Souris
Etude de la représentation neuronale et l’effet comportemental de la manipulation respiratoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à la fin du protocole pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées dans leur cerveau, 455 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies, la seconde durant de deux à quatre heures et demie, puis des séances d'enregistrement en contention pouvant atteindre trois heures par jour pendant une semaine. Une partie d'entre elles reçoit jusqu'à sept administrations de molécules anxiogènes ou panicogènes utilisées en psychiatrie, pendant que leur rythme respiratoire est manipulé, ce que le porteur décrit comme une physiologie inhabituelle source de stress. L'effectif tient en partie à un choix de méthode assumé dans le RNT, où la puissance statistique repose sur le nombre de neurones enregistrés plutôt que sur le nombre d'animaux.
Objectifs
La perception que nous avons de notre rythme respiratoire peut réguler nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant, le rythme respiratoire est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception respiratoire. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement d’une méthode de manipulation du rythme respiratoire pour pouvoir étudier spécifiquement la perception de la respiration. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information respiratoire. Pendant les stimulations respiratoires, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations respiratoires. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information respiratoire. Nous nous intéressons au cortex car les études chez l’humain ont mis en évidence son implication dans les dérégulations de la percéption du corps liée à l’anxiété. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact de la respiration : la perception respiratoire, l’effet de la respiration sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information respiratoire. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme respiratoire sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension de l’impact de la respiration sur les émotions et certaines maladies psychiatriques.
Bénéfices attendus
La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier notre respiration, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive respiratoire ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive respiratoire en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment la respiration influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception respiratoire ? L’impact du contrôle de la respiration est très variables entre individus. Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies. La première chirurgie dure 1heure, la deuxième entre 2 et 4h30. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme respiratoire ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité respiratoire à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.
Réduction
Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.
Raffinement
Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Hébérgement : Les animaux sont hébergés à plusieurs dans des cages enrichis (dôme, coton). Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires
Choix des espèces
Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique (ayant une modification génétique qui nous permet de cibler des sous-types cellulaires) qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.
Caractérisation d’un modèle de souris développant la maladie de Steinert et développement d’une approche de thérapie génique à l’aide d’un Vecteur Associé à l’Adénovirus sur ce modèle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour mesurer si une thérapie génique injectée dans le sang atteint le muscle, le cœur et la respiration, 1 120 souris issues d'une lignée reproduisant la maladie de Steinert vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit un prélèvement de queue pour génotypage, une injection du vecteur viral, des prises de sang répétées, puis une série de mesures qui totalisent plus de deux heures par animal, dont une épilation du thorax pour l'échographie cardiaque et la pose d'électrodes transcutanées. Le porteur signale un risque de blessures aux griffes lors du test d'agrippement et des irritations douloureuses après l'épilation. Une partie des souris nées de ces croisements n'a pas le génotype recherché, et le RNT indique qu'elles seront mises à mort sans jamais entrer dans l'expérience.
Objectifs
La Dystrophie Myotonique de type 1 ou maladie de Steinert est une maladie génétique rare sans traitement affectant tous les organes, mais caractérisée principalement par un problème de décontraction des muscles. Elle est causée par la perte d’activité d’une protéine, MBNL, dont le rôle est de régler les niveaux de dizaines de gènes. Son inactivation a donc des conséquences très importantes sur tous les organes (muscle, cœur, appareil respiratoire) et les patients les plus sévèrement atteints meurent prématurément des défaillances de ces organes. Des études réalisées sur des modèles cellulaires ou par injections locales dans des modèles de souris reproduisant la maladie ont permis de montrer que l’injection d’un traitement réactivant MBNL corrige les défauts de décontraction des cellules musculaires. Afin de vérifier l’efficacité du traitement au niveau du corps entier et de pouvoir traiter des patients humains, notre projet a pour objectif de tester l’efficacité du traitement donné par injection intraveineuse dans un modèle murin de la maladie. Cette approche devrait permettre au traitement d’atteindre tous les organes touchés et de corriger les défauts essentiels mortels (notamment les problèmes cardiaques et respiratoires). Dans un premier temps, le modèle murin de DM1 sera mis en reproduction et caractérisé au niveau des fonctions musculaire, cardiaque et respiratoire. Ensuite, deux études de recherche de la dose médicamenteuse seront réalisées : la première étude sera réalisée sur un temps court afin de déterminer la dose efficace, puis une seconde étude plus longue permettra de vérifier la persistance du traitement dans le temps.
Bénéfices attendus
La caractérisation du modèle de souris reproduisant la maladie de Steinert permettra de connaitre les symptômes, notamment au niveau des fonctions musculaires et cardiorespiratoires. Cette étude est nécessaire pour faire les meilleurs choix de tests et optimiser les temps de traitements et d’arrêt de l’étude thérapeutique qui sera faite dans un second temps. L’étude d’efficacité thérapeutique du traitement réactivant MBNL permettra de déterminer la meilleure dose pour le traitement de thérapie génique, ce qui servira à transposer la dose aux futurs essais cliniques qui seront réalisés chez les patients.
Procédures
Afin d’identifier le fond génétique de l’animal, un prélèvement d’un bout de queue sera réalisé sur chaque animal. En cas de doute sur l’échantillon, un deuxième prélèvement sera réalisé à l’oreille au cas par cas. Chacun de ces gestes ne durera en moyenne pas plus d’une minute. Les molécules thérapeutiques (virus non pathogènes transportant le médicament) seront délivrées par une injection unique sur souris éveillée (durée moyenne 2 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés au cours du temps sur souris éveillé (durée moyenne 2 minutes) ou anesthésiée (10 minutes maximum avec l’anesthésie). Les souris seront soumises à des tests permettant de mesurer la fonction de différents organes : mesure de la force musculaire et de la myotonie (durée moyenne 1 heure), mesure de l’activité électrique du cœur (durée moyenne 30 min), mesure de l’activité électrique du muscle (durée moyenne 15 min), mesure de la fonction cardiaque (durée moyenne 20 min), mesure de la fonction respiratoire (durée moyenne 30 min), mesure d’activité globale (durée moyenne 15min).
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses des produits thérapeutiques, ce qui pourrait entrainer un stress et une douleur légère et passagère due à l’injection. Une douleur légère et passagère locale pourrait être ressentie au moment du prélèvement du petit morceau de queue réalisé à des fins de génotypage, ainsi qu’au moment des prélèvement de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire ou des irritations accompagnées de douleurs localisés pourraient être causées par l’épilation nécessaire pour pratiquer les échocardiographies, par la pose d’électrodes transcutanées au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle (ENMG) ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire sur animal éveillé (pinch test, test d’agrippement) notamment si l’animal présente une blessure au bas du dos (pinch test) ou au niveau des griffes ou des pattes (test d’agrippement). L’ensemble de ces nuisances constitue pour l’animal un niveau global de contrainte léger à modérée.
Devenir
Les animaux sans génotype d’intérêt issue de la procedure de la caractérisation genetique seront mises à mort. Les animaux, avec génotype d’intérêt, utilisés pour la caractérisation du modèle et les études de recherche de la dose du produit thérapeutique seront euthanasiés à la fin du protocole pour récolter les tissus et les organes pour les analyses moléculaires, hématologique et histologique.
Remplacement
La maladie de Steinert est causée par la perte de fonction d’une protéine, MBNL, qui entraine des défauts dans les fonctions de nombreux organes, donc le cœur et la fonction respiratoire. Notre projet consiste à mesurer l'efficacité d’un médicament permettant d’activer à nouveau la protéine MBNL et de corriger ces pertes de fonction. Ces évaluations ne peuvent pas être réalisées dans des modèles de cellules car il est impossible de mimer les symptômes de la maladie dans ces modèles (type perte de la locomotion ou atteinte des paramètres cardiaques). Il est également impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du médicament entre les différents organes. De plus, l’utilisation de notre médicament peut entrainer une réaction de défense immunitaire de l’organisme contre le traitement, réaction impossible à recréer en laboratoire à ce jour. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été réduit grâce à :1) le calcul par des tests statistiques des effectifs minimaux mais adéquats permettant une analyse fiable et une exploitation garantie des résultats (groupes de 8 souris) ; 2) l’analyse d’un maximum de paramètres chez chaque animal (plusieurs dizaines) et 3) l’obtention des souris non malades et malades en utilisant les mêmes croisements parentaux.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation avant les tests visant à mesurer le fonctionnement des muscles de la respiration. Lors de certains tests, il y a un risque exceptionnel de blessures aux griffes : dans ce cas, un traitement avec un désinfectant sera appliqué jusqu’à la guérison. Afin de contrôler la douleur et le stress de l’animal, certains tests seront réalisés sous anesthésie gazeuse ou sous anesthésie générale et un antidouleur sera administré avant et pendant les 48 heures qui suivront la fin des tests. Dans le cas d’animaux anesthésiés, les tests seront réalisés sur une plaque chauffante pour maintenir la température corporelle constante et quand nécessaire, une application de gel oculaire sera réalisée pour augmenter le confort des animaux anesthésiés. Une application de crème anti-irritation sera appliquée sur le thorax des animaux après l’épilation nécessaire pour la mesure du fonctionnement du cœur. Les sites d’insertion des aiguilles seront désinfectés et en cas de signes d’infections ou d’inflammation, un traitement anti-inflammatoire et/ou antibiotique sera administré dans l’eau des biberons. Tous les tests seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés une fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance. Les souris étant des animaux grégaires, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements médicamenteux administrés dans l’eau de biberon s’avéraient nécessaires : dans ce cas, la période d’isolement serait réduite au maximum.
