Souris

63 souris privées de système immunitaire fonctionnel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées, puis reçoivent sans anesthésie une injection intraveineuse de cellules sanguines humaines, avant jusqu'à quatre anesthésies générales de quinze à trente minutes pour le suivi par imagerie. Le porteur attend une maladie du greffon contre l'hôte atteignant la peau, le tube digestif et le foie, une perte de poids progressive sur quatre à six semaines, une leucémie envahissant la rate, le foie et les ganglions, et des inflammations de la muqueuse buccale après l'irradiation. Il affirme qu'aucune simulation informatique ne reproduit ces interactions, que le modèle murin est "le seul modèle validé" et qu'une étude préclinique chez la souris est "indispensable" au dépôt du dossier auprès de l'agence du médicament.

Objectifs

La greffe de cellules sanguines issues d'un donneur volontaire sain est considérée comme le seul traitement permettant d’obtenir la guérison de certains cancers du sang chez l'Homme. La greffe permet que le système immunitaire du donneur reconnaisse comme étrangères les cellules cancéreuses du receveur et les tue : c’est ce qu’on appelle l’effet anti- tumoral (ou anti-leucémique) du greffon. Toutefois, les cellules du système immunitaire du donneur sont incapables de faire la différence entre une cellule cancéreuse et une cellule saine du receveur. L’attaque des cellules saines du receveur par le système immunitaire du donneur s’appelle la maladie du greffon contre l’hôte. Une stratégie prometteuse qui permettrait de moduler la maladie du greffon contre l’hôte sans altérer l’effet l’effet anti- tumoral du greffon est la thérapie cellulaire, notamment avec les cellules myéloïdes régulatrices (MDSCs). Notre objectif est de développer un médicament de thérapie innovante pour moduler les conflits hôtes/greffon dans le contexte de la transplantation de cellules sanguines à partir d’un donneur volontaire sain. Nous avons développé une méthode pour obtenir rapidement des "MDSCs" obtenues à partir d’un échantillon de greffon de donneur sain, conduisant au dépot d'un brevet. Précedemment, nous avons identifié la dose injectée minimale pour obtenir une diminution de l'incidence et de la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte dans un modèle pré-clinique murin. L'objectif de ce projet est triple 1/Reproductibilité de l'efficacité des MDSCs injectées au moment de la transplantation, en injectant des MDSCs issues de 3 lots différents de production. 2/L'évaluation de la dispertion des cellules dans les organes cibles et l'infiltration/différenciation des cellules injectées dans ces organes. 3/ L'absence d'effet néfaste de la thérapie notamment de l'absence de favorisation de cellules leucémiques. Il s’agit d’un projet multisite dans deux EU différents.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus à moyen terme de ce projet sont de déposer un dossier technique complet (dossier non clinique) auprès de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) afin de proposer un jour notre thérapie cellulaire chez l’Homme. Le projet va permettre de 1/ de confirmer chez l'animal l'efficacité du produit de thérapie cellulaire. 2/Etudier la répartition tissulaire des cellules après l'injection. 3/ Vérifier l'absence d'aggravation de la leucémie (leucémie, principale indication actuelle en clinique pour la greffe de cellules sanguines humaines à partir d'un donneur sain). A plus long terme, si ce produit de thérapie cellulaire est efficace et peu toxique dans la greffe de cellules sanguines, il pourrait s'étendre à d'autres applications comme la transplantation d'organes solides pour moduler les conflits hôte/greffon.

Procédures

-Une irradiation faible dose, de chaque animal pour 63 souris réalisée une seule fois (durée d'environ 2 minutes sur une journée).: -Une injection intraveineuse sur animal conscient (non anesthésié) de cellules sanguines humaines, une seule fois en début d’expérience pour 63 souris (dure environ 5 secondes sur une journée). -Une anesthésie générale répétée (X4 maximum) pour 63 souris (anesthésie générale de 15 à 30 minutes maximum sur une journée). L'anesthésie générale est prévue soit 4 fois dans 1 semaine pour suivre par imagerie la dispertion et répartition tissulaire des cellules une fois par semaine (maximum 4 semaines) pour le suivi de la leucémie.

Impact sur les animaux

-la douleur légère induite par la piqure d’aiguille à l’injection des cellules (J0) -stress modéré lors de la procédure d'irradiation à faible dose, -Potentielles mais rares lésions d'inflammation de la muqueuse de la bouche après irradiation (pendant 3-5 jours) -Stress lié aux injections et aux anesthésies générales -Potentiels signes de maladie du greffon contre l’hôte (atteinte de la peau, du tube digestif et/ou du foie), avec une sévérité habituellement modérée. Les souris vont alors très progressivement (sur 4 à 6 semaines) perdre du poids et montrer des signes de fatigue et d’altération de l’état général. -Développement leucémique lent infiltrant la rate, le foie et les ganglions. Cette infiltration leucémique des organes est contrôlé par l'imagerie hebdomadaire basée sur la bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) qui permet d'arrêter l'expérimentation à un volume tumoral cible sans laisser se développer les symptômes terminaux de la leucémie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour confirmer les données cliniques et de bioluminescence (technique permettant de visualiser l'activité des cellules in vivo grâce à de la lumière produite par réaction chimique après injection d'une substance inoffensive) par des données microscopiques. Tâche1: prélèvement des organes cibles de la maladie du greffon contre l'hôte (peau, tube digestif, foie) pour analyse au microscope de la sévérité de la maladie développée. Tâche 2: prélèvement des organes cibles dans lesquels patrouillent les MDSCs pour observer par microscopie la localisation exacte et le devenir des MDSCs. Tâche 3: prélèvement des organes envahis par la leucémie pour explorer d'éventuels contacts cellulaires entre les cellules leucémiques et les MDSCs.

Remplacement

Nous avons optimisé in vitro nos connaisances sur le mécanisme d'action des MDSCs. Toutefois, pour proposer les MDSCs comme médicament de thérapie innovante chez l'Homme, une étude pré-clinique robuste dans un modèle murin est indispensable. En effet, dans les cancers liquides, aucune simulation informatique ("modèle in silico" )ne permet aujourd'hui de reproduire en laboratoire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules en thérapie. A ce jour, le seul modèle validé est le modèle murin.

