Souris

37 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux opérations du cerveau de deux à trois heures, pour une partie d'entre elles une privation de sommeil paradoxal de 48 heures, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie qui permet de prélever le cerveau. L'objet déclaré est de cartographier les réseaux nerveux responsables de la paralysie musculaire du sommeil paradoxal, sans application clinique annoncée à court terme. Le porteur reconnaît que les organoïdes, les cultures sur puces et la modélisation informatique se développent, mais conclut qu'ils ne constituent "pas encore d'alternatives crédibles", et qualifie d'"indispensable" l'isolement des souris en barils individuels pendant une dizaine de jours.

Objectifs

Le sommeil paradoxal est commun à tous les mammifères incluant les humains. Il se caractérise par une forte activité cérébrale semblable à celle de l’éveil mais paradoxalement associées à une paralysie musculaire, expliquant notre immobilité pendant la nuit. De récentes recherches expérimentales chez le rongeur ont identifié les mécanismes nerveux qui conduisent à cette paralysie réversible de nos muscles. Des atteintes neurodégénératives peuvent cibler ces réseaux de neurones provoquant alors une maladie, le trouble comportemental en SP, qui est un signe diagnostic précoce de la maladie de Parkinson ou la maladie à corps de Lewy. Chez ces patients endormis, les muscles ne sont plus paralysés favorisant la survenue de mouvements violents et incontrôlés qui reflèteraient le contenu de nos rêves. En revanche, nous ne savons toujours pas comment et où dans notre cerveau ce sommeil particulier est généré. Ce projet a pour ambition de progresser sur ces questions d’apparence fondamentale mais qui sont un prérequis pour comprendre ses fonctions physiologiques et cognitives, et ses dysfonctionnements dans de pathologies neurologiques assez fréquente comme le trouble comportemental en SP, la narcolepsie, le syndrome des jambes sans repos ou les apnées/ronflements du sommeil. Dans ce contexte, notre stratégie expérimentale repose sur la spécificité fonctionnelle dorénavant solidement établie des mécanismes nerveux impliqués dans la paralysie et l’utilisation de nouveaux outils génétiques, moléculaires et viraux pour circonscrire chez la souris la(s) parties du cerveau activée(s) pendant le SP et capable(s) de controler la paralysie musculaire. La description fine de ce substrat anatomique et fonctionnel devrait ouvrir des champs d’investigations nouveaux dans le domaine de la physiologie du SP et de ses pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à renforcer les connaissances sur les réseaux neuronaux et les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à l’apparition et la régulation du SP. A ce jour, beaucoup de structures ont été identifiées comme pouvant moduler les différents paramètres du SP mais aucun réseau permettant de faire le lien entre elles n’a solidement été décrit. Nous avons précédemment confirmé que la voie SLD vers vmM génère l’atonie musculaire spécifique à l’état de SP chez la souris. Il reste à utiliser cette porte d’entrée préférentielle et solide vers les réseaux du SP. Ainsi, ce projet vise à identifier les structures projetant sur la voie SLD vers vmM tout en confirmant leur implication dans l’état de SP. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir sur le long terme des pistes pour comprendre comment le SP est généré par le cerveau, un prérequis à l’étude de ses diverses fonctions vitales.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie de 2h à 3h selon la procédure - Période de récupération post-opératoire de durée variable selon la procédure - Protocole de privation/rebond de sommeil paradoxal de 48h pour la procédure 3 précédant mise à mort - Perfusion intracardiaque sous anesthésie en fin de procédure avec prélèvement de biopsies

Impact sur les animaux

Les procédures sont classifiées de sévérité modérée. Selon la procédure, les souris subiront une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie, d’une durée variant de 2 à 3h. Ces interventions entrainent une douleur modérée, traitée efficacement par administrations médicamenteuses adaptées avant, pendant et après l’intervention chirurgicale. Pour les enregistrements du sommeil, les souris devront être isolées en barils individuels jusqu’à la fin de la procédure. Nous n’attendons pas de dérèglement du cycle veille-sommeil grâce à la période d’habituation à l’isolement social en barils individuels. Cependant, nous serons vigilants pour détecter d’éventuels signes de mal-être liés aux procédures.

Devenir

Tous les animaux subiront le processus d’euthanasie pour collecter et préserver les tissus cérébraux afin de réaliser des études d’anatomopathologie et d’immunohistochimie.