Choix des espèces
La maladie de Steinert affecte le bon fonctionnement des muscles, du cœur et de la respiration. A ce jour, des modèles murins, drosophiles et poisson-zèbres portant cette maladie ont été décrits. De ces trois modèles, la souris est le modèle le plus utile, car il est le seul modèle de mammifère et il développe des symptômes similaires à ceux observés chez les patients (atteinte des muscles, du cœur et de la respiration). Il permettra donc de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la maladie. La caractérisation préalable du modèle entre les âges de 2 à 12 mois permettra de déterminer à quel moment la pathologie apparait et son évolution, ce qui permettra de bien choisir le temps de démarrage du traitement, afin de se rapprocher au plus juste des différentes conditions de traitement qui seront testées sur les malades humains.
Rôle des circuits cortico-pallidaux dans le développement des symptômes moteurs et non-moteurs chez le modèle murin de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une chirurgie crânienne de trente à quatre-vingt-dix minutes implante des fibres optiques dans le cerveau de 1 018 souris, dont une partie subit en plus une lésion destinée à reproduire la maladie de Parkinson. Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Entre les deux, elles enchaînent pendant trois à douze semaines des tests moteurs, cognitifs et émotionnels, l'un d'eux imposant une restriction alimentaire. Le porteur écrit que les animaux "ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l'anesthésie", tout en décrivant l'administration préopératoire d'un morphinique puissant, un anti-inflammatoire pendant au moins trois jours et trois semaines d'hébergement en pièce de post-chirurgie chauffée.
Objectifs
L’objectif du projet est de comprendre comment les dysfonctionnements les circuits neuronaux qui contrôlent la motricité volontaire contribuent au développement de la maladie de Parkinson. Nous utilisons une panoplie d'outils de pointes pour contrôler l’activité des circuits neuronaux avec la lumière chez le modèle souris et évaluer les effets bénéfiques potentiels de la restauration de l’activité sur l’expression des symptômes moteurs et non-moteurs de la maladie.
Bénéfices attendus
La stimulation électrique cérébrale profonde de certaines structures cérébrales qui contrôlent la motricité volontaire est aujourd’hui largement utilisée pour le traitement des symptômes moteurs de la maladie de Parkinson. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la physiopathologie de la maladie de Parkinson et pourrait aboutir au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques de modulation plus efficaces et mieux tolérées ciblant les symptômes moteurs et non-moteurs de la pathologie.
Procédures
Les lots d’animaux soumis à l’étude en condition normale seront soumis à 1) une chirurgie sous anesthésie générale profonde réalisée une seule fois (durée 30-90 min selon le type d’intervention) pour exprimer des protéines sensibles à la lumière et pour implantater des fibres optiques, 2) une batterie de tests comportementaux pour évaluer les effets de la manipulations des circuits neuronaux sur les fonctions motrices, cognitifs et émotionnelles (3-12 semaines d’analyse avec 1 à 5 jours séparant deux test comportementaux successifs durant 4-60 min chacun), 3) une restriction alimentaire temporaire lors d’un test cognitif de flexibilité comportementale et 4) une mise à mort par perfusion intracardiaque (5-6 min) pour mener des analyses cellulaires complémentaires post-mortem. Les lots d'animaux soumis à l’étude en condition lésionnelle, seront exposés aux mêmes interventions mais subiront lors de la procédure chirurgicale une lésion du circuit neuronal atteint dans la maladie de Parkinson.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues causées par les différents actes sur les animaux :douleur post opératoire minorée par des antalgiques, perte de poids et une hypoactivité locomotrice (cas des animaux parkinsoniens) et stress léger lié à la restriction alimentaire temporaire, la manipulation et l’exposition aux tests comportementaux.
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses post-mortem qui sont sont indispensables pour vérifier la qualité de la lésion et les localisations des fibres optiques au niveau des structures d’intérêt.
Remplacement
Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes physiopathologique complexes impliquant une dérégulation d’un vaste réseau de structures cérébrales nécessitant l'utilisation de modèle d'animaux pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La perte progressive des neurones induite par la lésion s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux du cortex et des structures qui sous-tendent le développement de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire d’évaluer l'impact de ces manipulations sur l’ensemble de ces réseaux. Ce type de recherche intégré et invasif ne peut pas être fait chez l’être humain et les cultures cellulaires ne peuvent y répondre.
Réduction
Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 1018 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs procédures (n= 10 à 16/groupe expérimental en fonction du type d’étude). Il repose sur l’utilisation d’une procédure lésionnelle et des tests comportementaux robuste et largement validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des données fiables. Cependant, l’effectif des groupes prévu pourra être réduit quand des effets robustes sont obtenus avec des petits groupes et il n’est pas nécessaire d’augmenter les effectifs comme prévu initialement.
Raffinement
La chirurgie pour modéliser la condition parkinsonienne et l’implantation des fibres optiques a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde et les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique est mise en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées, avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour cela, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car elles représentent le modèle expérimental de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques des maladies mentales. Le recours aux souris génétiquement modifiées est indispensable dans le contexte de ce projet à cause de l’absence d’outils pharmacologiques permettant de cibler sélectivement des sous-populations neurones spécifiques dans le cerveau. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux adultes âgés à partir de 10 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature
Évaluer les effets de traitements innovants dans un modèle de sepsis pulmonaire chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 98
980 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, 70 d'entre eux étant gardés vivants pour être réutilisés dans d'autres expériences et tous les autres tués pour prélever leurs organes. Les expérimentateurs leur inoculent un pneumocoque, parfois associé à un virus grippal, pour déclencher un sepsis pulmonaire. S'ensuivent jusqu'à deux injections par jour pendant 72 heures et des prises de sang allant jusqu'à 7,5 % du volume sanguin, 64 animaux subissant en plus une chirurgie sous anesthésie générale. Les atteintes attendues tiennent en trois lignes, isolement, démarche affaiblie, écoulements, perte de poids et chute de température corporelle, quand le bénéfice espéré tient dans une phrase au conditionnel sur un traitement qui "pourrait avoir un impact significatif".
Objectifs
Le sepsis est une maladie grave, causée par une réponse incontrôlée du système immunitaire à une infection. Elle fait 11 millions de victimes par an dans le monde, en particulier chez les jeunes enfants et les personnes âgées, dont le système immunitaire est plus fragile. Aujourd’hui, les traitements actuels visent à réduire l’inflammation et combattre l’infection. En collaboration avec une autre équipe de recherche, nous avons testé une nouvelle molécule prometteuse. Cette molécule réduit l’activation des macrophages, un type de cellule immunitaire, et améliore la survie de souris atteintes de sepsis. Cependant, les modèles précliniques utilisés ont leurs limites, en manquant de représentativité avec le sepsis humain, ou en étant invasif et difficiles à reproduire. Bien que cette molécule semble efficace, nous avons encore beaucoup à apprendre sur son fonctionnement global. Nous pensons qu’elle influence plusieurs aspects du système immunitaire et qu’il est essentiel de confirmer son efficacité dans un modèle plus proche du sepsis humain. Objectifs de l’étude: 1. Développer un modèle de sepsis pulmonaire: Comme la majorité des cas de sepsis pulmonaires sont causés par une bactérie (Streptococcus pneumoniae), souvent associée à des infections virales comme la grippe, nous infecterons des rongeurs avec ces agents. Cela nous permettra de vérifier si ces modèles reproduisent les symptômes des patients humains atteints de sepsis. 2. Tester la molécule dans ces conditions : Nous administrerons différentes doses pour identifier la dose optimale et étudier comment elle se distribue dans le corps par des techniques d’imagerie. Nous analyserons aussi la réponse immunitaire, notamment l’activité des cellules et des molécules responsables de l’inflammation. 3. Explorer en combinaison avec des corticoïdes : Les corticoïdes, souvent utilisés pour réduire l’inflammation, peuvent avoir des effets secondaires importants. En combinant ces deux traitements, nous espérons réduire ces inconvénients tout en améliorant l’efficacité du traitement. Nous mesurerons les mêmes paramètres pour évaluer les bénéfices de cette combinaison. En conclusion, cette recherche nous permettra de mieux comprendre les effets de la nouvelle molécule dans un modèle plus proche du sepsis humain. Ces avancées ouvriront potentiellement la voie à des essais cliniques et, à terme, à une utilisation thérapeutique, seule ou associée à d’autres traitements comme les corticoïdes.
Bénéfices attendus
Le sepsis provoque la majorité des admissions dans les unités de soins intensifs. Il se manifeste par une réponse inflammatoire généralisée due à une infection incontrôlée. Malgré les avancées médicales et l’application des directives internationales, les traitements actuels restent principalement symptomatiques, sans solution curative véritable. Dans le cadre de notre projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité d’un traitement curatif prometteur nouvellement synthétisé. Si nos résultats sont concluants, ce traitement pourrait avoir un impact significatif non seulement sur la santé humaine et vétérinaire.
Procédures
La plupart des animaux (plus de 90 %) seront soumis à des injections et des prélèvements de sang pratiqués sous anesthésie générale. Un animal subira un maximum de 2 injections par jours sur une durée de 72h, et les prélèvements ne dépasseront pas 7,5 % du volume sanguin de l’animal. Nous estimons à 64 le nombre d’animaux qui subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Celle-ci sera précédée d’une injection d’anti- douleur, et suivie par une ou plusieurs injections de traitement. Les animaux pourront subir également des prélèvements de sang dans les 72h qui suivent la chirurgie, dans la limite de 7,5 % du volume sanguin de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pour reproduire le sepsis présentent des changements de comportement. Ils ont tendance à s’isoler, montrent une faiblesse physique qui affecte leur démarche, et peuvent avoir des écoulements, comme un nez qui coule. On observe également une perte de poids et une baisse de leur température corporelle.
