Souris

Pour mesurer l'effet de l'exercice sur l'atrophie musculaire provoquée par la chimiothérapie du cancer du sein, 320 souris d'environ 8 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Elles reçoivent une ou plusieurs injections de chimiothérapie, espacées de 1 à 3 semaines, et celles de l'étude aiguë passent 4 jours seules en cage, dans une cage réduite à 330 centimètres carrés, sans possibilité de suspension, pour celles dont l'activité doit être réduite. Elles subissent aussi deux tests de force et de fonction musculaire que le porteur ne nomme pas et, pour certaines, des tests d'effort maximal de 10 à 20 minutes, alors que les séances d'exercice citées parmi les sources de stress ne sont décrites nulle part. En cas de faiblesse musculaire, une nourriture en gel et une réhydratation sous la peau sont prévues. Le porteur juge l'interaction entre chimiothérapie et inactivité "difficile à dissocier chez la patiente", et s'appuie sur ses propres "études cliniques" pour fixer l'âge des souris.

Objectifs

La chimiothérapie utilisée pour traiter le cancer du sein précoce entraîne de nombreux effets secondaires sur le muscle squelettique, affectant à la fois sa quantité et sa qualité. Les patientes traitées présentent diverses altérations musculaires, comme une atrophie, qui contribuent à la diminution des capacités fonctionnelles. Ces altérations, observées après un traitement par chimiothérapie, varient en fonction de la molécule utilisée. Par ailleurs, la réduction de l’activité physique, fréquemment observée chez les patientes, aggrave probablement ces altérations musculaires. En effet, la diminution des contraintes mécaniques et métaboliques exercées sur les muscles entraîne des effets similaires à ceux induits par la chimiothérapie. L'interaction entre ces deux facteurs reste difficile à dissocier chez la patiente, ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal. À l'inverse, l’exercice, qui augmente les stimuli mécaniques et métaboliques, pourrait prévenir ces altérations, bien que ces bénéfices n’aient été observés que chez des sujets sains avec des preuves scientifiques robustes. Cependant, les effets aigus, chroniques et différés de l'exercice dans le contexte de l'atrophie musculaire induite par la chimiothérapie demeurent largement méconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier, dans un modèle murin, l'impact de la modulation de l’activité physique sur l’atrophie musculaire induite par la chimiothérapie. L’étude 1 caractérisera les effets combinés de la réduction de l’activité physique et des chimiothérapies sur les altérations musculaires, tandis que l’étude 2 explorera les effets aigus, chroniques et différés de l’exercice sur ces altérations.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples au niveau fondamental et au niveau de l’application clinique possible. Tout d’abord, la caractérisation de l’interaction entre la réduction du niveau d’activité physique et la chimiothérapie sur les altérations musculaires permettra de proposer un modèle murin plus proche de la réalité clinique. En effet, étant donné que les patientes atteintes d’un cancer du sein ont une réduction de leur niveau d’activité physique après l’administration de chimiothérapie, il est probable que cette réduction, induite dans le modèle murin, exacerbe les effets de la chimiothérapie sur le tissu musculaire. D’autre part, l’étude des effets aigus, chroniques et différés de l’exercice permettra d’un point de vue fondamental de caractériser les voies de signalisation cellulaires sous-jacentes et d’un point de vue clinique d’adapter la prise en charge des patientes. En effet, nous pensons que de manière aigue, l’exercice pourrait prévenir une partie des altérations musculaires. Si nous montrons ces bénéfices, cela aboutira à une preuve de concept et un changement de prise en charge clinique. Il sera alors recommandé de pratiquer de l’exercice juste avant l’administration de chaque dose de chimiothérapie. Enfin, la caractérisation des effets différés de l’exercice et de la chimiothérapie permettra d’indiquer aux patientes si la pratique d’exercice spécifique doit se poursuivre au-delà du traitement.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous allons administrer des traitements de chimiothérapies. Pour l'étude avec administration aigu : une injection sur animal vigile, d'une durée de quelques secondes, sera effectuée sur les animaux. Lorsque les chimiothérapies seront administrées par injection de manière chronique, celles-ci seront espacées de 1 à 3 semaines selon le type de molécule administrée. Pour répondre aux questions scientifiques, les souris de l’étude avec administration aigue seront placées dans des cages individuelles, tandis que celles du groupe "réduction d’activité" seront hébergées dans des cages de dimensions réduites (330 cm², sans possibilité de suspension). la durée de ce maintien cage individuelle avec ou non réduction de la surface au sol disponible sera de 4 jours. Deux tests de force et de fonction musculaire seront réalisés, pour une durée inférieure à 5 minutes. Ces tests seront effectués avant et 4 jours après l’administration de la chimiothérapie dans le cadre des expérimentations aiguës, ou avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie pour les expérimentations chroniques et différées. Dans le cadre des expérimentations chroniques et différées, des tests d’effort maximaux seront réalisés, d’une durée de 10 à 20 minutes, avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l'administration des chimiothérapies entraîne une douleur légère à modérée au site d'injection, de courte durée. La répétition des injections, bien qu’alternées entre les côtés injectés et espacées d’au minimum 1 semaine, pourrait induire une légère induration locale et un stress modéré lié à la contention, d’intensité croissante avec le nombre de manipulations. Les manipulations répétées pour les séances d’exercice et les évaluations (force, fonction musculaire et vitesse maximale à l'exercice) induisent un stress modéré, de durée variable selon la fréquence des manipulations. Dans l’étude 1, le placement des animaux dans des cages individuelles pendant une courte durée entraîne une altération mineure du bien-être animal, sans impact significatif sur l’anxiété ou les capacités cognitives. Le placement en cage individuelle sera limité à 4 jours, réduisant ainsi son impact potentiel. Pour le groupe de réduction d’activité, le placement dans des cages de dimensions réduites (330 cm² sans possibilité de suspension) entraîne une réduction des opportunités de mouvement, avec une faible nuisance physiologique et une intensité limitée sur le bien-être, en accord avec les études précédentes.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, il n’existe pas à ce jour un modèle in vitro permettant de réduire le niveau d’activité physique et les modèles d’électrostimulation utilisés pour mimer l’exercice sont incomplets. De plus, pour comprendre les aspects fonctionnels (force et fonction musculaire), le recours à un modèle in vivo est nécessaire.

