Souris

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

Pour savoir si la réparation de l'ADN dans les neurones commande la mémoire et si elle peut être ciblée contre la maladie d'Alzheimer, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever des organes et alimenter une biobanque. 1 152 d'entre elles subissent une chirurgie cérébrale de moins de 40 minutes, 360 une infection chronique dont la phase d'invasion provoque un syndrome fébrile de sept jours, et 216 des injections hebdomadaires pendant treize semaines. Toutes passent des tests cognitifs sur quinze jours, dont un labyrinthe de Barnes qui impose un hébergement individuel, et le porteur fixe la mise à mort à deux signes de souffrance parmi perte de poids supérieure à 20 %, déshydratation, léthargie et absence de toilettage. Les bénéfices annoncés restent de l'ordre de "mieux cerner la stratégie thérapeutique de demain", quand la fièvre, les chirurgies et l'isolement sont déjà programmés.

Objectifs

Des modifications épigénétiques notamment liées aux dommages causés à l'ADN jouent un rôle majeur dans les mécanismes liés à l'apprentissage et la mémoire. Dans ce cas, les dommages sont transitoires et efficacement réparés par des mécanismes encore mal compris dans les neurones. Des dérégulations de ces processus épigénétiques, qui aboutissent à leur signalisation chronique contribuent directement aux troubles mnésiques dans la maladie d'Alzheimer (AD), ainsi qu'au cours d'infections. Le projet a pour objectifs de déterminer l’importance de la détection ou de la réparation des dommages dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans le processus de neurodégénérescence liée à l'AD. L'étude utilisera un modèle trangénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et l'infection subclinique ou l'expression combinée avec un modèle transgénique permettant de modifier le processus épigénétique dans des régions cérébrales d'intérêt.

Bénéfices attendus

Comprendre l'impact d'infections latentes communes (de seroprevalence 30-70% chez l'humain et qui augmente avec l'âge) sur la réponse au traitement contre la maladie d'Alzheimer est un enjeu clé pour mieux définir les stratégies thérapeutiques futures. Comprendre par quels mécanismes le senseur épigénétique contribue au processus mnésiques et à leurs altérations et évaluer par preuve de concept son potentiel thérapeutique contre la maladie d'Alzheimer permettront de mieux cerner ensuite la stratégie thérapeutique de demain concernant sa manipulation.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections répétées hebdomadairement pendant 13 semaines, sur animaux vigiles (216 souris, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection de l'agent infectieux, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (360 souris, une injection de quelques secondes); iii) un type de chirurgies sous anesthésie générale de moins de 40 minutes par animal ( 1152 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1368), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), test d'apprentissage et de mémoire spatiale (chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), v)un prélèvement sanguin à la veine caudale pour test sérologique (360 animaux, quelques secondes).

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes, où les souris doivent être hébergées individuellement, des mesures d'enrichissiment du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les 1368 souris seront euthanasiées par anesthésie profonde et irréversible, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant aux dommages de l’ADN. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. De plus, seule l'utilisation de l'animal permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires lors d'infection et de 12 dans le groupe non infecté. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe pour obtenir des résultats interprêtables.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. Les souris sont préalablement familiarisées avec le gel diet dans les jours précédant une chirurgie ou l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Les chirurgies seront menées sous anesthésie générale accompagnée d'une analgésie opiacée en périopératoire et maintenue pendant 48h en post-opératoire. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids) . Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatés à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les test ne requièrent que mobilité, exploration d'objets.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel de l'agent infectieux que nous étudions, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques de la réponse aux dommages dans l'ADN des neurones dans le cadre d’une infection pertinente. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés ( modèles exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux pour ces modifications géniques n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

73 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur animal vigile, chacune subit quatre prises de sang, quatre pesées, deux ou trois instillations nasales et parfois une ou deux injections intradermiques, certaines étant identifiées au poinçon à l'oreille. Le vaccin testé vise les bovins, chez qui la besnoitiose provoque infertilité, atteintes cutanées et jusqu'à 10 % de mortalité dans les troupeaux, et le porteur reconnaît qu'aucun modèle animal, bovins compris, ne reproduit la maladie. Pour le remplacement, il écrit en une phrase qu'aucun modèle ne reproduit la complexité du système immunitaire.