Devenir
La majorité des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de collecter les échantillons et mesurer les changements aux niveaux tissulaires, cellulaires ou moléculaires. Certains animaux pourront être gardés en vie, s’ils ont subi une procédure modérée ou légère et ne démontrent pas de signes pathologiques. Ils seront alors réutilisés.
Remplacement
Dans cette étude, l’utilisation d’animaux est nécessaire en raison de la complexité du sepsis, qui affecte plusieurs organes en même temps. Pour bien comprendre cette maladie, il est indispensable d’étudier ses effets sur un organisme entier. Par ailleurs, les résultats obtenus chez les rongeurs, lorsqu’ils sont cohérents entre différents modèles, reflètent généralement bien ce qui se passe chez l’Homme. Dans le cas où notre projet révèle certains mécanismes qui peuvent être étudiés sur cellules, nous remplacerons l’utilisation de modèles animaux par les cultures cellulaires.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes basés sur les travaux précédents menés dans notre laboratoire, ainsi que sur une analyse approfondie de la littérature scientifique sur cette maladie. Nous avons aussi optimisé les prélèvements sanguins et les échantillons de tissus (cœur, foie, reins, poumons, glandes surrénales, muscles, moelle épinière, et omentum) prélevés après l’euthanasie de chaque animal. De plus, nous avons effectué un test statistique appelé "test de supériorité" (avec une puissance de 90 % et un seuil d’erreur de 5 %) pour déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Enfin, les variations des données collectées seront analysées à l’aide d’une méthode statistique spécifique (analyse de variance à deux facteurs) pour évaluer les effets du modèle et du traitement.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Nous surveillerons régulièrement les rongeurs pour détecter toute douleur excessive, car cela pourrait fausser nos résultats. Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons cinq critères standardisés, chacun noté sur 4 points, permettant d’obtenir un score global sur 20 : • L’état physique, le comportement, et les sécrétions seront vérifiés visuellement. • Le poids sera suivi à l’aide d’une balance. • La température corporelle sera mesurée avec un thermomètre rectal adapté aux rongeurs. Les rongeurs seront placés dans des armoires ventilées, où la température et la pression seront contrôlées. Ils auront un accès permanent à l’eau, à la nourriture, ainsi qu’à du papier et du coton pour construire leur nid. Nous ajouterons également des éléments d’enrichissement pour encourager le jeu et l’activité. Étant des animaux sociaux, aucun rongeur ne sera isolé dans sa cage, sauf en cas d’agressivité ou si des soins particuliers sont nécessaires.
Choix des espèces
Depuis 40 ans, plus de 10 000 études ont été publiées sur le sepsis en utilisant des rongeurs comme modèle animal. Leur utilisation nous permet de mieux situer nos résultats dans un contexte scientifique global. Ces modèles de rongeurs ont été largement étudiés, et l’on connaît bien leur cycle de vie ainsi que leurs éventuels impacts sur les expérimentations. Les rongeurs sont compatibles avec un large éventail de techniques pour analyser différents paramètres et mécanismes, y compris ceux que nous utiliserons dans cette étude. Une étude future pourrait se concentrer sur les mécanismes physiopathologiques liés à l’administration de la supformine. L’utilisation de souris est donc recommandée, notamment pour faciliter de futures comparaisons avec des souris transgéniques. Enfin, le rat présente l’avantage de fournir un volume de sang suffisant pour réaliser plusieurs analyses, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires tout en limitant les différences entre individus Les souris seront âgées de quelques jours à 24 mois. Cette grande amplitude permettra de moduler le système immunitaire dès le plus jeune âge et d’évaluer les effets de nos traitements sur des souris âgées plus représentatives des patients touchés par le sepsis. Les rats mâles auront un poids compris entre 200 et 400 g et agés de 5 à 10 semaines lors de leur utilisation soit l’âge de leur maturité sexuelle pour cette espèce. La grande majorité des animaux (80-90%) seront des souris. Les rats (10-20%) ne seront employés que pour les études nécessitant un grand volume de sang, et ce afin de réduire le nombre d'animaux employés.
Evaluation d’une première génération de doubles analogues GLP-1/26RFa pour le traitement du diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
802 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune enchaînant des jeûnes de six heures, des incisions au bout de la queue et des séjours seule en cage de calorimétrie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un régime gras les rend obèses et hyperglycémiques avant de recevoir des analogues d'hormones digestives, une sonde télémétrique étant implantée sous anesthésie chez une partie d'entre elles au cours d'une chirurgie d'une heure. La mise à mort sert à prélever les organes pour l'histologie. Le porteur indique avoir écarté deux molécules sur cellules bêta-pancréatiques avant de passer à la souris, puis affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives non-animales appropriées" pour la suite.
Objectifs
Face au défi majeur que constitue la prise en charge de l’obésité et de ses nombreuses comorbidités, dont le diabète de type 2 (DT2), il devient crucial de développer des stratégies thérapeutiques innovantes et efficaces. Le diabète de type 2, largement associé à l’obésité, représente une véritable urgence de santé publique en raison de sa prévalence croissante. À ce jour, les traitements classiques ne permettent pas toujours un contrôle optimal de la maladie, soulignant ainsi la nécessité de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce contexte, l’émergence récente de molécules multi-agonistes, tels que les doubles agonistes et, plus récemment, les triples agonistes combinant les actions sur les récepteurs des incrétines ouvre de larges perspectives thérapeutiques. Ces nouvelles molécules permettent de cibler simultanément plusieurs voies métaboliques impliquées dans la régulation de la glycémie, de la sécrétion d'insuline et du métabolisme lipidique, en s’appuyant sur l’axe entéro-insulaire. Cette approche pluri-hormonale est ainsi particulièrement prometteuse pour améliorer la gestion du DT2, en optimisant la régulation métabolique. Plusieurs peptides aux propriétés métaboliques intéressantes ont été identifiés et étudiés. Parmi eux, un neuropeptide découvert pour ses effets incrétiniques, s’intègre parfaitement dans ce nouveau paradigme thérapeutique. En effet, il présente des effets bénéfiques sur la sécrétion d'insuline et la régulation de la glycémie, faisant de lui un candidat de choix pour être combiné à d’autres hormones dans le cadre de traitements pluri-hormonaux. Le projet s’inscrit pleinement dans cette dynamique et vise à concevoir, caractériser et évaluer, à la fois in vitro et in vivo, une première génération de molécules chimériques combinant les effets d'une incrétine traditionnelle et de cette nouvelle. L’objectif est de développer des molécules capables de potentialiser les effets thérapeutiques des agonistes actuels tout en explorant de nouvelles voies de régulation du métabolisme glucidique et lipidique, afin d'offrir une alternative prometteuse et plus efficace pour le traitement du diabète de type 2.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient permettre des avancées majeures dans les domaines de la recherche fondamentale et biomédicale, avec des répercussions importantes pour la compréhension et le traitement des maladies métaboliques. Tout d'abord, il s'agit de concevoir de nouveaux doubles analogues, qui combinent les actions de différentes hormones impliquées dans la régulation du métabolisme glucidique. Ces molécules innovantes feront l'objet d'une caractérisation approfondie des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels elles interviennent dans le maintien de l'homéostasie du glucose, tant dans des conditions normales que dans des contextes physiopathologiques. Une attention particulière sera portée à l'analyse de leur impact sur les cellules β-pancréatiques, les tissus cibles de l'insuline, ainsi que sur les mécanismes de signalisation associés à la sécrétion et à l'action de l'insuline. Ce volet permettra d'élucider comment ces analogues peuvent corriger les perturbations métaboliques observées dans des états pathologiques comme l’obésité et le diabète de type 2. Ensuite, en nous basant sur les résultats obtenus lors de ces investigations, nous envisageons de proposer ces nouveaux analogues comme molécules prometteuses pour le développement de traitements pharmacologiques innovants. En effet, l'identification de telles cibles ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques complexes comme l’obésité et le diabète de type 2. Ces traitements viseront non seulement à restaurer une régulation efficace de la glycémie, mais aussi à corriger d’autres déséquilibres métaboliques associés à ces pathologies, en améliorant possiblement la sensibilité à l'insuline, la gestion des lipides et la réduction de l'inflammation systémique. Ce projet permettra d’évaluer le rôle potentiel thérapeutique d'une nouvelle classe de molécules incrétinomimétiques, en contribuant à la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées pour les patients souffrant d’obésité et de diabète de type 2.
Procédures
Les animaux subiront diverses expérimentations et prélèvements, sous anesthésie ou en état de veille. Pour le suivi glycémique, des prélèvements sanguins seront effectués à l’extrémité de la queue. Une semaine de repos sera respectée entre chaque expérimentation pour la récupération sanguine. Une chirurgie d’une heure sous anesthésie permettra d’implanter une sonde télémétrique pour un suivi continu de la glycémie. Pour l’analyse tissulaire, les animaux seront placés sous anesthésie profonde en vue d’une chirurgie sans réveil. Enfin, pour le suivi métabolique, ils seront hébergés en cage de calorimétrie indirecte avant d’être regroupés avec leurs congénères.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Le traitement par le peptide seul n'a pas montré d'effets indésirables ou de nuisances chez la souris dans des études antérieures. Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Afin de suivre la glycémie, un implant télémétrique sera introduit au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par l’utilisation d‘analgésiques adaptés. Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun de 6h avant chaque test physiologique. Nuisances prévues : Perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux. Toujours pour suivre la glycémie, les animaux subiront une incision à l’extrémité de la queue. Nuisance prévue : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique. Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés en cage de calorimétrie indirecte afin d'évaluer les paramètres métaboliques. Nuisance prévue : isolement des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à morts afin de prélever les organes pour permettre une étude histologique.