Remplacement

Il est impossible d’étudier une fonction vitale comme le sommeil hors d’un organisme vivant. Aussi, les modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire, comprendre et modéliser des mécanismes neurobiologiques complexes. La souris est particulièrement bien adaptée aux études neurophysiologiques (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge, lignées génétiquement modifiées). Par ailleurs, ses mécanismes nerveux du cycle veille- sommeil sont communs à tous les mammifères, incluant l’homme. Des animaux moins évolués comme la mouche, le vers ou le poisson zèbre sont parfois utilisés (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal et leur cerveau ne présente pas la même complexité anatomique et fonctionnelle. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation in-silico et l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces ou les organoïdes mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles et pertinentes aborder des processus aussi complexes que le sommeil et comprendre des pathologies invalidantes qui l’affectent comme les apnées du sommeil, le ronflement, le trouble comportmeental en SP ou la narcolepsie. Par ailleurs, la dissection fine des réseaux neuronaux et de mécanismes complexes ne peut être abordée chez l’homme par les techniques globale mises en œuvre en recherche clinique (imagerie cérébrale). La compréhension de mécanismes neurobiologiques à l’échelle cellulaire et moléculaire nécessite la mise en place de techniques invasives, inapplicables pour l’heure chez l’homme.

Réduction

La détermination de la taille de l'échantillon est essentielle pour le succès et la reproductibilité des résultats dans toute étude scientifique. Notre estimation porte sur un besoin de 37 souris réparties en 3 procédures expérimentales. Les expériences proposées ont été conçues pour minimiser le nombre d'animaux tout en maximisant les effets statistiques. La taille de chaque lot expérimental a ete calculée et optimisée sur la base de nos propres études récentes chez la souris. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes de chaque procédure expérimentale et la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, mais aussi la nécessité de ne pas compromettre la reproductibilité et la significativité des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques adaptés aux petits échantillons).

Raffinement

Pour minimiser le stress individuel et favoriser aussi longtemps que possible les interactions sociales, les souris dès réception seront hébergées par paire en cage conventionnelle ainsi que pendant les procédures quand cela est techniquement possible. Des enrichissements environnementaux seront mis en place systématiquement pour la durée des procédures pour entretenir leur bien-être. Les conditions d’hébergement, les soins post-chirurgies et les différentes étapes expérimentales seront contrôlés pour réduire le risque de détresse. Pour la partie physiologique du projet, les animaux seront hébergés en baril individuel pour une dizaine de jours seulement. Des enrichissements conventionnels (roue, coton, bâtonnet de bois, lanière de carton) seront fournis pour la fabrication du nid et limiter l’anxiété générée par cet isolement social indispensable. Les animaux seront suivis quotidiennement dès la phase post-opératoire pour optimiser leur récupération (médicaments adaptés si nécessaire, suivis du poids, de la mobilité et du comportement). Notre préoccupation est de détecter rapidement si certains paramètres physiologiques et comportementaux se dégradent pendant les procédures, constituant des points limites avec mise à mort pour prévenir une quelconque souffrance

Choix des espèces

Il s’agira de souris sauvages, jeunes adultes âgées 10-12 semaines au début des procédures. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale et fonctionnelle avec un cycle veille-sommeil stabilisé et consolidé. La souris a été largement utilisée dans la recherche sur le SP et constitue le modèle mammifère le plus adapté pour l’utilisation d’outils moléculaires, génétiques et cellulaires prévus pour ce projet. Ainsi, la compréhension des mécanismes régulant le SP à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par des techniques invasives encore impossibles chez l’homme mais applicables chez la souris. Le SP est une caractéristique commune aux mammifères, incluant l’homme. Les modèles animaux alternatifs plus simples que la souris (mouche, poisson zèbre) parfois utilisés sont dépourvus de SP et ne sont donc pas pertinents pour comprendre le sommeil, ses fonctions et les pathologies qui l’affectent chez l’homme.

Jusqu'à seize examens d'imagerie et quatre mesures de la fonction rétinienne sous anesthésie, entre l'âge de 14 jours et six mois : 280 souris porteuses de mutations qui détruisent leur rétine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'enjeu déclaré est de repérer à quel moment la rétine commence à se dégrader, afin de fixer la fenêtre où tester plus tard des thérapies géniques. Le porteur indique que la répétition des anesthésies expose les souris à l'hypothermie, première cause de mortalité anesthésique chez les rongeurs, et prévoit sept jours de repos entre deux anesthésies fixes. Il conclut qu'il n'existe aucune méthode substitutive in vitro ou par simulation, le système visuel devant rester intact.

