Souris
Propagation de l’information sonore le long des voies auditives chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Gerbilles de Mongolie : 630
Opérés de l'oreille ou du cerveau pendant une à quatre heures, maintenus la tête fixée deux à quatre heures pour enregistrer leur activité cérébrale, ou exposés une fois à 100 décibels pendant deux heures, 1 710 souris et 630 gerbilles de Mongolie vont être utilisés dans des procédures allant de la chirurgie sans réveil aux atteintes modérées. Tous sont tués à l'issue, le porteur indiquant qu'un animal transgénique, injecté d'un vecteur viral ou porteur d'un implant ne peut être ni réutilisé ni placé. L'objectif déclaré est de décrire la transformation des vibrations sonores en activité du nerf auditif et de tester un implant cochléaire à stimulation optique. La perte auditive provoquée par l'exposition sonore est présentée comme légère et réversible en une semaine, "ce qui correspond à la perte auditive usuelle de personnes âgées de 60 ans".
Objectifs
Répondre à certaines interrogations scientifiques concernant le traitement de l’information sonore le long des voies auditives. : a)Au niveau périphérique, la cochlée traite les informations sonores avant même que le cerveau n’entre en action. Le premier objectif est d'obtenir une description précise de la transformation des vibrations sonores en activité électrique du nerf auditif. Au-delà de son intérêt pour la recherche fondamentale, cette approche sera importante pour améliorer les aides auditives et les implants cochléaires actuels et développer de nouvelles stratégies de stimulation. b)Un son peut être entièrement caractérisé par sa fréquence et son intensité. Cependant, au niveau perceptif ces 2 dimensions interagissent (un son fort parait plus aigu par exemple). Cette interaction apparait dès la cochlée, c’est-à-dire au niveau le plus précoce du traitement de l’information sonore. Afin de pouvoir contrôler précisément l’information envoyée par la cochlée au cerveau, nous allons développer une méthode de stimulation optique du système auditif périphérique. Ceci nous permettra de déterminer qu’elle est l’information nécessaire et suffisante pour identifier les sons. c)Au niveau du circuit auditif, l’information auditive est relayée à différents noyaux avant d’atteindre le centre auditif. De façon remarquable, certaines informations comme l’information fréquentielle est propagée le long des voies auditives grâce au contrôle précis de la connectivité entre les différents noyaux. Ici, nous utiliserons des approches de marquage de certains types cellulaires afin de caractériser finement les connexions neuronales le long réseau auditif. d)Au niveau central, les 2 hémisphères du cerveau traitent les informations fréquentielles et temporelles différemment. Chez l’humain, la latéralisation du traitement du langage en constitue un exemple qui a été amplement décrit. Notre objectif est ici de tester l’hypothèse que le centre auditif gauche répond de manière sélective aux attributs temporels de vocalisations conspécifiques, alors que le centre auditif droit répond préférentiellement aux attributs de fréquence. 2)Proposer un nouveau type de traitement de surdités profondes en déterminant les avantages et les inconvénients d’un nouveau type d’implant basé sur la stimulation optique de la cochlée. Nous réaliserons dans ce projet nos expériences sur le rongeur mais transféré à l’humain.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de répondre à des interrogations scientifiques concernant le traitement de l’information sonore à la fois au niveau périphérie (oreille interne) et au niveau central (voies auditives). Il permettra de caractériser finement comment les sons complexes sont analysé par le système auditif et quel est le réseau neuronal qui permet à l’information sonore de se propager efficacement le long des voies auditives. A la fin du projet, nous aurons une meilleure compréhension de ces phénomènes fondamentaux de codage de l’information sensorielle et du circuit neuronal permettant de véhiculer efficacement l’information auditive.
Procédures
Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 des interventions chirurgicales de l’oreille ou du cerveau, sous anesthésie générale et durant de 1 à 4 heures. Les animaux transgéniques seront génotypés afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, un prélèvement à l’oreille sera fait au moment du sevrage. L’intervention est brève (1 minute par animal) et ponctuelle (le prélèvement ne sera effectué qu’une seule fois au cours de la durée de vie de l’animal). Certains animaux seront maintenus en contention pendant 2-4 heures pour mesurer leur activité cérébrale sur animal éveillé en réponse à des stimuli auditifs. Chaque animal effectuera 5-8 séances d’habituation qui seront suivies par au maximum 5 séances d’expérimentation. Pour étudier l’effet de pertes auditives sur la façon de percevoir les sons, certains animaux subiront une exposition sonore unique à 100 décibels pendant 2 heures.
Impact sur les animaux
L’injection de vecteurs viraux (chez le nouveau-né ou chez l’animal adulte) nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 30 minutes chez le nouveau-né et jusqu’à 2 heures chez l’adulte. Cela peut donner lieu à des douleurs contrôlées par un traitement antalgique et à une sensibilité post-opératoire de courte durée. L’implantation chirurgicale d’implant cochléaire ou de fenêtre crânienne chez l’animal adulte nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 3 heures. Cela peut donner lieu à des douleurs modérées contrôlées par un traitement antalgique et à une sensibilité post-opératoire pendant une semaine. Les séances d’enregistrements de l’activité cérébrale sur animal éveillé nécessitent une contention par fixation de tête. Ceci est susceptible de générer du stress et de l’anxiété chez les animaux. Afin que l’animal se familiarise avec l’expérimentateur et l’environnement et pour pouvoir réaliser des séances d’enregistrement d’une durée de 3 heures, une période d’habituation progressive sera mise en place. A la fin de cette période, un maximum de 5 séances en contention avec un minimum de deux jours de repos entre séances consécutives seront réalisées. Pour étudier l’effet de pertes auditives sur la façon de percevoir les sons, certains animaux subiront une exposition sonore unique à 100 décibels pendant 2 heures. Ceci génèrera une perte auditive légère (environ 30 décibels, ce qui correspond à la perte auditive usuelle de personnes âgées de 60 ans) qui sera réversible et durera environ 1 semaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés pour au moins l’une des raisons suivantes : - Nous utiliserons certains animaux pour le prélèvement d’organes. - Certaines chirurgies seront sans réveil. - Nous utiliserons des animaux transgéniques ou subissant une injection de vecteur viral ou étant appareil avec un implant, lesquels ne peuvent pas être réutilisés ou placé.
Remplacement
L’organe auditif est le fruit de millions d’années d’évolution et il n’est pas possible de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux qui permettraient de reproduire le circuit auditif. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement naturel du système. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative pour remplacer l’expérimentation animale par des expériences purement in vitro ou in silico car nous avons besoin d’étudier le système auditif périphérique dans son ensemble. Afin de comprendre le fonctionnement cochléaire sur un modèle réaliste, il est important d’utiliser des animaux comme la souris ou la gerbille chez qui l’architecture du système auditif périphérique (la cochlée) est similaire à celle de l’Homme. Notre stratégie expérimentale implique l’expression de protéines exogènes dans la cochlée ou le cerveau de la souris ou de la gerbille. Ceci est permis grâce aux outils génétiques dont nous disposons. La production de ces protéines nécessite un organisme vivant.
Réduction
Ce projet impliquera sur une durée de 5 ans un total de 1710 souris et de 630 gerbilles qui entreront dans des procédures sans réveil, légères ou modérées. Des méthodes d’analyse statistique ont été utilisées afin de déterminer la taille optimale des groupes expérimentaux pour répondre aux questions scientifiques posées. Ce chiffre a été estimé avec l’aide d’une équipe de biostatisticiens afin de calculer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les animaux transgéniques seront systématiquement génotypés pour garder uniquement les génotypes souhaitables. Des expériences pilotes sur un nombre réduit d’animaux seront réalisées afin d’éviter des pertes dues aux difficultés techniques. Toutes les procédures utiliseront mâles ou femelles confondus. Cependant, si un des sexes ne s’engage pas de la même façon dans les tests comportementaux, nous privilégierons le sexe le plus réceptif aux tâches comportementales. L’utilisation de nouvelles technologies d’enregistrement neuronal à haute densité permettant d’enregistrer en parallèle plusieurs dizaines de neurones à partir de différentes zones d’intérêt signifie que la quantité de données obtenue par séance d’enregistrement sera maximisée. Dans le cas d’enregistrements sur animal éveillé, la réutilisation de chaque animal pour plusieurs séances d’enregistrement augmentera encore davantage la taille de l’échantillon de neurones obtenues par animal et contribuera à réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes.