Objectifs

La besnoitiose, causée par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), représente une menace significative pour l’élevage bovin. Cette maladie entraîne des conséquences graves telles que l’infertilité, des atteintes cutanées, une perte de poids et une mortalité jusqu’à 10% au sein des troupeaux. Maladie ré-émergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites présents dans la peau peuvent être transmis par l’intermédiaire d’insectes ou d’aiguilles avec une progression jusqu’à 20% de nouveaux animaux infectés par an dans les troupeaux touchés. Une transmission par ingestion de parasites présents dans l’environnement sous forme d’oocystes est également suspectée. Aucun traitement curatif n’est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limités au dépistage et à l’élimination des animaux malades ou à l’application d’insecticides. Le développement d’un vaccin efficace offrirait aux éleveurs une meilleure stratégie de contrôle de cette maladie. Le but de ce projet est d’évaluer l’immunogénicité et l’efficacité d’un vaccin sous-unitaire à administration nasale et dermique contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitué de protéines et de glycolipides de B. besnoiti associés à un muco-excipient à base d’amidon. Les souris seront immunisées par voie nasale seule ou par voie nasale puis par voie intradermique afin de déterminer la meilleure stratégie d’administration pour déclencher une réponse immunitaire optimale, tant systémique que locale (cutanée). En effet, la voie nasale d’administration du vaccin devrait déclencher une réponse immunitaire muqueuse, notamment du système respiratoire et de l’intestin, permettant une protection contre une infection orale. Cependant, il n’est pas certain que cette voie d’administration déclenche une réponse immunitaire protectrice contre une infection cutanée. Dans ce cas, une administration intradermique pourrait être nécessaire. Au total, 73 souris adultes seront nécessaires. Puisque le remplacement par des méthodes in vitro n'est pas envisageable en raison de la complexité du système immunitaire et de la nécessité d'étudier l'ensemble de ses réponses, le nombre de souris a été réduit au minimum requis pour obtenir des résultats significatifs. Les souris seront hébergées conformément aux directives européennes, avec un enrichissement (cachette, matériaux à ronger, renforcement positif alimentaire). Toute médication interférant avec la réponse immunitaire est proscrite.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise en évidence du développement d’une immunité protectrice contre Besnoitia besnoiti associée à un effet protecteur contre une infection par le parasite. Ces résultats sont essentiels pour envisager une vaccination de bovins, cibles du vaccin anti-besnoitiose.

Procédures

Les animaux vigiles subiront 4 prises de sang et 4 pesées à 2 semaines d’intervalle et recevront 2 ou 3 instillations par voie nasale à 2 semaines d’intervalle. Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 administrations intradermiques à deux semaines d’intervalle et certains animaux seront identifiés une fois à l'oreille. Chacune de ces interventions dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire pour les administrations nasales et intradermiques ainsi que pour les prises de sang peut engendrer du stress. L’identification des animaux par poinçon à l’oreille peut entrainer une douleur locale temporaire. Les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur localisée temporaire. L’injection intradermique peut entrainer une douleur locale temporaire. L’administration du vaccin peut entraîner une inflammation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d'étudier les réponses immunitaires cellulaires induites par les différentes formulations vaccinales, de déterminer la capacité du parasite à se multiplier in vivo et de déterminer la protection induite par la vaccination en terme de réduction de la charge parasitaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience acquise sur des projets de vaccination contre des parasites de la même famille. Les analyses statistiques seront faites sur les dosages des molécules produites par les cellules du système immunitaire et sur le nombre de parasites.

Raffinement

Les souris seront hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés à raison de 4 maximum par cage, dans un environnement enrichi permanent (de type igloo pour se cacher) ou ponctuel (de type carré en cellulose pouvant être dépouillé pour la confection d’un nid) après chaque procédure. Une habituation à la prise en main sera réalisée avant le début du protocole. Un renforcement positif sous forme de récompense alimentaire (par exemple : rondelle de banane séchée, popcorn…) sera appliqué après chaque utilisation d’aiguille. Les responsables du projet ont l’habitude de pratiquer les procédures mises en place. Des points limites sont déterminés en vue de mettre fin à d'éventuelles souffrances.