Réduction

Nos études antérieures ont révélé un effet important de nos traitements, aboutissant à des différences significatives entre des groupes même avec un faible nombre d'animaux (n=3). Ainsi pour chaque tâche expérimentale, des groupes de taille minimale de trois animaux seront constitués.Des analyses statistiques seront réalisées pour interpréter les résultats. Afin de prendre en compte une viariabilité liée au donneur (variation d'efficacité d'un produit cellulaire en fonction du donneur humain d'origine), chaque tâche sera repétée trois fois avec des cellules issues de trois donneurs différents.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un secteur spécifique pour les animaux avec une déficience profonde de leur système immunitaire, en animalerie exempte d'organisme pathogène spécifique. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Les expérimentations d'imagerie seront atourées d'une anesthésie. Les points limites sont clairement identifiés : des signes généraux sur l'évaluation clinique de l'état général de la souris et le développement de signes cliniques de conflits hôte/greffon) et des signes spécifiques de chaque expérimentation ( suivi de la croissance tumorale), conduisant à un arbre décisionnel pour l'arrêt anticipé de la souffrance.

Choix des espèces

La modèle animal murin utilisé est un modèle mondialement reconnu pour étudier la greffe de cellules sanguines humaines. Ces souris n'ont pas de système immunitaire fonctionnel capable de rejeter des cellules sanguines de l'Homme (ce qui permet une étude à long terme des cellules sanguines humaines injectées). En revanche elles ont des cellules présentatrices d'antigènes qui peuvent activer les cellules sanguines humaines acceptées. Ainsi, ce modèle reproduit la maladie du greffon contre l'hôte couramment observé chez les patients greffés. On observe une réactivité des cellules sanguines humaines contre les organes cibles de la souris ( la peau, le tube digestif et le foie), ce qui mime ce qui est observé chez l'Homme. D'autre part, la greffe de cellules sanguines d'un donneur sain vers un patient est en général indiquée pour véhiculer un effet du greffon contre la leucémie. Or l'adjonction de lignées leucémiques humaines dans ce modèle de souris reproduit le contexte leucémique d'un patient. Notre projet vise à étudier l'administration d'un nouveau médicament (produit à partir de cellules du greffon du donneur) dans ce contexte de greffe de cellules sanguines. Nous devons étudier l'impact de ce nouveau médicament sur l'incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l'hôte et l'absence d'effet qui pourrait favoriser la leucémie. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe de cellules humaines est meilleure dans cette période de vie

Pour montrer que des particules de fer permettraient de baisser les doses des traitements contre la carence martiale, 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord privées de fer pendant six semaines jusqu'à l'installation d'une anémie, puis traitées pendant quatre semaines par voie orale ou sous-cutanée. Une goutte de sang est prélevée à l'aiguille dans leur queue deux fois par semaine pendant dix semaines. Les souris témoins restent anémiées sans traitement, avec la faiblesse musculaire et la baisse d'activité que le porteur décrit, et l'effectif de 144 animaux n'est appuyé par aucun calcul statistique, le porteur qualifiant l'étude d'exploratoire.

Objectifs

La carence en fer est le résultat de toute condition dans laquelle l’apport alimentaire en fer ne répond pas aux besoins de l’organisme. C’est un problème de santé publique touchant environ 1,5 milliards d’individus dans le monde, principalement les enfants ou les femmes enceintes, bien que les hommes soient également touchés. Le déficit en fer est responsable de multiples conséquences comme la fatigue chronique, les essoufflements, les palpitations, une tachycardie, un retard de développement psychomoteur, des défauts cognitifs, et une anémie. Les traitements actuels de la carence en fer sont essentiellement à base de fer ferreux par voir orale et nécessitent l’utilisation de doses importantes en fer car les sels ferreux sont faiblement absorbés (entre 10 à 15% de la dose ingérée). Ces fortes doses entrainent d’importants effets secondaires gastro-intestinaux. Dans ce projet, des petites particules contenant du fer seront utilisés pour réduire les doses de fer et engendrer moins d’effets secondaires dans un modèle de souris soumis à un régime carencé en fer pendant 6 semaines. Une fois l’anémie établie, les souris recevront, dans un premier temps, un traitement oral à base de petite particules contenant du fer ou de fer ferreux durant 4 semaines maximum. Dans un second temps, et seulement dans le cas d’une absence de résultats pour le traitement oral, d’autres souris recevront un traitement par voie sous-cutanée de petite particules contenant du fer ou de fer ferreux durant 4 semaines maximum.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait démontrer que le traitement à base de petites particules contenant du fer, mieux absorbé par l’organisme, permettra de réduire les doses en fer administrées. Ainsi, en clinique humaine, cela conduirait à réduire les effets secondaires, principalement intestinaux, en comparaison du traitement classique.

Procédures

Une ponction d’une goutte de sang (qq sec) à la queue est réalisée 2 fois par semaine par aiguille chez l'ensemble des souris pendant 10 semaines pour permettre de contrôler le paramètre sanguin hémoglobine et suivre l'évolution du bilan en fer.

Impact sur les animaux

Les souris carencées en fer ne recevant aucun traitement montreront une anémie modérée pouvant être responsable d’une faiblesse musculaire et d’une baisse de l’activité générale. Dans le cas des souris traitées par fer ferreux (médicament de référence à fortes doses), des effets secondaires principalement intestinaux (diarrhée, ou constipationavec possibilité d'apparition d'un bouchon anal dues respectivement à une inflammation des intestins ou au ralentissement du transit, variables en fonctions des individus) peuvent apparaître au cours du traitement (une grille de scoring a été déterminée pour évaluer de façon précises ces effets secondaires intestinaux). L'apparition d'un inconfort ou d'un stress lié au gavage, à l'injection quotidienne ou le prélèvement sanguin pourrait être observé.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, toutes les souris de l'étude seront anesthésiées et mises à mort dans le but de récupérer le sang et les organes pour des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.