Raffinement
Les animaux impliqués dans le projet seront suivis régulièrement et seront anesthésiés, lorsque c’est nécessaire, pour éviter toute forme de souffrance. Des traitements analgésiques et antalgiques seront mis en œuvre et adaptés à l’âge des animaux en préopératoire et postopératoire pour obtenir une analgésie idéale pour chaque procédure. Après la chirurgie, les animaux bénéficieront d’un chauffage de la cage et d’un gel hydrique spécialisé. La plaie sera examinée tous les jours pendant une semaine pour repérer des signes d’infection ou toute autre anomalie physique, comportementale ou développementale (chez le nouveau-né). Un traitement analgésique post-opératoire sera observé pour réduire ces effets indésirables à leur minimum. Une perte de poids dans les premiers jours suivant la chirurgie peut se manifester. La pesée régulière des animaux au cours de la première semaine post-opératoire permettra de surveiller que cette perte reste transitoire et ne dépasse pas les 15% du poids initial de l’animal. Dans de très rares cas, des infections au niveau de l’implant ou de la fenêtre crânienne peuvent survenir. Si l’infection persiste malgré un traitement antibiotique, l’animal sera mis à mort. La contention par fixation de tête est susceptible de générer du stress et de l’anxiété chez les animaux. Afin de réduire ce stress autant que possible, des séances de maniement permettront aux animaux de se familiariser avec l’expérimentateur. De plus, l’habituation à la fixation de tête se fera de façon progressive sur plusieurs séances, tout en prenant en compte la vitesse de progression de chaque animal individuellement. Les expériences comportementales auront lieu dans les cages d’hébergement et sans restriction hydrique. Comme les souris sont hébergées dans ce dispositif expérimental, elles ne seront pas effrayées par un nouvel environnement et pourront réaliser la tâche selon leur volonté. L’état général de santé des souris et des gerbilles sera caractérisé par un score d’état corporel qui prend en compte différent facteur (perte de poids, changement de posture, yeux plissés, manque de toilettage etc.) et qui nous permettra d’évaluer l’état de l’animal tout au long de la procédure et de déterminer des points limites spécifiques et précoces. En fin de procédure ou si nous observions un comportement anormal l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Afin de comprendre le fonctionnement périphérique et central du traitement de l’information sonore sur un modèle réaliste, il est important d’utiliser des animaux comme les rongeurs chez qui l’architecture du système auditif est similaire à celle de l’Homme. En effet, la cochlée est seulement présente chez les mammifères. Au niveau cérébral, les différents centres neuronaux du traitement auditif sont largement conservés et chaque noyau possède son homologue chez l’espèce humaine. Il est également démontré que la souris et la gerbille possèdent un répertoire considérable de vocalisations qui peuvent servir de modèle au langage humain. La souris étant parmi les espèces le plus couramment utilisés en biologie, il existe de nombreux modèles de surdité génétique ayant un équivalent chez l’Homme. La gerbille présente l’avantage par rapport à la souris d’être sensible à une gamme de fréquences très proche de l’humain et représente donc une étape importante pour en vue d’applications translationnelles. Dans le cas d’injection virale pour exprimer les molécules d’intérêt dans les cellules de l’oreille interne, l’administration est plus efficace à un stade précoce du développement. Nous utiliserons des animaux juvéniles (de 1 à 3 jours) qui seront ensuite soit mis à mort pour en extraire les tissus soit soumis à l’expérimentation électrophysiologique ou comportementale à l’âge adulte. Ensuite, chaque procédure du projet impliquera des animaux à un stade de développement où le système auditif périphérique et central est totalement mature (>6 semaines). Cependant, les souris qui sont largement utilisées en laboratoire commencent à présenter des pertes auditives à partir de 15 semaines, c’est pourquoi nous utiliserons des souris plutôt jeunes (6 à 10 semaines) pour les expériences d’exploration de la fonction auditive. Les expériences comportementales durent plus longtemps et seront réalisées sur des souris entre 4 et 14 semaines. Les expériences sur les gerbilles seront réalisées à des âges identiques car les trajectoires de développement sont similaires.
Contrôle de la régression tumorale à long terme par les lymphocytes T antiviraux modifiés génétiquement
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules leucémiques dans la veine de la queue, puis d'un traitement cellulaire, prélevées de sang sept fois et passées sept fois sous imagerie sous anesthésie de quarante minutes, 36 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La leucémie qui s'installe se traduit par des poils hérissés, une baisse d'activité, une perte de poids et, dans les cas extrêmes, un début de paralysie des pattes arrière, auxquels peuvent s'ajouter des signes de maladie du greffon contre l'hôte avec lésions cutanées et diarrhées. L'objectif déclaré est de comparer un nouveau type de lymphocyte anticancéreux issu de donneurs sains au traitement de référence, sur un suivi porté à 56 jours. Aucune souris n'est gardée au-delà de ces 56 jours, ni au-delà du point limite atteint.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse à partir des cellules du patient modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses (appelées CAR-T cells) permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells. Après avoir montré que les cellules issues d’un seul donneur sont aussi efficaces que le traitement actuel, nous devons reproduire ces résultats sur des cellules provenant de deux autres donneurs, et assurer un suivi d’efficacité plus long, jusqu’à 56 jours
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer avec certitude si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique reproductible et comparable au traitement de référence par CAR-T cells, et plus long, afin de permettre la mise au point de traitements efficaces à long terme.
Procédures
- Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - 7 prélèvements d’une goutte de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - 7 Imageries sous anesthésie (40min)
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse est de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction. - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Dans les semaines qui suivent l’injection des cellules d’intérêts (CAR T cells ou CAR VST), les souris peuvent présenter des signes de maladie de greffon contre l’hôte, caractérisés par une perte de poids, une altération de la fourrure avec lésions cutanées, un mal-être et des diarrhées. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, sous contention douce.
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 56 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour valider lepotentiel anti-leucémique des cellules issues de donneur sains de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés de façon à obtenir des effets significatifs avec un nombre minimum d’animaux. Nos précédents travaux nous ont permis de déterminer ce nombre via l’utilisation d’un logiciel appliqué.
Raffinement
Les souris seront logées dans de grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien ventilée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Offre de prestation pour évaluer les candidats médicaments : étude de l’audition et de la réponse immunitaire sur des modèles pathologiques inflammatoires chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
L'évaluation de candidats médicaments pour des clients extérieurs est ici vendue comme une prestation. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte des tissus. Elles reçoivent des composés pro-inflammatoires, parfois directement dans l'oreille sous anesthésie, puis des candidats médicaments jusqu'à sept jours de suite, avec une mesure de l'audition sous anesthésie générale de deux heures chaque semaine. Le porteur attend des gonflements articulaires, des boiteries, une altération de l'état général à partir du troisième jour et une perte d'audition moyenne, et qualifie le recours aux animaux non-humains d'"indispensable" faute de méthode validée pour reproduire une inflammation systémique. La prestation est adossée à une thèse financée par un contrat industriel, qui doit aboutir à au moins une publication.
Objectifs
Les maladies auto-immunes touchent environ 4% de la population. Ces maladies se produisent lorsque le système immunitaire du corps attaque par erreur ses propres tissus sains. Parmi ces maladies, la polyarthrite rhumatoïde est particulièrement répandue. Elle provoque principalement une inflammation des articulations, mais peut aussi affecter d'autres parties du corps, y compris l'audition. Des études récentes ont montré que les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde ont un risque plus élevé de souffrir de perte auditive que la population générale. Cette perte d'audition peut toucher jusqu'à 40% des patients, ce qui en fait un problème de santé important mais souvent négligé. L'inflammation générale du corps causée par la polyarthrite rhumatoïde pourrait être responsable de ces problèmes auditifs. Elle pourrait affecter les vaisseaux sanguins et le fonctionnement de l'oreille interne. De plus, certains médicaments utilisés pour traiter la polyarthrite rhumatoïde peuvent avoir des effets négatifs sur l'audition. Pour mieux comprendre ce lien entre inflammation et perte auditive, les chercheurs utilisent des modèles animaux. Ces modèles permettent d'étudier comment l'inflammation affecte l'oreille et l'audition. Ils montrent que l'inflammation peut endommager les cellules de l'oreille interne responsables de la perception des sons. Comprendre cette relation entre la polyarthrite rhumatoïde et la perte auditive pourrait aider à améliorer la qualité de vie des patients. Cela pourrait conduire à de meilleurs traitements et à une prise en charge plus complète de la santé des personnes atteintes de maladies auto-immunes.
Bénéfices attendus
Le projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant les maladies inflammatoires et la perte auditive. Ces connaissances pourraient guider le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou traiter efficacement ces troubles, améliorant ainsi la qualité de vie des patients et réduisant les impacts sur le système de santé. Une thèse CIFRE vient de débuter afin de mettre au point les 2 premiers modèles décrits dans ce projet et pourra aboutir à au moins 1 publication dans un journal international.