Remplacement
Pour mieux comprendre la fonction des doubles analogues, nous caractérisons leurs effets en sélectionnant les deux molécules les plus prometteuses sur des lignées de cellules bêta-pancréatiques, ainsi que sur des lignées cellulaires préalablement transfectées avec les récepteurs d'intérêt. Cette méthode permet de réduire considérablement l'utilisation d'animaux dans les premières phases de l'étude. Toutefois, pour appréhender pleinement le rôle physiologique et physiopathologique de ces doubles analogues dans l'ensemble des systèmes de l'organisme, des études in vivo sont indispensables, car il n'existe pas d'alternatives non-animales appropriées à ce stade. Dans ce contexte, la grenouille a déjà été utilisée dans des recherches antérieures, ayant conduit à l'identification du peptide d'intérêt. Les études ultérieures menées chez les mammifères ont confirmé son rôle crucial dans la régulation du métabolisme énergétique et glucidique, ce qui en fait un candidat de choix pour un développement thérapeutique visant les maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2. Une approche physiologique complète ne peut être réalisée que grâce à des études sur des modèles mammifères, qui offrent la meilleure approximation des processus physiologiques humains. Ces modèles sont essentiels pour évaluer les effets des doubles analogues dans un contexte proche de la physiologie humaine et pour envisager leur potentiel en tant que traitement innovant contre le diabète et l’obésité.
Réduction
Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons entrepris une planification expérimentale en amont et avons réalisé des estimations de puissance statistiques. Ceci permet de réduire au plus juste le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant d’avoir la puissance statistique nécessaire à nos tests. En outre, cela permet d’éviter le double emploi et la réplication d’expériences. Ces calculs ont été réalisé avec EDA (Experimental Design Assistant), ils prennent en compte l’« effect size » prévu (estimé par nos précédentes études et adapté selon la significativité scientifique de la différence, c’est-à-dire la différence minimale ayant une conséquence scientifique significative), la déviation standard prenant en compte la variabilité inter-individuelle, le type de test statistique prévu, la puissance statistique et le risque alpha. Le design de nos expérimentations prévoit quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple) qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à minimum trois individus par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. Pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle des doubles analogues dans la régulation de l’homéostasie glucidique et de comprendre les mécanismes d’actions de ces peptides. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Etude de l’activité cérébrale chez la souris vigile modèle expérimental de la maladie de Parkinson (1/2).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées du cerveau dans un premier établissement puis descendues par monte-charge du quatrième au premier étage vers un second pour les enregistrements, 360 souris vont être utilisées dans ce volet initial, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre. La chirurgie dure une heure quinze à une heure trente, suivie de quatre tests moteurs de huit minutes et de trois jours d'apprentissage à quarante-cinq minutes par jour, la moitié des animaux recevant en plus une injection abdominale d'une molécule pharmacologique. Saignement intracérébral, douleurs aiguës après la pose des implants, infection, contention crânienne : le porteur liste les atteintes prévisibles sans les chiffrer. Le bénéfice annoncé tient à une meilleure compréhension de la connexion entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur, face à un déficit moteur induit avec perte de poids et comportements de rotation, avant la mise à mort des 360 souris pour analyse histologique.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie qui touche le cerveau et provoque des troubles du mouvement, comme des tremblements ou une raideur musculaire mais provoque aussi des troubles non-moteurs. Cette pathologie est caractérisée par la perte progressive de certains neurones dans une zone spécifique du cerveau appelée « substance noire », qui produisent une substance essentielle au bon fonctionnement du cerveau : la dopamine. Dans ce projet, nous nous intéressons à une autre région du cerveau très importante dans cette maladie : le noyau sous-thalamique. Ce noyau joue un rôle central dans la coordination des mouvements et pourrait être impliqué dans l’apparition des symptômes de la maladie de Parkinson. Cependantt, certaines connexions de ce noyau, notamment avec le cortex moteur (la zone qui contrôle les mouvements volontaires), sont encore mal connues. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment cette voie de communication fonctionne dans le contexte de la maladie de Parkinson. Pour cela, nous avons entrepris d’étudier l’activité des neurones du cortex moteur de souris atteintes de Parkinson, grâce à des techniques sophistiquées comme l’imagerie cérébrale en temps réel. Nous pourrons ainsi tester l’impact de la stimulation ou de l’inhibition de cette voie sur le fonctionnement du cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de ces circuits cérébraux dans la maladie, et à long terme, il pourrait aider à concevoir de nouveaux traitements plus précis et plus efficaces pour les patients atteints de Parkinson. Ce projet se déroule dans 2 établissements Utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la connectivité entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur, ce qui va contribuer significativement aux connaissances sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson.
Procédures
Chirurgie : (se déroulera dans l'établissement Utilisateur: EU1). sous - anésthésie générale, les 360 animaux du projet recevront une chirurgie au niveau du cerveau, durée moyenne : 1h15 à 1h30. Le reste des interventions se dérouleront dans l'établissement Utilisateur: EU2 (même bâtiment). Comportement: -Tous les animaux (n=360) recevront le test de comportement moteur , durée : 8 minutes (4 fois soit 2x avant la chirurgie et 2 x après la chirurgie). -Tous les animaux (n=360) recevront l’apprentissage de la tâche motrice pendant 3 jours soit 45 min par jour. Puis 180 souris réaliseront cette tâche pendant la séance d'imagerie (d’enregistrement de l’activité) (1 fois) et 180 la réaliseront 2 fois. - 180 animaux vont recevoir une injection abdominale d’une molécule pharmacologique et une injection du serum physiologique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle de la maladie de Parkinson, qui entraîne un déficit moteur caractérisé par une réduction de l’activité locomotrice, une perte de poids et des comportements de rotation. D'autres effets indésirables prévisibles peuvent inclure : • un risque de saignement intracérébral, • des douleurs aiguës post-chirurgicales, notamment liées à la pose d’implants, • un risque d’infection associé à l’intervention chirurgicale et à la présence de matériel implanté, • un stress à court terme induit par l’utilisation de la contention crânienne, le stress physiologique associé à l’anesthésie générale •la douleur liée aux injections abdominales.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l'expérimentation, soit 360 souris pour une analyse précise histologique afin de valider l'ensemble des résultats.
Remplacement
Le but du projet est de caractériser l’activité électrique des neurones pyramidaux du cortex moteur en lien avec le noyau sous-thalamique. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections dans le cerveau, afin de faire exprimer des protéines capables de moduler l’activité du de ce noyau, combinées aux enregistrements de l’activité électrique in vivo chez l’animal réalisant une tâche comportementale. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, le recours au modèle animal reste la seule alternative pour la réalisation de cette étude. Le recours au modèle transgénique pour répondre aux questions scientifiques très spécifiques nous conforte dans cette décision. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions nécessaires pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
La réalisation de ce projet dans son ensemble concernera des souris mâles et femelles. Au-delà de l’intérêt de comparer les effets obtenus chez les 2 sexes, ceci permet d’inclure tous les animaux transgéniques des portées produites pour ce projet afin d’éviter que des animaux de l’autre sexe soient euthanasiés inutilement. La qualité de nos procédures qui est basée sur des années d'expériences, ce qui nous permettra de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. La réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique qui tient compte de l’hétérogénéité inter-individuelle. Le nombre de souris utilisé dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe.
Raffinement
Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au long de l’expérimentation en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie (2 fois par jour y compris le WE) jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place de mesures conservatoires si besoin. Des points limites suffisamment précoces sont définis. Les animaux seront ainsi suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques. En plus, des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie et ce pendant 3 jours après la chirurgie et 15 jours pour les souris lésées, modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Le transport des animaux entre les 2 établissements utilisateurs dure 3 min environ (du 4° au 1er étage), il se fait par le monte-charge. Les souris sont transportées dans des cages opaques dédiées au transport interne avec litière et papier. Les groupes sociaux sont respectés pendant le transport.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central (cerveau et moelle épinièredes vertébrés). En effet, c'est un mammifère présentant un lien de parenté proche avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologiques neurologiques telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris à l'aide de neurotoxines, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. Enfin, les lignées transgéniques pour cibler des populations neuronales de cette étude n’existent que chez la souris, d’où le choix de travailler avec cette espèce. Les modèles utilisés doivent être réalisés à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le cerveau et la moelle épinière sont matures. D’où le choix de souris adultes à partir de 8 semaines.
Evaluation de l’efficacité prophylactique de candidats vaccins dans un modèle de sepsis à Klebsiella pneumoniae chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Surveillées toutes les quatre heures pour repérer le moment où le sepsis les fait basculer, 86 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent six administrations de vaccins candidats dans les cuisses, deux prises de sang sous anesthésie volatile, puis une injection de Klebsiella pneumoniae destinée à provoquer une septicémie. L'étude mesure la mortalité, ce qui peut laisser une souris seule dans sa cage jusqu'à quinze jours. Le porteur reconnaît ne pas connaître la tolérance des six vaccins produits et s'appuie sur une grille de score de douleur pour décider de l'arrêt.
