MAXIMUM UN REJET POSSIBLE DE LA MERE (CHANGEMENT DE GANTS ENTRE CHAQUE CAGE, FROTTER LES GANTS SUR LA LITIERE AVANT DE MANIPULER LE PETIT POUR CONSERVER L’ODEUR, REMETTRE LE PETIT CONTRE SA MERE, GESTE RAPIDE, ATTENTION PARTICULIERE POUR MAINTENIR LE PETIT AU CHAUD…). AUGMENTATION DE L’OBSERVATION DES ANIMAUX SUITE A UNE ADMINISTRATION INTRACEREBROVENTRICULAIRE POUR VOIR SI DES TROUBLES NEUROLOGIQUES APPARAISSENT.

Choix des espèces

LE SOPK DEBUTANT A L’ADOLESCENCE LORS DE LA PUBERTE, LE MODELE INDUIT PAR UN INDUCTEUR CHIMIQUE SERA REALISE SUR DES ANIMAUX ADULTES OU PREPUBERES (3 SEMAINES). DE CE FAIT, NOUS UTILISERONS DES ANIMAUX AGES D’AU MOINS 3 SEMAINES (ANIMAUX LIVRES AVEC LEUR MERE CAR LE SEVRAGE NE SERA PAS TERMINE). POUR LE MODELE D’EXPOSITION AUX HORMONES, NOUS UTILISERONS DES FEMELLES GESTANTES DE 2-3 MOIS OU NON GESTANTES AGEES DE 4 SEMAINES MINIMUM (FEMELLES PREBUBERES OU ADULTES SELON LES MODELES), ET DES NOUVEAU-NES FEMELLES AGES DE 10 JOURS MINIMUM. SELON LE MECANISME D’ACTION ET LA CIBLE DU CANDIDAT MEDICAMENT, LE RAT ET/OU LA SOURIS POURRONT ETRE UTILISES. LE CHOIX DU MODELE UTILISE SERA DEPENDANT DES DEMANDES CLIENTS CAR LES MODELES SOPK INDUITS PAR UN INDUCTEUR CHIMIQUE OU PAR EXPOSITION HORMONALE SONT BIEN DECRITS DANS LA LITTERATURE CHEZ LES DEUX ESPECES. LE CHOIX DES MODELES DEPEND DE L’OBJECTIF DE L’ETUDE.

Un produit injecté à des souris nouveau-nées pour induire des symptômes proches de la schizophrénie leur cause une perturbation motrice de deux heures. 5 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Une partie subit en plus une chirurgie de trente minutes pour poser une canule, avec douleurs post-opératoires, inflammation du site d'implantation et perte de poids possibles, ainsi qu'un isolement réparti sur deux semaines. Le porteur annonce des tests de comportement qu'il dit "indispensables à l'étude", sans préciser lesquels.

Objectifs

La schizophrénie est une maladie psychiatrique touchant environ 1 % de la population. Les symptômes sont classés en trois groupes : positifs (hallucinations, délires…), négatifs (apathie, retrait social…) ou cognitifs (mémoire réduite, attention limitée…). Plusieurs hypothèses proposent des dysfonctionnements de la transmission de certaines informations dans le cerveau. Ces informations sont des sortes de messages chimiques qui circulent dans le cerveau pour aller activer ce qu’on appelle des récepteurs. Les traitements existants ne permettent de traiter que les symptômes positifs, ce qui cause de nombreux abandons de traitement, d’où la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Des mini-anticorps , ont la capacité de cibler spécifiquement les récepteurs impliqués dans la transmission des messages chimiques dans le cerveau. Ils constituent un espoir de traitement qu’il convient d’investiguer. Ce projet a donc pour ambition d’évaluer le potentiel thérapeutique de plusieurs mini-anticorps chez la souris, et plus précisément sur des souris traitées pour mimer des symptômes proches de la schizophrénie humaine.