Remplacement

En parallèle de ce projet, des analyses encore en cours sont réalisées sur des cellules hépatiques et intestinales humaines. Cependant, le projet porte sur la restauration physiologique du métabolisme du fer et l’amélioration des paramètres sanguins en fonction de la réponse au traitement. L’anémie est un syndrome global qui ne peut être étudié de façon complète que sur des animaux avec leur physiologie et les différents échanges inter-organes (principalement le lien sang, foie et moelle osseuse). C’est pourquoi, il est essentiel d'observer l'effet d'un traitement pharmacologique (dose et impact sur les effets secondaires intestinaux) sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris utilisées par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour une étude exploratoire. L’étude prévoit 6 souris par groupe avec 3 mâles et 3 femelles réparties, dans un premier temps, en 12 groupes d'études, soit un total de 72 souris destinées à l'étude dose-réponse par administration orale. Dans un second temps, et dans le cas où aucun effet par voie orale ne serait observé, 12 autres groupes, soit un total de 72 autres souris seront destinées à l’étude dose-réponse par administration sous-cutanée. Un maximum de 144 souris au total sera utilisé dans ce projet. Ce projet mettant en oeuvre une étude à viser exploratoire, aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Dès la réception des souris, une période d’acclimatation de 7 jours sur le site d’accueil sera respectée. Tout au long du déroulement des expérimentations, l’état clinique global des souris sera observée quotidiennement pour anticiper et éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable par la SBEA et permettant la mise en place de mesures pour diminuer ou supprimer la douleur des souris de l’étude. Une arbre décisionnel est mis en place de la cas d'observations de points limites liés (1) à l'anémie, (2) au traitement et/ou (3) à la perte de poids et ceci en allant de l'arrêt partiel du traitement, la diminution des doses administrées, à la programmation de la mise à mort de l'animal. Dans le cas des prélèvements sanguins, la queue sera préalablement désinfectée à la chlorhexidine 0,05 % pour limiter tout risque d’infection. Une anesthésie locale à lidocaïne liquide avec action rapide sera effectuée pour limiter la douleur liée à la piqure d’aiguille. Une attention particulière sera portée au site de prélèvement en veillant à changer de site de prélèvement (en allant de l’extrémité de la queue à la base). Un point de compression sera effectué ensuite pour stopper un éventuel écoulement sanguin. Une surveillance accrue de site de prélèvement sera effectuée les jours suivants.

Choix des espèces

La souris a été choisi pour cette étude pour sa disponibilité, sa facilité d’utilisation. Elles sont généralement utilisées dans le cas des carences nutritionnelles en fer permettant d’avoir des paramètres connus du métabolisme du fer de ces souris. Les souris de l’étude seront âgés de 6 semaines. La carence en fer nutritionnelle est un déficit observé à généralement à l’âge adulte. C’est pourquoi, la mise en place de la carence nutritionnelle et le traitement seront effectués chez des souris adultes.

4 500 souris vont être utilisées, chacune soumise jusqu'à trente-deux semaines de régime gras associé à un composé qui élève la pression artérielle, quarante heures en cage individuelle sans enrichissement et vingt-quatre heures en cage métabolique sur grille. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une à deux administrations par jour, des pompes implantées sous la peau au cours d'une chirurgie de dix à quinze minutes, trois prises de sang, des mises à jeun de six heures et des courses sur tapis roulant. Le porteur attend de ce modèle qu'il permette d'évaluer de futurs médicaments contre l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, et précise que les animaux seront traités avec les molécules de ses clients, aux doses que ceux-ci auront fixées.

Objectifs

Les désordres métaboliques (diabètes, obésité, ...) et le vieillissement augmentent le risque de maladies cardiovasculaires dont l’insuffisance cardiaque, qui touche 1 à 1,5 millions de Français. On distingue deux types d’insuffisance cardiaque. D’un point de vue étiologique et physiopathologique, les 2 formes d'insuffisance cardiaque sont très différentes. La forme à fraction d’éjection préservée (50 % des cas) est une maladie qui se manifeste de plusieurs façons et présente une physiopathologie complexe. À l’heure actuelle, le traitement de cette forme d’insuffisance cardiaque ne repose sur aucune recommandation solide. Jusqu’à il y a peu, il était d’usage d’appliquer aux patients les mêmes stratégies thérapeutiques que celles utilisées pour les patients souffrants d’une de l’autre forme d’insuffisance cardiaque. Parmi les facteurs de risque identifiés figurent : l’âge, le sexe féminin, les maladies métaboliques (diabète et obésité), l’hypertension, … Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie, il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie de cette maladie, en incluant une ou plusieurs comorbidités. Le développement de modèles prédictifs et robustes ainsi que leur utilisation en recherche pré-clinique permettront d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels.

Bénéfices attendus

Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine, donc présentant plusieurs comorbidités afin d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. L’ensemble des expériences effectuées ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouvelles cibles ou futurs médicaments. Les animaux seront traités avec les molécules de nos clients aux doses qu’ils auront déterminées.

Procédures

Pour induire une insuffisance cardiaque chez la souris, des régimes gras associés à un composé chimique augmentant la pression artérielle seront mis à disposition dans les cages d'hébergement (jusqu’à 32 semaines de procédure). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par voie : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié ou vigile. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 à 15 minutes sous couverture analgésique). Des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés (à 3 reprises pendant les 32 semaines). Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Pour les mesures de paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose pourront être effectués (des mesures répétées du taux de sucre dans le sang après administration de sucre). Les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux de la fonction cardiaque et vasculaire sous anesthésie gazeuse (20 minutes maximum). L’exploration de la fonction métabolique se fera sur animaux vigiles. Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement. Pour la fonction rénale, la mise en place d’un patch, nécessitera une courte anesthésie (moins de 10 minutes) puis sera effectuée sur animaux vigiles. La mesure des paramètres urinaires se fera en cage métabolique (24 heures). Au maximum, ces examens seront effectués à la fin de l’induction, au milieu et à la fin des traitements. Bien que non invasifs, ils requièrent pour la plupart une anesthésie gazeuse qui pourrait impacter les mesures. Ainsi, il aura 3 examens par semaine maximum. Au-delà, ils devront être distribués sur plusieurs semaines. Pour faire les échographies et fixer les patchs, nous devrons au préalable dépiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. En fin de procédure, les animaux seront soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course. Les mesures terminales nécessiteront la mise en place d’un cathéter dans la carotide au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil.