Objectifs

La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de trouver des thérapies efficaces pour ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer chez les personnes l’ayant perdue. Grâce au progrès de la recherche en génétique, un grand nombre de gènes responsables de pathologies oculaires comme la rétinite pigmentaire ont été identifiés, ouvrant de nombreuses opportunités pour le développement de thérapies géniques. Pour évaluer l’efficacité de ces thérapies géniques, des modèles murins ont été créés afin de répliquer la pathologie observée chez les patients. Bien qu’une dégénérescence de la rétine ait été observée dans ces modèles, peu voir aucune information n’est disponible sur le moment où la pathologie débute dans ces modèles. Cette information est pourtant cruciale pour déterminer la fenêtre thérapeutique optimale pour tester une thérapie génique. L’objectif de ce projet est donc de précisément caractériser la vitesse de dégénérescence rétinienne de plusieurs modèles murins de rétinite pigmentaire, afin de déterminer la fenêtre thérapeutique optimale pour ensuite tester les différentes thérapies en cours de développement. Ce projet permettrait également de mieux comprendre les différences de symptômes observés chez les patients (apparition de la maladie plus ou moins précoce, dégénérescence de la rétine plus ou moins rapide…) en fonction des différentes mutations causales.

Bénéfices attendus

Ce projet conduira : à une meilleure connaissance des modèles murins utilisés pour étudier les maladies dégénératives de la rétine ; à comparer l’effet de différentes modifications génétiques (mutations) causant une même maladie permettant ainsi de mieux comprendre les effets moléculaires et cellulaires de chaque classe de mutation dans le développement de la maladie chez les patients ; et à définir le meilleur moment dans le développement de la pathologie pour tester de nouvelles thérapies.

Procédures

La structure anatomique de la rétine (différentes couches de cellules) sera visualisée par une méthode d’imagerie in vivo sur souris anesthésiées. L’acquisition d’images dure environ 5 minutes par animal. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 16 fois par animal entre l’âge de 14 jours et de 6 mois. La fonction rétinienne (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux) sera évaluée sur souris anesthésiées et analgésiées. L’analyse dure environ 30 minutes par animal. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 4 fois par animal à l’âge de 1, 2, 3 et 6 mois.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les gestes expérimentaux auxquels seront soumises les souris seront réalisés sous anesthésie induisant une répétition des anesthésies. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme).

Devenir

Tous les animaux de l’étude (280) seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et de biologie moléculaire post-mortem

Remplacement

Nous étudions dans ce projet le fonctionnement du système visuel en fonction de différentes mutations. Ceci ne peut être étudié qu'in vivo puisque le fonctionnement du système visuel doit être intact. Il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro ou par simulation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (280 souris) est limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (5 souris par groupe). Ce nombre de 5 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et ou les expérimentateurs et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement), alimentation et abreuvement à volonté. Une anesthésie gazeuse courte, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les actes expérimentaux le permettent Pour les actes expérimentaux plus longs, les souris auront une anesthésie fixe et recevront une anesthésie locale de la cornée. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant les électrorétinogrammes. Les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. Une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne est appliquée à la fin des électrorétinogrammes. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors des injections. Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie gazeuse et une anesthésie fixe et de 7 jours entre deux anesthésies fixes. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (ainsi que nourriture et eau à volonté). Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée sur des modèles de souris car il existe différents modèles génétiques de rétinopathie proches du phénotype humain. Nous utiliserons plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ayant des mutations différentes et une vitesse de dégénérescence rétinienne différente, pour modéliser la variabilité observée chez les patients. Les animaux entreront en procédure à l’âge de 14 jours. La réalisation d’imagerie ne peut pas débuter avant car il est nécessaire que les souris aient les paupières ouvertes (chez la souris, l’ouverture des paupières a lieu au cours de la deuxième semaine de vie post-natale).