Procédures
L'administration de composés à tester ou de produits de référence suivent les bonnes pratiques vétérinaires et sont des gestes nécessitant quelques dizaines de secondes à moins de 5 minutes. Les composés pro-inflammatoires seront administrés 1 à 3 fois dans l'étude, sur animal anesthésié lorsque l'administration est réalisée directement dans l'oreille (phase de 30 minutes maximum), et sur animal vigile lorsqu'il s'agit des autres voies d'administration. Les candidats médicaments seront administrés tous les jours, au maximum pendant 7 jours, directement dans l'oreille (animal anesthésié, au maximum 30 minutes) ou par voie orale (animal vigile) La mesure de l'audition sera réalisée sous anesthésie générale (2 h) 1 fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables incluent des douleurs, des gonflements des articulations pouvant se traduire par des boiteries, des difficultés locomotrices et une altération de l’état général des animaux à partir du 3ème jour après l’injection et le temps de la durée de l’étude. Une perte d’audition moyenne est attendue.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car la collecte des différents tissus pour analyse histologique requiert l’euthanasie des animaux.
Remplacement
Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complémentaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux. Dans ce but, nous envisageons, en collaboration avec notre partenaire, le développement d’organoïdes lymphoïdes (des modèles in vitro de culture cellulaire complexes) pour approfondir l’étude des mécanismes immunitaires liés au processus d’induction d’auto-immunité. Toutefois les composés qui rentrent en phase de test in vivo ont préalablement démontré une activité pharmacologique intéressante pour le traitement de maladies inflammatoires Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthode alternative validée pour mimer l’inflammation systémique Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction d’une inflammation systémique et ces effets sur la perte auditive, afin de développer à terme, des nouvelles thérapies pour traiter ces pertes d’auditions. Ceci nécessite des modèles expérimentaux dotés d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé pour assurer que les résultats soient statistiquement significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. En ce qui concerne les modèles de polyarthrite rhumatoïde, le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrite chez la souris et le degré de variabilité expérimentale liée à la magnitude de la réponse immunitaire. En ce qui concerne les autres modèles inflammatoires, le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’études publiées dans la bibliographie et le degré de variabilité expérimentale liée à la réponse immunitaire.
Raffinement
Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique aux rongeurs mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. De l’aliment (gel Diet) sera mis sur le sol des cages après l’administration des composés si nécessaire afin de faciliter l’accès à la nourriture. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15 minutes les animaux sont placés sur des tapis chauffants et un gel oculaire est appliqué. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquelles des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet. Le choix de la souche est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à développer les modèles inflammatoires d’intérêt. Ces souches de souris sont aussi adaptées pour le suivi des mesures de leurs capacités auditives. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte.
Investigation du mécanisme d’action d’une approche de thérapie cellulaire chez la souris âgée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
864 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 480 irradiées pour préparer une greffe, 64 soumises à une chimiothérapie de conditionnement et 160 nouveau-nés transplantés dès la naissance, 128 d'entre eux recevant une seconde transplantation neuf à douze mois plus tard. Une irradiation de moins de cinq minutes, que le porteur qualifie de "rapide et non douloureuse", précède la greffe, alors qu'il attend par ailleurs un amaigrissement et une anémie liés au conditionnement. Les animaux âgés de neuf à douze mois sont retenus parce que leur thymus vieilli ressemble à celui de patients humains conditionnés pour une greffe de moelle osseuse. Toutes sont tuées pour le prélèvement de la moelle osseuse, de la rate et du thymus, à l'appui de bénéfices annoncés en termes d'essais cliniques et d'économies pour les systèmes de santé.
Objectifs
La greffe de cellules souches du sang, appelées aussi cellules souches hématopoïétiques (CSH), est le traitement de référence pour de nombreuses maladies du sang, malignes (comme les leucémies ou les lymphomes) et non malignes (incluant les déficits immunitaires, en particulier chez les enfants). Cependant, la maladie du greffon contre l'hôte, les infections et les rechutes sont des obstacles majeurs au succès de cette thérapie. Certains de ces obstacles sont liés à une lente reconstitution du système immunitaire après la greffe de CSH. Dans ce contexte, une nouvelle stratégie thérapeutique a été développé pour améliorer la régénération immunitaire lors des greffes de CSH et augmenter la chance de survie des patients greffés. Cette stratégie repose sur la production in vitro de progéniteurs lymphoïdes et leur greffe, pour favoriser une production rapide de cellules immunitaires. Par rapport à la transplantation de CSH, la transplantation des progéniteurs lymphoïdes à des souris immunodéficientes nouveau-nées conduit à une régénération plus rapide des cellules du système immunitaire qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes et les cellules cancéreuses. Les progéniteurs lymphoïdes transplantés sont immatures, une caractéristique qui confère une grande sécurité à ce produit en termes de risque de maladie du greffon contre l’hôte. Toutes ces caractéristiques soulignent un fort potentiel d’applications cliniques pour accélérer la reconstitution immunitaire et surmonter les complications post-transplantation. Nos objectifs de recherche du projet proposé sont de tester ces progéniteurs T produits in vitro pour leur capacité à régénérer les lymphocytes T de patients âgés. En effet, avec l’âge, le thymus, organe jouant un rôle central dans la production des lymphocytes T, fonctionne moins bien ce qui complique la reconstruction du système immunitaire. De précédentes études expérimentales ont suggéré que l’ajout de progéniteurs lymphoïdes lors de la transplantation de CSH améliorerait le fonctionnement du thymus. Ce processus encore mal compris nécessite une investigation approfondie pour en optimiser les effets dans le cadre de futures applications thérapeutiques de ces progéniteurs chez les personnes âgées. Cela passe par une meilleure compréhension des mécanismes de vieillissement et par l'amélioration du système immunitaire après la greffe, dans le but d'augmenter les chances de survie des patients.
Bénéfices attendus
Le projet actuel présente des bénéfices potentiels significatifs, tant à court qu'à long terme. Tout d'abord, les résultats attendus permettront d’approfondir la connaissance du produit de thérapie cellulaire à base de progéniteurs lymphoïdes T. Ce projet permettra d'éclaircir son mode d'action chez les individus âgés, d'affiner ses caractéristiques de qualité et d'évaluer son efficacité au-delà de la simple reconstitution des lymphocytes T. Ces découvertes pourraient déboucher sur de nouveaux essais cliniques ou sur l'optimisation des essais en cours, favorisant ainsi des avancées thérapeutiques. En outre, ce projet ouvre la voie à l'élargissement des applications thérapeutiques du produit, initialement conçu pour traiter l'immunodéficience combinée sévère chez les enfants. Les progéniteurs lymphoïdes pourraient également bénéficier à d'autres groupes de patients, notamment ceux dont la fonction thymique est diminuée, que ce soit en raison du vieillissement, du VIH/SIDA ou de l'exposition aux radiations ionisantes. Cela pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces populations vulnérables. Enfin, d'un point de vue sociétal et économique, les progéniteurs lymphoïdes pourraient réduire les hospitalisations post-greffe de cellules souches hématopoïétiques et diminuer les risques de rechutes, entraînant ainsi des économies substantielles pour les patients et les systèmes de santé. Ces bénéfices contribueront non seulement à l'amélioration des traitements actuels, mais aussi à la réduction des coûts de santé à l'échelle globale. Ce projet vise également à approfondir notre compréhension des processus de vieillissement, de dégénérescence et de régénération du thymus, organe essentiel pour la production de cellules du système immunitaire. Il propose notamment d'identifier des molécules capables d'influencer le vieillissement immunitaire et les altérations du thymus. Une connaissance fine des mécanismes permettrait une régénération de l'architecture thymique dégradée avec l’âge et faciliter une greffe plus efficace des progéniteurs lymphoïdes et une meilleure reconstitution des cellules immunitaires.
Procédures
480 animaux vigiles seront conditionnés à la greffe par une irradiation d'une durée inférieure à 5 minutes. Ce procédé est rapide et non douloureux. 64 animaux vigiles recevront une chimiothérapie de conditionnement pour la greffe, chaque traitement durant environ 1 minute/animal. 96 animaux, sous anesthésie gazeuse, recevront des molécules de régénération du thymus d’une durée de 1 minute/traitement et un seul traitement/animal. 96 animaux vigiles recevront en vigile différentes molécules de conditionnement/régénération du thymus chaque jour pendant 15 jours, chaque traitement durant 1 minute/animal. 704 animaux sous anesthésie gazeuse seront transplantés avec des cellules souches/progénitrices, durée de l’action 1 minute/animal. 160 animaux nouveau-nés vigiles recevront une transplantation de cellules (1 minute/animal). 128 d’entre eux recevront sous anesthésie une seconde transplantation, 9 à 12 mois plus tard, chaque action durant 1 minute, une seule action/animal. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront un prélèvement sanguin juste avant leur euthanasie. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront deux prélèvements sanguins au cours de leur suivi, à au moins 5 mois d’intervalle. Chaque prélèvement sanguin dure environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les conditionnements à la greffe (chimiothérapie ou irradiation), nécessaires pour préparer l’organisme à recevoir une greffe de CSH et mimer ainsi les conditions des patients humains, peuvent occasionner chez la souris des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress transitoire. Le traitement par voie orale peut provoquer un stress, une douleur, et une légère irritation au niveau de l’œsophage chez l’animal surtout lors des traitements en continu. L’anesthésie gazeuse générale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux.