Impact sur les animaux

Le modèle induit progressivement une dysfonction cardiaque associée à d’autres comorbidités. Chez le rongeur, les effets indésirables se manifesteront sous différentes formes : comportementale (hyper ou hypoactivité, isolement, agressivité, hygiène), prises hydriques et alimentaires (poids et hydratation), aspect général (aspect du pelage, manque d’hygiène) ... Ces altérations du comportement seront détectées lors des visites quotidiennes. Les animaux seront nourris, au plus tôt à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet avec un régime enrichi en graisse pour une durée de 32 semaines. Cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer un inconfort. Les administrations (jusqu’à 12 semaines, 1 à 2 fois par jour) et les prélèvements de sang répétés peuvent engendrer un stress léger à modéré et une douleur légère (piqûre). Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques, bien que non invasives, nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires en cages métaboliques, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h générant un stress et un inconfort. Lors des tests de course sur tapis roulant, les animaux seront soumis à un stress et une douleur légère.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder à la collecte des organes et du sang pour l'évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans les organes cibles, paramètres métaboliques et de fonction rénale et cardiaque dans le sang...)

Remplacement

Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système intégré et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions cardiaques associées aux complications métaboliques, vasculaires et rénales ne peuvent être pleinement reproduites que dans un système in vivo pour le moment. Le remplacement par un animal d'une autre classe (comme le poisson zèbre) ne permettra pas une analyse aussi précise des mécanismes pathologiques à cause sa très petite taille et contrairement aux rongeurs il n’appartient pas aux espèces réglementaires pour le développement de nouveaux médicaments.

Réduction

Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux tout en prenant en compte la mortalité (environ 10%) et la variabilité interindividuelle lors du développement de la dysfonction (10% des animaux exclus après randomisation à la fin de l’induction). Ces estimations sont basées sur notre expérience, au sein de la société, des modèles induits par régime, des données bibliographiques et d’échanges avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal sur les paramètres cardiovasculaires, métaboliques et rénaux pour chaque animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Par ailleurs, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, anatomiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), une grille de score spécifique est mise en place. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Des mesures de la fonction cardiaque, vasculaire, rénale et métabolique peuvent être répétées sur un même animal (suivi longitudinal) en ayant recours à des techniques non invasives. Pour les mesures effectuées sur animaux vigiles (tapis de course/cage métabolique), une habituation au dispositif sera réalisée. Pour les procédures qui peuvent induire de la douleur chez l’animal une analgésie pré et per-opératoire est mise en place pour la prévenir et la réduire.

Choix des espèces

Les souris sont largement utilisées et caractérisées par la communauté scientifique afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles de maladies cardiovasculaires et cardio-métaboliques. Il est possible d’induire chez ces espèces des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe,, …). L’ensemble des procédures décrites dans le projet concerne des animaux sevrés (minimum 4 semaines). Si l’étude le requiert, les expérimentations pourront être réalisées sur des animaux plus âgés afin de considérer le vieillissement (comorbidité connue) comme les facteurs aggravants de la pathologie.

Une injection dans le vitré ou sous la rétine, parfois répétée trente jours plus tard, puis une imagerie de l'œil sous anesthésie et jusqu'à deux électrorétinogrammes de moins d'une heure : 2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une opacification possible de la cornée et des saignements dans l'œil quand un vaisseau est touché. Il s'agit de tester une thérapie génique neuroprotectrice contre les dégénérescences de la rétine, avec un taux de réussite d'injection annoncé entre 50 et 75 %, les souris mal injectées étant tuées sur place encore sous anesthésie. L'effectif de 2 000 souris sur cinq ans est présenté comme "ajustable" sans autre justification, et les tests comportementaux censés mesurer la vision ne sont pas nommés.

Objectifs

Certaines maladies des yeux provoquent la mort progressive des cellules sensibles à la lumière (appelées photorécepteurs) dans la rétine, ce qui entraîne une perte de la vision. Ces maladies, comme les rétinites pigmentaires, le glaucome ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), touchent des millions de personnes dans le monde. Leur fréquence augmente avec l’âge, et il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour la plupart d’entre elles. Notre projet vise à développer une nouvelle approche pour protéger les cellules de la rétine avant qu’elles ne meurent. Cette stratégie est dite "neuroprotectrice" : elle ne vise pas à remplacer les cellules perdues, mais à préserver celles qui sont encore vivantes. L’avantage est qu’elle pourrait s’appliquer à un grand nombre de patients, quel que soit le type exact de mutation génétique ou la cause précise de la maladie. Pour cela, nous utilisons une technique appelée thérapie génique. Elle consiste à introduire dans l’œil, grâce à un virus inoffensif (appelé AAV, pour adeno-associated virus), un gène protecteur qui aide les cellules à survivre. Ce gène a été identifié comme capable d’activer des mécanismes naturels de survie dans les cellules de la rétine. Le but de ce projet est de tester cette thérapie dans plusieurs modèles expérimentaux de maladies de la rétine, et de comprendre comment elle agit au niveau cellulaire.

Bénéfices attendus

Il existe peu de traitements pour les maladies de la rétine, et la plupart ne sont efficaces que pour certains patients selon leur mutation génétique. Notre projet vise à développer une thérapie génique applicable à un large nombre de cas, quel que soit le type de mutation. En testant cette approche dans plusieurs modèles, nous espérons poser les bases d’un futur traitement plus universel, avec à terme un développement clinique possible pour les patients.