Réduction

L'équipe de recherche bénéficie de l’expérience et de l’expertise nécessaire pour permettre la mise en place d’expérimentations de qualité avec un nombre de souris réduit au minimum mais suffisant pour les analyses statistiques. Pour rappel, l’étude 1 vise à caractériser la contribution de la réduction du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par une administration de chimiothérapie. Pour calculer mathématiquement le nombre d'animaux par groupe, le critère de jugement principal sest basé sur le degré d’atrophie mesuré au niveau histologique par la surface de section des fibres musculaires encore appelé taille de l'effet. Sur la base de la littérature, la chimiothérapie peut en moyenne induire une atrophie de 17, 9%. Les résultats obtenus seront comparés grâce à des analyses statistiques adaptées permettant de mettre en évidence l'effet de la réduction d'activité physique sur l'atrophie induite par la chimiothérapie.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont maitrisées. Le bien-être des animaux sera constamment surveillé, et toute modification du comportement, telle que la manifestation de souffrance ou d'angoisse, sera immédiatement rapportée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour mettre en place les mesures correctives nécessaires. En cas de signes de douleurs, un avis au vétérinaire sera demandé.Avant le début des procédures, les animaux seront habitués aux conditions environnementales et manipulés pour les habituer aux expérimentateurs ainsi qu'à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Pour enrichir l’environnement des souris, les cages seront équipées de matériaux et d'objets adaptés pour leur permettre de nidifier et ronger. Les souris seront maintenues en groupes sociaux et, pour une des études, individualisées uniquement lorsque cela sera nécessaire pour atteindre les objectifs et la durée du placement en cage individuelle sera de durée très limitée (4j). Nous observerons attentivement la locomotion des souris afin de détecter tout signe de boitement ou de difficulté à se déplacer, ce qui pourrait indiquer des effets secondaires inattendus de la chimiothérapie. En parallèle, nous évaluerons régulièrement l'aspect général des animaux, incluant leur posture, leur tonus musculaire, leur comportement dans la cage, l'état de leur pelage et leur poids corporel via des grilles de scoring pour lesquelles des mesures correctives ainsi que des points limites ont été définies pour interrompre les procédures et limiter la souffrance animale. Pour exemples, en cas de signes de faiblesse musculaire, affectant potentiellement leur capacité à s'alimenter ou à se mouvoir, nous fournirons de la nourriture en gel en complément de leur régime alimentaire standard. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être mise en place.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles cellulaires est impossible pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie. Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. La souris présente un intérêt particulier du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l’Homme (99% d’identité de gènes avec l’Homme), tant au niveau histologique et cellulaire qu’au niveau du type de réponses aux traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique sur le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie utilisée chez les patientes atteintes d’un cancer du sein. Ainsi, pour se rapprocher de la réalité clinique, nous travaillerons sur des souris adultes (8 mois post natal environ). En effet, dans nos études cliniques, aucune patiente n’était âgée de moins de 26 ans. Conformément aux équivalences entre âge souris/humain, une souris de 8 mois correspond à un humain d’âge moyen.