Devenir
Afin de mesurer la production des cellules lymphoïdes T humaines après injection, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (Moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou non de l’injection effectuée.
Remplacement
Ce projet n'a pas d'alternative non animale. L’utilisation d’un modèle préclinique in vivo capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’Homme est indispensable pour évaluer et comprendre les effets de la greffe de progéniteurs lymphoïdes sur la reconstitution du système immunitaire. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine
Réduction
Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Toutes les souris sont hébergées en portoir à cages ventilées dans une pièce avec un cycle jour/nuit de 12h/12h. Chaque cage est indépendante des autres, l’air entrant est filtré et l’eau utilisé est filtrée, et donc constitue une entité séparée. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires chez les animaux greffés. Toute irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. Les greffes seront précédées par une anesthésie générale. Lors des greffes chez le nouveau-né, l’expérimentateur transfère l’odeur de la cage sur ses gants en le frottant sur la litière pour ne pas risquer une réaction négative de la mère par rapport à ses petits. En outre, les mères sont isolées durant les greffes afin de diminuer leur stress durant la manipulation des petits. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l’euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes qui reproduisent de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l’Homme. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines normales et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Nous utiliserons les souris âgées entre 9 et 12 mois. Le thymus des souris immunodéficientes âgées ressemble à celui des patients humains atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients. Nous utiliserons aussi les animaux nouveau-nés pour humaniser leur système hématopoïétique sans passer par l’irradiation.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique dans des modèles de neuropathies douloureuses chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 844
1 170 souris et 844 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour le prélèvement de nerfs et de cerveaux. Trois chirurgies sont prévues : l'injection d'un candidat médicament directement dans le nerf sciatique ou facial, la ligature de ce nerf, puis sa ligature ou sa section pour installer une neuropathie traumatique. S'y ajoutent une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie et des tests comportementaux hebdomadaires, sur des animaux chez qui le porteur attend des douleurs neuropathiques, une mobilité réduite et, dans certains groupes, une obésité et une hyperglycémie sur six à dix semaines. Il annonce des essais chez l'être humain entre 2027 et 2029 et conclut que l'expérimentation animale reste "le seul véritable moyen" d'aborder ces maladies du nerf.
Objectifs
Le système nerveux périphérique des mammifères est composé des nerfs qui commandent les mouvements (motoneurones) et des nerfs qui renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps (neurones sensitifs). Le dysfonctionnement des motoneurones entraîne une faiblesse ou paralysie musculaire alors que celui des neurones sensitifs entraîne une sensibilité anormale ou une perte de sensibilité. La douleur neuropathique résulte d’une lésion ou d’un dysfonctionnement du système nerveux et peut également provenir d’une complication du diabète. Pour traiter la douleur, différents types d’analgésiques sont utilisés: les anti-inflammatoires et les opioïdes lors de douleurs intenses. Cependant les opioïdes peuvent créer une dépendance. L’objectif du projet est de valider des nouvelles approches thérapeutiques pour introduire dans les cellules des nerfs des candidats médicaments efficaces pendant plusieurs années pour prévenir ou réduire les troubles moteurs et sensoriels responsables de la douleur. Les traitements seront directement injectés dans les nerfs chez des modèles de rongeurs de neuropathies douloureuses. Ce projet validera nos candidats médicaments en vue de futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
Avantages court-terme: Ce projet doit nous permettre de valider notre stratégie thérapeutique pour réaliser par la suite des essais cliniques et créer une biobanque pour des analyses ultérieures. Les résultats seront publiés. Avantages à long terme: Cette approche thérapeutique permettrait d’administrer une fois tous les 10 ans, un traitement non toxique et stable aux patients. L’injection locale envisagée n’endommage pas le nerf et évite une dissémination des vecteurs dans tout l’organisme avec pour objectif la diminution des symptômes existants et l’arrêt de l’évolution et possible réversion de la maladie. Nous prévoyons les premiers essais chez l’Homme entre 2027 et 2029 et l’approbation pour la mise sur le marché entre 2029 et 2032.
Procédures
- Trois types de chirurgies o La première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent et consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques ou le nerf facial. Elle durera 20-30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisé. o La deuxième chirurgie de ligature unilatérale du nerf sciatique ou facial sera effectuée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent. Elle durera 15 à 30 minutes. o La troisième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique (ligature ou transection du nerf sciatique) sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent. Elle durera 15 à 20 minutes. - L’analyse de la conduction nerveuse du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 20 minutes. - Les tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois par semaine sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
- Chirurgies selon les bonnes pratiques vétérinaires - Douleurs post-opératoires (4 jours) traitées par des analgésiques puissants - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité - Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) - Nuisance associée au diabète : obésité, hyperglycémie (6 à 10 semaines et une évolution progressive). Dans les modèles de névralgie faciale, les animaux présenteront une gêne au niveau de la face en ipsilatéral à la ligature ou compression du nerf facial. Dans le modèle de neuropathie douloureuse, les animaux présenteront une gêne au niveau de la patte en ipsilatéral à la ligature ou transection du nerf sciatique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons des tissus (nerfs, cerveaux) pour étudier l’effet du traitement sur les pathologies étudiées.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude, qui repose principalement sur une profonde collaboration entre la myéline et les axones qu'elles couvrent, rend difficile la modélisation et la reproduction complète du système in vitro. Il existe des méthodes pour étudier les nerfs mais leur structure obtenue par ces méthodes reste incomplète et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il a été montré que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
L’étude du nombre d’animaux utilisés dans les articles scientifiques ainsi qu’à partir de nos données internes sur lesquelles nous avons réalisé des tests de puissance statistique avec un logiciel spécialisé nous ont permis de déterminer le nombre d’animaux composant chaque groupe expérimental. Nous avons prévu de faire des calculs de puissance statistique sur les cohortes recevant la première dose avant de tester la deuxième dose afin de réduire si nécessaire le nombre d’animaux. Les procédures 2 à 4 sont des études longitudinales. Cette démarche permet de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Le nombre exact d’animaux nécessaire aux études sera commandé auprès de fournisseurs agréés pour limiter la production d’animaux inutiles. Dans la procédure 1, dans la mesure du possible nous réutiliserons les animaux n’ayant passés que des tests de comportement pour de la formation en chirurgie et en électrophysiologie s’il y a un nouvel employé à former sur ces tests.
Raffinement
Les rongeurs auront une période d'acclimatation de 5 jours lors de laquelle ils ne seront pas dérangés puis une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée à partir du 6ème jour pour diminuer leur stress. Ils seront observés quotidiennement par du personnel formé et compétent. Les conditions d'hébergement des rats et souris respecteront les bonnes pratiques en matière d'hébergement (matériel de nidification, copeaux, frisottis et maison en carton). La fréquence du change des cages et des biberons des souris diabétiques sera augmentée. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie et la prise en charge de la douleur pré et post opératoire sera traitée par l’utilisation d’analgésiques puissants. Les points limites précis et spécifiques du projet seront appliqués de manière stricte. La méthode d'injection locale des vecteurs viraux est un raffinement par rapport à l'injection systémique (diminution de la dissémination et des effets secondaires). Des fiches de suivi des animaux sont mises en place pour évaluer la sévérité de la neuropathie et l'état clinique des animaux en post-opératoire. Selon des critères précis pour une évaluation de la souffrance animale, il y aura une discussion avec le vétérinaire et/ou la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) pour décider des soins à apporter. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, en cas de déshydratation un apport d'eau gélifiée ou une injection sous-cutanée d'une solution isotonique d'électrolytes pourra être effectuée et en cas de perte de poids ou d'état affaibli, de la nourriture humidifiée sera déposée sur le sol de la cage. Avant leur mise à mort, les souris et les rats seront sédatés.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de rongeurs, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Différents modèles de douleurs neuropathiques existent à la fois chez le rat mais aussi chez la souris, nous avons choisis d’utiliser les modèles les plus pertinents et les plus étudiés en recherche fondamentale pour évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments afin de pouvoir anticiper les résultats que nous pourrons obtenir chez le gros animal avant d’évaluer leur efficacité chez l’homme. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements soit au début de l’apparition des symptômes pour prévenir la démyélinisation pathologique ou la dégénération axonale (stade précoce), soit une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin de bloquer la progression de la maladie ou de favoriser la régénération. Rat/souris : mâle et femelle jeunes adultes (4 à 6 semaines d’âge) et adultes (8 semaines d’âge).
