Souris

36 souris Swiss femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections sous-cutanées d'antibiotique en trois jours consécutifs, puis un gavage oral unique d'une suspension d'Enterococcus faecalis, avant que leur tube digestif soit prélevé pour dénombrement bactérien. Le porteur affirme qu'aucune alternative in vitro ou ex vivo ne reproduit la complexité d'une infection gastro-intestinale, et attend du modèle qu'il éclaire la persistance de la bactérie après une endocardite. L'âge et le sexe des souris sont fixés "à la demande du client", ce qui situe le projet du côté de la prestation.

Objectifs

Les entérocoques sont des bactéries ubiquitaires, naturellement présents dans le microbiote intestinal humain. Parmi eux, Enterococcus faecalis est l'espèce majoritairement responsable des infections humaines. Historiquement considérés comme des bactéries opportunistes, les entérocoques suscitent aujourd’hui une inquiétude croissante en raison de leur capacité à développer une résistance aux antibiotiques et à persister dans des environnements hospitaliers hostiles. E. faecalis est impliqué dans diverses pathologies, telles que les endocardites (infections du cœur), les infections urinaires, les bactériémies, et plus rarement les infections gastro-intestinales. La rechute fréquente de certaines infections laisse supposer une tolérance ou une persistance bactérienne qui échappe aux traitements classiques. Dans ce contexte, le projet vise à développer un modèle d’infection gastro-intestinale permettant d’évaluer le comportement infectieux de deux souches mutées en comparaison d’une souche non mutée. L’objectif est de déterminer si ces mutations influencent la capacité de la bactérie à établir ou maintenir une infection différente de la souche parentale.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle murin standardisé permet de reproduire les conditions d'une colonisation intestinale par Enterococcus faecalis et d'étudier son comportement in vivo, dans un environnement contrôlé et reproductible. En comparant la souche parentale à deux mutants identifiés chez des patients ayant rechuté d’endocardite, le projet permet d’explorer les déterminants bactériens responsables de la persistance, de la tolérance aux antibiotiques, et potentiellement de la rechute infectieuse.

Procédures

- 3 injections sous cutanée (de 10 secondes (aiguille 26G) à raison d’une injection quotidienne 3j consécutifs - 1 administration unique par gavage oral de 10 secondes (0,9 x 25 mm)

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur : - La première phase consistera à administrer par voie sous cutanée un antibiotique. La nuisance principale sera liée ici au geste de l’injection sous cutanée. Des expériences de décontamination digestive menées par le passé et utilisant un cocktail de plusieurs antibiotiques n’ont pas montré d’effets secondaires de type intolérance digestive/diarrhée. - Dans la phase 2, les nuisances attendues seront liées à l’administration de l’antibiotique (comme dans l’étape 1) et de la suspension bactérienne par gavage oral. De la même façon, des effets digestifs à type de diarrhée ne sont pas attendus suite l’administration orale de cette bactérie (un protocole similaire a déjà été testé par l’équipe de recherche avec laquelle nous menons ce projet).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes du tube digestif pour dénombrement bactérien

Remplacement

Le recours à un modèle animal, en l’occurrence la souris, se justifie par l’absence d’alternative in vitro ou ex vivo permettant de reproduire de manière réaliste la complexité d’une infection gastro-intestinale impliquant l’interaction dynamique entre le microbiote, la barrière intestinale, le système immunitaire et la bactérie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été soigneusement calculé pour permettre une analyse statistique robuste (ANOVA) tout en limitant au maximum le nombre de souris par groupe : 6 souris par groupe et 3 pour le groupe véhicule. De plus, une phase de validation est effectuée sur un très petit nombre de souris (n=3), ce qui permet d’optimiser les conditions expérimentales avant le test à plus grande échelle, évitant ainsi des utilisations inutiles d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 ou 6 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Tous les animaux sont suivis quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance ou de détresse. Les antibiotiques sont administrés par voie sous-cutanée ou dans l’eau de boisson pour éviter des manipulations trop invasives et le gavage oral est réalisé avec précaution, par du personnel formé, pour limiter le stress et les complications.

Choix des espèces

La souris Swiss est un modèle de choix répandue dans la greffe d’infection gastro intestinale à Enterococcus faecalis. Des souris femelles âgées de 8 semaines seront utilisées dans cette étude à la demande du client et selon les données de la littérature.

