Souris
Rôle des lymphocytes T dans la fonction anti-bactérienne du foie dans le modèle souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Toutes tuées pour la collecte de leurs organes, 412 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 112 d'entre elles et modéré pour les 300 autres. Elles reçoivent une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie, certaines une seconde dix semaines plus tard, et une partie subit une irradiation totale du corps suivie d'une greffe de moelle osseuse. D'autres ingèrent pendant sept jours une molécule qui déclenche une inflammation intestinale, avec diarrhées et perte de poids, puis reçoivent des bactéries. Le porteur reconnaît que des données humaines et des expériences in vitro existent déjà, mais conclut que le modèle animal reste "nécessaire" à ce stade pour établir le rôle des lymphocytes T du foie.
Objectifs
Les lymphocytes T sont des cellules immunitaires qui jouent des rôles centraux dans les défenses contre les agents pathogènes, mais aussi dans les interactions symbiotiques avec les bactéries commensales colonisant les muqueuses et la surface du corps. Dans ce projet de recherche fondamentale, nous nous intéressons à une population de lymphocytes T reconnaissant des composés (aussi appelés antigènes) bactériens fabriqués par de nombreuses bactéries intestinales. Ces lymphocytes présentent un fort interet car ils sont très abondants chez l'humain et sont impliqués dans de nombreuses maladies telles que les infections, l’obésité, la sclérose en plaque, le diabète, les maladies inflammatoires de l’intestin et le syndrome métabolique. Leur rôle dans le foie, où ils représentent jusqu'à 40% des lymphocytes T, reste inconnu à ce jour. Le foie a notamment comme fonction d'éliminer les bactéries commensales qui ont atteint le système sanguin, en particulier lors d'une rupture de la barrière intestinale. Ce projet vise à tester l'hypothèse que les lymphocytes T du foie contribuent à cette fonction pare-feu en éliminant les bactéries commensales présentes dans la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le role dans le foie de lymphocytes T très abondants chez l'humain et impliqués dans de nombreuses pathologies. Le projet peut donc conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques pour améliorer le traitement de pathologies telles que le diabete, l'inflammation intestinale chronique ou encore l'obésité.
Procédures
Les animaux recevront une injection intra-veineuse par voie rétro-orbitale sur animaux anesthésiés par inhalation (environ 1 minute, 1 fois au cours de l'expérience). Certains animaux recevront une irradiation totale suivie d'une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sur animaux anesthésiés par inhalation (environ 1 minute). Certaines souris recevront une deuxième injection rétro-orbitaire après anesthésie par inhalation (1 minute environ) 10 semaines après la première injection. Certains animaux recevront une molécule dans l’eau de boisson pendant 7 jours, suivi d'une administration orale sur animaux vigiles (geste d'environ 10 secondes réalisé une fois au cours de l'expérience).
Impact sur les animaux
L’inflammation intestinale peut causer des diarrhées entrainant une perte de poids. Le poids initial est retrouvé 2-7 jours après la fin du traitement. Le développement d'une immunodépression induite par l'irradiation peut engendrer une perte de poids. Le poids initial est retrouvé environ 1 semaine après administration de moelle osseuse. L'administration de E. coli non-pathogène peut entrainer une perte de poids. Le poids initial est retrouvé environ 4 jours plus tard. Le développement de suppurations des yeux peut apparaitre suite aux injections rétro-orbitales. En cas d'apparition, un gel anti-septique sera immédiatement appliqué.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses.
Remplacement
Les données obtenues chez l'humain montrent une fréquence élevée de lymphocytes T dans le foie. In vitro, les lymphocytes T sont activés par différentes lignées de cellules du foie en présence d'E. coli. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant à la réponse des lymphocytes T et quant à l'identité des cellules qui les activent in vivo en présence de E. coli. Le rôle des lymphocytes T dans la clairance de bactéries commensales ne peut pas non plus être déterminé dans des modèles in vitro ou ex vivo. Le modèle animal reste donc nécessaire à ce stade.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique (t-test de student). Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le projet est conçu en 2 phases: certaines procédures ne seront réalisées qu'en fonction des résultats obtenus, de façon à réduire le nombre d'animaux au minimum. Enfin, une étude pilote est prévue pour s'assurer de la bonne re-constitution du compartiment hématopoeitique (et notamment des lymphocytes T dans les tissus) après greffe de moelle.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et non isolés. Ils bénéficieront de matériel d’enrichissement (igloos, tunnels). L’inflammation intestinale est induite par administration de produits chimiques et peut causer des diarrhées. En cas de déshydratation, les souris seront réhydratées par voie intra-péritonéale et un gel hydratant sera placé dans la cage. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptés aux signes cliniques associés à l’inflammation intestinale.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes MAIT ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour l’étude de l’inflammation intestinale et des réponses immunes associées, du fait de l’existence de modèles bien définis, de la similarité de la flore intestinale, et de la parenté génétique avec l’humain. -Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 14 semaines). -Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.