Le rôle des macrophages dans les défenses immunitaires dirigées contre le cancer du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 266 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, des injections intrapéritonéales et intraveineuses de traitements, puis deux mesures de tumeur par semaine au pied à coulisse. Le porteur annonce une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, l'objectif restant de comprendre comment un type de macrophage récemment décrit participe aux défenses contre le cancer du sein. Sur le remplacement, il affirme que la complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires rend l'expérimentation animale "indispensable", après des modélisations informatiques et des cultures cellulaires menées en amont.
Objectifs
Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à se défendre. On en trouve en grande quantité dans les tumeurs. Notre équipe a découvert un nouveau type de macrophages dans les cancers du sein. Au début du cancer du sein, ces macrophages aident d'autres cellules de notre système de défense (les lymphocytes) à détruire les cellules cancéreuses. Mais si la tumeur continue de se développer, les macrophages peuvent arrêter de fonctionner correctement, ce qui rend nos défenses moins capable de combattre la tumeur. Nos buts sont : 1. Comprendre comment ces macrophages aident à combattre le cancer. 2. Étudier ce qui les empêche de bien fonctionner.
Bénéfices attendus
Les macrophages sont des cellules qui aident notre corps à combattre le cancer. Les scientifiques les voient comme des cibles importantes pour les traitements contre le cancer. Notre projet vise à comprendre comment ces cellules aident à lutter contre le cancer pour trouver de meilleurs traitements.
Procédures
1- biopsie de la queue (5 secondes/souris). 2- Injection sous-cutanée de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire (5 secondes/souris). 3- Injection intrapéritoneale de différents traitements (5 secondes/souris). 4- Injection intraveineuse de différents traitements (5 secondes/souris). 5- Mesure de la croissance tumorale au pied à coulisse 2 fois par semaines (20 secondes/souris)
Impact sur les animaux
- biopsie au niveau de la queue induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - injection intrapéritonéale de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Injection intraveineuse de traitements induisant une légère douleur et un léger stress de courte durée. - Anesthésie générale lors de la greffe de tumeur entraînerant un léger stress de courte durée. - Injection sous-cutanée de tumeurs entraînerant une douleur légère de courte durée. - La croissance des tumeurs entraînerant une douleur modérée, une gêne à la locomotion et une baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque expériences pour analyser les tissus cancéreux et pour analyser les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs. Les mâles reproducteurs seront mis à mort à l'issue de leur période reproductive.
Remplacement
La complexité des interactions entre cellules tumorales et immunitaires ne peut être modélisée de manière complète in vitro, rendant l’expérimentation animale indispensable. Toutefois, des modélisations informatiques et des cultures cellulaires ont été réalisées en amont afin de limiter autant que possible l’usage d’animaux.
Réduction
Nous utilisons des tests statistiques adaptés pour réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour mener à bien ce projet tout en assurant des résultats interprétables. Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques sur chaque animal permettant de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences.
Raffinement
Afin de minimiser l'impact des procédures sur le bien-être animal, nous anesthésions les souris dans tous les protocoles incluant des injections susceptibles de causer des douleurs. Nous réalisons une surveillance rapprochée des animaux et nous avons établis des points limites adaptés pour réduire leur souffrance. Des points limites intermédiaires sont aussi mis en place lorsque les animaux présentent des premiers signes de douleur ou de détresse: nous placerons si nécessaire de la nourriture gélifiée dans les cages. Enfin si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour la recherche en immunologie et en thérapeutique du cancer. Sa grande homologie avec l’humain permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes pour étudier un système immunitaire mature et une croissance tumorale adaptée.
Développement de CAR-T cells à visée thérapeutique pour la thérapie des cancers dans un modèle de souris immunodéprimées NSG NOD-SCID (mus musculus).
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées sous la peau avec des cellules de cancer humain, pesées dix fois, injectées par voie intraveineuse de lymphocytes CAR-T, mesurées quinze fois au pied à coulisse sur cinq semaines et prélevées de sang à cinq reprises sous anesthésie, 1 500 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que la tumeur grossit sur le flanc et que des effets indésirables apparaissent en fin d'expérience, surtout dans les groupes témoins laissés sans traitement. L'objectif déclaré est de sélectionner le meilleur lymphocyte CAR-T anticancéreux en vue d'essais cliniques. Toutes sont tuées pour que leurs tumeurs et leurs tissus soient prélevés et analysés.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d'un nouveau traitement anti-O-Acétyl GD2 (OAcGD2) dans un modèle de souris greffées en sous cutanée avec des cellules de cancers humains ou PDX (Patient-Derived Xenograft, en bref des tumeurs de patient d'origine humaines.) Cette possibilité d’utiliser ce nouveau traitement plutôt que des anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients sans les contraintes des multiples injections. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester nos différentes constructions sur des modèles de tumeurs xénogéniques.
Bénéfices attendus
Le meilleur CAR-T thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles thérapies sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.
Procédures
Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intraveineuse CAR-T sur animal vigile (1 injection, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 24 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements, 2 minutes maximum chacune + temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 3/4 jours sur environ 5 semaines (15 mesures, maximum 1 minute / animal = 15 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liés à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration de la tumeur puis du traitements (injections sous-cutanées puis intraveineuse). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation d’une tumeur sur le flanc de l’animal, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les CAR-T (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe attachée à cette demande de projet.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des CAR-T et de réaliser également des analyses complémentaires
Remplacement
Avant de réaliser ce projet, les CAR-T cells ont été caractérisés in vitro afin de vérifier que les cellules CAR-T ont bien été modifiées et qu'elles expriment le récepteur chimérique correct. De plus, un test fonctionnel permettant de visualiser en temps réel la destruction des cellules tumorales par les CAR-T a été également réalisé. Cependant, aujourd’hui il est impossible de reproduire les tissus tumoraux dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation et le développement du modèle par notre partenaire, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris maximum par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application d'un anesthésique local sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en immunologie. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe partenaire a déjà évalué des traitements de d’autres CAR-T et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 7 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 7 semaines avaient également été utilisées dans des traitements avec des anticorps.
Pharmacocinétique, Biodistribution et Immunogénicité
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 26000
Cochons d'Inde : 4800
Hamsters dorés : 4800
Lapins : 11500
73 100 animaux non-humains vont être utilisés sur la durée du projet, 26 000 souris, 26 000 rats, 11 500 lapins, 4 800 cobayes et 4 800 hamsters dorés, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun reçoit des administrations par voie orale, intraveineuse, intra-artérielle, sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire ou intranasale, possiblement quotidiennes jusqu'à la mise à mort, avec des prélèvements répétés. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer des douleurs aux sites d'administration et de prélèvement, ainsi que celles liées à la toxicité éventuelle de la substance testée. Il s'agit d'une prestation pour l'industrie pharmaceutique et agroalimentaire, une centaine d'études par an, dont le bénéfice annoncé, améliorer la santé humaine, reste énoncé comme une finalité générale.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la pharmacocinétique, l'immunogénicité et la biodistribution de substances pour l’industrie pharmaceutique chez les rongeurs, de type rat, souris, hamster et cobaye et chez les lagomorphes de type lapin. La pharmacocinétique permet d'étudier le devenir d'une substance, contenue dans un médicament, dans l'organisme après son administration selon différentes voies d'administration. L’immunogénicité permet d’étudier une réponse immunitaire induite par les vaccins et les adjuvants. La biodistribution permet d’étudier le devenir d'un candidat médicament dans l'organisme par l'analyse de l'évolution de ses concentrations dans l'urine, les fèces et le/les organe(s) cibles au cours du temps. Le nombre d'étude par an est d'environ 29 études pour la pharmacocinétique, 36 études pour l'immunogénicité et 36 études pour la biodistribution. Le nombre d'études par espèces est le suivant : Pour les pharmacocinétiques : - Rats : 10 études/an - Souris : 10 études/an - Cobayes : 3 études/an - Hamsters : 3 études/an - Lapins : 3 études/an. Pour les biodistributions : - Rats : 10 études/an - Souris : 10 études/an - Cobayes : 3 études/an - Hamsters : 3 études/an - Lapins : 10 études/an. Pour l'immunogénicité : - Rats : 10 études/an - Souris : 10 études/an - Cobayes : 3 études/an - Hamsters : 3 études/an - Lapins : 10 études/an.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’évaluer les essais de pharmacologies ainsi que la reponse de l’organise face a des substances et dispositifs pharmaceutiques ou agro-alimentaires sur des modèles animaux. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances ou dispositifs sur l’Homme afin de proposer des vaccins, des traitements ou des produits agro-alimentaires. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Les animaux sont utilisés dans le cadre d’études de pharmacocinétique, de biodistribution ou d’immunogénicité. Les animaux recevront des administrations par voie orale, intraveineuse, intra-artérielle, sous-cutanée, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, ou encore intra-nasale selon les besoins de l’étude. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. La durée de chaque traitement ne dépassera pas 10 minutes par animal. Les prélèvements durent 10 minutes maximum par animal. Le nombre maximum de prélèvements peut varier en fonction de l'étude mais ne peut dépasser les volumes et fréquences défini dans Diehl et al., A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes, J. Appl. Toxicol. 21, 145-23 (2001).