Les 60 souris de ce projet sont immunodéficientes, donc exposées aux infections opportunistes, condition posée pour qu'elles acceptent la greffe de cellules leucémiques humaines. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules leucémiques puis jusqu'à six prises de sang en trois mois, pendant que la maladie provoque anémie, amaigrissement et grossissement de la rate. Le porteur consacre une longue rubrique aux organoïdes de moelle osseuse, aux cultures en trois dimensions et aux bases de données de patients qui permettraient de se passer d'animaux, avant de conclure que "certaines questions scientifiques nécessitent encore un modèle biologique complet".

Objectifs

Il s’agit d’étudier l’impact de l’absence d’une enzyme sur le développement des leucémies aiguës myéloblastiques.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM), un type de cancer du sang. 1 - Avancées scientifiques • Mieux comprendre comment l'absence d’une enzyme influence le développement des leucémies. • Étudier l’impact de cette enzyme sur la survie des cellules cancéreuses. • Tester ces découvertes dans un modèle de souris pour confirmer les résultats obtenus en laboratoire. 2 - Développement de nouveaux traitements • Identifier de nouvelles cibles pour des traitements contre la leucémie. • Concevoir des médicaments capables de ralentir la progression de la maladie. 3 - Amélioration du diagnostic et du suivi des patients • Trouver de nouveaux indicateurs permettant de mieux prédire la résistance aux traitements. • Adapter les soins en fonction du profil biologique de chaque patient. 4 - Impact pour les patients • Développer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. • Réduire les effets secondaires des chimiothérapies en combinant différents types de traitements. • Mettre en place une meilleure surveillance après le traitement pour éviter les rechutes. • Proposer des soins plus personnalisés et adaptés à chaque patient. 5 - Retombées sociétales et économiques • Faire avancer la recherche sur les leucémies et d'autres cancers. • Réduire les coûts des traitements en diminuant les hospitalisations et en évitant l'utilisation de médicaments inefficaces. Conclusion En résumé, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la leucémie, d'améliorer les traitements actuels et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques plus ciblées.

Procédures

1 - Contention • Les souris seront manipulées avec précaution pour minimiser le stress lors des différentes interventions, en utilisant des techniques adaptées de contention douce. • Une attention particulière sera portée à la durée de la contention afin de limiter son impact sur les animaux. 2 - Greffe de cellules leucémiques • Les souris recevront une injection de cellules leucémiques pour reproduire un modèle de la maladie. • Nombre d’animaux concernés : 60 souris • Durée : une seule injection, environ 1 minute. 3 - Suivi de la maladie • Des prises de sang seront réalisées toutes les deux semaines (jusqu’à 3 mois après l’injection des cellules leucémiques) afin de surveiller l’évolution de la leucémie et d’analyser la réponse immunitaire. Nombre total maximum de prélèvements : 6. • Nombre d’animaux concernés : 60 souris • Durée : environ 1 minute par prise de sang

Impact sur les animaux

Malgré toutes les précautions prises pour assurer leur bien-être, certains effets secondaires sont attendus en raison de la nature de l’étude. Effets liés aux interventions expérimentales • Les traitements administrés avant l’injection des cellules leucémiques peuvent provoquer une fatigue passagère et une légère perte de poids. • Les prises de sang régulières, nécessaires au suivi de la maladie, peuvent entraîner un certain stress. Pour limiter cet inconfort, des techniques adaptées seront utilisées. Effets liés au développement de la maladie • La progression de la leucémie peut causer une anémie (diminution des globules rouges), une perte d’énergie, un amaigrissement et une augmentation de la taille de certains organes comme la rate. Effets liés à l’immunodéficience • Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris immunodéficientes, ce qui les rend particulièrement sensibles aux infections opportunistes.

Devenir

Mise à mort des animaux pour analyses scientifiques Toutes les souris seront mises à mort pour des analyses approfondies qui concernent principalement la moelle osseuse et le sang, éléments essentiels pour comprendre l’évolution de la maladie. • Justification : ces examens sont indispensables pour valider les hypothèses scientifiques du projet et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie. • Méthode : la mise à mort sera réalisée selon des protocoles stricts garantissant une mort rapide et sans douleur, conformément aux réglementations en vigueur sur le bien-être animal.