Choix des espèces

Les rares essais d’infection expérimentale par Besnoitia besnoiti sont peu concluants puisqu’aucun modèle animal, même chez les bovins, ne permet de reproduire la pathologie. De plus, le parasite n’est pas détecté chez tous les individus infectés lors d’une même expérience. Le choix de la souris peut se justifier par le fait que Besnoitia besnoiti a déjà été détecté chez la souris sauvage, que les parasites ont été localisés dans la cavité péritonéale et les organes internes après infection intrapéritonéale de souris et que les parasites présentaient la même morphologie chez des souris expérimentalement infectées que chez des bovins naturellement infectés. Animaux adultes. Cette expérience ne nécessite pas un stade de développement particulier.

Valider chez la souris trente-deux combinaisons de médicaments déjà testées sur cellules leucémiques humaines, en vue d'essais cliniques: 1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées quatre-vingt-dix secondes, greffées par voie intraveineuse avec des cellules de leucémie aiguë myéloïde prélevées chez des patients, saignées à la joue chaque semaine et ponctionnées au fémur jusqu'à six fois sous anesthésie. La maladie ainsi installée peut provoquer une perte de poids importante, une déshydratation, une hypothermie et des changements de comportement, avant des traitements administrés par voie orale ou abdominale pendant deux à quatre semaines. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" d'obtenir des preuves d'efficacité chez des animaux vivants, et justifie ses effectifs par les seules études antérieures du laboratoire.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est un type de cancer du sang où des cellules se multiplient rapidement et ne fonctionnent pas correctement. Ces cellules se retrouvent dans la moelle osseuse et dans le sang, ce qui empêche le sang d’accomplir ses fonctions normales. Le taux de survie à 5 ans pour les personnes atteintes de LAM est faible. Les cellules de LAM présentent souvent plusieurs altérations génétiques qui influencent leur développement et l’évolution de la maladie Ces modifications génétiques persistent tout au long de la maladie, ce qui permet à certaines cellules de survivre au traitement et de provoquer des rechutes. Pour traiter cette situation, des médicaments ont été développés pour bloquer l’expansion des cellules leucémiques. Des essais cliniques ont montré que ces traitements peuvent réduire le nombre de cellules leucémiques ayant ces altérations et améliorer la réponse au traitement. Cependant, d’autres modifications génétiques peuvent rendre ces cellules résistantes aux médicaments, et de nouvelles altérations peuvent apparaître au fil du temps, rendant le traitement moins efficace. Dans ce projet, nous cherchons à tester de nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison avec ceux existants, pour surmonter la résistance aux traitements actuels. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés sur plusieurs types de cellules leucémiques de patients, et certains médicaments ont montré des résultats prometteurs. Cependant, pour vérifier si ces traitements sont efficaces et sûrs, il est nécessaire de les tester sur des modèles vivants de souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients, permettent de recréer les conditions réelles de la maladie en transplantant les cellules leucémiques de patients dans des souris. Ils sont très utiles car ils reflètent bien la diversité des tumeurs humaines, ce qui nous permet de tester les médicaments dans des conditions proches de celles des patients. En résumé, l’objectif de ce projet est de valider les résultats obtenus en laboratoire en les testant sur des modèles vivants afin de pouvoir envisager leur utilisation dans des essais cliniques chez l’homme.

Bénéfices attendus

Nos travaux visent à tester un nouveau traitement, ayant des résultats prometteurs sur culture de cellules cancéreuses dans des modèles de souris avant de le tester chez l’homme. L’objectif est de trouver une stratégie efficace et bien tolérée, afin d'améliorer le pronostic des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde..

Procédures

Pour la mise en place du modème d'étude, un groupe d’animaux sera irradié (durée 90s) pour favoriser la prise de greffe, puis les cellules cancéreuses humaines seront injectées (3 à 6h plus tard) par voie intraveineuse (veine de la queue; durée: 2 min sur souris éveillées). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue seront réalisés chaque semaine (durée: 1 min) et un prélèvement de moelle osseuse au niveau du fémur sera effectué toutes les deux semaines sous anesthésie (durée: 5 min; maximum 6 prélèvements) si aucune cellule humaine n'est détectable dans le sang. Une fois la maladie installée, différents traitements seront administrés en fonction du groupe une fois par jour : 1. Un premier groupe recevra un médicament par injection abdominale tous les 2 jours pendant 2 semaines (durée de l'injection: 30s, sur souris éveillée). 2. Un deuxième groupe recevra un autre médicament par voie orale 3 jours par semaine pendant 4 semaines ((durée de l'injection: 1 min, sur souris éveillée). 3. Un troisième groupe recevra un autre traitement par voie orale pendant 5 jours par semaine pendant 3 semaines. 4. Un quatrième groupe recevra un médicament similaire pendant 3 semaines. 5. Un cinquième groupe recevra un autre médicament par voie orale pendant 4 semaines. 6. Un sixième groupe recevra un traitement combiné de médicaments par voie orale pendant 3 à 4 semaines, en fonction de la combinaison. Des groupes supplémentaires recevront des traitements combinés de ces médicaments selon différents protocoles.