Bénéfices attendus

Evaluer le potentiel thérapeutique des mini-anticorps permettra de poser les bases d’un développement thérapeutique futur allant de la souris jusqu’à l’Homme. Ce travail permettra également de mieux comprendre comment de petits agents thérapeutiques tels que ces mini-anticorps peuvent pénétrer et agir dans le cerveau, permettant ainsi une approche thérapeutique moins invasive et risquée pour l’Homme.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront traités par différentes voies : - Pour toutes les injections, le geste de contention et injection durera quelques secondes par animal Chaque injection sera au minimum espacée de 2 jours. - Pour les inhalations, le geste de contention et inhalation durera quelques dizaines secondes par animal. Les inhalations seront au nombre maximum de 4 espacées d’une semaine les unes des autres. - Certains animaux de ce projet connaitront une chirurgie (réalisée sous anesthésie et analgésie) d’une durée de 30 minutes pour mettre en place une canule permettant par la suite une injection (sous anesthésie légère). Les injections seront uniques. De plus, certains animaux auront un isolement temporaire pour un test comportemental. Cet isolement sera réparti sur 2 semaines.

Impact sur les animaux

Induction la maladie et traitement par les mini-anticorps : Les aiguilles d’injections peuvent conduire à une légère douleur à l’endroit de l'injection. Cependant, aucun effet nocif de nos mini-anticorps n’a été observé dans nos précédentes études. Le produit injecté pour induire les symptômes de la schizophrénie conduit à une perturbation motrice des nouveaux nés pendant 2h après l’injection. Chirurgie : Des douleurs en suite d’opération (problèmes sur la cicatrisation, inflammation du site d’implantation, perte de poids transitoire) peuvent être observées. Isolement temporaire des animaux pouvant générer un stress.

Devenir

Afin de retirer le maximum d’informations des expériences, tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d’organes nécessaire à une étude complémentaire.

Remplacement

Dans cette étude, il n'est pas possible de remplacer les souris. En effet, les mini-anticorps que notre équipe a développés sont conçus spécialement pour fonctionner dans le corps d'une souris. Leurs propriétés et efficacité ont été testées en amont au laboratoire. Mais, sans animaux, on ne peut pas reproduire la façon dont ces mini-anticorps se déplacent dans le sang, traversent la barrière qui protège le cerveau, et agissent une fois à l'intérieur. De plus, cette étude porte sur une maladie mentale que les scientifiques ne comprennent pas encore totalement. Pour l'étudier, il existe plusieurs modèles de souris malades qui reproduisent certains symptômes de cette maladie. Pour mesurer ces symptômes, on fait passer des tests de comportement à ces souris, et ces tests sont indispensables à l'étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour l’étude a été déterminé afin de minimiser l’utilisation de l’animal tout en assurant la pertinence statistique des études réalisées par la suite. Des variabilités attendues sur la base de travaux antérieurs ont été prises en compte. Enfin, nous avons programmé cette étude de manière à ce que les premiers résultats observés nous permettent de réduire le nombre d’animaux au cours du projet.

Raffinement

Lors des traitements les animaux seront surveillés dans les 2 heures qui suivent l’injection. Avant la procédure de chirurgie, les animaux concernés sont pesés et leur état général sera vérifié. L’étape de chirurgie est pratiquée sous anesthésie gazeuse générale sur tapis chauffant avec la mise en place d’une couverture antalgique adaptée. Une analgésie locale sera mise en place ainsi qu’une protection oculaire. Ces animaux feront l’objet d’un suivi post-opératoire particulier. Les résultats d’autres études permettent d’assumer que le traitement au mini-anticorps n’entraine pas d’inconfort particulier chez l’animal. Tous les animaux suivront une période de quatre jours d’habituation à la manipulation afin de réduire à son maximum le stress lié au contact humain et à l’environnement de l’étude.

Choix des espèces

Les souris que nous utiliserons permettent de reproduire des symptômes de la schizophrénie qui apparaissent à l’adolescence chez l’Homme. Pour obtenir ces symptômes les souris doivent être traitées lorsque le cerveau est en pleine formation. Par la suite, les effets seront étudiés à l’âge adulte.

Tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles appartiennent à une lignée mise au point par une autre équipe pour reproduire certains aspects de la maladie de Crohn, et reçoivent par voie orale une bactérie intestinale cinq fois par semaine pendant trois mois, plus une injection et un prélèvement de sang. Le porteur indique que ces administrations répétées peuvent causer une douleur modérée, une gêne ou une irritation courant sur les trois mois, et une perte de poids passagère. Sur le remplacement, il décrit des organoïdes intestinaux "intéressants et prometteurs" qui ne permettent pas d'observer "l'impact du reste de l'organisme", et conclut au "besoin de travailler sur l'animal".