Rôle du cil primaire dans les maladies rénales chroniques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Pour étudier le rôle du cil primaire des cellules rénales dans les maladies rénales chroniques, 17 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson pendant vingt-quatre heures ou deux semaines, subissent l'ablation chirurgicale d'un rein ou son obstruction permanente sous anesthésie, parfois suivie d'une réversion chirurgicale quatre jours plus tard, et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales. Le porteur indique que la maladie peut entraîner à un stade avancé une baisse de l'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité, et que les souris atteignant les points limites sans possibilité de soulagement sont tuées. Ce chiffre de 17 320 n'est adossé qu'à la mention d'un test statistique comparant les groupes deux à deux.
Objectifs
Les maladies rénales chroniques sont des pathologies génétiques ou acquises caractérisées par une détérioration de la fonction et de la structure du rein avec l’apparition de multiples kystes rénaux ou l’accumulation de cellules immunitaires et cicatricielles. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter l’évolution vers l’insuffisance rénale terminale. Ce projet a pour objectif d’étudier le rôle du cil primaire, une extension filiforme de la membrane des cellules rénales dans les maladies rénales. Le cil primaire joue un rôle important dans ces maladies en régulant la forme et les propriétés mécaniques du rein ainsi que le recrutement de cellules qui participent à la destruction du rein. En permettant une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de la destruction du rein, ce projet va servir de base à l’élaboration de nouveaux traitements à destination des patients atteints de maladies rénales chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but une meilleure compréhension des maladies rénales chroniques kystique et fibrosante pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement actuellement, afin d’améliorer les traitements et la prise en charge des patients.
Procédures
-Induction d’une maladie rénale chronique par administration d’antibiotique dans l’eau de boisson en continu sur animaux vigiles. Cette intervention dure 24 heures ou 2 semaines et est réalisée une seule fois. -Ablation chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction permanente chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie. Cette intervention dure 5 minutes et est réalisée une seule fois. -Obstruction chirurgicale d’un des deux reins sous anesthésie générale et analgésie (5 minutes) suivi d’une réversion chirurgicale de cette obstruction 4 jours plus tard également sous anesthésie générale et analgésie (20 minutes). Ces interventions sont réalisées une seule fois. - Injections intrapéritonéales de molécule induisant la perte des cellules mutantes dans le rein sur animal vigile : les injections durent 10 à 20 secondes. 1 à 5 injections sont réalisées à 24 heures d’intervalle. -Prélèvement de sang sous anesthésie générale. Cette intervention dure 2 minutes et est réalisée une seule fois.
Impact sur les animaux
La contention peut provoquer un stress chez l’animal. L’ajout d’antibiotique dans l’eau de boisson peut induire un goût amer. La maladie rénale chronique peut entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité́. La chirurgie induit une douleur modérée et passagère. Le prélèvement sanguin sous anesthésie peut occasionner une douleur passagère. Les injections intra-péritonéales induisent une douleur légère et passagère.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l'étude pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoïdes rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, et l’ensemble des populations cellulaires observées in vivo. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par une approche statistique en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. De plus, lors des chirurgies, un seul rein sera manipulé, permettant de conserver le rein controlatéral comme contrôle interne.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Pour diminuer l’amertume liée à la prise d’antibiotique, du sucre est ajouté dans l’eau de boisson. Afin de réduire la douleur associée à la chirurgie, une anesthésie générale est réalisée. Un antalgique et un analgésique seront administrés en pré- et post-opératoire. Dans l’attente de leur réveil, les souris opérées sont placées sur une table chauffante jusqu’aux premiers signes de réveil puis transférées dans une cage propre avec de la nourriture à disposition. Le prélèvement sanguin est réalisé à l’aide d’un mini-capillaire sous anesthésie générale. A l’issue des procédures, les souris seront mises à mort sous anesthésie générale préalable. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Tout animal en souffrance recevra un antalgique et/ou des compléments alimentaires. Si les points limites établis sont atteints sans possibilité de soulager l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin du développement rénal. Les maladies rénales chroniques étudiées dans ce projet affectent majoritairement les patients adultes. L’induction de la maladie sera effectuée sur des souris âgées de 4 semaines afin que la maladie se développe progressivement à l’âge adulte entre 12 et 18 semaines.