Procédures

Une partie des animaux du projet recevrons une injection intravitréenne durant max 5 minutes et un certain nombre de ces animaux recevront une deuxième injection intravitréenne 30 jours plus tard. Une autre partie des animaux du projet recevrons une injection sous rétinienne durant 5 minutes max et un certain nombre de ces animaux recevront une injection intrapéritonéale 1 mois plus tard. Tous les animaux injectés subissent une imagerie de leurs yeux tant qu’ils sont toujours sous anesthésie pour vérifier la qualité des injections (10 minutes). Certains animaux subiront un Electroretinogramme (ERG) 2 fois à des âges différents sous anesthésie générale et locale pour une durée inférieure à 1h. Des tests comportementaux pour tester la vision seront également réalisé sur une partie des animaux vigiles. Ces tests durent entre 10 et 30 minutes et seront réalisés deux fois à quelques mois d’intervalle.

Impact sur les animaux

Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Les animaux peuvent présenter des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection si un vaisseau est accidentellement touché ce qui est rare.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés à la fin des procédures auxquelles ils sont associés ; leurs rétines permettront des analyses aux échelles tissulaires, cellulaires et moléculaires. Grâce à cette méthode, nous pourrons caractériser l’ensemble des effets du traitement sans augmenter le nombre d’animaux utilisés

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Enfin, les modèles animaux permettent d’étudier les réactions comportementales et électrophysiologiques au traitement, qui seront des informations cruciales pour poursuivre ultérieurement vers un essai clinique. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter un niveau d’information suffisant. L’existence de lignées de souris atteintes de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. De nombreux mutants comme la souris rd10 présentent des mécanismes moléculaires de dégénérescence similaires à ceux observés chez les patients humains. Travailler in vivo permettra de valider nos vecteurs, les modèles in vitro ne permettant pas d’observer la réponse des cellules dans leur environnement réel. Les techniques qui seront effectuées sont peu invasives et couramment utilisées en recherche ophtalmologique.

Réduction

Notre étude se déroule sur 5 ans, et comprend l’analyse de plusieurs modèles et vecteurs thérapeutiques. Ceci est important pour vérifier que notre stratégie thérapeutique va cibler le plus grand nombre de patients ainsi que pour comprendre le mécanisme d’action. Nous indiquons ici environ 2000 souris sur 5 ans pour réaliser toutes les expérimentations que nous pensons nécessaire, mais cela sera ajustable. Si un nombre d’individus correctement injectés pour obtenir les résultats statistiques souhaités est atteint nous arrêterons les injections. Le criblage in vitro des différentes isoformes ex vivo par milieu conditionné devrait permettre d’identifier rapidement au moins une isoforme d’intérêt. Le but est d’obtenir 15 à 20 yeux traités, en fonction des expérimentations. et pour chaque vecteur. Le taux de réussite d’injection (large détachement rétinien sans fuite de liquide dans le vitrée) pouvant varier entre 50% et 75%, nous prévoyons donc plus d’animaux que nécessaire. Nous ne garderons que les animaux correctement injectés dans au moins un œil. Les autres seront sacrifiés à la fin de l’injection, encore sous anesthésie. Chaque œil pouvant être analysé séparément, le nombre d’animaux est réduit. Nous commencerons par établir la dose de vecteurs à injecter sur les temps courts. Nous comparerons ensuite l’efficacité de nos différents produits de thérapie génique, pour ne réaliser les procédures chez ce modèle qu’avec celui sélectionné à la dose efficace. Les animaux subiront divers tests détaillés dans les procédures ci-après, très peu invasifs et quasiment indolores. Grâce à nos équipements, nous pourrons réaliser nos expériences à différents temps sur les mêmes animaux. Des tests statistiques seront réalisés. Finalement, si nous nous apercevons que le traitement n’est plus efficace à partir d’un certain temps, les temps restants supérieurs ne seront pas réalisés.

Raffinement

Durant l’injection dans l’oeil, une anesthésie locale sera effectuée. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur due à l’injection dans l’oeil, les animaux recevront de manière préventive un analgésique, par injection sous-cutanée à la suite de l’opération. Que ce soit durant l’élevage ou pendant les procédures, les animaux seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire.

Choix des espèces

L’existence de lignées de souris atteintes de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. De nombreux modeles murins de dégénérescence rétinienne sont des mutants spontanés apparus dans les colonies d’élevage au cours du temps. Le modèle murin de retinite pigmentaire utilisé correspond aux pathologies humaines d’intérêts pour notre étude, avec une mutation sur un gène conduisant à une dégénérescence des photorécepteurs. Travailler in vivo permettra de valider l’efficacité de nos vecteurs. Les modèles in vitro comme les organoïdes rétiniens ne permettent pas d’observer la réponse des cellules dans leur environnement réel (interaction avec l’épithélium pigmentaire rétinien, absence de vascularisation et de cellules immunitaires). De plus, les modèles murins sont nécessaires afin de tester l’efficacité du traitement en mesurant des réponses comportementales et électrophysiologiques. Les résultats précliniques in vivo sont également nécessaire d’un point de vue règlementaire si nous voulons conduire ce produit jusqu’à un essai clinique. Les techniques qui seront effectuées sont peu invasives et couramment utilisées en ophtalmologie chez l’homme. En ce qui concerne l’âge des animaux utilisés il est déterminé par l’âge d’apparition de la maladie et sur le fait que chez la souris les paupières s’ouvrent 14 jours après la naissance quand la rétine a fini de se développer. A ce stade l’œil a une taille correcte permettant l’injection des doses nécessaires.