6 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à 56 injections, subir 26 mesures de composition corporelle et 15 prélèvements sanguins dont sept en une seule journée. Un quart d'entre elles est exposé au froid pendant 21 jours, d'autres sont hébergées à 30 degrés jusqu'à six mois ou soumises à un régime engraissant pendant cinq mois. Le porteur décrit les nuisances attendues, prise de poids modifiant la mobilité, problèmes cardiovasculaires liés à l'obésité, diarrhées, hématomes, risque de péritonite et d'irritation de l'œsophage. Les retombées thérapeutiques annoncées contre l'obésité restent au conditionnel, et l'effectif de 6 080 animaux est rapporté à des "outils statistiques" et au partage des témoins entre protocoles, sans qu'aucun chiffre soit donné.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’analyser les mécanismes de différenciation et d’adaptation des cellules adipeuses en réponse aux variations pondérales, en particulier dans le contexte de l’obésité. L'idée est d'identifier les éléments clés qui favorisent ou freinent l'inflammation et la régénération de la graisse en étudiant : les adipocytes (les cellules qui fabriquent la graisse) et les cellules impliquées dans leur régulation. Pour cela, les cellules du tissu adipeux seront étudiées en parrallèle de l'évaluation de l'état de santé des animaux. L'objectif final est de voir si on peut agir directement sur ces cellules pour rendre le tissu adipeux plus sain, ce qui pourrait non seulement améliorer la gestion du poids mais aussi la santé métabolique en général.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier les acteurs moléculaires essentiels au bon fonctionnement des progéniteurs (cellule à l'origine des cellules graisseuses) et des adipocytes (cellules graisseuses) du tissu adipeux. En effet, la perte de fonction des adipocytes contribue au développement et à l’aggravation des comorbidités associées à l’obésité. Bien que le lien entre les altérations du tissu adipeux et la sévérité clinique de l’obésité soit bien établi, les mécanismes capables de restaurer les fonctions de ce tissu restent aujourd’hui largement méconnus. Nos travaux permettront donc, à terme, de développer des stratégies thérapeutiques innovantes ciblant le tissu adipeux, afin de limiter les désordres métaboliques liés à l’obésité. Par ailleurs, nos résultats pourraient également ouvrir la voie à de nouvelles approches pour optimiser la perte de poids et en améliorer les bénéfices métaboliques. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc : 1) de mieux comprendre le fonctionnement des cellules graisseuses 2) les mécanismes de régulation de ces cellules 3) afin de trouver de nouvelles stratégies pour lutter contre l'obésité et les maladies métaboliques associées.

Procédures

La moitié des animaux recevront une molécule pour enclencher le phénotype souhaité (animal vigile, par voir orale 21 fois sur 10 semaines-1minute ou par injection 28 fois sur 14 jours-11minute ou en continu en eau de boisson ou via l'alimentation). La moitié des animaux pourra être sous régime alimentaire spécial (animal vigile, 5 mois maximum en continu). Les animaux seront hébergés à température ambiante ou à thermoneutralité (30 degrés) (animal vigile, 6 mois maximum en continu). Ils pourront recevoir un traitement au cours du projet (animal vigile, 1 fois par jour pendant 8 semaines maximum soit 56 fois, 1 minute). La composition corporelle (taux de gras, de muscle et d'eau) de l'animal sera évaluée de manière non invasive (animal vigile, 26 fois soit 1 fois par semaine pendant 6 mois, 3 minutes). Des challenges métaboliques seront effectués : une exposition au froid pour 25 pourcents des animaux (animal vigile, 21 jours maximum en continu), un test de tolérance au glucose (animal vigile, 1 fois, 2 heures), un test de tolérance à l'insuline (animal vigile, 1 fois, 2 heures) et un test de réponse au jeun (animal vigile, 1 fois, 16h). La dépense d'énergie des animaux sera mesurée (animal vigile, 1 fois, 4 jours). Certains tests nécessiteront des prélèvements sanguins répétés (animal vigile, 15 prélèvements au total : 7 sur une journée, 6 sur une autre puis 2 sur une dernière, l'acte dure quelques secondes). En fin de procédure des mesures seront réalisées (animal vigile ou anesthésié, 1 fois, 5 minutes à 1 heure).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques qui pourront engendrer les nuisances suivantes : 1) Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une prise de poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. 2) L'obésité peut conduire à des problèmes cardiovasculaires. 3) Les différentes températures d'hébergement pourront entrainer un stress chez les animaux et une altération de leur thermorégulation 4) Les différents traitements pourraient induire des effets indésirables comme la diarrhée et une perte de poids. 5) Les différentes administrations peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections répétées peuvent induire risque de péritonite, des lésions cutanées, une irritation de l'oesophage ou à une irritation de la zone d'injection. 6) Les mesures de la composition corporelle et des échanges de chaleur (calorimétrie) peuvent induire un stress léger chez les animaux 6) Les challenges métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures. Une sensation de faim et un léger stress peuvent également être ressentis lors des mises à jeun de quelques heures 7) Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de permettre des prélèvements post-mortem, principalement des tissus adipeux. D'autres organes seront également collectés, dans une logique de valorisation optimale des données issues de chaque animal au service de la recherche.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier et de comprendre comment sont régulées les cellules du tissu adipeux. Pour cela, il est essentiel d’adopter une approche à l’échelle de l’organisme, ce qui nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux adaptés. Les souris sont particulièrement pertinentes, car elles permettent de développer des modèles transgéniques ciblés pour analyser des mécanismes précis. C’est pourquoi l’utilisation de modèles rongeurs est indispensable et ne peut être remplacée. Toutefois, nous exploiterons autant que possible des modèles cellulaires in vitro afin d’affiner nos analyses avant de valider nos résultats in vivo.