Caractérisation des sous-populations de neurones « Ghost » de l’hypothalamus dans l’obésité.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavées une fois par jour pendant cinq jours avec du tamoxifène, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures classées comme impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées après des périodes de régime hypercalorique. Une partie d'entre elles subit en outre une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau, avec incision du cuir chevelu et douleurs postopératoires attendues. Ces actes servent à caractériser des sous-populations de neurones de l'hypothalamus impliquées dans l'obésité. Le porteur qualifie le gavage de méthode indolore tout en décrivant l'immobilisation totale qu'il impose et le stress qu'il déclenche, et attribue au tamoxifène une perte de tissu adipeux et de poids qu'il présente comme temporaire.
Objectifs
L'obésité est un problème mondial, touchant plus de 13% de la population et entraînant des comorbidités graves telles que le diabète, l'hypertension et les maladies cardiaques. Cette condition résulte principalement de troubles de la balance énergétique. Cependant, les thérapies actuelles ont des limites en termes d'efficacité à long terme. Pour développer de nouvelles stratégies, il est essentiel de comprendre les mécanismes biologiques régulant la balance énergétique. Dans ce contexte, il existe dans notre cerveau des neurones capables de détecter différents nutriments issus de l’alimentation, afin d’adapter nos choix alimentaires. Certains de ces neurones ont longtemps été considérés comme responsables de la satiété, mais des études récentes ont dévoilé leur grande hétérogénéité. L'objectif est d'identifier ces sous-populations de neurones susceptibles de dysfonctionner dans l'obésité. Pour cela, une caractérisation de la structure, de l'activité électrique et de la fonction de ces neurones grâce à des lignées de souris transgéniques sera effectuée. Les bénéfices escomptés incluent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans les dysfonctionnements neuronaux liés à l'obésité, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes obèses à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malheureusement, les traitements disponibles à l’heure actuelle ne sont que peu efficaces pour lutter contre cette pathologie, et seules des techniques extrêmement invasives comme la chirurgie bariatrique permettent une perte de poids durable (sans garantie de succès systématique). Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au développement de l’obésité, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques qui favorisent le développement de l’obésité et des comorbidités associées. En outre, il s’inscrit pleinement dans un contexte de recherche international visant à décrypter les rôles spécifiques des différentes souspopulations de "neurones de la satiété". À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité.
Procédures
Gavage oral (1440 animaux) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. La durée de l’administration orale de tamoxifène ne dure que 15 secondes par animal, en prenant en compte la contention de l’animal et l’administration de l’agent pharmacologique à proprement parler. La durée de l'administration de la dose d’euthanasiant quant à elle ne dure que 10 secondes à prenant en compte la contention et l’administration en elle même.
Impact sur les animaux
Certaines souris de l'étude (à l’exception des souris de la lignée KISS-Cre-GFP) seront soumises à une administration orale de tamoxifène. Le tamoxifène est un agent pharmacologique susceptible d’induire des effets indésirables. Il induit une perte temporaire de tissu adipeux. Il entraine donc une perte de poids, qui est néanmoins temporaire. Le gavage oral est une méthode indolore, mais implique une immobilisation totale de l’animal, induisant du stress chez ce dernier. Des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris qui subiront une injection stéréotaxique bilatérale de virus (deuxième partie du projet, uniquement pour la lignée KISS-Cre-GFP), par neurochirurgie. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neurochirurgie. L’incision de la peau du crâne et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires. Ces douleurs devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place.
Devenir
Pour la procédure 1: toutes les souris seront gardés en vie à l'issue du gavage. Après des temps précis de régime hypercalorique, les souris seront mises à mort aux temps définis. Pour la procédure 2 : toutes les souris seront gardés en vie de la chirurgie. Après des temps précis de régime hypercalorique, les souris seront mises à mort aux temps définis.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la relation entre l’activité des sous populations de neurones et la consommation de régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones que nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques qui influencent l’activité neuronale via des signaux hormonaux. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les variables mesurées ici telles que le comportement alimentaire nécessite évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires chez les deux sexes, pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 6 semaines et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales
Caractérisation des paramètres ultrasonores optimaux pour une neurostimulation sélective pour le traitement de la douleur chronique
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 72 recevront chacune cent stimulations ultrasonores d'une milliseconde, chaque tir visant une zone de peau différente. Les douze autres reçoivent une injection intrapéritonéale et une injection intradermique, qui peut enflammer le site de piqûre. Le porteur indique que la stimulation peut provoquer une sensation de douleur au réveil de l'anesthésie, l'objectif étant d'activer sélectivement des neurones sensoriels pour préparer de futurs dispositifs contre la douleur chronique. Entre dix minutes et deux heures après la neurostimulation, chaque souris est tuée pour le prélèvement de ses ganglions rachidiens et de sa moelle épinière.