Modifiées pour n'exprimer qu'un récepteur humain à la place du récepteur murin, 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales de côlon ou de pancréas sous anesthésie générale, puis des chimiothérapies une fois par semaine pendant trois semaines et jusqu'à cinq injections de la molécule testée. Les tumeurs peuvent gêner leurs mouvements et se nécroser, et les souris sont tuées quand la tumeur atteint une taille limite ou en cas de perte de poids. La molécule a déjà été administrée à des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques, où elle a été bien tolérée, mais le porteur indique qu'elle active le récepteur chez la souris alors qu'elle l'inhibe chez l'humain, ce qui le conduit à construire un modèle murin porteur du récepteur humain.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester l’efficacité de la combinaison thérapeutique de chimiothérapies et d’une molécule bloquant un récepteur humain et rechercher le mécanisme mis en jeu. Ce projet a comme origine un essai clinique de phase I réalisé avec cette molécule sur des patients porteurs de tumeurs solides métastatiques. Cette molécule s’est révélée être bien tolérée par les patients, ne pas présenter de toxicité et il y a eu stabilisation de la maladie pour certains des patients inclus. L’étude de l’effet anti-tumoral de cette molécule avait été réalisée dans des modèles de rongeurs, or il s’est avéré que cette molécule qui active le récepteur chez la souris, au contraire inhibe ce même récepteur chez l’Homme. Ce projet a donc comme but d’élucider le mécanisme anti-tumoral de cette molécule dans un modèle de souris exprimant le récepteur humain et non murin. Nous chercherons également à montrer l’intérêt d’associer cette molécule à des chimiothérapies pour augmenter l’efficacité anti-tumorale de cette thérapie. En effet, un nouvel essai clinique est en projet et inclura des patients porteurs de tumeurs coliques ou pancréatiques traitées par des chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Afin de pouvoir finaliser la mise en place d’un nouvel essai clinique chez les patients porteurs de cancers pancréatiques et coliques, il est nécessaire de déterminer l’efficacité thérapeutique de ces combinaisons dans ce modèle de souris exprimant uniquement un récepteur humain, ainsi que de comprendre le mécanisme mis en place. A l’issu de ce projet, l’essai pourra débuter et à terme nous comptons bien pouvoir proposer un nouveau type de traitement pour les patients atteints de ce type de tumeurs.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection des chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines - injection de la molécule, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum.

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales, ce qui peut provoquer un stress de quelques minutes une fois dans la chambre d’endormissement, un léger refroidissement, ainsi qu’un léger stress et des vacillements au moment du réveil. - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections répétées des traitements pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - La molécule est également utilisée à des doses déjà bien établies dans les modèles murins et induit un léger épisode fébrile qui ne devrait pas être présent dans ces souris humanisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur pourra être prélevée.

Remplacement

L’effet de la molécule combinée ou non à des chimiothérapies a déjà fait l’objet de nombreuses expériences in vitro en utilisant des cellules cancéreuses et immunitaires humaines, porteuses du récepteur humain. Cependant pour démontrer l’efficacité anti-tumorale de ces combinaisons, il est nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant l’ensemble des cellules présentes dans les tumeurs : cellules immunitaires, fibroblastes, vaisseaux sanguins… De plus, cette démonstration nécessite aussi que ces organismes présentent un récepteur humain d’où ce modèle de souris humanisées pour ce récepteur.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage. En cas de nécroses sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, un produit cicatrisant sera utilisé. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection de la molécule, les souris recevront 1 injection d’analgésique en sous-cutané toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Le fait que la molécule, ciblant le système immunitaire, a un mode d’action différent sur le récepteur humain de ce qui est retrouvé sur le récepteur murin nous oblige à utiliser un modèle de souris modifiées pour n’exprimer que le récepteur humain. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Des prélèvements dans l'os du tibia toutes les trois semaines, des prises de sang tous les vingt et un jours et des injections d'anticorps deux fois par semaine attendent 9 724 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le myélome leur est inoculé par injection de cellules tumorales murines ou humaines, et le RNT décrit ensuite des douleurs chroniques, des ulcérations, une anémie, une immunosuppression persistante et une mobilité qui se dégrade. L'objectif déclaré est d'évaluer des anticorps monoclonaux et bispécifiques avant des essais chez l'humain. Le porteur écrit néanmoins que ce protocole "vise à réduire l'utilisation d'animaux" et que les interventions "visent à minimiser la souffrance animale", alors que les 9 724 souris seront toutes tuées pour prélèvements post mortem.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le myélome multiple, en particulier à travers l'immunothérapie, afin d'augmenter l'efficacité des traitements actuels et, à terme, induire la guérison des patients à long terme. Cela inclut l'évaluation de l'activation des lymphocytes tueurs par l'administration d'anticorps monoclonaux, en testant ces approches sur des modèles murins de myélome. L'objectif est également de suivre le comportement des cellules immunitaires in vivo pour mieux comprendre leur rôle dans la lutte contre la tumeur et d'identifier des solutions thérapeutiques innovantes qui pourraient être validées avant des essais cliniques sur l'homme.

Bénéfices attendus

Ce projet offre des bénéfices multiples pour la recherche fondamentale et les traitements cliniques du myélome multiple, en répondant aux questions clés des immunothérapies et en optimisant leur efficacité. L’étude de l’action des anticorps monoclonaux ou bispécifiques et leur association avec des chimiothérapies classiques vise à surmonter les résistances observées chez certains patients et à augmenter les taux de réponse à long terme. Ces travaux permettront aussi d’identifier de nouvelles cibles immunologiques et d’approfondir notre compréhension des rôles de molécules spécifiques et des mécanismes d’action des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules NK dans le contexte tumoral, avec des implications directes pour les thérapies humaines. Les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) sont des cellules du système immunitaire capables de reconnaître et de détruire les cellules tumorales ou infectées, en libérant des substances cytotoxiques. De leur côté, les cellules NK (Natural Killer)sont des acteurs clés de l'immunité innée qui éliminent les cellules anormales sans nécessiter d’activation préalable par un antigène, jouant ainsi un rôle crucial dans la surveillance immunitaire contre le cancer. Grâce aux études croisées entre modèles humanisés et murins, ce projet permettra de relier directement les résultats aux thérapies appliquées en clinique, avec l’ambition d’élaborer des traitements plus ciblés, limitant les effets secondaires et adaptés au profil de chaque patient. En parallèle, ce protocole vise à réduire l'utilisation d’animaux en maximisant la collecte de données longitudinales, conformément aux exigences éthiques modernes. Enfin, en testant l'efficacité des combinaisons d’immunothérapie et de chimiothérapie, ce projet constituera une base solide de données précliniques pour accélérer la transition vers des essais cliniques, soutenant ainsi l'intégration de nouvelles approches dans le traitement du myélome multiple.