Impact sur les animaux

Le développement de la maladie peut entrainer une importante perte de poids, un changement de comportement, de mobilité, une déshydratation et/ou une hypothermie. L’administration orale d’un traitement peut entrainer une possible irritation du tube digestif. Les différents prélèvements et injections peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire surtout après le prélèvement de moëlle osseuse.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole pour prélever la moelle osseuse et la rate afin de caractériser l’effet du traitement sur l’expansion des cellules cancéreuses.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps tester sur des cellules cancéreuses humaines 32 conditions différentes afin d'identifier les combinaisons les plus efficaces. Néanmoins, nous devons valider à l'aide d'un modèle d'étude de souris ces résultats. En effet, les cultures de cellules ne permettent pas de reproduire complétement la pathologie humaine et dans ce type de tests, nous n'avons pas la problématique de distribution des molécules médicaments au travers des tissus. Il est donc indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles utilisant des animaux vivants.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites qui seuls ou cumulés qui vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Un suivi clinique hebdomadaire des animaux à l’aide d’une grille d’observation permettra de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi et/ou à l’euthanasie de l’animal. Si un signe de détérioration est détecté, la fréquence du suivi sera augmentée et s’il n’y a pas d’amélioration de l’état général de l’animal, il sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

Mises à jeun, anesthésiées, ouvertes au niveau de l'intestin pendant vingt minutes, 436 souris sont réveillées sous anti-douleur puis maintenues en vie six heures au maximum. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et une partie des souris génétiquement modifiées subit en plus une biopsie de l'oreille pour être identifiée. Le porteur justifie le recours aux animaux par des modèles de tissus respiratoires reconstitués qui ne reproduisent ni la structure complète ni le microbiote, alors que le projet porte sur la muqueuse intestinale, et il annonce en une ligne que l'étude "permettra de développer des vaccins par voie orale plus efficaces". Toutes sont tuées au terme des six heures, le temps de prélever l'anse intestinale et d'y chercher les particules vaccinales.

Objectifs

Développer des vaccins plus efficaces contre les infections intestinales est un enjeu majeur dans le domaine de la vaccination. La vaccination par voie orale est une stratégie prometteuse pour avoir des réponses vaccinales protectrices plus efficaces contres les pathogènes bactériens ou viraux intestinaux. Un des point clé est de mieux comprendre l'entrée des particules vaccinales au niveau de la muqueuse intestinale et d'essayer d'ameliorer leur entrée avec differentes stratégies de type vecteur ou en modificant le microbiote localement. Le modèle de l'anse intestinale est le modèle idéal pour caractériser l'entrée des particules vaccinales dans des conditions physiologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer des vaccins par voie orale plus efficaces.

Procédures

Les souris seront anesthesiées et elles subiront une intervention chirurgicale au niveau de l'intestin qui dure 20 min. Les souris resteront sur un tapis chauffant durant toute l'intervention et jusqu'à leur réveil. Les souris pourront être maintenues en vie au maximum 6 heures après l'intervention et elles recevront des anti-douleurs. La même intervention sera réalisée sur des souris modifiées mais sans que ça n'amène de souffrance. Ces souris pourront subir une petite biopsie à l'oreille sous anesthesie plusieurs semaines avant l'intervention (durée 1 minute) ou les selles seront prélévées (durée 20 min), afin de les identifier génétiquement.

Impact sur les animaux

Avant la chirurgie, les souris seront mises à jeun. Après la chirurgie, les souris pourront ressentir des douleurs au niveau du ventre mais un anti-douleur sera administré. Pour les souris modifiées, celles-ci pourront ressentir une petite douleur à l'oreille après la biopsie.