Objectifs
La neurostimulation par ultrasons focalisés est une technique alternative prometteuse pour le traitement de la douleur chronique. Comparé à la stimulation électrique standard nécessitant l’implantation d’électrodes par chirurgie, les ultrasons ont l’avantage d’être non-invasifs, de pouvoir pénétrer jusqu’à plusieurs centimètres dans le corps et de permettre une grande précision spatio-temporelle. Nous avons récemment démontré grâce à des expériences in vitro sur les neurones des ganglions de la racine dorsale (DRG) de souris qu’il était possible d’activer les neurones sensoriels de différents sous-types. En particulier, il a été montré que les neurones nociceptifs jouant le rôle de senseurs de la douleur ainsi qu’une sous-population de neurones sensoriels du toucher identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion, sont particulièrement sensibles aux stimulations ultrasonores. L’activation sélective de ces neurones sensoriels du toucher est susceptible de constituer une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement des douleurs chroniques pathologiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’activation sélective de neurones sensoriels induite par les ultrasons chez la souris in vivo et d'identifier les voies spinales et cérébrales activées par les stimuli ultrasonores. Ce projet devrait permettre d’ouvrir la voie à une nouvelle génération de dispositifs thérapeutiques à ultrasons pour le traitement de la douleur chronique.
Bénéfices attendus
Les douleurs chroniques touchent jusqu'à 20% de la population mondiale, et sont de fait un problème majeur de santé publique. Une sous-population de neurones sensoriels spécialisés dans le toucher ont été identifiés comme de puissants modulateurs de la douleur induite par lésion tissulaire et représentent par conséquent une cible de choix, mais encore inexplorée, pour le traitement de la douleur chronique pathologique. Comprendre les conditions de stimulation par ultrasons in vivo pourra à long terme ouvrir la voie à de nouvelles modalités de thérapies pour les douleurs chroniques, à la fois non invasives et plus efficaces que les traitements par stimulation électrique. D’autre part, le chemin pris par le signal nerveux lors de la stimulation de ces neurones sensoriels du toucher n’a jamais été identifié.
Procédures
Dans une première procédure, 12 souris recevront une injection intrapéritonéale et une injection intradermique de quelques secondes chacune. Dans une deuxième procédure, 72 autres souris recevront une série de 100 stimulations ultrasonores d’une milliseconde maximum chacune, chaque stimulation ciblant une zone de peau distincte des précédentes. Au total, cette procédure durera au maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’injection intradermique peut causer une légère inflammation au niveau du site d'injection. La stimulation ultrasonore peut provoquer une sensation de douleur lors de la phase de réveil de l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car le prélèvement des tissus (ganglions rachidiens et la moelle épinière) est indispensable pour réaliser des études histologiques permettant de confirmer l’activation des neurones sensoriels après la stimulation par ultrasons.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour appréhender l’étude du système nerveux sensoriel dans sa globalité, de la stimulation en périphérie au niveau de la peau jusqu’à l’intégration du signal nerveux dans le cerveau.
Réduction
Des études préliminaires in vitro ont permis d’identifier une gamme de paramètres ultrasonores pour la stimulation des neurones sensoriels, réduisant le nombre paramètres à utiliser pour l’étude in vivo et donc le nombre d'animaux. Nous mettons en place une première procédure qui est une étude pilote et qui va permettre de localiser la zone à stimuler par ultrasons lors d'une deuxième procédure, permettant une réduction significative du nombre de souris à tester. Lors de la deuxième procédure, nous réaliserons le plus de marquages possibles sur des mêmes tissus afin de minimiser le nombre de souris nécessaires. Nous ne stimulerons par ultrasons qu’un seul côté de la souris afin que l’autre côté serve de contrôle et qu’il n’y ait pas besoin de souris contrôle supplémentaires. Après application de ces stratégies, les effectifs ont été calculés avec un outil informatique de calcul statistique pour être ramenés au minimum tout en permettant d'avoir un effet significatif.