Remplacement

Stratégies de remplacement de l’expérimentation animale Afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, plusieurs méthodes alternatives seront utilisées pour mener cette étude sur la leucémie. 1. Expériences en laboratoire sur des cellules humaines • Des cultures de cellules leucémiques humaines seront utilisées pour observer comment une enzyme influence leur croissance et leur évolution. • Des modèles plus avancés, appelés cultures 3D et organoïdes de moelle osseuse, seront développés pour recréer un environnement proche de celui du corps humain. Cela permettra d’obtenir des résultats plus réalistes sans utiliser d’animaux. 2. Analyses informatiques et exploitation des données existantes • Des bases de données contenant des informations sur des patients atteints de leucémie seront analysées afin de repérer d’éventuels liens entre l’expression d’une enzyme et la progression de la maladie. • Ces approches bioinformatiques permettront de générer des hypothèses solides avant de tester de nouveaux traitements, réduisant ainsi le besoin d’expériences sur des animaux. 3. Études sur des cellules humaines en dehors du corps (ex vivo) • Des cellules souches du sang seront cultivées dans des conditions spécifiques pour étudier le rôle d’une enzyme sans passer par des tests sur des souris. • Des échantillons de moelle osseuse prélevés chez des patients atteints de leucémie permettront de valider les résultats obtenus en laboratoire. Conclusion L’objectif est d’utiliser autant que possible ces alternatives avant d’envisager l’expérimentation animale. Cependant, certaines questions scientifiques nécessitent encore un modèle biologique complet pour être étudiées, ce qui justifie l’utilisation de souris lorsque les autres méthodes ne suffisent pas.

Réduction

Ce projet met en place plusieurs approches pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. 1. Optimisation des protocoles expérimentaux • Une planification minutieuse des expériences permettra de réduire le nombre de souris nécessaires tout en obtenant des données statistiquement significatives. • Chaque animal sera utilisé pour plusieurs types d’analyses afin de maximiser les informations obtenues, évitant ainsi d’avoir recours à un plus grand nombre de sujets. 2. Expériences préliminaires avant les tests sur animaux • Des tests seront d’abord réalisés sur des cultures cellulaires (in vitro) et des échantillons biologiques (ex vivo), afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes avant de passer à des essais sur animaux. • Cela permettra d’éviter des expériences inutiles et de limiter le nombre de souris impliquées. 3. Utilisation de méthodes statistiques avancées • Des outils statistiques performants seront employés pour garantir des résultats fiables avec le plus petit nombre d’animaux possible. • Ces méthodes permettent d’optimiser les groupes expérimentaux en veillant à ce que chaque test apporte un maximum d’informations. 4. Partage des ressources et des résultats avec d’autres laboratoires • Une collaboration avec d’autres équipes de recherche permettra d’éviter de répéter des expériences déjà réalisées ailleurs. • L’exploitation de bases de données existantes sur la leucémie permettra d’affiner les hypothèses sans multiplier les tests sur animaux. Conclusion Grâce à ces stratégies, le recours aux animaux sera limité au strict nécessaire. Ces mesures s’inscrivent dans une démarche responsable et éthique, visant à réduire l’impact de l’expérimentation animale tout en poursuivant des avancées scientifiques essentielles pour la lutte contre la leucémie.