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’étudier l’impact d’une bactérie habituellement présente dans l’intestin, appelée Akkermansia muciniphila (ou AKK), sur l’inflammation intestinale qui caractérise la maladie de Crohn. AKK est connue pour avoir des effets bénéfiques pour l’organisme et est considérée un probiotique prometteur, son abondance est fortement diminuée lors de la maladie. Dans un 1er objectif, nous administrerons cette bactérie AKK à des souris présentant des symptômes de la maladie de Crohn et analyserons les effets sur l’immunité et l’inflammation intestinales. Dans un 2ème objectif, nous nous intéresserons aux interactions entre la bactérie AKK et certaines cellules de la membrane intestinale. Cette membrane est une barrière essentielle pour notre organisme qui permet l'absorption des nutriments et de l'eau, et assure une protection contre les agents pathogènes. De plus, certaines cellules qui la constituent jouent un rôle dans l’inflammation présente dans la maladie de Crohn. Ces deux objectifs nous permettront de mieux comprendre comment la maladie de Crohn se développe et les mécanismes mis en jeu. Ces mécanismes restent encore peu connus mais impliquent une mauvaise régulation de l’équilibre entre le malade et son microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet en santé humaine seront à court terme une meilleure connaissance des effets de la bactérie AKK sur l’intestin, l’identification de ses bienfaits dans des conditions où l’intestin est très inflammé, et la compréhension de ses interactions avec l’organisme. Ces bénéfices pourront s’appliquer à large échelle puisque le nombre de patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin comme la maladie de Crohn ne cesse d’augmenter dans le monde et aucun traitement efficace n’existe à ce jour. A moyen terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de cette maladie.

Procédures

Chaque animal sera soumis aux gestes suivants : - Administration orale (5 fois/semaine pendant 3 mois, 3 minutes par geste) - 1 injection (1 fois, 3 minutes) - Prélèvement de sang (1 fois, 5 minutes)

Impact sur les animaux

L’administration des antibiotiques peut conduire à un inconfort intestinal. L'injection pourra entraîner une douleur et un stress légers de courte durée. Les administrations orales pourront entraîner un stress de manipulation, une douleur modérée et une gêne ou irritation courant sur les trois mois de durée du projet. Une perte de poids passagère peut se produire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Il existe des modèles intéressants et prometteurs en 3 dimensions (que l’on appelle organoïdes intestinaux) qui reproduisent les structures de la membrane de l’intestin, qui constitue une barrière cruciale entre l’environnement et le corps, et qui permettent d’étudier les interactions entre l’intestin d’un hôte et sa flore bactérienne. A ce jour, ces modèles peuvent donner des informations préliminaires mais ils ne permettent pas d’observer l’impact du reste de l’organisme : la circulation sanguine, le système immunitaire, les autres organes de la digestion. Or ces différents éléments jouent un rôle très important dans la physiologie de l’organisme mais aussi dans les maladies, et ne peuvent être reproduites totalement in vitro pour le moment. Nous avons donc besoin de travailler sur l’animal pour mieux comprendre les mécanismes responsables du développement des pathologies intestinales et les causes à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

Les effectifs ont été estimés à l’aide d’un test statistique pour obtenir un nombre minimum d’individus tout en permettant d’obtenir des résultats statistiques significatifs. Afin de limiter le nombre d’animaux, les prélèvements de tissus seront utilisés dans différents types d’expériences prévues pour ce projet.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, des étapes d’entraînement des animaux ont été prévues, une surveillance accrue sera mise en place, des protocoles d’anesthésie et analgésie ont été définis. Pour traiter les impacts indésirables, une surveillance intensive sera réalisée, des points limites précoces ont été spécifiés, un suivi de poids quotidien et la mise en place d’une grille d’évaluation de l’animal seront réalisés et un régime alimentaire adapté sera fourni. Des critères d’arrêt de souffrance ont été définis.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Afin de tester la capacité de la bactérie AKK présente dans le microbiote intestinal à réduire ou prévenir l’inflammation intestinale (son abondance est fortement réduite chez les patients atteints de la maladie de Crohn qui développent une inflammation chronique de l’intestin), nous utiliserons un modèle préalablement développé dans cette espèce par une autre équipe récapitulant certains aspects de la pathologie humaine. De plus, nous combinerons ce modèle avec un autre modèle de souris afin d’analyser les communications entre cette bactérie et les cellules de la membrane de l’intestin et de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu. Nos travaux précédents ont montré que l’inflammation modérée dans le modèle de prédisposition génétique à la maladie de Crohn que nous utilisons se produit à l’âge adulte, progressivement, entre 3 et 6 mois. Dans le but de tester si la bactérie peut prévenir le développement de cette inflammation, des animaux âgés de 3 à 6 mois seront utilisés. De plus, les expériences visant à tester si l’exposition à la bactérie peut améliorer l’inflammation lorsque qu’elle est présente, des animaux âgés de 6 à 9 mois seront utilisés. Nous utiliserons les animaux des 2 sexes pour ce projet.