Devenir

Afin d'analyser l'entrée des particules vaccinales dans la muqueuse intestinale, il faut prélever l'anse intestinale après la mise à mort. Ainsi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le passage des antigènes dans la muqueuse est préalablement étudié dans des modèles de tissus respiratoires reproduits en laboratoire. Cependant, ces modèles ne reproduisent pas complètement les conditions physiologiques notamment parce qu'il n'y a pas la structure complète des tissus permettant de générer des réponses immunitaires et il n'y a pas non plus de microbiote.

Réduction

En se basant sur notre experience de cette technique chirurgicale, les expériences seront optimisées pour réduire le nombre d'animaux au minimum. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer les différences dans l'entrée des particules vaccinales.

Raffinement

Les souris seront sous anesthesie durant la chirurgie et un anti-douleur sera administré afin que le réveil ne soit pas trop douloureux. Des point limites ont été mis en place et seront appliqués après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est le modèle de predilection pour étudier le système immunitaire humain car il ressemble beaucoup au sytème immunitaire humain. De plus, ce modèle animal est parmi les plus aisé à manipuler. Seules des souris adultes de plus de 7 semaines seront utilisées car elles ont un système immunitaire mature. Des souris transgéniques adultes seront aussi utilisées pour déterminer l'impact de certains facteurs immunitaires sur l'entrée des particules vaccinales dans la muqueuse.

Deux injections par jour, cinq jours par semaine, six semaines de suite: chaque souris de ce protocole reçoit une soixantaine d'injections destinées à lui faire développer une sclérodermie. 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir quels macrophages entretiennent la fibrose et à tester des vésicules issues de cellules stromales, une piste jamais essayée dans cette maladie. Le modèle a été retenu parce que la sclérodermie se déclenche chez 100 % des souris qui y sont soumises, et le porteur décrit les blessures cutanées obtenues comme réversibles à l'arrêt des injections.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie rare où le corps attaque ses propres organes, comme la peau, les poumons et le cœur. Cela cause une cicatrisation excessive (fibrose), des problèmes de vaisseaux sanguins et un mauvais fonctionnement des défenses du corps (le système immunitaire). Même si des progrès ont été fait, on ne comprend pas encore bien ce qui déclenche ces problèmes ni pourquoi ils persistent. Les macrophages, qui sont des cellules du corps jouant un rôle important pour se défendre et réparer les tissus, semblent très impliqués dans cette maladie. Il existe plusieurs types de macrophages : certains vivent déjà dans les tissus (on les appelle "résidents"), et d'autres viennent du sang pour aider quand il y a un problème (on les appelle "recrutés"). On ne sait pas encore bien lequel de ces types de macrophages est le plus impliqué dans la maladie. Aujourd'hui, les traitements pour la sclérodermie ne sont pas très efficaces. Mais il existe des cellules appelées "cellules stromales mésenchymateuses" (CSM), qui produisent des vésicules contenant des substances utiles (elles sont appelées "vésicules extracellulaires" ou VE). Ces vésicules pourraient peut-être aider à réparer les macrophages et à réduire les cicatrices et l'inflammation, mais cela n'a pas encore été testé dans cette maladie. Notre projet a donc pour objectif : 1. De mieux comprendre les différents types de macrophages dans les organes touchés par la sclérodermie. 2. De savoir si ce sont les macrophages "résidents" ou "recrutés" qui jouent un rôle plus important dans la maladie. 3. De tester si les vésicules des CSM peuvent aider à réparer les macrophages malades. 4. Et de rendre ces vésicules encore plus efficaces pour traiter la maladie. Pour cela, nous allons utiliser un modèle de souris qui imite la sclérodermie humaine. Ce modèle nous permettra d’étudier les phases de la maladie, comme l’inflammation et la cicatrisation, et de tester les effets des vésicules sur les macrophages. Nous espérons ainsi mieux comprendre cette maladie et développer un traitement plus ciblé et efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices importants : 1. Mieux comprendre la maladie : La sclérodermie systémique est une maladie rare et grave dont on connaît encore mal les causes. Cette étude pourrait nous aider à mieux comprendre pourquoi elle apparaît et comment elle évolue. 2. Trouver un traitement : Actuellement, il n'existe pas de traitement efficace pour cette maladie, qui est mortelle. Ce projet pourrait permettre de développer un médicament capable d’aider les personnes atteintes à vivre mieux et plus longtemps. 3. Améliorer les connaissances scientifiques : En étudiant les macrophages et en utilisant des vésicules extracellulaires, les chercheurs pourraient découvrir une nouvelle façon de soigner non seulement cette maladie, mais peut-être aussi d’autres maladies.