Raffinement

Afin de limiter le stress et la souffrance des animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables, plusieurs mesures seront mises en place. 1. Techniques expérimentales adaptées pour minimiser l’inconfort • Les injections et prélèvements sanguins seront réalisés avec des techniques optimisées pour réduire la douleur et le stress des animaux. • Les expérimentateurs seront spécialement formés pour effectuer ces manipulations rapidement et avec le plus grand soin. 2. Surveillance attentive pour prévenir la souffrance • Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de détresse ou de douleur. • Des critères stricts seront appliqués : si un animal montre des signes avancés de souffrance ou de détérioration de son état de santé, il sera mis à mort de manière éthique et sans douleur pour éviter toute souffrance prolongée. 3. Amélioration des conditions de vie • Les souris seront élevées dans un environnement enrichi, comprenant des tunnels, des cachettes et une litière adaptée, afin de favoriser leur bien-être et de réduire leur stress. • Elles seront logées en petits groupes compatibles pour éviter l’isolement et favoriser un comportement naturel. • Les souris utilisées étant immunodéficientes, elles seront hébergées sous couvercle filtrant pour limiter le risque infectieux, qui pourrait altérer leur bien-être ainsi que les résultats expérimentaux. 4. Formation et encadrement des chercheurs • Tous les chercheurs impliqués recevront une formation continue aux meilleures pratiques en expérimentation animale, pour garantir des manipulations respectueuses et éthiques. • Un dialogue constant sera maintenu avec le comité d’éthique et les spécialistes du bien-être animal, afin d’améliorer en permanence les protocoles et de s’assurer qu’ils respectent les dernières recommandations en matière de protection animale. Conclusion Grâce à ces mesures, l’impact des expériences sur les animaux sera réduit au minimum, tout en garantissant des conditions de vie optimales et un suivi rigoureux de leur bien-être.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette étude car elle représente un modèle particulièrement adapté à la recherche sur la leucémie humaine. Pourquoi utiliser la souris ? • Une grande similarité avec l’humain : le système de production des cellules sanguines (hématopoïèse) chez la souris fonctionne de manière très proche de celui de l’être humain. Cela permet de reproduire fidèlement les mécanismes impliqués dans le développement de la leucémie. • La possibilité de modifier son patrimoine génétique : grâce à des modèles génétiquement modifiés, les chercheurs peuvent étudier avec précision l’effet de l’absence d’une enzyme sur la maladie. • Une expérimentation contrôlée : la souris permet de tester l’évolution de la leucémie dans un organisme vivant, en réalisant des injections de cellules leucémiques, des traitements et des analyses de sang dans des conditions proches de celles utilisées en milieu clinique. • Un modèle rapide et efficace : les souris ont une durée de vie courte et se reproduisent rapidement, ce qui permet d’obtenir des résultats en un temps relativement réduit et d’évaluer l’évolution de la maladie sur plusieurs générations de cellules. Pourquoi utiliser des souris adultes ? Les études seront débutées sur des souris à un âge compris entre 8 et 12 semaines, car : • À cet âge, leur système sanguin est totalement formé et stable, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. • Leur taille et leur maturité physiologique facilitent les procédures expérimentales, comme les prélèvements et injections.

Aucune souris n'est gardée vivante à l'issue, les procédures subies étant jugées incompatibles avec toute conservation. 382 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de trente minutes sous anesthésie générale pour recevoir une injection dans le cerveau, puis vit cinq à neuf semaines avant les analyses. Le porteur ramène les atteintes attendues à une douleur et une perte de poids survenant "dans des cas très rares", et conclut que l'étude in vivo est "indispensable" parce que les cultures cellulaires ne reproduisent pas les interactions entre neurones et astrocytes.

Objectifs

Depuis maintenant plusieurs décennies, de nombreuses études indiquent que l’astrocyte joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule gliale détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la communication neurone-neurone via la libération de transmetteurs. Récemment, de nombreux papiers révèlent également la présence au niveau astrocytaire de molécules d’adhésion cellulaire, qui étaient jusqu’à présent considérées comme étant des molécules uniquement neuronales. L'expression astrocytaire des molécules d'adhésion pourrait expliquer comment les astrocytes forment des interactions étroites avec leurs partenaires synaptiques, et exercent des fonctions importantes, notamment la régulation de l’activité synaptique. Afin d’aller plus loin dans la compréhension du transfert d’information dans l’hippocampe, une région cérébrale jouant un rôle clef dans la mémoire, il est donc nécessaire de déterminer si les molécules d'adhésion astrocytaires interviennent dans la régulation de la transmission synaptique, la plasticité synaptique à long terme, ainsi que la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : - Chirurgie sous anesthésie générale pour injections intra-cérébrale (30 min), - Euthanasie après anesthésie profonde (instantanée).

Impact sur les animaux

Suite aux différentes procédures, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la mémoire. Nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dispositions d’hébergement : Pour chacune des études, les animaux seront placés dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière effectué chaque semaine. Dispositions visant à réduire la douleur : Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement un antalgique. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Les diverses études seront réalisées 5 à 9 semaines après les injections intracérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 12 à 20 semaines.