Procédures

Dans le cadre de ce protocole, les animaux subiront plusieurs interventions afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le myélome multiple. Voici les principales interventions : 1. Prélèvements sanguins : Réalisés tous les 21 jours. 2. Injections de traitements : Administration d’anticorps monoclonaux et anticorps bispécifiques Fréquence : deux fois par semaine, pendant 2 semaines max. 3. Injections de cellules tumorales: Pour induire le myélome, des lignées murines ou humaines sont injectées. 4. Prélèvements intra-osseux : Prélèvements intratibiaux toutes les 3 semaines pour évaluer la croissance tumorale. 5. Suivi de la croissance tumorale : Mesures fréquentes de la taille des tumeurs. 6. Analgésie et soins : Administration d'analgésique (20 min avant le prélèvement) pour soulager la douleur. Les animaux présentant des signes de souffrance seront euthanasiés. Ces interventions visent à minimiser la souffrance animale tout en assurant le suivi des traitements expérimentaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce protocole expérimental visant à évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le myélome multiple, les animaux sont susceptibles de présenter diverses nuisances, dont certaines peuvent s’inscrire dans la durée. Les prélèvements sanguins répétés, peuvent induire une anémie modérée et un stress physiologique cumulatif sur une période de plusieurs jours à plusieurs semaines. Les injections de cellules tumorales et les administrations de traitements sont susceptibles d'entraîner des effets secondaires systémiques prolongés, tels qu’une perte de poids progressive ou une immunosuppression persistante, pouvant affecter le bien-être sur le moyen terme. Les prélèvements intra-osseux, réalisés ponctuellement sous anesthésie, comportent un risque limité mais réel de douleur post-procédure ou de boitement temporaire, généralement de courte durée (24 à 72 heures), nécessitant une surveillance clinique ciblée. Le développement tumoral peut, quant à lui, s’accompagner de douleurs chroniques, d’ulcérations et d’une altération progressive de la mobilité, avec une intensification des signes cliniques au fil des jours, imposant des critères d’arrêt clairs et anticipés (CF grille de scoring) Enfin, la manipulation fréquente des animaux, associée aux contraintes environnementales liées aux procédures expérimentales, représente un facteur de stress chronique non négligeable, dont les effets peuvent s’accumuler tout au long de l’étude. Une surveillance rapprochée, associée à des mesures de raffinement (anesthésie, analgésie, période de récupération, limitation des interventions non essentielles), est mise en place afin de limiter au maximum la durée et l’intensité de ces nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélèvement post mortem.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans ce protocole n’intervient qu’après une phase approfondie d’études in vitro sur des modèles cellulaires. Ces recherches préliminaires ont permis de démontrer l’importance des facteurs étudiés dans la régulation des mécanismes biologiques liés au myélome multiple. Ces approches in vitro, incluant notamment des co-cultures cellulaires et des tests fonctionnels sur les récepteurs et les cytokines, permettent de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires en validant en amont les hypothèses expérimentales. Ainsi, les modèles murins ne sont utilisés que pour des validations finales indispensables, lorsque les systèmes cellulaires ne permettent plus de répondre aux questions scientifiques posées. Cette démarche s’inscrit pleinement dans le principe de remplacement des 3R.

Réduction

Le principe de Réduction, dans le cadre des 3R, vise à minimiser le nombre de souris utilisées tout en assurant la solidité scientifique des résultats. Dans ce protocole, une planification rigoureuse des expériences, appuyée par des analyses statistiques, permet de déterminer avec précision le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives, évitant ainsi toute expérimentation superflue. L’emploi de suivis longitudinaux, tels que des prélèvements sanguins ou intratibiaux répétés, permet d’optimiser la collecte d’informations sans accroître le nombre de sujets utilisés. Par ailleurs, le partage des données entre équipes de recherche et le recours à des modèles complémentaires, comme les systèmes in vitro ou les simulations informatiques, renforcent l’efficacité des études tout en limitant le recours aux animaux.

Raffinement

Le principe de raffinement est appliqué dans ce protocole pour assurer les meilleures conditions de bien-être animal tout au long de l’étude. Une procédure rigoureuse de suivi quotidien des souris est mise en place, permettant d’observer tout signe de stress ou de souffrance. En cas de douleur, des mesures adaptées, comme l’administration d’analgésiques, sont immédiatement appliquées pour limiter les effets indésirables des interventions. De plus, des techniques minimisant l’inconfort, comme l’utilisation de méthodes non invasives et des conditions de logement enrichies, contribuent à réduire le stress. Cette approche vise à respecter les exigences éthiques tout en maintenant la qualité scientifique des données obtenues.

Choix des espèces

Les modèles souris sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. Ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisées en clinique

Trois souris par groupe vont être utilisées en surnombre pour compenser un taux d'échec de 20 % à l'injection dans la veine de la queue, celles dont l'injection rate étant écartées et tuées aussitôt. Elles sont 70 en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome puis sont gardées quatorze jours pendant que les métastases se développent, avec une perte de poids, une cachexie et des difficultés respiratoires parmi les effets attendus. Le porteur indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le développement des métastases et l'intégrité des vaisseaux sanguins, et conclut que le projet "nécessite" d'observer l'"organisme entier".

Objectifs

Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Le projet est la suite d’un projet qui nous a permis de démontrer que le miR-155 est un nouveau facteur stimulant la croissance des vaisseaux sanguins mais qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. En particulier, nous avons établi qu’une exposition au miR-155 entraine une altération de la forme et de la structure des vaisseaux sanguins, notamment en fragilisant la paroi des vaisseaux et ayant pour conséquence de faciliter la formation de nouvelles ramifications vasculaires. Ces ramifications se font par bourgeonnement des cellules endothéliales qui tapissent la face interne des vaisseaux. Le miR-155 est classé comme un biomarqueur du cancer en raison de sa surproduction dans le microenvironnement tumoral de cancers solides (sein, poumon, foie). Dans notre projet nous émettons l’hypothèse qu’un excès de miR-155 d’origine tumorale conduirait à une perte d’intégrité et d’étanchéité des vaisseaux sanguins qui pourrait favoriser la dissémination des cellules tumorales et donc la formation de foyers métastatiques. Dans ce contexte nous souhaiterions déterminer la contribution du miR-155, synthétisé naturellement par des cellules de mélanome, au processus métastatique in vivo. Nous prévoyons d’utiliser un modèle de métastases chez la souris en réalisant une analyse macroscopique des foyers tumoraux pulmonaires complétée par des approches d’immunofluorescence afin d’évaluer l’intégrité des vaisseaux sanguins. En fonction des résultats obtenus, nous tenterons, dans un second temps, de préciser la spécificité et d’élucider le mécanisme de transfert du miR-155 produit par les cellules tumorales pour une action sur les cellules vasculaires.