Procédures

Pour mener ce projet, nous utilisons des souris afin d'étudier la maladie. Voici comment cela fonctionne : 1. Créer la maladie chez l'animal : Les souris vigiles reçoivent deux injections par jour, 5 jours par semaine pendant 6 semaines, cette injection dure 30 secondes. Cela permet de reproduire les symptômes de la sclérodermie pour les étudier. 2. Suivre les macrophages : Pour voir comment les macrophages se comportent, on injecte une molécule qui les rendent fluorescents. Cette injection d’une durée de 10 secondes est répétée à 3 reprises sur la souris vigile, elle permet de suivre les macrophages et de mieux comprendre leur rôle. 3. Tester le traitement : Une fois les vésicules extracellulaires prêtes, elles sont injectées dans la souris, cette injection unique est réalisé sur la souris vigile et dure 10sec. Cela permet de voir si le traitement peut réduire les symptômes de la maladie.

Impact sur les animaux

Pour réaliser cette étude, les souris reçoivent des injections permettant de reproduire la maladie. Voici comment cela se passe : 1. Injections rapides : Les souris sont contentionnées pour les injections, qui durent 30 secondes. Ces injections peuvent causer une douleur légère à modérée d’environ 1min, les souris ne montrent plus de signes d’inconfort après s’être habituées aux manipulations quotidiennes. 2. Effets sur la peau : Le modèle peut parfois provoquer des petites blessures sur la peau, mais celles-ci s’améliorent lorsque les injections sont arrêtées ou après avoir reçu le traitement. Si des blessures apparaissent et ne guérissent pas spontanément, les injections sont suspendues pour laisser le temps à la peau de cicatriser. Ces précautions permettent de limiter la douleur et d’assurer le bien-être des souris tout au long de l’étude. Cela est important pour obtenir des résultats fiables tout en respectant les animaux utilisés.

Devenir

À la fin de l’étude, toutes les souris seront euthanasiées. Cela est nécessaire pour permettre de récupérer les organes et d’analyser les effets du modèle expérimental et des traitements testés.

Remplacement

À ce jour, il n'existe aucune alternative non animale permettant d’étudier de manière complète l’origine et le rôle des macrophages dans les tissus malades. Également, avant de proposer un traitement pour les humains, il est crucial de prouver que les vésicules extracellulaires sont à la fois efficaces et sûres en utilisant un modèle pré-clinique qui ressemble le plus possible à la réalité. Bien que des tests en laboratoire (modèles in vitro) soient effectués en amont, ces tests ne suffisent pas à évaluer correctement l’efficacité des traitements dans un organisme vivant, où la situation est beaucoup plus complexe. En effet, les modèles in vitro actuels ne parviennent pas encore à recréer fidèlement les interactions complexes entre les organes et les systèmes biologiques d’un organisme vivant.

Réduction

Nous avons utilisé les résultats d'expériences précédentes menées au laboratoire et avons calculé que l'inclusion de 16 souris par groupe expérimental est suffisante pour obtenir des résultats fiables et significatifs tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ce nombre de souris nous permet d’avoir confiance dans les résultats obtenus avec notre traitement pour le proposer par la suite chez les patients.

Raffinement

Les souris sont examinées quotidiennement pour détecter d’éventuelles lésions cutanées et s’assurer qu’il n’y a pas d’infections. On cherche aussi des signes de douleur ou de souffrance, en utilisant des méthodes validées d’évaluation de la douleur. Par exemple en surveillant la perte de poids ou les changements dans leur comportement. Si les lésions cutanées ne guérissent pas, les injections seront arrêtées jusqu'à ce que la cicatrisation soit complète, et des médicaments contre la douleur seront administrés pour soulager les animaux. En cas de perte de poids, les injections seront arrêtées et de la nourriture enrichie sera donnée.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé pour la sclérodermie systémique a été choisi parce qu'il reproduit de manière très fidèle les caractéristiques de la maladie observées chez l’être humain et est largement reconnu comme une référence pour étudier cette pathologie. Les souris utilisées dans l’étude ont entre 8 et 12 semaines, c'est-à-dire qu'elles ont atteint leur maturité sexuelle. Les tests de mise en place du modèle ont montré que la sclérodermie se développe chez 100 % des animaux utilisés.