Soumises 6 à 12 mois à des régimes enrichis en graisses ou en sucres, puis toutes tuées pour des prélèvements post-mortem, 4 896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est échographiée au foie sous anesthésie tous les 15 jours, une autre subit une chirurgie terminale, et certaines sont transportées entre les deux établissements du projet. Le projet vise le rôle de régulateurs de l'intégrité du génome et du microenvironnement immunitaire du foie dans la progression de la stéatose vers le carcinome hépatocellulaire. Le porteur annonce une injection "intraveineuse unique sous anesthésie générale", puis décrit comme source d'inconfort une "injection sous-cutané" avec "passage de l'aiguille au travers de la peau et du péritoine".

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris). Une autre partie de ces animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4896).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4896 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

4 896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes passent 6 à 12 mois sous des régimes enrichis en graisses ou en sucres pour reproduire la stéatose et le cancer du foie, une partie reçoit une injection intraveineuse sous anesthésie pour exprimer un gène, une autre est échographiée sous anesthésie tous les 15 jours, soit 8 à 12 séances en moyenne, une autre encore subit une chirurgie terminale, et certaines sont transportées entre deux établissements. La prise de poids attendue peut modifier leur mobilité et les tumeurs du foie peuvent altérer leur état général, pour des résultats qui "devraient" mener, écrit le porteur, à de nouvelles pistes thérapeutiques "dans un futur proche". Il qualifie d'"indispensable" l'utilisation de souris vivantes, parce qu'elles constituent selon lui "le seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire un gène dans un tissu précis.

Objectifs

Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris). Une autre partie de ces animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). Une partie des animaux sera sujette à un transport entre centres de recherche. L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs impliqués peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (4896).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.

Réduction

4896 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.

1 920 souris portant une mutation qui reproduit un variant génétique humain vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines isolées jusqu'à deux semaines dans une cage de calorimétrie. Elles subissent une chirurgie abdominale pour implanter une puce de température ou une chirurgie du crâne, portent des fibres optiques fixées sur la tête pendant les enregistrements, reçoivent un régime engraissant jusqu'à trois mois et sont maintenues à 90 % de leur poids normal pendant l'apprentissage des tâches de motivation. Des mesures à 30 et à 13 degrés complètent le protocole. Le porteur annonce à terme des approches nutritionnelles et pharmacologiques personnalisées contre les troubles alimentaires et l'obésité, quand ce qui est certain ici est l'isolement, la restriction alimentaire et la mort de 1 920 souris.

Objectifs

La surconsommation d'aliments à forte densité énergétique est aujourd'hui clairement identifiée comme l'un des principaux responsables de l’obésité. Cependant, dans ce contexte, tous les individus ne deviennent pas obèses, suggérant que nos gènes entrent également en interaction avec notre environnement et influencent notre santé. C’est dans ce contexte que l’on porte de plus en plus d’attention aux facteurs génétiques qui pourraient influencer nos comportements. Le polymorphisme génétique correspond aux variations naturelles dans la séquence d’ADN qui existent dans la population ; l’un des plus étudiés dans les maladies psychiatriques est appelé TaqIA. Affectant environ 50% de la population, ce polymorphisme est corrélé à une vulnérabilité accrue au développement de comportements addictifs, mais également aux troubles des comportements alimentaires et à l’obésité. Cependant, ce polymorphisme n’est observé que chez l’espèce humaine, ce qui empêche de comprendre son rôle causal dans les troubles neuropsychiatriques et métaboliques. Nous avons ainsi généré une mutation ponctuelle chez le rongeur reproduisant le contexte humain du polymorphisme TaqIA et permettant d’enfin étudier son rôle causal dans le développement de l’addiction, des troubles du comportements et de l’obésité. Un total de 1920 animaux sur 5 ans sera utilisé pour répondre à ces questions. La règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux (réutilisation des animaux dans différentes procédures n'entrainant pas de douleur ou de stress) et en raffinant les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme une meilleure connaissance du rôle du système de la récompense dans le contrôle du comportement et du métabolisme, ainsi que du rôle du polymorphisme TaqIA dans la modulation de l’activité des neurones dopaminergiques dans un environnement alimentaire normal ou obésogène. A moyen et long terme, l’objectif sera de développer et valider des approches nutritionnelles et/ou pharmacologiques personnalisées basées sur le polymorphisme génétique humain pour traiter les troubles psychiatriques, alimentaires et métaboliques.