Raffinement
Pour la première procédure, les souris seront anesthésiées avant l'injection pour éviter le stress et leur température sera maintenue constante avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Le protocole prévoit une surveillance quotidienne de leur état de santé par le personnel compétent. Des points limites sont définis pour encadrer la surveillance, s’assurant que toute souffrance excessive est rapidement détectée et prise en compte. En cas de détection d’un signe de détresse, une concertation est menée avec la Structure chargée du Bien-Être des Animaux de l’établissement pour décider de la conduite à tenir (par exemple administration d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien). Si un animal atteint un état de souffrance non compatible avec une amélioration rapide, la procédure sera interrompue et l’euthanasie envisagée. Pour la seconde procédure, les expérimentations seront menées intégralement sous anesthésie générale gazeuse pour éviter le stress de l'animal et pour que la stimulation possible de neurones de la douleur ne provoque pas de sensation douloureuse pendant la stimulation ultrasonore. La température corporelle des souris sera maintenue constante avec un tapis chauffant. Après la neurostimulation, les souris seront replacées dans leur cage et leur état de santé sera surveillé par le personnel compétent de la phase de réveil de l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie qui aura lieu entre 10 minutes et 2 heures plus tard. D’autres points limites sont définis pour encadrer cette surveillance. En cas de détection d’un état de souffrance non compatible avec la poursuite de la procédure, celle-ci sera interrompue et l’euthanasie envisagée.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, différents tissus impliqués dans l'intégration nociceptive sont parfaitement décrits chez la souris : la peau, les neurones sensoriels et la moelle épinière. Nous utiliserons des individus ayant atteint leur maturité sexuelle et âgés de 8 semaines. A ce stade du développement, le système sensoriel primaire arrive à maturation avant tous les autres, aussi c'est à ce stade que nous avons choisi de réaliser nos expériences.
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation de souris et de rats génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 2000
52 000 souris et rats nouveau-nés vont être utilisés pour un génotypage, chacun pour une minute de prélèvement au maximum, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souriceaux jusqu'à douze jours et les ratons jusqu'à sept jours sont séparés de leur mère jusqu'à dix minutes, tenus en contention et amputés d'un fragment de queue sur animal vigile, la mère restant dans sa cage couvercle fermé pour l'isoler des vocalisations de ses petits. Au-delà de ces âges, le prélèvement se fait à l'oreille sous anesthésie, que le porteur juge "moins délabrant" qu'une amputation de la queue. Les animaux au génotype voulu partent vers d'autres projets ou deviennent géniteurs, les autres sont "prioritairement réutilisés pour la formation ou le prélèvement de tissus ou d'organes post-mortem", ou tués dans le cadre de la gestion des élevages.
Objectifs
Les animaux génétiquement altérés produits sont destinés à être utilisés dans les projets scientifiques car ils représentent des modèles pertinents pour aborder les questions scientifiques posées au sein de ces projets dans des domaines variés comme les neurosciences , la chronobiologie, la cancérologie, le système immunitaire, la nociception/ douleur, le métabolisme, les fonctions physiologiques comme la reproduction..Les rats et souris génétiquement altérés doivent être identifiés de manière unique afin de pouvoir associer à chaque numéro un génotype spécifique. Cette identification est réalisée par tatouage des doigts des nouveaux-nés et le génotypage par une méthode invasive de prélèvement tissulaire : biopsie de queue ou d'oreille. Ces prélèvements tissulaires fournissent un matériel biologique permettant de génotyper chaque animal de manière fiable et reproductible, quelles que soient les techniques d’extraction et d’amplification du matériel génétique. L'objectif de ce projet est donc de pouvoir prélever du tissu (queue et oreille) pour caractériser génétiquement les animaux produits.
Bénéfices attendus
La caractérisation fiable du génotype des animaux génétiquement altérés est nécessaire afin de produire les animaux au génotype d'intérêt pertinent pour les projets de recherche, qui seront en utilisation continue si ces projets de recherche nécessite une DAP"expérimentale", tout en limitant au minimum le nombre d’animaux de génotype non conforme.
Procédures
Les animaux sont soumis à un prélèvement tissulaire (queue) d'une durée d'une minute maximum réalisée sur animal vigil avant 7j maximum chez le rat et 12j maximum chez la souris. Au-delà de ces âges les animaux seront prélevés sous anesthésie et la biopsie sera réalisé à l'oreille (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
La procédure de prélèvement tissulaire nécessite une séparation de la mère (maximum 10 minutes) et une contention douce, génératrices de stress et d'une douleur légère de courte durée. Le prélèvement tissulaire en lui-même dure moins d’une minute par animal. L’anesthésie à l’isoflurane en cas de prélèvement sur un animal âgé de plus de 7 jours (rats) ou 12 jours (souris) entraîne aussi un stress léger et passager, elle durera 3 à 4 minutes par animal.