Objectifs
S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae, responsable de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables de septicémie sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Plusieurs candidats vaccins ont déjà montré des résultats intéressants in vitro et in vivo. L’objectif du projet est d’affiner les résultats précédemment obtenus et qui ont permis de sélectionner un candidat. Ce vaccin a été optimisé et a servi de base dans la préparation de 5 autres vaccins afin d’induire une production d’anticorps permettant la prévention d’une infection septicémique à Klebsiella pneumoniae. A cette fin, un protocole d’immunisation sera testé chez la souris afin d’évaluer l’efficacité potentielle de ces 6 candidats vaccins sur la prévention du sepsis à K. pneumoniae ; Le développement de vaccins prophylactiques contre K. pneumoniae constitue une nouvelle stratégie thérapeutique à fort potentiel d'applications cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un ou plusieurs candidats vaccin contre une infection à K. pneumoniae. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces différentes solutions. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Une injection de bactéries de 3 secondes - 6 administrations de vaccins de 5 secondes - 2 prélèvements de sang de 15 secondes sous anesthésie volatile
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur : - Injection des bactéries : la nuisance principale sera liée ici au geste technique et à l’apparition du sepsis. - Pré-immunisation : les nuisances attendues seront liées à l’administration des différents vaccins dans la cuisse droite et gauche et au prélèvement sanguin. Ces souris seront ensuite infectées par les bactéries. Ici une phase de sepsis est également attendue chez certains animaux S’agissant d’une étude de suivi de mortalité, il se peut qu’un animal se retrouve seul dans sa cage (2 jours maximum dans la phase pilote et 15 jours au maximum dans la phase d’efficacité).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (86). Les animaux seront tous infectés et ne pourront donc pas être réutilisés.
Remplacement
L’évaluation de l’efficacité d’un candidat vaccin ne peut être réalisée sans le concours complexe d’un modèle animal. La reproduction des différentes étapes menant au sepsis ne peut être réalisée in vitro. Également, la production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. Aussi, il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.
Réduction
Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. 8 à 10 animaux par groupe seront afin d’obtenir une analyse statistique robuste pour évaluer l’efficacité ou non de ces différents traitements.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 8-10 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Des phases d’habituation ont été prévues. Ils seront suivis étroitement (toutes les 4h) durant les différentes phases de l’étude. Ce genre d’étude a déjà été réalisé au sein du laboratoire et nous permet d’avoir une bonne compréhension de l’infection et ainsi de prédire à quel moment l’animal est susceptible de montrer des signes de souffrance et donc d’augmenter la fréquence de surveillance en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Même si aucun effet toxique n’a été rapporté dans une étude précédente sur d’autres composés, la tolérance des nouveaux candidats vaccins produits n’est pas connue a priori et des critères d’interruption de l’étude supportés par une grille de score de douleur ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. L’administration des vaccins et le prélèvement se feront sous anesthésie volatile. Au cours de l’étude de suivi de mortalité, il se peut qu’un animal se retrouve seul dans sa cage. Dans ce cas, un enrichissement supplémentaire sera alors ajouté (igloo, jouet …). De plus, les animaux seront hébergés dans des cages transparentes afin que le contact visuel et auditif soit toujours maintenu pour limiter au maximum le stress de l’animal qui pourrait se retrouver seul dans sa cage.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point d’un modèle de sepsis à Klebsiella pneumoniae dans d’autres projets. Des souris mâles et femelles seront utilisés dans cette étude pour évaluer l’impact du paramètre genre sur la réponse vaccinale. Des souris de 5 semaines (+ 1 semaine de stabulation) seront nécessaires pour la phase de pré-immunisation afin que l’infection se fasse à l’âge de 11 semaines avec une système immunitaire mature. La phase pilote (sans pré-immunisation) demandera donc des souris de 10 semaines (+ 1 semaine de stabulation).
Implantation d’embryons dans des femelles porteuses pseudogestantes
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Assurer le statut sanitaire des lignées commandées par des utilisateurs extérieurs passe par 1 500 souris femelles, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Accouplées à des mâles vasectomisés pour être rendues pseudogestantes, elles subissent une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour qu'on leur implante des embryons, avec un risque d'infection au point d'incision et une douleur modérée. Le porteur ne décrit la procédure qu'en une phrase. Celles qui ne portent pas sont tuées, les autres le sont après le sevrage des souriceaux, et le porteur compte cette méthode comme une réduction du nombre d'animaux parce qu'elle évite de maintenir des lignées en accouplement permanent.
Objectifs
Ce projet vise à assurer la continuité et la qualité sanitaire des lignées de souris utilisées en recherche, par la mise en œuvre de deux prestations complémentaires :(1) la redérivation de lignées afin de les adapter au statut sanitaire exigé par notre zone d’hébergement, et (2) la reviviscence de lignées à partir d’embryons cryoconservés. Ces procédures impliquent toutes la réimplantation d’embryons dans des femelles pseudogestantes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à produire des souriceaux présentant des caractéristiques génétiques définies et un statut sanitaire contrôlé, indispensables à la réalisation de recherches biomédicales ou fondamentales de nos utilisateurs. Il repose sur deux prestations : la redérivation de lignées pour assainissement sanitaire, et la reviviscence de lignées à partir d’embryons cryoconservés. L’obtention d’animaux génétiquement modifiés permet de modéliser des pathologies humaines ou d’étudier des fonctions biologiques spécifiques, tandis que le maintien d’un haut niveau sanitaire garantit la fiabilité des résultats expérimentaux, la sécurité des installations et la conformité aux exigences réglementaires. 1. La redérivation de lignées, qui permet d’éliminer des agents pathogènes ou opportunistes pouvant compromettre les résultats expérimentaux, la santé des animaux ou la sécurité des installations. Cette opération est essentielle pour introduire ou maintenir des lignées dans des zones d’animalerie à statut sanitaire élevé. 2. La reviviscence de lignées à partir d’embryons cryoconservés, qui offre la possibilité de restaurer des lignées précieuses sans recourir à une reproduction continue. Elle répond également à des besoins ponctuels de recherche, tout en contribuant à la réduction du nombre d’animaux élevés sans usage immédiat.
Procédures
Les femelles subissent une chirurgie sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La chirurgie de ré-implantation peut entrainer une infection au point de chirurgie et une douleur modérée qui seront traités selon les recommandations du vétérinaire. Pour l infection la plaie sera néttoyée à la vetedine ou au chlorexyderm.
Devenir
les femelles ayant subi la chirurgie sont toutes mises à mort (soit si non gestation soit apres le sevrage des souriceaux)
Remplacement
Ce projet permet une prestation fournit à des utilisateurs ayant deja obtenu une DAP pour leur projet de recherche. Ils ont besoin soit de rederiver des animaux pour être conforme au statut sanitaire de la zone qui hebergera leurs animaux soit de revivifier leur lignée à partir d'embryons congelé. Cette prestation n'est atteignable qu'en reimplantant des embryons dans des femelles pseudogestantes. La transplantation d’embryons permet de garantir le statut sanitaire d’une zone de production tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Elle évite de maintenir des lignées en accouplement permanent et permet de produire un lot de souris à un moment donné, ce qui limite le nombre de portées nécessaires. Cette méthode contribue donc à une utilisation plus raisonnée des animaux, en accord avec les principes des 3R.
Réduction
La lecture des bouchons vaginaux permet de ne sélectionner que les femelles ayant effectivement été accouplées. Si aucune bouchon vaginal n'est observé, les femelles sont remises en accouplement.
Raffinement
Pour le moment les femelles sont accouplées avec des males vasectomisés et ensuite subissent une chirurgie. Les femelles pourront etre ré-implantées par voie basse. Cette technique est en cours de tests et de validation. L’efficacité de cette technqiues étant à confirmer, elle sera applicable uniquement aux modèles homozygotes et simple transgéniques. Pour faciliter la convalecence post-opératoire et reduire la douleur, la chirurgie est unilatérale. La réimplantation dans une seule corne utérine est aussi efficace qu’une réimplantation bilatérale. Chaque cage est enrichie avec des accessoires spécifiques tels qu'un igloo en plastique rouge, des bâtonnets de bois et du papier essuie-tout pour la construction de nids. Leur statut sanitaire (SOPF; sans opportuniste ni pathogène spécifique; pour cette zone) est vérifié trimestriellement. Les zootechniciens, sensibilisés aux diverses pathologies potentielles en élevage, prennent des mesures préventives pour éviter toute souffrance des animaux. Ils possèdent une expertise dans les gestes techniques et sont formés aux méthodes alternatives à la préhension par la queue. Des produits de soins sont disponibles et utilisés selon les recommandations du vétérinaire désigné. L’habituation des animaux à leur zootechnicien permet de diminuer le stress des animaux lié à la contention. Les personnels sont parfaitement formés à la technique chirurgicale qui, procédurée avec du matériel de chirurgie aiguisé et désinfecté, permet de limiter le stress et la douleur des animaux au maximum. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et l’analgésie contrôlées, sur tapis chauffant dans des conditions optimales d aseptie.
Choix des espèces
Les lignées hébergées au sein du service sont tous des modèles murins. Les procédures sont celles de prestations de services, les utilisateurs du service n’utilisent que le modèle murin. Les femelles utilisées sont au stade de maturation sexuelle (après 6 semaines en general dans notre cas).
Etude du rôle des cellules T résidentes mémoires du système immunitaire dans la tuberculose et développement de stratégies vaccinales et thérapeutiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 014 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 588 d'entre elles et sévère pour 1 426. Elles sont infectées par la bactérie de la tuberculose alors qu'elles sont éveillées, maintenues dans des tubes de contention pendant une nébulisation qui dure quarante à quarante-cinq minutes par groupe de vingt. Certaines reçoivent chaque jour pendant deux à trois semaines des molécules par gavage ou par voie intrapéritonéale, d'autres subissent une ouverture de la cage thoracique et restent jusqu'à cinq heures sous respiration artificielle, en hypothermie et déshydratation, sans être réveillées. Parmi les atteintes sévères, le porteur cite la perte de poids, la perte de pelage, l'isolement social et la difficulté à respirer, et conclut que le projet "nécessite" un "organisme entier" faute de culture cellulaire reproduisant ces interactions.