Procédures

- Pour deux lots, les animaux seront soumis à des études de calorimétrie et/ou de métabolisme du glucose. Pour les études calorimétriques, les animaux resteront isolés au maximum 2 semaines lors d'une première exposition aux cages. Ces mesures en cages de calorimétrie indirecte pourront être répétées plusieurs fois sur un même animal, mais la durée d'exposition aux cages sera limitée à une semaine maximum dans ce cadre. Une partie des animaux sera également exposée à une chirurgie abdominale (15 min) pour implanter une puce de relevé de température. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles pourront également être également réalisés après un gavage de glucose ou l’injection d’insuline (environ 4h pour chaque test). Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois). - Pour deux lots, les animaux seront soumis à des études comportementales visant à étudier les comportements alimentaires, les comportements motivés et les comportements de type anxieux. Dans le cas où les animaux sont évalués dans plusieurs tests, chaque test est espacé a minima de 7 jours. Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois). - Enfin, pour deux lots, les animaux seront soumis à une chirurgie (1 h), suivie d'une période de repos. Les animaux effectueront ensuite des tâches comportementales visant à étudier les comportements alimentaires, les comportements motivés et les comportements de type anxieux. Dans le cas où les animaux sont évalués dans plusieurs tests, chaque test est espacé a minima de 7 jours. Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois).

Impact sur les animaux

- La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris (nuisance modérée). - La calorimétrie indirecte demande un hébergement individuel des animaux pendant 7 jours maximum (nuisance modérée). Une partie des expérimentations se fera à 30°C et 13°C pour évaluer l'adaptation themrique des animaux pendant 3 jours au maximum (nuisance modérée). - Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux (nuisance légère). Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum, nuisance modérée). - Les nuisances attendues suite à la chirurgie (badominale ou stéréotaxique) sont bien identifiées au laboratoire, après plusieurs années d'expérience de cette procédure (nuisance modérée). Notamment, la baisse de température corporelle induite par l’anesthésie est contrôlée par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant le contrôle de température. Ainsi, la température est maintenue en permanence à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress (nuisance modérée). Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable. Cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. Nous nutiliserons pas également les invértébrés, car ils ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques.

Raffinement

Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, des bâtons de bois ou des tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de stratégies transgéniques et virales disponibles uniquement dans des modèles murins. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 9 semaines) afin que les réseaux neuronaux soient bien en place.

Des souris âgées subissent une insuffisance circulatoire aiguë provoquée par chirurgie, sous anesthésie, pendant trois heures au maximum et sans réveil, après un test de force des pattes. 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, leurs muscles, reins, foie et cerveau étant prélevés. L'objectif déclaré est d'établir une signature métabolique du muscle âgé, pour repérer plus tard les patients de réanimation exposés à des complications. Les nuisances attendues se résument, selon le porteur, au stress du test de force et aux quelques secondes précédant l'endormissement, sans que le geste chirurgical lui-même soit décrit ni les niveaux d'hypotension retenus, encore non arrêtés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes. In fine, il s’agit de positionner le muscle squelettique comme une possible cible thérapeutique afin d’améliorer le devenir des patients en réanimation et en péri-opératoire.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet présente un intérêt important pour le laboratoire de recherche puisqu’il permettra la mise en place d’un modèle d’insuffisance circulatoire aigue chez la souris dont l’objet principal sera l’étude du métabolisme musculaire. Ce modèle est conçu pour être au plus proche de la présentation et la prise en charge de l’ICA chez l’humain. Par ailleurs, ce modèle s’intègre dans une démarche translationnelle puisqu’il viendra compléter un essai clinique sur l’ICA en chirurgie cardiaque. Ce projet scientifique pourrait constituer une avancée importante dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques en anesthésie et réanimation, centrées sur le muscle squelettique. Grâce à la meilleure compréhension physiopathologique du rôle du muscle dans la récupération après une agression, nous souhaitons mettre en évidence des cibles métaboliques pour identifier les patients à risque de présenter des complications post-opératoires ou une hospitalisation prolongée en réanimation. Cela permettra d’améliorer la qualité des soins et la sélection des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à un grip test (3 répétitions du test d'une durée de quelques secondes chacune, entrecoupées de 2 à 3 minutes de repos) ainsi qu'à une procédure chirurgicale (ICA) de 3 h maximum, sans réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues se résument au stress lors du grip test (maximum 10 minutes au total) et de l'anesthésie générale (quelques secondes avant endormissement).

Devenir

A la fin de chacune des procédure, l'ensemble des animaux est mis à mort, par des personnes formées et compétentes, dans le but de collecter et d'analyser les tissus d'intérêt (sang, muscle squelettique, rein, foie, cerveau). Ces analyses (biochimie, expression genique, histologie) permettront d'explorer la signature métabolique du muscle squelettique âgé préalablement exposé à une insuffisance circulatoire aigue (ICA) et d’en comprendre l’éventuel impact à distance sur les autres organes.