Bénéfices attendus

Nous avons montré dans une étude précédente que le miR-155 favorise la formation de vaisseux sanguins mais il génère des vaisseaux anormaux et perméables ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Nous souhaiterions confirmer ces observations dans des souris adultes quand le réseau vasculaire est établi et mature. En particulier, nous souhaiterions déterminer si le miR-155 produit par les cellules tumorales circulantes induit des dommages vasculaires. Cette fragilisation de la paroi des vaisseaux par le miR-155, aurait pour conséquences de faciliter l’échappement des cellules tumorales circulantes et de favoriser le développement de foyers métastatiques. Ainsi, nous pourrions envisager des stratégies pour le cibler (cible thérapeutique) afin de préserver l’intégrité vasculaire et limiter l’apparition de métastases.

Procédures

Une injection de cellules tumorales par souris sera effectuée. Les analyses seront réalisées après 14 jours. Tous les animaux sont concernés par les procédures.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir des conséquences de l’injection de cellules tumorales et tout particulièrement au cours du développement des métastases durant 14 jours. Les effets indésirables et nuisances attendus dans ce modèle et qui seront particulièrement observés afin de déceler un mal-être chez ces animaux sont les suivants : - Perte de poids - Cachexie - Gêne/douleur - Difficulté respiratoires (métastases pulmonaires)

Devenir

14 jours après l’injection (procédure1) ou si un point limite est atteint, les animaux seront directement sacrifiés par du personnel formé et qualifié. Différents tissus seront prélevés pour analyses (ex. : poumons, foie, reins, aorte, yeux,... ) puis fixés pour des analyses macroscopiques et en histologie. En fonction des résultats obtenus sur les premiers animaux, la méthode de mise à mort prévue pourrait évoluer vers une méthode alternative (procédure 2) permettant de fixer profondément les tissus et ainsi faciliter nos analyses. Cette procédure sera elle aussi réalisée par un personnel qualifié.

Remplacement

Certains aspects du projet vont être réalisés in vitro sur des cellules vasculaires d’origine commerciale. En particulier, des co-cultures avec les lignées de cellules tumorales seront réalisées. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier le développement des métastases et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). Dans ce contexte, la réalisation du projet nécessite d’avoir recours à l’animal afin d’étudier des effets sur l'organisme entier qui ne sont pas approchables in vitro (ex. : formation de métastases, relations avec le système immunitaire à grande échelle, ...).

Réduction

Basé sur notre expérience et sur la littérature existante, nous devons prendre en compte que le taux d’échec pour les injections par la veine caudale chez la souris est de 20% en moyenne (causes d’échec : résistance à l’injection, bulles et qu’il existe une certaine variabilité intrinsèque au développement des métastases. Afin d'obtenir des études statistiques fiables, nous avons réalisé des analyses de puissance statistique. Suite à ces analyses, nous avons calculé que nous aurions besoin au minimum de 11 animaux utilisables par groupe d'étude lorsque nous utilisons le test statistique adéquat. De plus, pour pallier ce taux d’échec d’injection de 20%, nous tablons donc sur 14 animaux par groupe d'étude, soit 3 souris pouvant être écartées de l’étude en cas de problème d'injection. Par conséquent, 11 animaux par condition seront analysables statistiquement et ceci pour chacun des 5 groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d'animaux, les expériences en place sont étudiées afin de recueillir le maximum de données et d'échantillons biologiques. C'est la raison pour laquelle nous recueillerons les poumons (site privilégié pour la formation de métastases dans le cas du mélanome) et d’autres d'organes d’intérêt (ex. : foie, reins, aorte, yeux... ), lors du sacrifice des animaux. Ceux-ci seront utilisés aussi bien pour des études à l'échelle macroscopique (dénombrement des foyers métastatiques) que microscopique (histologie). Des morceaux de tissus seront aussi congelés pour des analyses transcriptomiques et protéiques, a posteriori.

Raffinement

L’élevage est supervisé par le personnel compétent de l’animalerie. L’hébergement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate ou polysulfone. Afin de réduire le stress des animaux, une phase d'habituation sera mise en place en cinq séances sur deux semaines avant le début de la procédure. Cette période permettra de les familiariser progressivement au déplacement vers la salle d'expérimentation ainsi qu'à la manipulation. Concernant les problèmes inhérents aux injections, tous les animaux dont l’injection n’aura pas été maitrisée seront écartés de l’étude et immédiatement sacrifiés par du personnel qualifié pour ne prendre aucun risque. Les injections seront réalisées sous anesthésie, induisant une analgésie modérée.

Choix des espèces

Dans la recherche en oncologie, la souris constitue un modèle pertinent qui présente l’avantage d’être très documenté d’un point de vue des protocoles développés par la communauté scientifique étudiant la croissance tumorale et le processus métastatique. L'étude de la formation de métastases pulmonaires dans les modèles de cancer peut s'effectuer par la formation de métastases provenant de la tumeur primaire et nécessite donc une implantation de cellules dans un organe. Cependant, en se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait qu’une injection de cellules tumorales chez la souris constitue un procédé plus rapide, plus efficace en termes de formation de métastases, et moins sévère du point de vue chirurgical, en vue d'étudier ce processus. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 7-8 semaines minimum. En dessous de cet âge, les animaux ne sont pas assez matures. En particulier, les poumons et le système vasculaire ne sont pas complétement développés, ce qui pourrait interférer avec nos résultats car nous souhaitons étudier l’effet du miR-155 sur les vaisseaux matures.