Devenir
Les animaux identifiés et génotypés dont le génotype est considéré d'intérêt seront alors utilisés dans les projets de recherche auxquels ils sont destinés et inclus dans une DAP si ces projets en requiert une. Certains animaux de génotype d'intérêt seront gardés comme géniteurs pour assurer le maitien des colonies. Parmi les animaux qui ne seront pas utilisés dans les projets de recherche ou pour maintenir les colonies, ils seront prioritairement réutilisés pour la formation ou le prélèvement de tissus ou d' organes post-mortem ou sinon ils seront mis à mort dans le cadre de la gestion des élevages.
Remplacement
La stratégie de remplacement est envisagée dans les projets autorisés utilisant les animaux génétiquement modifiés élevés dans nos locaux. Dans ces projets, la nécessité d'utiliser l'animal pour atteindre les objectifs des projets ainsi que la pertinence des lignées génétiquement modifiées choisies a été précisée. Les animaux inclus dans cette demande sont donc considérés comme indispensables pour la réalisation des projets autorisés et ne peuvent être remplacés.
Réduction
Le nombre d’animaux génétiquement modifiés produits pour utilisation dans les projets autorisés est calculé au plus près des besoins. Le nombre d’animaux non utilisés et de génotype non conforme est suivi par la SBEA afin de repérer les colonies où la gestion peut être optimisée. Les animaux surnuméraires ou de génotype non conforme peuvent être utilisés pour les formations, les prélèvements de tissus ,ou d'organe post-mortem . Les lignées qui ne sont plus utilisées sont cryoconservées ou éliminées.
Raffinement
Afin de réduire le nombre de manipulations et de séparations des nouveau-nés de leur mère, l'identification et la biopsie de queue sont effectuées en même temps. Les souriceaux ou ratons sont placés dans un bac propre et leur mère laissée dans sa cage, couvercle fermé pour l’isoler des vocalisations des petits et donc limiter le stress de séparation. La procédure de prélèvement est très rapide, moins d’1 minute par animal lorsque l’opérateur est expérimenté, et ne provoque pas ou très peu de saignement (chez le rat notamment). La portée est rendue à la mère à l’issue du prélèvement de tous les nouveau-nés (ou en 2 temps pour les portées de plus 12 animaux) et il est vérifié le jour suivant lors du suivi quotidien si tous les petits sont bien dans le nid. Le cannibalisme maternel après biopsie chez le nouveau-né est très rare. Pour limiter ce comportement lorsque les nouveau-nés doivent être prélevés avant 6 jours chez la souris ou 3 jours chez le rat, l’opérateur frottera ses mains dans la litière de la cage afin de limiter le dépôt d’odeurs étrangères sur les petits. Tout prélèvement pour génotypage réalisé sur un animal de plus de 7 jours chez le rat et 12 jours chez la souris sera mis en œuvre sous anesthésie à l’isoflurane et intéressera un prélèvement du bord de l'oreille. Ce prélèvement n’induit pas de saignement et est considéré comme moins délabrant qu’une caudectomie. Néanmoins ce prélèvement n'est pas possible sur des animaux plus jeunes (oreilles plaquées contre le crâne). Enfin, le génotypage précoce permet de supprimer les nouveau-nés qui ne seront pas utilisés dans la semaine précédant le sevrage et ainsi de soulager la mère allaitante, parfois déjà gestante. De plus, l'établissement utilisateur en lien avec sa SBEA met au point la méthode de génotypage sur poils et chaque fois que cette méthode aura été validée et sera reproductible elle remplacera sur la durée du projet la biopsie de queue et d'oreille.
Choix des espèces
Les modifications génétiques portées par les souris et rats élevés permettent d’identifier des populations cellulaires spécifiques dans le système nerveux central, sont impliquées dans les rythmes biologiques, dans des pathologies neurodégénératives, du système immunitaire, d’ordre métabolique, la régulation de la douleur, les sécrétions neuroendocrines. Aucune autre espèce de mammifères ne peut ainsi être modifiée génétiquement. Les souris seront identifiées et biopsiées vigiles le plus souvent entre 6 et 8 jours et jusqu’à 12 jours maximum, et les ratons entre 3 et 4 jours, 7 jours maximum. Au-delà de ces âges maximum, les animaux seront anesthésiés Une intervention à un âge plus précoce s’accompagne d’un risque accru de cannibalisme. Néanmoins dans les cas exceptionnels où les nouveau-nés seraient utilisés avant l’âge de 6 jours chez la souris, ou 3 jours chez le rat, la biospie de queue sera réalisée à partir de l’âge de 2 jours chez la souris ou 1 jour chez le rat. La connaissance précoce du génotype est nécessaire pour les projets utilisant des nouveau-nés et permet de sélectionner au plus tard au sevrage les animaux à conserver.