Remplacement

L’étude de l’insuffisance circulatoire aigue et de la communication inter-organes qui lui succède nécessite un modèle intégratif permettant la prise en compte de l’action à distance de tous les organes après une ICA. De ce fait l’analyse ne peut être réalisé qu’in vivo pour garde un niveau d’information suffisant. L’intérêt de cette recherche réside aussi dans son potentiel applicatif et l’utilisation de critères de jugement fonctionnels. Il n’existe à ce jour pas d’autre méthode fiable d’analyse systémique de la communication inter-organe.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur les données bibliographiques actuelles. Compte tenu de la variabilité des réponses individuelles et du risque de décès durant l'ICA tant que les conditions expérimentales ne sont pas arrêtées, des groupes de 15 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. De plus, une veille bibliographique a été effectuée afin d'éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes de recherche et pour utiliser les travaux susceptibles de nous aider dans notre démarche (définir les niveaux d'hypotension à tester, les durées d'ICA notamment). Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement pour repérer les blessures éventuelles, comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur sont réalisées sous anesthésie chirurgicale et un analgésique est utilisé en parallèle de ces procédures. Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé. Lors de l'ICA, si la pression artérielle moyenne chute en deçà de la valeur définie dans le protocole, une perfusion du sang de l'animal (prélevé pour l'ICA et hépariné) sera réalisée pour maintenir la pression à la valeur choisie.

Choix des espèces

Les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et la souche choisie pour ce projet a déjà été utilisée pour la réalisation d’un modèle d’ICA permettant l'étude de la fonction renale dans la littérature. Notre modèle s'intéresse à l'altération musculaire. Nous prenons donc exemple sur ce premier modèle publié et l'adaptons pour l'étude du muscle squelettique. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à partir de 8 semaines, pour ne pas interférer avec les mécanismes mis en jeu au cours du développement.

Trois injections d'allergène à une semaine d'intervalle, puis un gavage qui déclenche la réaction : les souris présentent alors du grattage, des douleurs abdominales et un choc anaphylactique avec chute de la température corporelle. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récupérer les tissus destinés aux analyses immunologiques. Le projet est présenté comme un raffinement, puisqu'il vise à remplacer l'injection intrapéritonéale, que le porteur juge "plus douloureuse et peu performante", par une injection sous-cutanée, et le gavage par une administration à la micropipette. Comparer ces voies suppose pourtant de maintenir un groupe sensibilisé par voie intrapéritonéale et de provoquer des chocs anaphylactiques dans les quatre sous-groupes de vingt souris.

Objectifs

Les allergies sont répandues et ont été classées comme quatrième pathologie en termes de morbidité par l’Organisation Mondiale de la Santé. Depuis une vingtaine d’années, une augmentation constante de la prévalence de cette pathologie et notamment de la forme sévère (dite anaphylactique) a été constatée. A l’heure actuelle, les mécanismes impliqués dans le développement de la réaction allergique et les causes spécifiques de l’augmentation de leur prévalence sont peu établis. L’allergie au blé est l’une des allergies alimentaires les plus fréquentes. Au sein de notre laboratoire, nous avons mis au point différents modèles d'allergie alimentaire, mais dans un soucis de raffinement nous aimerions améliorer ce modèle en testant des voies de sensiblisation à l'allergène différentes (voie sous cutanée VS intra péritonéale) mais aussi différentes voies de déclenchement ou challenge allergique (MDA : Micropipette guided Drug oral Administration VS gavage oral). Ensuite, les différentes voies de sensibilisation et/ou de déclenchement seront comparées en étudiant les variables habituellement observées dans l'allergie alimentaire (Immonoglobulines E spécifiques, perméabilité intestinale, mécanismes immunologiques).

Bénéfices attendus

Ce projet à pour objectif d'essayer d'améliorer et de raffiner notre protocole d'allergie alimentaire aux gliadines de blé mis en place dans notre laboratoire en tentant de remplacer la sensibilisation par voie intra péritonéale, plus douloureuse et peu performante, par une sensibilisation par injection sous cutanée. Mais aussi en tentant de remplacer la provocation par gavage oral via une sonde qui est souvent douloureuse et peut provoquer des lésion de l'œsophage par une alternative moins invasive : la MDA pour Micropipette guided Drug oral Administration.