3 075 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois injections dans l'œil et une lésion du nerf optique, au cours de chirurgies de cinq minutes. Toutes sont tuées pour que leurs tissus soient analysés, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que ces gestes peuvent enflammer l'œil ou l'endommager, et décrit en deux phrases l'ensemble des atteintes attendues. L'effectif de 3 075 animaux n'est rattaché à aucun calcul dans le RNT, qui mentionne seulement "l'utilisation de tests statistiques optimaux".

Objectifs

Les maladies du système nerveux représentent un défi sociétal majeur. En effet, le glaucome par exemple concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau ce qui induit une perte définitive de la vue. Une voie de guérison consiste à protéger les neurones de la mort et à faire repousser le nerf optique pour reformer le circuit qui traite l’information visuelle. Ce projet a pour but de comprendre l’impact de l’expression génique dans les cellules sur la neuroprotection et la régénération. Nous allons manipuler chez l’adulte l’expression de ces protéines pour induire la régénération et permettre le retour visuel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant la neuroprotection et/ou la régénération du système visuel pour combattre des maladies comme le glaucome où il faut de nouveau connecter l’œil au cerveau.

Procédures

Les souris peuvent subir jusqu'a 3 injections dans l’œil et une lésion du nerf optique. Les chirurgies durent 5 min.

Impact sur les animaux

- L’injection intraoculaire peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil -La lésion du nerf optique chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil

Devenir

les souris sont mises à mort car notre projet nécessite de récupérer les tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les expériences sur les souris sont essentielles et non remplaçables car i) les conséquences d’une lésion du système nerveux chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, et ii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents types de cellules qui ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle souris est reconnu pour la recherche sur la régénération du système nerveux central. Il est à noter que tous les candidats d'intérèts seront seront étudiés d’abord sur des cultures cellulaires.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - tester les candidats identifiés in vitro sur des cultures cellulaires. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seuls les candidats les plus pertinents in vitro seront utilisées chez la souris.

Raffinement

Les interventions sur l’œil sont des chirurgies et seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris recevront une injection d’un médicament antidouleur et antiinflammatoire adapté avant et apres l’opération . Après chaque anesthésie, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La régénération du système nerveux est un phénomènes multifactoriels qui permettent la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in vivo pertinent grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles tels que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les questions scientifiques que nous nous posons. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est mature. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.

Deux injections, une incision de la peau sous anesthésie, la pose d'un implant de titane recouvert d'un polymère, deux points de suture, puis une plaie inspectée chaque jour pendant trois jours et deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort. 27 souris femelles de huit semaines suivent ce parcours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour un prélèvement de tissu. Le porteur attend surtout des effets locaux, retard de cicatrisation, nécrose, infection, œdème ou hématome, et indique avoir réduit les groupes de cinq à trois animaux au vu de l'homogénéité des résultats antérieurs. Le choix de l'espèce vient d'une commande, le RNT précisant que "la demande de l'industriel a porté sur l'utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines".

Objectifs

Les infections bactériennes associées à la présence d’un biofilm représentent l'une des complications les plus graves suite à l'implantation de dispositifs médicaux. En particulier, les infections sur prothèse orthopédique sont particulièrement redoutées en clinique car elles sont associées à des échecs thérapeutiques et une morbi-mortalité importante. En effet, le biofilm qui recouvre ces prothèses est une matrice composée d’exopolysaccharides et de bactéries en dormance, présentant une sensibilité réduite aux antibiotiques et une faible accessibilité mécanique, ce qui donne lieu à des infections chroniques, extrêmement difficiles à combattre. Ainsi, l’inhibition de la formation de biofilm est un élément clé de la prévention des infections ostéoarticulaires sur matériel. Dans ce cadre, différents matériaux constituant les prothèses et présentant des caractéristiques antibactériennes sont actuellement à l’étude. Plusieurs polymères ont déjà montré des résultats intéressants in vitro. Toutefois, des essais doivent maintenant être conduits chez l’animal pour en vérifier la tolérance locale (et par la suite l’activité antibactérienne, en fonction des résultats obtenus). L’objectif du présent projet vise donc à évaluer la tolérance locale d’implants en titane, recouverts de différents polymères antibactériens, chez la souris, après implantation sous-cutanée.