Réduction

Cette étude nécessitera 6080 souris. Le nombre d'animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude. Les résultats seront évalués à l'aide de tests statistiques. A la fin du projet, différents organes seront prélevés pour analyse afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux. De plus, nous optimiserons les groupes expérimentaux en partageant les témoins entre protocoles compatibles afin de limiter le nombre total de souris utilisées.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Un bâton à ronger est systématiquement mis en place pour les animaux sous régime alimentaire spécifique mou. Ce régime est renouvelé régulièrement pour éviter son oxydation et le changement de cage sera augmenté si l'aliment s'effrite trop afin de réduire l'inconfort des animaux. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La durée des administrations sera réduite au maximum et quand cela sera possible, les molécules seront combinées pour limiter le nombre d'injection. Les volumes injectés seront également toujours réduit au maximum. Lors des challenges métaboliques, les animaux seront étroitement surveillés (prise de température, suivi pondéral) et les animaux bénéficieront toujours d'un temps de récupération adapté. Pour les mesures de calorimétrie, les animaux seront toujours habitués à leur environnement avant les enregistrements afin de réduire leur stress au minimum. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. Les animaux entreront en procédure entre 4 et 8 semaines de vie car les procédures doivent être initiées pendant la phase précoce de développement du tissu adipeux. Une procédure durera 6 mois maximum.

Génétiquement modifiés pour développer un cancer du pancréas, des souriceaux reçoivent par le lait de leur mère le produit qui déclenche la maladie, dès les premiers jours d'allaitement. 581 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une biopsie de queue dans leur première semaine de vie, puis jusqu'à trois examens d'imagerie de deux heures sous anesthésie, pendant que les lésions précancéreuses évoluent vers le cancer avec perte de poids et baisse d'activité. Le pancréas est prélevé après la mise à mort, découpé en coupes fines et comparé aux images obtenues.

Objectifs

Le cancer du pancréas le plus fréquent et le plus grave s’appelle l’adénocarcinome canalaire pancréatique. Ce cancer se développe en plusieurs étapes : d’abord, des petites anomalies apparaissent dans le pancréas, puis elles évoluent en lésions précancéreuses avant de devenir un cancer. Aujourd’hui, il n’existe pas de moyen d’imagerie efficace pour repérer ces anomalies et lésions précancéreuses avant que la maladie ne soit trop avancée. De plus, ce cancer est très complexe, car il varie beaucoup d’un patient à l’autre, et donc la réponse au traitement varie également grandement. Les techniques d’imagerie actuelles ne sont pas assez précises pour décrire toutes les caractéristiques de l’adénocarcinome du pancréas. Il est donc très important de développer de meilleures techniques d’imagerie capable d’identifier précisément le type de tumeur pancréatique, et de renseigner sur toutes les caractéristiques tumorales, au niveau cellulaire et moléculaire mais aussi au niveau biophysique, comme la dureté du tissu ou la pression exercée sur l’environnement tissulaire. Ce projet cherche à valider deux nouvelles approches d’imagerie dans ce contexte : l’imagerie de diffusion, qui permet d’étudier la microstructure du tissu, et l’élastographie, qui permet d’étudier les propriétés biomécaniques.

Bénéfices attendus

L'adénocarcinome canalaire pancréatique est très difficile à diagnostiquer tôt, et les premières anomalies apparaissant dans le pancréas sont difficiles à observer chez le patient. Ce projet vise à utiliser des techniques d’imagerie pour mieux comprendre comment l’adénocarcinome se développe à partir des premières lésions précancéreuses, en utilisant un modèle animal. L’étude des premiers stades de ce cancer est impossible à réaliser chez l’homme, car les patients sont souvent diagnostiqués à un stade avancé.