Procédures

Pour le groupe sensibilisation par voie intrapéritonéale IP : 3 injections par voie intra périntoneale à 1 semaine d'intervalle. Pour le groupe sensibilisation par voie sous cutanée SC : 3 injections par voie sous cutanée à 1 semaine d'intervalle. Pour le sous groupe provocation par gavage : 1 gavage oral. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (provocation), une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée, ainsi que des douleurs abdominales.

Impact sur les animaux

Légères : inflammation légère au niveau du point d’injection, gêne abdominale suite à l’injection IP lors de la sensibilisation. Modérées : grattage, douleurs abdominales, choc anaphylactique (baisse de la température corporelle).

Devenir

Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et physiologique.

Remplacement

Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire. Notamment, dans le cas de l’étude de l’influence des différentes voies d'exposition, le modèle in vivo reste irremplaçable. Dans l’allergie, de multiples types cellulaires peuvent être impliqués et leurs interactions peuvent avoir un rôle dans la physiopathologie. De plus, les allergies alimentaires sont caractérisées par des symptômes que seuls des modèles animaux, et en particulier les souris peuvent adéquatement reproduire.

Réduction

Le protocole d’allergie alimentaire est régulièrement réalisé au sein du laboratoire. De ce fait, en se basant sur des tests statistiques et de la variabilité individuelle rencontrée lors de nos anciens protocoles, le nombre de souris a été déterminé à 20 souris par sous-groupe.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permettent de minimiser l'inconfort et la douleur.L'évaluation des points limites sera faite tous les jours lors de l'observation journalière des animaux et se base sur la présence de signes cliniques notables et sévères. En présence d’un ou deux signes cliniques notables, le responsable du projet et la cellule du bien-être animal sont informés. Une surveillance accrue de l’animal est mise en place. En Présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, la cellule du bien-être animal et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendront la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à la mise à mort. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse.

Choix des espèces

Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles et males. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches. Il n’existe aujourd’hui pas de méthodes alternatives pour analyser efficacement et dans son ensemble la réaction allergique. De plus, l’allergie est caractérisée par des symptômes que seuls des modèles animaux peuvent adéquatement reproduire. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les souris Balb/c utilisées auront 3 semaines de vie à réception et 4 semaines de vie au début des procédures. Quatre semaines est l’âge idéal correspondant à des souris sevrées et adultes ayant un système immunitaire mature.

Pour savoir si les bactéries passées dans le sang après une chimiothérapie modifient la réponse immunitaire, 504 souris reçoivent des cellules cancéreuses du poumon dans une veine, puis des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant 33 jours. Elles vont toutes être tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un, cinq ou dix jours après une injection unique de cisplatine, pour prélever leurs poumons. Le porteur signale des difficultés respiratoires liées à la tumeur pulmonaire, une perte de poids due à la chimiothérapie et des diarrhées dues aux antibiotiques. La taille des groupes, sept animaux, est justifiée par la puissance statistique et par le fait qu'une seule personne doit pouvoir prendre en charge l'expérience, répétée trois fois.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. La chimiothérapie est un traitement fréquemment utilisé chez les patients. Plusieurs études ont montré qu’un traitement par chimiothérapie induisait une entrée de bactéries dans le flux sanguin mais l’impact de ces bactéries sur la réponse immunitaire n’a pas encore été étudié. Le cisplatine est une chimiothérapie couramment utilisée dans le traitement du cancer du poumon dont l’action est dépendante des cellules immunitaires Ainsi, nous voulons étudier l’impact des bactéries sur l’efficacité de la réponse immunitaire après cisplatine. En particulier, nous allons étudier la relation entre bactéries et le système immunitaire de façon plus vaste afin de voir toutes les conséquences de l’entrée de bactéries sur la chimiothérapie et la tumeur.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé public majeur. Il est donc nécessaire de trouver des traitements efficaces et bien supportés par le patient. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Les animaux reçoivent les cellules tumorales du cancer du poumon non à petites cellules murin en intra-veineuse (1 minute pour l’injection). Les souris recevront des antibiotiques dans leur eau de boisson pendant 33 jours maximum. Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes) une seule fois. 1, 5 et 10 jours après le traitement par chimiothérapie, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale à l’isoflurane (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort).

Impact sur les animaux

Le développement d’un modèle orthotopique du cancer du poumon peut conduire à une difficulté respiratoire. La chimiothérapie utilisée peut entraîner une perte de poids chez les souris. Les animaux pourraient ressentir une douleur lors de l’injection en intra-veineuse (IV) ou intra-péritonéale (IP). Les animaux pourraient développer de la diarrhée due au traitement par antibiotique.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répéterons les expériences 3 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui le plus adapté en raison de la taille des groupes.