Gestion de la production de souris modèles de la myopathie de Duchenne
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les reproductrices sont tuées après six à huit portées, les femelles sans mutation au sevrage, et la moitié des mâles produits, porteurs de la myopathie de Duchenne, sont gardés en vie pour d'autres projets. 9 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit à sept jours une biopsie de queue pour le génotypage, geste que le porteur situe avant l'ossification de la vertèbre caudale. Il précise que les mâles malades seront utilisés avant l'âge de six mois, donc avant l'apparition des troubles musculaires, et présente cette production comme une "source précieuse" pour d'autres laboratoires et collaborateurs.
Objectifs
La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant environ 1 garçon sur 5000 naissances, causée par des mutations dans le gène des dystrophines. En plus d’une dégradation progressive des muscles squelettiques, des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques touchent une grande partie des patients DMD, mais les relations entre des types spécifiques de mutations et les symptômes sont encore peu claires. En effet, le profil cognitif des patients diffère en fonction de la position des mutations et du nombre de protéines perdues, ce gène produisant en effet plusieurs dystrophines à partir de plusieurs promoteurs internes. Par ailleurs, les avancées récentes dans notre compréhension des mécanismes dépendants des dystrophines et responsables de la DMD ont conduit au développement d’outils innovants en thérapie moléculaire, thérapie génique et neuropharmacologie. Cependant, leur capacité à corriger toutes les altérations cognitives associées à cette maladie reste limitée. Une large part de nos connaissances actuelles ont été acquises grâce à l’étude comparative de plusieurs souris modèles porteuses de différentes mutations mimant les différents cas de figure observés chez les patients. De même, les approches thérapeutiques sont initialement développées dans le cadre d’études précliniques chez la souris. Le projet consiste à produire l’ensemble des souris modèles de cette pathologie, afin de disposer des animaux expérimentaux nécessaires à l'étude du rôle des dystrophines dans le système nerveux et pour développer différentes approches thérapeutiques pour remédier aux troubles cérébraux.
Bénéfices attendus
La production de souris modèles de myopathie de Duchenne permet de développer de nombreux projets visant à comprendre les causes des troubles cognitifs, comportementaux, sensoriels et neuropsychiatriques associés à cette maladie, avant que la maladie musculaire n’impacte ces fonctions. Elle permettra en particulier d’identifier les causes des variations des symptômes dans cette maladie, en fonction de la position de la mutation dans le gène responsable, et de tester différents types d’approches thérapeutiques (génétique, pharmacologique, comportementale). Les projets associés permettront de déterminer s’il y a un bénéfice potentiel pour les patients à recevoir ces traitements. La procédure de croisement des reproducteurs utilisée permet de contrôler efficacement les facteurs génétiques et environnementaux, et d’effectuer des comparaisons avec des souris saines issues des mêmes parents. Cette production est par ailleurs une source précieuse pour d’autres laboratoires et collaborateurs souhaitant développer des études sur cette maladie. Le projet est optimisé afin d’éviter que des problèmes moteurs sévères ne se manifeste, en utilisant des reproducteurs asymptomatiques et en utilisant les souris produites avant l’âge d’apparition d’une myopathie invalidante.
Procédures
Une biopsie de queue est faite à l’âge de 7j pour réaliser le génotypage. La moitié des souris mâles produites seront hémizygotes avec un phénotype dommageable qui se traduit par une dégénérescence progressive et lente des muscles squelettiques, cardiaques et du diaphragme (myopathie).
Impact sur les animaux
La biopsie de queue effectuée à l’âge de 7j peut provoquer une légère douleur. Les symptômes des souris mâles modèles de myopathie se manifestent progressivement après l’âge de 6 mois et il a été montré qu’ils sont dommageables après l’âge d’un an. Ils sont alors caractérisés par une baisse de la locomotion et des difficultés respiratoires et cardiaques, en général largement après l’âge de 6 mois.
Devenir
Les reproducteurs seront euthanasiées en fin de procédure (au plus tard 27 semaines ou 6-8 portées), ou avant s’ils ne produisent pas de portées. Les mâles hémizygotes produits et leurs frères non mutés seront gardés en vie pour une utilisation continue dans des demandes d’autorisation de projet d’expérimentation. Les femelles sans mutation (WT) seront euthanasiées au sevrage ; quelques mâles non mutés (WT) seront gardés pour servir de reproducteurs.