Procédures

On donne aux souris femelles allaitantes un produit qui passe dans le lait afin que les souriceaux allaités reçoivent ce produit (1 fois par jour pendant 4 jours; injection dans l’abdomen ou gavage, sur souris éveillée, moins d’une minute par administration du produit). Ce produit permet d’induire l’activation de la modification génétique des souriceaux transgéniques, provoquant ainsi la maladie. Certains animaux seront soumis à un examen d’imagerie, au maximum trois fois pendant la durée du projet. L’examen est réalisé sous anesthésie et dure au maximum 2 heures.

Impact sur les animaux

Le traitement des souris allaitantes 1 fois par jour pendant 4 jours peut entrainer une légère perte de poids le jour suivant la première administration, mais le poids est ensuite récupéré. Un prélèvement d’un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectué sur les souriceaux dans leur première semaine de vie. La manipulation est très rapide et n’induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise très rapidement à ce stade. Les modèles de souris utilisés développent des lésions précancéreuses puis un cancer du pancréas. Ceci peut entrainer une perte de poids et une diminution de l’activité de l’animal (alimentation, locomotion, toilettage). Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et le passage à l’intérieur d’un tunnel d'appareil d'imagerie avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l'animal. De plus, un stress peut être occasionné pour les animaux devant subir une succession de sessions d’imagerie durant l’expérience.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés et les pancréas seront collectés. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène, cellules immunitaires) qui composent la tumeur. Une partie du pancréas sera également destinée à des analyses des molécules présentes dans le tissu. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

Bien qu’il existe des modèles de cellules mimant le cancer du pancréas, ils ne permettent pas de reproduire l’environnement tumoral ni les symptômes très précoces observés chez les patients. De plus, afin de valider les méthodes d’imagerie comme solutions de diagnostic non-invasives en clinique, il est plus approprié de mener les expériences sur des modèles animaux afin de recréer la physiologie de la maladie mais également afin d’utiliser ces méthodes telles qu’elles le seront sur les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux défini pour les groupes a été déterminé de sorte que l’on puisse obtenir des résultats statistiquement significatifs avec un nombre d’animaux minimum. Pour cela, un test statistique a été réalisé. Des animaux des mêmes portées sont utilisés en tant que contrôles, pour éviter leur non-utilisation. Enfin, les séries de mise au point prévues seront stoppées dès que les données d'imagerie sont satisfaisantes, évitant ainsi d’utiliser plus d’animaux que nécessaire. Un groupe d’animaux sera soumis à plusieurs examens d'imagerie, pour bien comprendre la progression du cancer et choisir les temps d’examen suivants de manière raisonnée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de 5 souris maximum. Ces cages seront enrichies en matériau favorisant la nidification. En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu une fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence et de son comportement. Selon le résultat, de la nourriture humidifiée pourra être ajoutée dans la cage et un analgésique (médicament supprimant la douleur) pourra être administré. Des critères à l'imagerie seront également notés pour évaluer le bien-être. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l'examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que le refroidissement de l'animal et la diminution du rythme respiratoire.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de cancer du pancréas qui reproduit fidèlement la pathologie observée chez l’homme. On peut donc s’attendre à ce que les propriétés biomécaniques et de diffusion mesurées chez la souris soient similaires à celles mesurées chez l’homme. De plus, la souris est une espèce dont le comportement est bien connu, ce qui facilite l’évaluation du bien-être et de la souffrance animale. Enfin, les dispositifs d’imagerie développés pour ce projet ont déjà été optimisés pour la souris. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte pour les croisements. Pour les expériences, les souris entreront dans le protocole d’expérimentation dès leur naissance. Les analyses seront effectuées à différents stades du développement de la maladie connus dans les modèles de souris utilisés (5, 10, 16 semaines, ou 5 mois).