Bénéfices attendus

A long terme, le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir développer un matériel innovant, permettant de d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme (ex : dispositifs médicaux ou prothèses). Avant cela, il est nécessaire d’en vérifier l’innocuité. Aussi, à court terme, le bénéfice attendu est de pouvoir sélectionner un ou plusieurs polymères antibactériens n’ayant pas de toxicité chez la souris parmi plusieurs candidats.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Deux injections (durant 2 secondes chacune) avant le geste chirurgical - Incision cutanée et suture sous anesthésie fixe

Impact sur les animaux

S’agissant d’un matériel étranger implanté en sous-cutané, les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaire (retard de cicatrisation, nécrose ou infection au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire). Les implants en titane sont déjà largement utilisés en pratique clinique et sont parfaitement tolérés. L’atteinte tissulaire chez les animaux serait davantage due au polymère recouvrant le titane mais les essais in vitro ne montrent pas de toxicité particulière de ces différents polymères. Par ailleurs, des essais similaires ont déjà été réalisés (implant titane recouverts d’autres polymères) et aucun effet indésirable n’a été enregistré.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux (27). Un prélèvement tissulaire sera réalisé post-mortem.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité des différents polymères de cette étude a déjà fait l’objet d’investigations menées in vitro sur des modèles cellulaires. Également, l’environnement complexe (tissu sous-cutané, cellules immunitaires …) est difficilement modélisable dans un autre système que le modèle animal. Aussi, l’utilisation du modèle animal est requise.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé pour établir la preuve de concept et discriminer rapidement un échantillon relevant de polymères. Les travaux précédents sur un modèle similaire avait requis l’utilisation de 5 animaux par groupe ; les résultats de l’analyse histopathologique ont montré une très bonne homogénéité et de ce fait, il a été décidé de n’utiliser que 3 animaux par groupe dans cette nouvelle étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Lors de la mise en place de l’implant, les souris recevront une analgésie de palier 2 et une anesthésie fixe. Après l’incision, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant du début de la chirurgie jusqu’à leur réveil. La plaie sera observée quotidiennement et désinfectée sur les 3j suivant la chirurgie puis 2 fois par semaine jusqu’à la mise à mort. Nos expériences précédentes nous informent que les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Toutefois, une grille de score nous permet de suivre individuellement chaque animal et d’établir un point limite défini par un score égal ou supérieur à 8.

Choix des espèces

Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris femelle âgée de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 22g (+/- 2g) et un système immunitaire mature. Également, dans un souci de comparaison avec les résultats antérieurs d’une autre étude, la souris sera choisie comme modèle dans cette étude.

Les expérimentateurs excluent de l'étude et mettent à mort tout animal dont l'état ne s'améliore pas, selon une grille de score prévue pour chaque procédure. 2 000 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à la fin pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines et pendant une quarantaine de semaines, elles reçoivent un régime hypercalorique et des boissons au fructose qui les rendent obèses, diabétiques et porteuses d'une stéatose hépatique, avec une à deux administrations de composés par jour, des jeûnes de six heures, une épilation sous anesthésie pour l'échocardiographie et jusqu'à trente semaines d'hébergement seule en cage. La finalité déclarée est de disposer de modèles reproductibles, utilisables ensuite pour tester des candidats thérapeutiques contre l'obésité et la stéatose.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possible. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (1 fois, durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement (max 3 fois). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes (1 fois). Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique (3 fois).

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère (quelques minutes) . Pour pouvoir relever la consommation alimentaire et hydrique, nous pourrons être amené à héberger les souris de façon individuelle pendant une partie ou toute la durée du projet (jusqu'à 30 semaines). Les souris seront stressées par cet hébergement, même si elles voient et entendent leur congénères. Pour palier le stress engendré, du sur-enrichissement (petits tunnels suspendus, boule de bois notamment) sera ajouté dans les cages et le personnel est formé à l'approche délicate des animaux, aux gratouilles lors des préhensions. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h. Lors des mesures de composition corporelle, l'animal peut ressentir un stress léger modéré , cela dure environ 2 minutes.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Pour les animaux immunodéficients, nous mettrons en place une zone dédiée et un process clair pour garantir leur statut sanitaire. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique pour chaque procédure est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et le mettront à mort. Les prélèvements de sang seront fait sous couverture analgésique.

Choix des espèces

Les souris sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques et des comorbidités associées. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.