Objectifs
La tuberculose est l'une des maladies les plus meurtrières au monde, causant près de 1,5 millions de décès chaque année. Elle reste difficile à diagnostiquer et à suivre chez les patients, et il est encore compliqué de la prévenir par la vaccination ou de la traiter efficacement avec des médicaments. Même si l'on sait que le système immunitaire joue un rôle clé dans cette maladie, notre compréhension actuelle est encore limitée, ce qui complique les efforts pour améliorer le dépistage, le suivi et le traitement. Ce projet de recherche s'appuie sur des découvertes récentes qui montrent des différences dans les cellules immunitaires présentes dans les poumons de souris infectées par la tuberculose, selon qu'elles y sont plutôt sensibles ou plutôt résistantes. L'objectif est de tester de nouvelles approches, soit par des traitements qui renforcent le système immunitaire, soit par des vaccins, pour stimuler une réponse protectrice des cellules T (un type de cellules immunitaires) chez la souris. Plus précisément, le projet cherche à renforcer certaines cellules immunitaires, les cellules T « mémoires », qui pourraient jouer un rôle crucial dans la protection contre la tuberculose.
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet un gain de connaissances fondamentales concernant le rôle de cellules T mémoires du système immunitaire dans le contrôle de l'infection. A partir de ces travaux, nous espérons des retombées indirectes comme par exemple le fait de pouvoir exploiter ces connaissances en proposant de possibles nouvelles approches préventives ou thérapeutiques, et ce, à partir de l'identification de stratégies vaccinales et/ou de l'utilisation de molécules pharmacologiques favorisant la résolution de l’infection en favorisant l’action des cellules T mémoires du système immunitaire. Ces démarches s'inscrivent dans la perspective de l'Organisation Mondiale de la Santé de mettre fin à la tuberculose.
Procédures
Dans ce projet, les souris seront infectées par la bactérie responsable de la tuberculose ; ceci se produit sur des animaux vigiles par l’utilisation d’aérosol et se déroule en une fois en quelques minutes. Certaines souris recevront l’administration d’un vaccin prophylactique (une seule injection dans une étape qui dure quelques minutes et qui est réalisée chez l’animal endormi) et d’autres recevront l’administration répétée de molécules thérapeutiques, réalisée sur des animaux vigiles de façon répétée (au maximum une fois par jour) pendant 2 à 3 semaines. Certaines souris seulement infectées subiront une chirurgie au niveau de la cage thoracique (une seule fois sous anesthésie générale et pour une durée de 5 heures au maximum).
Impact sur les animaux
Pour les souris recevant la vaccination (procédure 2), un stress faible lié à l’injection et à l’anesthésie est attendu, depuis l’endormissement jusqu’à la vaccination, qui ne durera pas plus de trois minutes au total. Pour les souris recevant les anticorps ou molécules thérapeutiques (procédure 3 et 4), un stress léger est attendu pour les administrations qui se feront par voie intrapéritonéale ou par gavage. Pour les souris infectées par M. tuberculosis (procédures 1, 2, 3 et 4), les nuisances attendues sur les animaux seront engendrées suite à la nébulisation et à l'induction de la pathologie pulmonaire. Les nuisances liées à la nébulisation sont : un stress modéré depuis leur installation et leur désinstallation dans les tubes de contention. L’ensemble de la nébulisation durera entre 40 et 45 minutes pour une infection de 20 souris (la mise en place de toutes les souris dans les tubes de contention, le cycle de l’infection et le démontage des tubes de contention). Les nuisances sévères observées durant la période d’infection sont : la perte de poids ou de pelage, l’isolement social ainsi que la tachypnée ou la dyspnée. Pour l’imagerie intravitale (procédure 1), les souris subiront un stress faible lors de injections IV par voie retro-orbitale qui ne dureront pas plus que 10 secondes. L’anesthésie provoquera une hypothermie et une déshydratation chez la souris durant la procédure chirurgicale qui ne durera pas plus de 20 minutes. Une fois sous respiration artificielle, la souris subira les mêmes nuisances (hypothermie et déshydratation) lesquelles dureront pendant la phase d’acquisition au microscope ne dépassera pas une durée de cinq heures.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences car celles-ci sont réalisées dans un environnement infectieux et que le poumon doit être analysé comme point final.
Remplacement
Nous nous intéressons à l’impact des cellules T mémoires dans la tuberculose. Etant donné que les populations de lymphocytes d’intérêt sont assez rares, qu’elles sont pour certaines accessibles seulement dans les poumons et qu’il n'existe aucun modèle cellulaire ni de possibilité de culture ex vivo, nous devons utiliser un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclut les modèles multicellulaires du type "organoïde"). Une partie de l’étude porte sur le comportement des lymphocytes notamment leur dynamique de déplacement, leur localisation pulmonaire et leurs interactions avec les cellules infectées dans l’environnement pulmonaire. L’autre partie vise à mobiliser ces cellules sur le site infectieux dans un cadre de thérapies ciblant l’hôte ou de vaccinations. L’ensemble de ces événements sont étroitement liés à certains paramètres physiologiques tels que la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et le microenvironnement des poumons. Il n’existe aucun modèle cellulaire de culture ex vivo à ce jour qui recapitule cette complexité d’interactions. De ce fait, afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire et un tissu pulmonaire suffisamment proche de l’homme. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier telles les souris vivantes.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 2014 animaux sera utilisé. Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré trois étapes dans notre raisonnement. Tout d’abord, certaines étapes de nos projets pourront en effet être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des promesses offertes par les résultats. Nous possédons une forte expertise dans le domaine de la microscopie intravitale des poumons ce qui nous a fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Pour les thérapies ciblant l’hôte et la vaccination, nous disposons là aussi d’une forte expertise qui nous a permis de développer des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés. Finalement, l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille minimale des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Des tests statistiques seront utilisés sur des lots de 6 animaux par test.
Raffinement
Dans ce projet, plusieurs étapes peuvent causer de la douleur, du stress ou de l’inconfort aux animaux, et nous les prenons en compte pour minimiser ces effets : • Vaccination : Elle se fait sous anesthésie pour éviter la douleur. • Administration de substances : Nous privilégions des méthodes non douloureuses, comme les aérosols ou la prise d’eau, ou faiblement douloureuses comme certaines injections. • Injections spéciales : Elles sont réalisées sous anesthésie et avec un analgésique pour éviter toute douleur. • Suivi des souris infectées : Les souris sont surveillées quotidiennement pour repérer tout signe de souffrance. Si leur état se dégrade, elles sont mises à mort pour éviter toute souffrance inutile. • Chirurgie pour l'observation au microscope : Les souris reçoivent des anesthésiques et des analgésiques pour éviter la douleur, et leur confort est surveillé pendant toute la procédure. Elles ne sont pas réveillées après l'intervention. Ainsi, chaque étape est encadrée pour assurer le bien-être des animaux autant que possible.
Choix des espèces
Il existe plusieurs modèles animaux pour étudier la tuberculose, comme les singes, les poissons ou les rongeurs. Nous avons choisi d’utiliser des souris, car elles réagissent de manière similaire aux humains en termes de réponse immunitaire et de développement de la maladie. En particulier, certaines souris développent des lésions pulmonaires ressemblant à celles observées chez l’homme, ce qui permet une étude plus représentative. Les souris offrent aussi l’avantage de pouvoir utiliser des outils précis pour suivre les cellules du système immunitaire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris d’un groupe génétique commun, ce qui permet d’éviter des différences qui pourraient fausser les résultats. Pour ce projet, seules des souris adultes de 6 à 12 semaines seront utilisées, car leur système immunitaire est suffisamment développé à cet âge pour fournir des résultats pertinents.
Etude des circuits cerebraux en charge de l’orientation locomotrice et la navigation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les fibres optiques implantées dans le cerveau et les électrodes posées dans le muscle tibial antérieur causent un inconfort que le porteur qualifie lui-même de permanent. 1 049 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 54 d'entre elles, modéré pour 912 et sévère pour 83. Presque toutes subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes à une heure pour recevoir un traceur dans la moelle épinière ou le tronc cérébral, parfois deux fois, tandis que certaines sont suspendues dans un harnais qui leur retire le contact des pattes avec le sol ou courent sur un tapis roulant, l'objectif étant d'identifier les neurones du tronc cérébral qui commandent les changements de direction. Leur cerveau et leur moelle épinière sont prélevés après mise à mort pour les analyses neuroanatomiques.