Raffinement

L’animal aura un temps d’acclimatation de minimum une semaine avant toute manipulation par l’applicateur du projet. Afin d’améliorer le bien-être des animaux, les souris ne seront pas isolées. De plus, de l’enrichissement sera présent dans les cages tel que des jouets, des frisotis pour leur nidification et des tubes pour qu’elles puissent se cacher. Des points limites ont été définis, prenant en compte les caractéristiques de l’étude, et un arbre décisionnel basé sur l’attribution de points lié au degré de sévérité des points limites a été mis en place permettant l’arrêt des souffrances suivant des critères définis.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

À partir d'un score clinique de 6 sur la grille de suivi, la souris est tuée, et dès le score 3 dans le modèle de tumeur sous-cutanée. 6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses humaines ou murines leur sont injectées dans le poumon après ouverture de la plèvre, puis viennent les traitements, jusqu'à cinq gavages par jour, des irradiations, des anesthésies gazeuses jusqu'à trois fois par semaine pour l'imagerie et jusqu'à dix prélèvements sanguins par jour par une incision de la queue, les difficultés respiratoires étant attendues puisque le poumon est opéré. Le porteur annonce environ 80 molécules testées grâce à ce projet, une partie des prélèvements dépendant des "demandes clients".

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les cancers du poumon, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du poumon soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le poumon par injection transpleurale. En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance tumorale. Les mesures de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de croissance tumorale permettra d’évaluer l’efficacité du ou des traitements Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié. Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires (histologie, cytométrie en flux par exemple). Grâce à ce projet envron 80 molécules pourront être testées et aboutir à de nouvelles thérapies pour le cancer du poumon.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde, avec le taux de mortalité le plus élevé chez les hommes et les femmes. Avec près de 50 000 nouveaux cas et 30 000 décès par an en France, il est le 3ème cancer le plus fréquent et la première cause de mortalité par cancer. Le traitement du cancer pulmonaire repose aujourd’hui principalement sur la chirurgie (exérèse partielle) lorsqu’il est à un stade précoce, puis des chimiothérapies associées à des radiations. Malheureusement ce cancer est souvent diagnostiqué à un stade avancé lorsque les possibilités de traitement sont limitées. Le pronostic vital reste particulièrement défavorable, notamment pour les formes métastatiques (survie à 5 ans inférieure à 5%) comparé aux formes localisées (survie à 5 ans de 20%) ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux :• Greffe des cellules tumorales par voie transpleurale : chirurgie d’une durée de 15 minutes incluant l’anesthésie, 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique - par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max5xjour), intrapéritonéale (max4xjour), sous-cutanée (max4xjour), intramusculaire (max2xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. - par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. - par voie intranasale : durée 30 secondes sur animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse flash) (max 1 fois par jour). - par voie intratracheale : durée 30 secondes sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse ou à l’aide d’anesthésique systémique (max 1 fois/jour). • Traitement par irradiation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude. • Administration de produit pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée). 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile - via la veine saphène : durée 30 secondes (max 4xjour) o via la veine mandibulaire : durée 30 secondes (max 2xjour) - via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour). • Prélèvements de sang sur animal anesthésié à l’isoflurane o via la veine sublinguale (max 1x/jour).

Impact sur les animaux

Nuisances des animaux : pour chacune des procédures, les animaux seront opérés pour pouvoir injecter les cellules tumorales directement dans le poumon sous anesthésie par injection intrapéritonéale d’un mélange de produits anesthésiques en addition d'analgésique pour éviter la douleur. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront traités avec des thérapies pendant quelques jours à plusieurs semaines qui peuvent parfois être mal tolérées (dose du traitement importante ou traitement à long terme). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de la croissance tumorale. Les animaux seront également soumis à des anesthésies gazeuses répétées (isoflurane) pour le suivi de la croissance tumorale par imagerie mais également lorsque les traitements nécessitent une anesthésie. Ils pourront également être sujets à plusieurs prélèvements sanguins durant les études. Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés du poumon, il est possible que les animaux présentent des difficultés respiratoires. Les traitements répétés par voie intra-trachéale pourraient également être irritant si la durée de traitement est importante. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux utilisés pour le développement des modèles orthotopiques du poumon peuvent parfois être utilisés pour effectuer une étude de pharmacocinétique/pharmacodynamie (PK/PD) à la fin pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Ces animaux seront mis à mort à la fin de cette 2ème procédure. Les animaux utilisés pour une étude de PK/PD ou d'efficacité seront mis à mort à la fin de leur procédure. Quelle que soit la procédure, des prélèvements de sang et de tissus pourront être réalisés et feront l’objet d’analyses ultérieures.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorale. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Dans le modèle orthotopique, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in sillico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique type Lacryvisc est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de l’instillation des cellules cancéreuses, une injection en sous-cutanée d'analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Une fiche de suivi des signes cliniques a été mise en place spécifiquement pour ce modèle (évaluation de l’hématurie, de la capacité à uriner…). Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. Ainsi, à partir d’un total de 4, les animaux seront observés par un vétérinaire et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. Dans le cas du modèle abscopal, une fiche de suivi de l’évolution de la tumeur sous-cutanée sera également utilisée. Dans ce cas, si le score 3 est atteint, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limites établi, il sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles orthotopiques de cancer du poumon chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes.