2 376 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à dix injections sous anesthésie locale et dix séances d'imagerie hebdomadaires, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une microchirurgie pour l'injection de cellules tumorales directement dans l'ovaire, d'autres reçoivent deux gavages de tamoxifène par semaine pendant deux semaines. La croissance tumorale peut provoquer une ascite, une distension abdominale douloureuse, une mobilité réduite et une perte de poids, et une des lignées employées présente un risque de leucémie. Une cohorte est maintenue en vie jusqu'à douze ou seize mois pour mesurer l'effet du vieillissement, avant que toutes les souris du projet soient tuées afin de récupérer les prélèvements.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l’impact de l’ontogenèse des macrophages sur le développement du carcinome séreux de haut grade de l’ovaire (HGSOC), leur rôle dans la réponse immunitaire locale et leur influence sur la progression tumorale. L’objectif est d’identifier les différences fonctionnelles et immunosuppressives entre macrophages résidents et ceux dérivés des monocytes, et d’explorer leur potentiel comme cibles thérapeutiques pour le HGSOC. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) favorisent un microenvironnement immunosuppressif permettant aux cellules tumorales de se développer et d’échapper à la surveillance immunitaire. De plus, la présence de TAM est un facteur de mauvais pronostic dans de nombreux cancers, y compris l’ovaire. Cependant, les mécanismes sous-jacents et les différences fonctionnelles entre sous-populations de macrophages selon leur origine restent mal compris. Les approches récentes, notamment le single cell RNAseq, ont révélé une grande plasticité des macrophages tumoraux, avec des sous-populations aux fonctions immunosuppressives et pro-tumorales distinctes. Dans cette étude, l’effet du vieillissement sera aussi pris en compte, car il influence la composition et le comportement des cellules myéloïdes dans les tumeurs, avec des changements dans l’hétérogénéité et l’ontogénie des populations myéloïdes. De plus, des différences épigénétiques observées entre diverses populations de macrophages suggèrent que leur origine ontogénique influe sur leur fonction et leur profil épigénétique. Ce projet s’intéressera donc aux différences épigénétiques spécifiques pouvant être associées à certaines ontogénies des macrophages. Ces analyses approfondiront notre compréhension des mécanismes d’immunosuppression médiée par les TAM et identifieront des cibles potentielles pour moduler ces fonctions. En cartographiant les différences fonctionnelles, moléculaires et épigénétiques de ces populations de macrophages dans des modèles murins, nous espérons établir des corrélations avec les données humaines pour mieux comprendre les interactions immunitaires dans le microenvironnement tumoral, ouvrant ainsi la voie à des cibles thérapeutiques visant à restaurer l’immunité anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’étudier l’impact de l’hétérogénéité des macrophages sur le développement tumoral, la réponse immunitaire et l’efficacité anti-tumorale d’immunothérapies déjà existantes. Le but ultime est l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections ou à des microchirurgies pour l'injection orthotopique de cellules tumorales.La microchirurgie sera faite sous anesthésie générale avec analgésie (n=1, durée 10 minutes maximum). Certains animaux recevront deux gavages de tamoxifène par semaine, pendant deux semaines, ainsi qu’un traitement par injection (sous anesthésie locale, dix injections, durée 30 secondes). Les souris seront également soumises à un suivi hebdomadaire par imagerie in vivo (imagerie non invasive avec une injection , contention de 30 secondes, anesthésie par isoflurane de 2 à 3 minutes, n=10).

Impact sur les animaux

Effets de la modification génétique : La plupart des modèles génétiques utilisés dans ce projet sont bien caractérisés et les modifications génétiques n'ont pas d'impact sur la santé des animaux. Cependant, un des modèles présente un faible risque de développement de leucémie chez certains animaux. Cette leucémie peut engendrer un amaigrissement et une perte de poids modérée. Effets de la croissance tumorale : L’implantation de cellules ID8 entraîne une croissance tumorale, pouvant inclure la formation d’ascite et, pour les injections intrapéritonéales, une propagation métastatique plus agressive. Cette progression peut induire une gêne et des symptômes de gravité modérée (distension abdominale avec douleur modérée, mobilité réduite, perte de poids modérée ). Effets du vieillissement : Dans le groupe de vieillissement, des effets liés à l’âge, tels qu’une réduction de l’activité, et une perte de poids modéres, sont possibles.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Ce projet nécessite l’établissement de tumeurs dans des conditions réelles pour la mise en évidence de sous-populations d’intérêt. Nous travaillons en parallèle sur une approche de type « organoïdes » avec laquelle des tumeurs sont re-créées en 3 dimensions en culture cellulaire pour créer des avatars de patients. Cependant, ces approches ne peuvent pas à l’heure actuelle résumer le microenvironnement tumoral naturel qui engendre la diversité de phénotypes cellulaires observés chez les patients. De plus, notre stratégie de suivi temporel de la différentiation de monocytes naïfs en macrophages associés aux tumeurs nécessite l’interaction de ces cellules avec les cellules tumorales tout au long du développement de la maladie, et donc avec l'organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum nécessaire. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, chaque souris générant ainsi de nombreuses informations. Les nombres de souris par groupe sont basés sur des données de la littérature et calculés avec un outil statistique. Si des résultats statistiquement significatifs sont obtenus avec un nombre inférieur, les groupes suivants seront réduits. Pour les analyses de croissance tumorale, les expériences seront réalisées en triplicatas indépendants avec des groupes de 6 souris, mais si des différences significatives sont observées dès la première expérience, les groupes pour les répétitions seront réduits à 3 animaux. Si aucune différence n’est observée, l’expérience ne sera pas répétée.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront des soins (médicaments, nourriture adaptée). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Similarité génétique avec l’Homme : Les souris sont choisies pour leur proximité génétique avec l’Homme, permettant des résultats transposables en matière de progression tumorale et d’interactions immunitaires. Les animaux seront utilisés à maturité sexuelle, entre 8 et 10 semaines, âge idéal pour assurer un système immunitaire fonctionnel et des caractéristiques physiologiques stables, garantissant ainsi la fiabilité des résultats. En complément, une cohorte de vieillissement composée de souris âgées de 12 à 16 mois sera également incluse. Cette cohorte permettra d’étudier l’impact de l’âge sur les populations de macrophages, pour mieux comprendre les différences d’ontogénie liées à l’âge et leurs conséquences dans le développement du cancer.