Objectifs
Notre projet de recherche s'intéresse aux mécanismes qui permettent à un être vivant de changer de direction en marchant. Si nous comprenons bien comment le cerveau contrôle les mouvements en ligne droite, les processus qui permettent de tourner ou de modifier sa trajectoire restent encore mystérieux. Pourtant, ces ajustements sont essentiels dans la vie quotidienne, que ce soit pour éviter un obstacle ou suivre un chemin précis. Récemment, des travaux sur la souris ont permis d’identifier un groupe spécifique de neurones dans le tronc cérébral. Ces neurones particuliers semblent jouer un rôle clé dans le changement de direction. Lorsque nous les activons, la souris modifie sa trajectoire. Nous pensons donc que ces neurones orchestrent la coordination des muscles du cou, du tronc et des pattes pour ajuster la marche. Pour mieux comprendre leur rôle, nous allons combiner plusieurs approches scientifiques : des enregistrements électriques de l’activité cérébrale, des outils génétiques ce qui pourra aider à mettre en place des modèles informatiques de la locomotion. À terme, nos découvertes pourraient aider à mieux comprendre certaines maladies neurologiques qui affectent la marche, comme la maladie de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique. Elles pourraient aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les personnes souffrant de lésions de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
Le contrôle de la marche par le cerveau est un enjeu crucial, notamment pour les personnes souffrant de troubles neurologiques. Nos recherches pourraient avoir un impact direct sur la récupération motrice après une lésion de la moelle épinière, ainsi que sur les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson ou les accidents vasculaires cérébraux. Ces affections altèrent profondément la capacité à se déplacer, rendant le quotidien difficile pour des millions de personnes. Jusqu’à présent, la plupart des études se sont concentrées sur la marche en ligne droite. Pourtant, dans la réalité, nous changeons constamment de direction pour nous adapter à notre environnement. Comment le cerveau ajuste-t-il ces mouvements ? Quels mécanismes permettent de garder l’équilibre en tournant ? Ces questions restent largement ouvertes. Notre projet vise à identifier les étapes précises du mouvement qui permettent aux animaux à quatre pattes d’effectuer un virage, tout en conservant leur équilibre. Grâce à des techniques de pointe, comme l’optogénétique (qui permet d’activer ou d’inhiber des neurones avec de la lumière), nous allons examiner le rôle des neurones du tronc cérébral impliqués dans ce processus. En collaboration avec des experts en modélisation biomécanique, nous allons intégrer ces découvertes dans un modèle informatique du contrôle de la marche. Ce type de simulation est essentiel, car il permet de tester virtuellement des scénarios complexes, comme la marche sur un terrain accidenté, sans avoir recours à des expériences supplémentaires sur les animaux. À terme, cette meilleure compréhension du contrôle cérébral des mouvements pourra guider le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment pour restaurer la mobilité des patients atteints de troubles neurologiques.
Procédures
La quasi-totalité des animaux recevront une injection de traceur de neurones au niveau de la moelle épinière et/ou dans le tronc cérébral lors d’une procédure chirurgicale. Le temps d’une injection est estimé entre 45 min à 1h. Le délai entre 2 injections sur un même animal est de 5 à 30 jours. Des tests de comportements moteurs seront réalisés chez quasiment 80% des animaux qui seront libres de leurs mouvements. 25% d'entre eux auront des marqueurs réfléchissants (petites sphères de 3mm de diamètre) apposés au niveau de leurs articulations pendant maximum 1 heure. 10% des animaux feront de la marche rapide (maximum 4 x 2minutes alternés de 5minutes de pause) en ligne droite sur un tapis roulant, spécialement conçu. 30% des animaux seront maintenus par une contention de moins de 10 secondes afin de connecter une fibre optique. 7% des animaux auront une électrode implantée dans le muscle tibial antérieur par une chirurgie d’une durée estimée à 1h. Quelques animaux seront légèrement sur-élevés à l'aide d'un harnais afin d'enlever transitoirement le contact des pattes avec le sol pendant au maximum 4 minutes consécutives.
Impact sur les animaux
Nous mettrons tout en œuvre pour minimiser l’impact des interventions. Voici les effets indésirables les plus fréquemment rencontrés lors de ces interventions : - Anesthésie : Dépression transitoire respiratoire et cardiaque, hypothermie. - Injection stéréotaxique: risque très faible d’infection au niveau des sutures. - Implantation de fibres optiques intra-cérébrales: très faible risque d’infection/Inflammation de la zone implantée. Inconfort lié à l’implant (permanent). - Tests moteur dans l’arène: inconfort transitoire lié à la présence de marqueurs collés sur la peau. Stress transitoire lié à la privation alimentaire (30 min maximum) pendant la phase de test. - Sur-élévation : inconfort transitoire lié à l’immobilisation. - Enregistrement d’activité par électromyographie : faible risque d’inflammation du muscle implanté, inconfort permanent lié à l’électrode. - Tests moteurs sur le tapis roulant : effort physique court, stress métabolique transitoire. Notez que la plupart de ces nuisances et effets indésirables, même s’ils peuvent survenir lors de nos expériences, restent exceptionnels. Aucun animal produit n’a de phénotype dommageable (incapacité de se déplacer, de se nourrir, etc…).
Devenir
La mise à mort des animaux à l'issue de chaque procédure est requise afin de permettre le prélèvement du cerveau et de la moelle épinière, nécessaires aux analyses neuroanatomiques prévues dans le cadre de notre projet.
Remplacement
Notre objectif est d’analyser en détail comment le cerveau contrôle les mouvements pendant la marche et d’identifier les circuits neuronaux impliqués. Actuellement, il n’existe aucune alternative non animale permettant de répondre à ces questions de manière complète. Les recherches sur des modèles alternatifs, comme les organoïdes de moelle épinière, progressent, mais ces technologies en sont encore à leurs débuts. Si elles pourront, à terme, aider à mieux comprendre la connectivité neuronale et son adaptation, elles ne permettent pas encore d’étudier concrètement l’impact de l’activation ou de l’inhibition de certains neurones sur les mouvements eux-mêmes. Or, mesurer et analyser ces effets en temps réel est essentiel pour démontrer scientifiquement leur rôle dans la locomotion. Notre projet intègre également une dimension numérique : en collaboration avec des experts, nous allons développer un modèle informatique, et potentiellement robotique, des circuits et des séquences motrices impliqués dans les changements de direction. Cependant, pour que ces modèles soient fiables, nous avons besoin de données issues d’animaux en mouvement. À long terme, nos recherches contribueront à affiner les modèles informatiques et à développer des solutions alternatives, réduisant ainsi progressivement le recours aux animaux dans l’étude du contrôle de la locomotion.
Réduction
Chaque animal sera utilisé pour plusieurs types d'analyses : à la fois étudier le rôle fonctionnel des neurones et pour analyser leur organisation anatomique. Cette approche permet d’optimiser l’utilisation des tissus, notamment pour des expériences complémentaires, sans nécessiter de nouveaux prélèvements. Nous avons soigneusement estimé le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour chaque groupe étudié, nous avons calculé un effectif optimal, en tenant compte des variations possibles dans l’efficacité des procédures et des risques liés à certaines expérimentations. Nous ajustons également ce nombre selon les besoins spécifiques de chaque analyse, en évitant tout recours superflu aux animaux. En adoptant ces méthodes rigoureuses, nous nous engageons à utiliser le strict minimum d’animaux nécessaires, tout en assurant la qualité et la pertinence des données recueillies.
Raffinement
Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d’un traitement analgésique adapté. Après chaque intervention chirurgicale, les animaux seront placés dans une chambre chauffante et ventilée, spécialement conçue pour assurer un réveil en douceur et dans des conditions optimales. Une fois complètement réveillés, ils seront réintégrés dans leur cage d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Un suivi post-opératoire rigoureux sera effectué quotidiennement pendant plusieurs jours, selon une grille d’évaluation spécifique à chaque type d’intervention. Nous surveillerons attentivement plusieurs critères tels que le poids, l’état général (respiration, pelage, déplacement, propreté), les expressions faciales indicatrices de douleur (selon les recommandations du NC3Rs), ainsi que le comportement en cage et lors des manipulations. Ces observations seront consignées dans une fiche de suivi avec un système de score permettant d’adapter les soins en fonction des besoins de chaque animal. Si un signe de douleur est détecté, un traitement antidouleur approprié sera administré immédiatement. En cas de problème de cicatrisation, une anesthésie gazeuse sera utilisée pour éviter toute douleur lors de la reprise des sutures, et une crème antibiotique sera appliquée en cas d’infection locale, bien que ces cas restent rares. En dehors du suivi post-opératoire, les animaux bénéficieront d’un contrôle quotidien par le personnel qualifié de l’animalerie.
Choix des espèces
L’étude des bases neuronales de la locomotion et de son contrôle par le tronc cérébral, que ce soit en condition normale ou pathologique, nécessite un modèle animal mammifère. Parmi les différentes espèces disponibles, la souris est un choix privilégié en raison de plusieurs atouts majeurs. D’une part, sa petite taille, sa facilité d’élevage et son cycle de reproduction rapide en font un modèle idéal pour les recherches en neurosciences. Depuis plus d’un siècle, elle est largement utilisée dans les études de génétique, car elle est actuellement le seul mammifère pour lequel la modification des gènes via le génie génétique sur cellules souches est facilement accessible. Cette spécificité a permis le développement de nombreuses lignées génétiquement modifiées, offrant des outils précieux pour l’exploration des circuits neuronaux. Dans le cadre de ce projet, les lignées sélectionnées permettent de cibler avec précision une population spécifique de neurones grâce à un traceur viral. C’est la seule approche permettant d’étudier ces neurones de manière isolée et de comprendre leur rôle dans le contrôle des mouvements. De plus, l’anatomie du cerveau et de la moelle épinière de la souris est extrêmement bien cartographiée. Il existe notamment un atlas de coordonnées de chaque région cérébrale, facilitant le ciblage de régions spécifiques et l’interprétation des résultats. Concernant l’âge des animaux, la majorité des expérimentations seront réalisées sur des souris adultes, âgées de 2 à 6 mois, avec une première intervention entre 2 et 3 mois. En effet, l’atlas de coordonnées est le plus fiable à ces stades, où la morphologie du cerveau est comparable entre animaux et ne change plus. En outre, le stade adulte nous assure que les animaux sont capables de se mouvoir et que les circuits étudiés sont matures.