Impact sur les animaux
La procédure de pharmacocinétique peut provoquer des douleurs au niveau des sites d’administration et de prélèvements et du stress lié aux prélèvements répétés. La procédure de biodistribution et d’immunogénicité peut provoquer des douleurs diverses dues à la potentielle toxicité de la substance test. Ainsi que des douleurs liées aux prélèvements répétés pouvant se dérouler en cours d’étude.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique et des essais réglementaires, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les procédures décrites dans ce projet permettent d’obtenir des informations relatives au temps que passe la substance dans l’organisme pour la pharmacocinétique. La biodistribution permet d’obtenir des informations sur le déplacement de la substance dans l’organisme. Et l’immunogénicité perme d’assurer le potentiel protecteur et l’innocuité des vaccins et adjuvants testés. Ces signes ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel, comme décrit dans les procédures internes.
Raffinement
De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton ou encore des jouets sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration et en fonction de l’observation des animaux, si les points limites adaptés sont atteints, nous mettrons en place une analgésie adaptée. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) est mis en place en fonction des observations quotidiennes. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème au niveau du site d’administration) après chaque traitement peut être réalisée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs et les lagomorphes sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Nouvelle stratégie médicamenteuse pour améliorer la mémoire dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Deux injections intrapéritonéales par semaine pendant 30 à 36 semaines, sur animal maintenu en contention, précèdent un acte chirurgical mené sous anesthésie profonde sans réveil. 192 souris d'un modèle de maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les tests de mémoire, de locomotion, d'anxiété et d'anhédonie, jusqu'à trois expositions à six tests différents, sont décrits comme n'engendrant "aucune nuisance chez l'animal", alors que le porteur attend par ailleurs un stress physique et une douleur liés aux injections répétées. Toutes sont mises à mort à la fin de l'étude et leurs cerveaux prélevés pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Plusieurs données de la littérature indiquent que l’inhibition d’une enzyme cérébrale, appelée phosphodiestérase, pourrait s’avérer être une stratégie intéressante pour traiter les troubles de la mémoire induits par la maladie d’Alzheimer. En parallèle, il a également été montré que l’activation de certains récepteurs cérébraux de la sérotonine engendrait des effets bénéfiques sur la mémoire chez l’animal. Notre hypothèse de recherche est que l’activation de ces récepteurs, conjuguée à l’inhibition des phosphodiestérases, exercerait des effets bénéfiques puissants sur la mémoire. Notre étude vise à démontrer, chez l’animal, la preuve de l’intérêt de cette association. Cette étude sera réalisée sur un modèle animal mimant la pathologie cérébrale et les troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider la preuve de concept de l’intérêt d’une association de deux agents pharmacologiques pour lutter contre les troubles de la mémoire chez la souris et permettra d’identifier les mécanismes cérébraux sous-jacents.
Procédures
Toutes les souris du projet seront exposées à : - 1 injection 2 fois par semaine pendant 36 semaines (Cohorte 1) ou 30 semaines (Cohorte 2) d’agents pharmacologiques. Cette injection (voie intra-péritonéale) nécessite une contention de l’animal et prendra environ une minute par souris. - Au maximum 3 expositions à 6 tests comportementaux d’une durée maximale de 10 minutes par exposition, selon le test utilisé. Les tests comportementaux choisis n’engendrent aucune nuisance chez l’animal. Ces tests ont pour but de tester la mémoire de reconnaissance, la mémoire de travail, la mémoire spatiale, les performances locomotrices, l’anxiété et l’anhédonie des animaux suite au traitement. Enfin, l’ensemble des souris du projet seront exposées à un acte chirurgical sans réveil, mené sous analgésie et anesthésie profonde, d’une durée inférieure à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux vont être exposés à des administrations par voie intra-péritonéale nécessitant une contention (nuisance modérée). Un stress physique et une douleur dus aux injections sont attendus lors de ces manipulations. Les animaux seron exposés à un acte chirurgical mené sous anesthésie et analgésie profondes (acte sans réveil).
Devenir
A l’issue de ce projet, les 192 souris seront mises à mort. Les cerveaux de tous ces animaux seront prélevés afin de réaliser des études post-mortem complémentaires.
Remplacement
Ce projet vise à favoriser le développement de nouveaux médicaments susceptibles d’avoir un intérêt dans le cadre de la prévention et/ou le traitement de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite (scientifiquement et règlementairement) l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive (ici des tests évaluant différents types de mémoire). Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé.
Réduction
Un total de 192 souris sera nécessaire pour cette étude. En faveur d’une réduction du nombre d’animaux utilisé, nous avons choisi d’utiliser à la fois des souris femelles et des souris mâles. En utilisant des mâles et des femelles issus des mêmes portées, nous éviterons une production excessive d’animaux. Cela permettra de limiter le nombre d’animaux excédentaires issus de l’élevage, qui, sans cette stratégie, seraient mis à mort sans avoir été utilisés. Nous avons également choisi de réaliser successivement les études comportementales d’une seule étude sur les mêmes souris et de poursuivre ces études comportementales par des mesures post-mortem.
Raffinement
Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de manipulation (handling) dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Ils seront surveillés quotidiennement et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Le site d’administration (droite ou gauche) pour les injections intra-péritonéales sera utilisé en alternance. Afin de réduire la douleur liée aux administrations chroniques, nous avons choisi de réaliser le traitement deux fois par semaine. Des points limites précoces et compatibles avec les objectifs scientifiques de notre recherche a ont été choisis. Pour la procédure chirurgicale sans réveil, les animaux seront analgésiés et anesthésiés profondément pour éviter toute douleur durant cette procédure.
Choix des espèces
Les souris font partie des espèces animales les plus exploitées en recherche biomédicale du fait de leur facilité de reproduction et de la similarité du système nerveux central qu’elles présentent avec l’Homme. Leur comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Les modèles murins possèdent une bonne faculté d’apprentissage justifiant leur utilisation dans l’étude de la mémoire. Des souris adultes (minimum 8 semaines d’âge) seront utilisées dans ce projet, un âge auquel les grandes fonctions physiologiques sont arrivées à maturité.
Stratégies de thérapie cellulaire et d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions du muscle squelettique.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une ablation partielle du quadriceps, une injection de toxine qui détruit les fibres musculaires, des électrostimulations sous anesthésie pendant 45 minutes : 1 224 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur reconnaît que l'ablation du quadriceps et la mesure de force in situ sont sources de douleur, et note que la mobilité revient deux heures après la chirurgie. L'objectif déclaré est de mettre au point des greffes de cellules souches musculaires pour réparer des pertes de muscle massives, l'expérimentation sur les souris servant à valider des données obtenues sur cellules humaines. Le choix de l'espèce, tel qu'il l'expose, tient à la disponibilité de lignées immunodéprimées et à une gestation courte, compatible avec la durée des expériences.
Objectifs
Le muscle squelettique adulte contient des cellules souches appelées Cellules Satellites (CS), qui lui permettent de se réparer après une blessure. Cependant, dans certaines conditions pathologiques (maladies musculaires) ou post-traumatiques (accidents, chirurgie), cette capacité de réparation est altérée, et le muscle ne peut plus fonctionner normalement. Nous utilisons les CS pour développer des traitements pour aider le muscle à se réparer après une lésion traumatique. Nos travaux s’articulent selon 3 projets de recherche : 1) L’optimisation des méthodes de purification des CS : nous améliorons les méthodes de purification des CS humaines pour augmenter la quantité de cellules obtenues et leur qualité pour la clinique, mais également des CS de souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche (Réduction). 2) Le développement de méthodes permettant de produire un nombre élevé de CS humaines in vitro tout en préservant leur pouvoir réparateur (capacité à réparer un muscle endommagé et à reconstituer un pool de CS appelé auto-renouvellement). 3) Le développement de stratégies de médecine régénérative pour réparer les lésions musculaires massives post-opératoires ou post-traumatiques, pour lesquelles il n’existe pas de traitement à ce jour. Nous étudions le potentiel thérapeutique de nouveaux matériaux associés à différentes sources de cellules ayant un pouvoir de réparation du muscle (les CS et les cellules souches pluripotentes induites [iPSC] humaines).