Tester si un composé qui désintègre la membrane des cellules retient mieux son effet antitumoral une fois mélangé à un hydrogel visqueux : 140 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à deux injections de cellules tumorales sous la peau, puis trois injections du traitement sur trois jours, et sont manipulées tous les trois jours pour mesurer la tumeur. La croissance tumorale peut provoquer une gêne mécanique et une perte de poids modérée. Le porteur qualifie l'association de très prometteuse et espère prouver son efficacité chez les patients, tout en justifiant l'expérimentation par l'impossibilité actuelle de reconstituer un système immunitaire in vitro.

Objectifs

Le développement d’inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICIs) est une des principales avancées dans le traitement contre le cancer. Ils permettent de stimuler les Lymphocytes T qui vont s’infiltrer dans la tumeur et tuer les cellules cancéreuses. Cependant, un nombre limité de patients présentent une réponse durable à ce type de traitement, majoritairement dû à un manque d’infiltrat de cellules T dans les tumeurs de beaucoup de patients. Des composés ont donc été développés ; leur mode d’action est simple : ils désintègrent la membrane plasmique des cellules. Cela entraîne la libération de signaux de danger ainsi qu’un large spectre d’antigènes tumoraux, qui vont activer notamment les cellules dendritiques. Cette activation va stimuler l’afflux de cellules T dans la tumeur. Notre composé fait partie des derniers composés développés et est conçu pour traiter localement des tumeurs profondes. Il a montré un fort pouvoir anti-cancéreux dans une grande variété de modèles expérimentaux, tel que le cancer du foie ou il stimule l’infiltration des lymphocytes T. Dans des modèles expérimentaux, il s’est avéré sûr et bien toléré. Pour l’améliorer, il a été associé à un hydrogel, augmentant ainsi la rétention du médicament dans la tumeur (en raison de la viscosité de l'hydrogel). Nous souhaitons donc vérifier si notre composé associé à l’hydrogel améliore son effet anti-tumoral.

Bénéfices attendus

Notre composé couplé a un hydrogel est très prometteur. En effet, l’hydrogel, avec sa viscosité, retiendra le composé dans la tumeur et devrait donc permettre d’améliorer ses effets. Sur le long terme, nous espérons pouvoir prouver son efficacité sur les patients en étude clinique et l’utiliser sur toutes les tumeurs solides de façon ciblée et très efficace, par la suite.

Procédures

Les souris recevront une à deux injections en sous cutanée de cellules tumorales (2min) sous anesthésie générale puis trois injections de traitements sous anestrhésie locale (durée moins d’une minute sur 3 jours). Ils seront manipulés brièvement (

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention peut stresser transitoirement et légèrement les animaux. Il peut apparaitre une irritation au niveau du point d’injection induisant un prurit léger. La croissance des tumeurs peut provoquer une gêne mécanique et induire une perte de poids modérées.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale avec une activation du système immunitaire (afflux de lymphocyte T), il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour analyser les résultats obtenus. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux nécessaire a été calculé avec une approche statistique.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie générale. Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : D’une part, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue et d’autre part, notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Par ailleurs, la souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.