Mise au point de l’automatisation de protocoles d’apprentissage sur écran tactile chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pour automatiser deux protocoles d'apprentissage sur écran tactile, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent sous anesthésie gazeuse, à l'âge de huit semaines, une puce d'identification implantée sous la peau après injection d'un analgésique local, l'intervention durant cinq minutes. Elles accèdent ensuite au dispositif de test depuis leur cage collective sans intervention de l'expérimentateur, ce que le porteur présente comme un raffinement face aux tests aversifs habituels. Toutes sont destinées à la réutilisation dans d'autres projets, le porteur indiquant qu'elles n'auront pas subi de stress significatif.
Objectifs
Les tests couramment utilisés pour l'évaluation des fonctions cognitives chez les rongeurs sont souvent aversifs et ont généralement peu de points communs avec les tests utilisés en milieu clinique. Une méthode de plus en plus populaire pour évaluer les fonctions cognitives chez les rongeurs est la plateforme automatisée à écran tactile, sur laquelle un certain nombre de tests cognitifs différents peuvent être effectués d'une manière très similaire aux méthodes actuellement utilisées pour tester les sujets humains. Cette méthodologie est peu stressante et fait appel à un renforcement positif plutôt que négatif. Elle présente un potentiel translationnel élevé et se prête à un haut degré de standardisation. Cette technologie est couramment utilisée chez les primates non humains mais reste peu employée chez les rongeurs. L'utilisation de cet outil chez les rongeurs, les primates non humains et les humains augmenterait la validité et la fiabilité des études translationnelles sur la cognition. L'objectif de ce projet est d’automatiser un protocole d'évaluation de la flexibilité cognitive et un protocole d'apprentissage spatial chez la souris. Plutôt que d’amener les animaux aux tests, ceux-ci iront faire le test dans un module dédié de manière volontaire ce qui limitera d’une part de stress lié à la manipulation, et produira d’autre part des résultats de meilleures qualités, les souris réalisant le test en accord avec leur cycle naturel. Les souris seront placées pendant plusieurs jours dans un environnement enrichi dans lequel elles auront accès au test grâce à une porte qui ne laisse passer qu’un seul animal à la fois en l’identifiant au passage. En plus des scores individuels dans le test, le comportement des animaux au sein du groupe sera également mesuré. Nous relierons les scores mesurés dans les tests individuels avec les comportements mesurés dans la partie sociale de la cage (exploration, interactions sociales). Ces protocoles d’apprentissage automatisés seront ensuite proposés à la communauté scientifique pour des études sur le vieillissement ou la caractérisation de modèles de pathologies humaines comme l'autisme ou la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
Les tests couramment utilisés pour l'évaluation des fonctions cognitives chez les rongeurs ont peu de points communs avec les tests utilisés en milieu clinique. La mise en place de ces deux protocoles d'apprentissage sur écran tactile, inspirés de méthodes actuellement utilisées pour tester les sujets humains, permettra d'améliorer l'aspect translationnel des tests précliniques sur rongeurs pour l'évaluation des fonctions cognitives. D’autre part, cette approche expérimentale a plusieurs avantages : i) les animaux sont testés dans un cadre dit naturalistique, plus éthologique, sans le stress de la manipulation ou de la présence de l'expérimentateur. En outre, les animaux font les tests de manière volontaire, à leur rythme. ii) les résultats obtenus seront extrêmement riches : nous aurons des mesures individuelles concernant l'exploration, les interactions sociales et les capacités cognitives. Ces différentes données pourront être croisées afin de mettre en évidence d'éventuels liens.
Procédures
Tous les animaux vont être évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives sans intervention de l’expérimentateur. Les animaux subissent uniquement l'insertion en sous-cutanée d'une puce RFID nécessaire au suivi comportemental à l'âge de 8 semaines. Cette intervention sous anesthésie gazeuse est très rapide (5 min) et est réalisée après injection d'un analgésique local en sous-cutané (5 secondes, pendant l’anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
La chirugie peu invasive nécessaire pour implanter la puce RFID nécessaire au suivi comportemental sous la peau entrainera une légère douleur liée à l'injection de l'antidouleur local et à l'incision.
Devenir
72 animaux de type sauvages seront utilisés pour la mise au point et la validation de tests comportementaux non invasifs. Ils n’auront pas subi de stress significatif. Nous proposerons la réutilisation de ces animaux.
Remplacement
La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des retards mentaux requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus cognitifs et moteurs. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Les échantillons proposés permettront de vérifier si le test de mise au point donne les résultats attendus.
Raffinement
L'étude elle-même s'incrit dans une logique de raffinement : les animaux restent en groupe et font des tests comportementaux individuels de manière volontaire. L'expérimentateur n'interviendra pas dans l'environnement, sauf pour recharger en eau ou en nourriture. Le stress lié à la manipulation est donc réduit au maximum. Un des buts de ce projet est de proposer une alternative plus éthologique pour l’étude du comportement animal. Par ailleurs, une telle approche permettra de collecter des données en continu sur chaque animal, ce qui nous permettra de fournir une caractérisation la plus exhaustive possible des traits comportementaux. La douleur lors de l’insertion sous la peau de la puce d'identification nécessaire au suivi comportemental est gérée par une injection préalable d’un anti-douleur local. Les animaux seront surveillés quotidiennement dans les trois jours suivants l'insertion. Des points limites adaptés permettront à l'expérimentateur de surveiller le bien-être des animaux et de décider de sortir un animal de la procédure si des signes de mal-être sont observés au cours des manipulations régulières des animaux.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. Comme le laboratoire utilise ces modèles, nous mettons au point les tests comportementaux pour les explorer. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 8 semaines. Nous avons choisi ce stade car le cerveau y est totalement mature.
Treg AVC Comportement fUS 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Tuées à l'issue pour que leur cerveau soit prélevé, avec des échantillons biologiques recueillis sur la moitié d'entre elles seulement, 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine au cours d'une intervention d'une heure trente, suivie d'une IRM, puis de deux heures de tapis roulant et de vingt-quatre heures de test de préférence au saccharose censés mesurer la fatigue et la dépression. Trente d'entre elles reçoivent en plus une injection de lymphocytes T régulateurs. Le porteur intègre dans son effectif 15 % d'animaux au titre de l'entraînement des expérimentateurs et des pertes, et indique que ce nombre pourra baisser selon l'aisance de ces derniers.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale responsable de déficits à long terme. La majorité des études précliniques sur l’AI se sont concentrées sur des temps précoces et sur la mesure du volume de la lésion, définitif 24 à 48 heures après le début de l'AVC, comme critère d'évaluation principal. Cependant, l'AI peut être considéré comme une maladie chronique. En effet, les patients peuvent souffrir de séquelles des mois, voire des années après la phase aigüe. Ainsi, au moins 1/3 des patients développent une dépression et une fatigue en post-AVC. L'origine de ces symptômes n'est pas claire et peut être difficile à traiter, ce qui en fait une priorité de la recherche sur l'AVC. Malgré cela, nos connaissances sur les phases subaiguës et chroniques de l'AI sont très limitées à ce jour. Il a été suggéré que la mise en place de la dépression et de la fatigue post-AVC pourrait être liée à la dérégulation de la réponse immunitaire. Des données récentes indiquent que les populations lymphocytaires T jouent un rôle dans la réparation et la régénération du tissu cérébral dans les semaines et les mois qui suivent l'AI. Dans ce projet, nous nous intéresserons à une sous population lymphocytaire, les lymphocytes T régulateurs, qui ont la capacité d'interagir avec des cellules résidentes du cerveau pour promouvoir la réparation tissulaire post-AVC. Nous souhaitons identifier de nouvelles stratégies d'imunomodulations impliquant les lymphocytes T régulateurs et déterminer leur implication dans la récupération foncitonnelle à long terme post AVC. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs distincts.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de l'implication des lymphocytes T régulateurs dans la récupération fonctionnelle post-AVC pourrait permettre d'identifier de nouvelles stratégies d'immunomodulation permettant de lutter contre les séquelles à long terme.
Procédures
Le modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine sera réalisé sur tous les animaux (n= 80, durée de la procédure : 1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=80, durée de la procédure : 15 minutes - site n°1). Une partie des animaux recevra une injection de lymphocytes T régulateurs en post-AVC (n=30, durée de la procédure : 15min - site n°1) et les séquelles comportementales seront évaluées par des tests comportementaux évaluant la fatigue et la dépression (n=80, durée de la procédure : 2h pour le test du tapis roulant et 24h pour le test de préférence au saccharose - site n°2) et par imagerie fonctionnelle par ultrason (n=80, durée de la procédure : 1h - site n°1). La totalité des animaux (n=80) sera mis à mort selon les préconisations réglementaires, des échantillons biologiques seront prélevés postmortem pour analyse ultérieure sur la moitié d'entre-eux.
Impact sur les animaux
Chirurgie : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Imagerie : Certains animaux peuvent montrer des signes de stress lié à la nuisance sonore produite par l’IRM ou l'imagerie fonctionnelle par ultrason, une perte de masse corporelle après les anesthésies. Comportement : Certains animaux peuvent ressentir un stress durant la période d’habituation à la salle de comportement.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, de nos travaux précédemment publiés, de la littérature et de tests statistiques. Afin d'avoir une idée de la numérotation des groupes, un test de numérotation a été effectué. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le transfert des animaux entre les deux sites d'experimentation sera réalisé sur un chariot à roulette, les deux sites étant séparés par un couloir intérieur. Nous avons indiqué pour chaque procédure expérimentale les points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le sysème immunitaire L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les AVC ischémiques. Les animaux (souris C57Bl/6 / SWISS) utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 20 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.