Bénéfices attendus
Projet 1 : Court terme : Améliorer le rendement de purification des CS de rongeurs permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés la recherche pré-clinique sur les CS. Long terme : Améliorer le rendement de purification des CS humaines permettra de franchir une étape vers leur utilisation clinique en thérapie cellulaire. Projet 2 : Court terme : Nos expériences permettront de mieux comprendre la façon dont les CS humaines fonctionnent et ainsi d’élaborer une méthode pour préserver leurs pouvoir réparateur in vitro. Long terme : Préserver le pouvoir réparateur des CS humaines permettra d’élaborer des traitements pour les lésions musculaires localisées (ex : l’insuffisance urinaire et certaines pathologies musculaires). Projet 3 : Court terme : Notre projet permettra de mieux comprendre les évènements intervenant lors d’une lésion massive des muscles (ou VML), et de développer des approches de médecine régénérative pour remplacer le muscle lésé. Long terme : Nos approches de médecine régénérative conduiront vers le développement clinique de stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de lésions musculaires massives.
Procédures
4 injections intrapéritonéales (IP) sur animal vigile : 2 min (1 fois/jour) ; 1 injection intramusculaire (IM) sous anesthésie générale : 10 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesure force musculaire : 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie et électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min. 1 injection IP sur animal vigile : 2 min ; chirurgie sous anesthésie générale : 30 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min. Mesures extension du genou sous électrostimulations sous anesthésie générale : 45 min ; injection en sous-cutanée (SC) : 2 min (3 fois/souris).
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales peuvent générer un inconfort passager pendant l’injection. Aucune perte de mobilité n’a été constatée. L’injection intramusculaire d’une toxine induisant une destruction des fibres musculaires est source de douleur. Les animaux retrouvent leur mobilité 10 à 15 min maximum après l’injection. L’ablation partielle du quadriceps est source de douleur pour l’animal. Les animaux retrouvent leur mobilité totale 2h après la chirurgie. La mesure de force musculaire in situ est source de douleur. Les électro-stimulations réalisées sur les muscles d’animaux anesthésiés sont de faible intensité mais peuvent être source d’inconfort. Aucune perte de mobilité n’est constatée. Pour toutes les procédures, des points limites adaptés ont été déterminés et seront appliqués.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures.
Remplacement
Pour l’ensemble de nos projets, les expériences seront réalisées en priorité sur des CS humaines quand cela sera possible. L’expérimentation sur les animaux ne sera utilisée que pour valider nos données in vitro et in silico (Evaluation du potentiel de greffes des hCS préamplifiées in vitro), ou lorsque les processus biologiques doivent être étudiés au niveau de l'organisme entier (Approches d’ingénierie tissulaire pour la réparation des lésions VML). Ces projets pré-cliniques ont un fort potentiel translationnel pour le traitement des lésions musculaires focales et des lésions musculaires massives (VML), et doivent donc être validés in vivo sur l’animal avant d'envisager un transfert vers la clinique.
Réduction
Afin de respecter le principe de Réduction dans nos projets, nous avons calculé le nombre d’animaux minimum (strictement nécessaire) par des analyses statistiques (test de puissance). Pour les différents axes, le nombre d’animaux a été calculé indépendamment, en tenant compte des résultats déjà obtenus, de la variabilité inhérente aux différentes procédures expérimentales, et des résultats déjà disponibles dans la littérature scientifique. De plus, toutes les expériences seront conçues et programmées de manière à recueillir le maximum de données par animal. Par exemple, un même muscle sera utilisé pour la mesure de force et plusieurs autres analyses.
Raffinement
Le concepteur et l’applicateur du protocole prendront les dispositions appropriées pour éviter toute souffrance, douleur, angoisse ou inconfort aux animaux. Les expérimentations seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté. Le milieu sera enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, abris en carton, carré de coton compacté et billes de bois. Les protocoles d’analgésie pré- et post-opératoires seront adaptés en fonction de la procédure expérimentale. Ils pourront également être adaptés pendant la réalisation des procédures de façon à limiter au maximum la douleur pouvant être ressentie par l’animal. Les procédures nécessitant l’anesthésie des animaux sont étudiées pour assurer une profondeur suffisante de l’anesthésie et pour limiter les difficultés de récupération pendant la phase de réveil des animaux. Pour prévenir tout risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur une plate-forme chauffante pendant l’intervention et la phase de réveil , et ne sont remis en stabulation qu’une fois actifs. Les animaux seront à nouveau contrôlés 2 heures après le réveil et de la nourriture humidifiée et de l’hydrogel seront placés dans la cage pour en faciliter l’accès, pendant les premières 24h suivant l’intervention, les potentiels signes de souffrance seront surveillés. Si l’un des point limites énumérés dans le projet était atteint, l’animal concerné serait immédiatement mis à mort (directive européenne 63/UE/2010).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour 2 principales raisons : (1) La disponibilité des modèles transgéniques reporteurs et immunodéprimés nécessaires à nos expériences de greffe, (2) La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Les expériences de greffe et de réparation post-lésionnelle ne peuvent être réalisées que sur des souris adultes en raison de la taille des souris. De plus, le processus d’auto-renouvellement des cellules souches (retour à l’état quiescent) ne peut être étudié que sur le muscle adulte.
Etude de l’origine des malformations cardiaques induites par la perte d’expression du gène Zic3 au cours du développement cardiaque précoce.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées pour le prélèvement de leurs organes, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les atteintes viennent de la lignée elle-même : presque tous les mâles reproducteurs présentent des déformations de la queue, environ 44 % une asymétrie des organes et environ 50 % des malformations cardiaques, que le porteur qualifie de sans impact sur leur physiologie et leur comportement. Aucun acte n'est pratiqué sur l'animal vivant, les embryons et les fœtus étant analysés à des stades successifs pour situer l'origine de ces malformations. Le porteur indique bâtir son projet autour de gastruloïdes cultivés in vitro, et conclut malgré tout que le recours au modèle vivant lui est "indispensable" pour caractériser les défauts anatomiques.
Objectifs
Les anomalies de notre gène d'intérêt sont associées à des anomalies du développement embryonnaire avec une asymétrie des organes. Les souris déficientes pour ce gène présentent des défauts similaires à ceux des patients et dans certains cas des défauts cardiaques particuliers. Le but du projet est de comprendre le role de ce gène au cours du développement cardiaque et particulièrement l’impact de sa perte dans l’apparition des défauts cardiaques. Le premier objectif est d’analyser l’anatomie cardiaque des embryons de souris déficientes dans ce gène afin de caractériser précisément le phénotype clinique. Le second objectif est d’identifier le stade et l’origine de ces malformations au cours du développement cardiaque précoce en analysant (moléculairement, cellulairement et anatomiquement) les embryons de façon temporelle en complément des études qui seront effectuées sur un modèle in vitro.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’améliorer nos connaissances sur l’origine physiopathologique des malformations cardiaques liées à la perte de fonction du gène afin de mieux appréhender l’importance de ce gène au cours du développement cardiaque, notamment lors du déploiement des différentes cellules progénitrices cardiaques. A plus long terme, les résultats issus du projet permettront d’améliorer nos connaisances, le diagnostique et la prise en charge des patients atteints de défauts cardiaques.
Procédures
Aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux en dehors de prélèvements d'organes en post mortem.
Impact sur les animaux
Chez les mâles reproducteurs, certains individus présentant des déformations de la queue (presque 100%), une asymétrie des organes (~44%), des malformations cardiaques (~50%) ainsi que variablement des malformations du cerveau sans impact sur la physiologie et le comportement des animaux. La sévérité et l’impact de ces défauts peuvent être variables. Chez les fœtus, nous nous attendons à des phénotypes proches de ceux rencontrés chez les mâles reproducteurs.
Devenir
A l'issue du projet, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes
Remplacement
Le point central du projet consiste à utiliser le modèle in vitro appelé « gastruloïde » qui mime les premières étapes du développement embryonnaire, afin de répondre au maximum aux questions biologiques à l’échelle moléculaire et cellulaire pouvant être adressées par un modèle simplifié en culture. Les gastruloïdes sont issus de l’aggrégat de cellules souches murines qui seront dérivées de souris controles ou mutantes. Malheureusement, les défauts physiopathologiques et anatomiques ne peuvent pas être modélisés avec les modèles in vitro. D’autant plus que la morphogénèse du cœur est étroitement liée à celles des autres organes et dépend de facteurs physiologiques. Ainsi, l’utilisation de modèle in vivo nous est indispensable pour la caractérisation des défauts et la validation des données qui seront obtenues in vitro.