Le plafond annoncé est d'une anesthésie gazeuse par jour pendant deux semaines. 744 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les prélèvements de tissus. Elles reçoivent jusqu'à douze injections intrapéritonéales ou sous-cutanées, et selon les groupes douze séances d'exercice musculaire en trois semaines, une lésion musculaire provoquée, ou douze microlésions intramusculaires par jour pendant deux semaines, l'objectif étant de supprimer les macrophages du muscle et d'observer ce qui suit. Sur l'effectif, le porteur écrit que "l'analyse statistique permet de définir le nombre d'animaux nécessaires minimum pour chaque expérience", sans donner ni ce calcul ni ce nombre, et résume les atteintes en une ligne sur le stress de la contention.

Objectifs

Les tissus renferment des cellules immunitaires résidentes dont les macrophages. Leur rôle n'est pas connu dans le muscle strié squelettique. Pour identifier ce ou ces rôles, l'approche utilisée dans le projet est d'éliminer ces cellules dans le tissu musculaire à l'aide d'un modèle de souris transgénique adapté, et d'évaluer les conséquences sur la stabilité physiologique et la fonction musculaires. Trois types de conditions seront étudiées : l'état basal, une condition physiologique d'exercice, une condition de lésion musculaire et une condition pathologique de maladie musculaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de définir le rôle des macrophages résidents du muscle strié squelettique dans toutes les conditions physiologiques et pathologiques. Cela pourra permettre ultérieurement d'identifier de potentielles voies d'action pour améliorer l'état du muscle, normal ou malade.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées (12 injections maximum). Certains seront soumis soit à un protocole d'exercice musculaire pendant 5 min, maximum 12 séances en 3 semaines, soit à un protocole de dommage musculaire (5 min en une fois), soit à des microlésions intramusculaires pendant 2 semaines (12 microlésions par jour). Tous protocoles utilisent l'anesthésie générale. Les nuisances attendues de ce projet incluent : un stress lors de la contention pour les injections vigiles et un stress lors du déplacement dans la boite d'anesthésie. Le maximum d'anesthésies est une anesthésie gazeuse quotidienne pendant 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont un stress lors de la contention lors des injections ou le déplacement dans la boite d'anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue des prélèvements tissulaires pour les analyses biologiques.

Remplacement

Les cellules étudiées (macrophages) sont incrustées au sein du muscle. Si on veut étudier leur rôle sur l'équilibre du tissu (homéostasie), on doit rester au niveau de l'organe et de l'organisme entier. Le projet apportera la preuve de concept de l'utilité des macrophages dans la régulation de l'équilibre du muscle dans les différentes conditions physiologiques et pathologiques, qu'il est impossible de mimer in vitro.

Réduction

La réduction est réalisée selon plusieurs principes : 1) l'analyse statistique permet de définir le nombre d'animaux nécessaires minimum pour chaque expérience; 2) nous utilisons un système de banque de tissu permettant leur réutilisation évitant le recours à de nouveaux animaux; 3) trois Go/Nogo sont établis dans le protocole.

Raffinement

Le raffinement se fait sur le site d'injection, et l'appareil pour mesurer la force musculaire, induire la lésion musculaire et l'exercice est complètement non-invasif. Les souris sont anesthésiées lors de procédures durant plus de 20 secondes. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

La souris présente un système musculaire proche de celui de l'homme. Les animaux sont des animaux adultes, dont le développement est terminé, des deux sexes.