Le protocole dépend de la molécule testée et de sa pharmacologie, dans un travail de tri de candidats médicaments mené en amont d'études d'efficacité plus longues. 1 550 souris et 1 250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement une ou deux fois par jour, par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale selon le composé, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique n'attendre aucun signe clinique, tout en reconnaissant que les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus, et justifie la mise à mort par le volume de sang requis, les animaux ne pouvant "survivre décemment à une grosse ponction sanguine".

Objectifs

L’objectif est de mettre en place un modèle de pharmacocinétique/pharmacodynamique inflammatoire. Pour cela, nous quantifierons les cytokines inflammatoires sécrétées ex vivo, en réponse à des stimuli ex vivo, par les cellules immunitaires sanguines exposées aux composés in vivo ou par des cellules immunitaires sanguines de culture exposées au plasma des souris traitées in vivo.

Bénéfices attendus

Ce modèle permettra une meilleure caractérisation de nos composés thérapeutiques en établissant une relation entre la pharmacocinétique in vivo (concentration en fonction du temps) et la pharmacodynamique (effet pharmacologique en fonction du temps). Ce modèle nous aidera à mieux sélectionner nos composés avant une évaluation dans des modèles d’efficacité in vivo plus longs et plus complexes.

Procédures

Une contention douce permettra la pesée et le traitement 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie. Pour la même raison, l’administration pourra se faire par voie orale ou sous-cutanée ou intraveineuse ou intrapéritonéale. Le prélèvement sanguin sera réalisé soit sous anesthésie et sans réveil avant mise à mort, soit après que les animaux aient été euthanasiés.

Impact sur les animaux

La douce contention des animaux nécessaire pour la pesée et le traitement, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress et un inconfort. Malgré la très bonne formation du personnel technique, il pourrait dans de rares cas y avoir des conséquences dues aux administrations ou aux prélèvements. Les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus.

Devenir

Les analyses ex vivo nécessitent beaucoup de sang total. Les animaux seront mis à mort car ils ne pourraient survivre décemment à une grosse ponction sanguine.

Remplacement

En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leurs mécanismes d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). L’intérêt de ce projet étant d’étudier l’effet du composé sur les cellules sanguines, nous ne pouvons utiliser à ce stade de modèle in vitro pertinent.

Réduction

La sélection des composés est faite en utilisant des tests in vitro puis cellulaires. Seules les molécules présentant une activité sur les tests cellulaires sans toxicité apparente et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été publié pour la molécule de référence de ce projet et a prouvé son intérêt scientifique. Nous utiliserons les données et les conditions utilisées pour cette molécule afin d’ajuster le nombre minimal d’animaux nécessaires. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer l’efficacité de notre composé par rapport à un contrôle.

Raffinement

Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien-être Animal émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Après réception, les animaux seront placés dans des cages par 4 à 5 souris ou par 2 à 3 rats. Un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager leur comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge ou tunnel en carton pour se cacher, bois à ronger… La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposent d’un cycle lumière obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Nous n’attendons pas de signes cliniques dans ce projet. Néanmoins, des critères cliniques et des points limites sont définis dans une liste pour determiner un score de suivi des signes cliniques. En cas d'atteinte de points limites et/ou d’observation de comportement non attendu, des mesures seront prises en accord avec le vétérinaire pour arrêter toute souffrance.

Choix des espèces

Les rats et souris entrent dans la plupart de nos études précliniques sur nos candidats médicaments. La concentration dans le sang des composés testés sont bien connus grâce aux études de pharmacocinétiques préalablement réalisées chez ces espèces ; ces données seront utilisées pour planifier les temps de prélèvements sanguins. Le choix de l’espèce sera choisi en fonction des caractéristiques intrinsèques des composés, selon les résultats de pharmacocinétique plus ou moins favorables entre rats et souris (des métabolismes différents induisent parfois des expositions et des cinétiques différentes). Il n’y a pas d’indication spécifique sur le choix de l’âge autre qu’une maturité immunitaire. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines pour les souris et 7 à 10 semaines pour les rats.