Réduction
Pour le maintien de la colonie, un nombre minimal de souris mâles sera généré. Dans un but de réduction, ces mêmes mâles serviront à la deuxième procédure afin de générer des embryons qui seront étudiés par une approche séquentielle aux différents stades du développement embryonnaires, avant la naissance.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal sur l’ensemble de nos individus. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. Si des animaux venaient à être isolés (mâles reproducteurs, agressivité au sein du groupe…), la cage contiendra systématiquement deux enrichissements. La structure en charge du bien-être animal (SBEA)sera sollicitée pour des conseils pour limiter ces situations d’hébergement isolé. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (mains en coupelle et tunnels). Les individus mâles que nous allons générer pour le projet peuvent présenter des phénotypes connus et plus ou moins dommageables. Nous allons donc procéder à des observations quotidiennes très méticuleuses des animaux dès leur naissance, en utilisant une méthode de scoring pour évaluer les aspects physiques et comportementaux, de façon à identifier le plus tôt possible l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la SBEA. Seuls les mâles présentant le moins d’effets indésirables et sans aucuns signes de détresse et de souffrance seront maintenus pour le projet.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences hémodynamiques et de leurs causes génétiques Afin de réaliser une analyse précise des défauts nous utiliserons les stades embryonnaires qui correspondent aux stades précoces du développement cardiaque lorsque les premiers progéniteurs sont déployés et lors de la mise en place des axes de symétrie embryonnaire. Les stades plus tardifs seront nécessaires pour étudier de façon linéaire la progression des malformations cardiaque lors de l’embryogénèse des 4 chambres et des gros vaisseaux. Enfin le stade fœtal sera utilisé afin de caractériser les défauts morphologiques lorsque le cœur est complétement formé. Les mâles reproducteurs seront utilisés comme reproducteurs entre 8 semaines et 8 mois.
Etude de l’influence de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Immobilité, prostration, apathie, ou perte de plus de 20 % du poids : ces signes déclenchent la mise à mort immédiate de la souris. 1 340 souris vont être utilisées, 528 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 812 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever poumons, tissu nasal, rate, iléon, caecum et côlon. Une colite leur est provoquée par un agent chimique dans l'eau de boisson ou par gavage de la bactérie Citrobacter rodentium, avec diarrhée, sang dans les selles et perte de poids, avant une infection par un virus respiratoire ou trois vaccinations à trois semaines d'intervalle. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur sera donné, le porteur indiquant que ces traitements perturberaient les réponses immunitaires qu'il mesure.
Objectifs
L’objectif est d’évaluer l’influence de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire causée par l’infection de différentes souches de virus respiratoires ou la vaccination chez la souris. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont caractérisées par une inflammation chronique de la muqueuse intestinale. Les patients qui ont une inflammation intestinale ont une réponse immunitaire déréglée et il a été démontré qu’ils sont plus suceptibles de developper des infections par des virus respiratoires et qu’ils ont aussi plus de risque de présenter des complications après infection. Il est désomais bien établi qu’il existe une communication entre le système digestif et le système respiratoire. Notre objectif est de mieux comprendre l’influence d’une inflammation intestinale sur le developpement des réponses immunitaires après une infection pulmonaire à des virus respiratoires mais aussi après vaccination contre ces virus notamment ceux qui induisent la grippe ou la bronchiolite. Afin d’étudier les effets de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire, nous induirons une inflammation intestinale chez les souris, grâce à un agent chimique ou infectieux, qui modélisera une maladie inflammatoire chronique intestinale. Différents modèles d’inflammation intestinale seront testés car ils induisent des réponses différentes. Une fois l’inflammation intestinale établie, les souris seront infectées ou vaccinées et la réponse immunitaire muqueuse (nasale, pulmonaire, intestinale) et dans le sang sera ensuite évaluée.
Bénéfices attendus
La réponse immunitaire des patients atteints de maladies inflammatoires chronique de l’intestin est modifiée et les sujets sont plus susceptibles à des inflections notamment respiratoires et leur réponse à des vaccins peut aussi varier. Notre projet vise à étudier par quels mécanismes l’inflammation intestinale peut moduler la réponse immunitaire respiratoire. Nous regarderons l'immunité au niveau des muqueuses et dans le sang. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances dans ces maladies complexes et pourra permettre d’améliorer la prise en charge des patients et d’optimiser les thérapeutiques. Ces résultats seront également potentiellemnt applicables à des sujets présentant une inflammation intestinale induite par des infections entériques ou dans le cadre du syndrome de l’intestin irritable. Suite aux résultats obtenus dans ces expériences animales, nous pourrons envisager de confirmer les résultats lors d’une étude chez l'homme.
Procédures
L'inflammation intestinale sera générée soit par un agent chimique dans l’eau que les souris boiront, soit par gavage avec la bactérie Citrobacter rodentium. Pour le suivi de l'inflammation, des prélèvements de sang et de fèces seront réalisés pour doser des anticorps et différents marqueurs inflammatoires. Le prélèvement de sang au niveau de la joue dure 30 secondes. Pour le prélèvement de fécès, les souris seront isolées dans des boîtes individuelles. Le mouvement des souris qui y seront enfermées n’est pas entravé et l’isolement n’excèdera pas 20 minutes. Ces prélèvements seront fait trois fois lors de colite et infection ou sept fois lorsque les souris auront une colite puis une vaccination puis un challenge, avant chaque étape. Les souris seront soit infectées une fois par des virus respiratoires, soit elles seront vaccinées 3 fois à trois semaines d’intervalle. Pour ces gestes, les souris seront ansthésiées pour leur confort et éviter de fausses routes, le geste dure 30 secondes maximum. Suite à l'infection, nous euthanasierons les souris à plusieurs interavalles de temps (J1, J3, J7, J14 et J21). Dans certaines expériences clés, les souris vaccinées seront ensuite infectées afin de déterminer la protection induite par le vaccin. Avant la première immunisation, un jour avant chacune des autres immunisations et un jour avant la mise à mort, des prélèvements de fèces, sang et lavages vaginaux seront aussi effectués afin de mesurer les réponses anticorps dans ces prélèvements. Les prélèvements vaginaux seront effectués sur les souris femelles avec une pipette pour liquide visqueux pour doser les anticorps sécrétés au niveau des muqueuses. Lorsque l’on veut analyser la permabilité intestinale, les souris seront gavées avec un agent qui permet de visualiser la perméabilité de l'intestin, 4 heures avant la mise à mort. Ce geste sera réalisé une seule fois. Lorsque l’on veut analyser certaines cellules spécifiques de la mémoire immunitaire dans les organes, une injection intraveineuse avec un anticorps fluorescent sera réalisée 3-5 minutes avant la mise à mort. Cette injection se fera à l’aide d’un tunnel fixé à la paillasse. La queue sera légèrement chauffée avec une lampe rouge durant 2 minutes. Ensuite, la queue sera rapidement désinfectée et un petit volume de solution saline contenant l’anticorps sera injecté. Cette injection sera réalisée sur souris vigile.
Impact sur les animaux
Les souris pouront, lors de la colite, avoir une perte de poids par rapport au poids initial, une diarrhée, du sang dans les selles. Les animaux peuvent diminuer leur toilettage et leur activité ainsi que s'isoler et changer leur posture. En plus de ces paramètres, suite à l’infection par les virus respiratoires ou la vaccination, la température corporelle peut être augmentée. Après l’infection voire aussi la vaccination, les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration de virus ou vaccin, une accélération du rythme respiratoire, une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration de virus ou du vaccin. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de prélèvements sanguins ou d’injections éventuelles de vaccins. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever des organes (poumons, tissu nasal, rate, iléum, caecum, colon) et des fluides muqueux comme les lavages venant des poumons et nasaux. Ces prélévements permettront d’analyser les réponses immunitaires locales et systemiques.
Remplacement
L’étude du dialogue entre l’intestin, les poumons et le système immunitaire est complexe. Ces systèmes biologiques imposent le modèle animal pour valider les hypothèses; il n’existe pas aujourd’hui de modèle cellulaire récapitulant tous les paramètres du tube digestif, du système respiratoire et du système immunitaire.
Réduction
Le design des expériences sera optimisé afin de minimiser le nombre de souris utilisé dans les groupes contrôles. Lors de chaque expérience, nous inclurons donc le maximum de groupes expérimentaux pour un groupe contrôle, tout en se veillant que les expériences restent réalisables par les expérimentateurs. La répétition des expériences sera réalisée au maximum trois fois lorsque des réponses immunitaires significativement plus élevées seront observées dans le groupe experimental que dans le groupe contrôle. Nous aurons 5 animaux par groupe conformément à nos expériences précédentes au laboratoire; c'est le nombre minimal nécessaire pour avoir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement durant l’induction de l'inflammation intestinale, après infection ou vaccination. L’immobilité, la prostration, l’apathie, ainsi qu’une perte de poids de plus de 20% du poids seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Etant donné que l’on analyse des réponses inflammatoires, nous ne pouvons pas donner d’anti-douleurs ou anti-inflammatoires qui pourraient perturber les réponses immunitaires des souris. Nous surveillerons l'apparition des points limites et appliquerons la procédure approprié. Lors de l'infection et de la vaccination par voie nasale, les souris seront anesthésiées par kétamine-Xylazine.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour les interactions poumon-intestin. Les souris auront entre 7 semaines et 16 semaines car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire et intestinal complétement developpé et apres 16 semaines le système immunitaire est potentiellement modifié.