Remplacement
Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine. Ces projets impliquent des tests fonctionnels (comportementaux) qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et pouvant se comporter librement. La production de ces modèles n’existe pas dans les centres référencés Français, et certains de ces modèles ne sont pas du tout commercialisés.
Réduction
Le nombre d’animaux issus de cette production est estimé sur la base des années précédentes et des projets en cours et à venir. Une estimation précise est effectuée dans le cadre des demandes d’autorisation de projets expérimentaux du laboratoire. Le nombre d’animaux susceptibles de présenter des signes de souffrance (la moitié des mâles) varie en fonction des projets en cours ; son estimation précise est effectuée dans le cadre des demandes d’autorisation de projets du laboratoire. Ainsi, certaines lignées peuvent être amplifiées pendant une période donnée, ou au contraire réduites à un maintien minimal, en fonction des besoins. Les naissances sont répertoriées et le responsable de projet ajuste le nombre de couples nécessaires à une production satisfaisant les besoins des projets en cours. Le nombre de souris présentant des signes de souffrance devrait être égal à, ou proche de zéro, vu que l’euthanasie avant l’âge de 6 mois évite que ces signes liés à la maladie musculaire se manifestent.
Raffinement
Le projet est conçu de manière à pouvoir étudier le phénotype « comportemental » des souris produites bien avant la survenue du phénotype « musculaire » dommageable (myopathie). La procédure de production des souris est également en accord avec ce principe, avec l’utilisation de reproducteurs qui ne développent pas la maladie (femelles porteuses et mâles sains) et des euthanasies avant l’âge de 6 mois. Les animaux sont en couples stables, ce qui réduit considérablement le stress et l’agressivité. Les souris susceptibles d’exprimer la maladie musculaire sont maintenues par fratrie pour limiter le stress social. Pour réaliser une identification du génotype des souris nouvellement nées, une biopsie de queue est réalisée à l’âge de 7-10 jours, donc avant l’ossification de la vertèbre caudale afin de réduire au maximum la douleur. Une analyse rétrospective du bien-être animal a statué l’absence de signe dommageable dans les conditions de production et de maintien de ces lignées. Le bien-être des souris est évalué par l’observation quotidienne par l’équipe zootechnique, y compris le week-end. En cas de signe de détresse ou souffrance, une action corrective est effectuée si cela est jugé bénéfique par l’équipe zootechnique et le vétérinaire, avec un suivi accru de l’individu concerné. Notamment, si une souris présente des signes de souffrance liés à sa maladie musculaire, avec des difficultés à se nourrir ou à prendre du poids, des croquettes mouillées ou un gel alimentaire supplémenté sera placé au sol pour un accès plus facile. Si cette action est inefficace, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. De plus, l’apparition des problèmes moteurs est tardive chez la souris. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur ces souris déficientes en dystrophine, chez lesquelles nous identifions des perturbations comportementales qui s’expriment avant l’apparition de troubles moteurs liés à la myopathie. Nous évaluons ensuite l’efficacité de traitements visant à compenser ces perturbations comportementales. Dans les conditions de reproduction choisies, la myopathie ne s’exprime pas pour les reproducteurs. Les mâles susceptibles de développer la myopathie seront utilisés comme animaux expérimentaux dans le cadre de demandes d’autorisation de projet, à un âge inférieur à 6 mois, donc avant que se manifestent les problèmes musculaires et moteurs.
Génotypage invasif en routine pour la caractérisation génétique de lignées de souris génétiquement altérées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
5 200 souriceaux de six à dix jours vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun est séparé de sa mère quelques minutes et subit, sur animal vigile, un prélèvement de tissu à la queue d'environ cinq minutes. Le bénéfice annoncé se limite à la gestion de l'élevage, sélectionner les animaux au génotype voulu pour des travaux sur le cancer et l'infertilité, et le porteur ramène le raffinement à des points limites "permettant de soustraire les animaux à la souffrance", sans autre détail. Ceux dont le génotype est jugé inutile sont tués aussitôt après le génotypage, une partie seulement étant gardée "dans la mesure du possible" pour des études futures.
Objectifs
L'objectif de cette saisine est de réaliser le génotypage des lignées murines qui sont utilisées pour nos projets de recherche scientifique dont les objectifs sont de comprendre les causes moléculaires du cancer et de l’infertilité.
Bénéfices attendus
Le génotypage sert à optimiser le maintien les colonies d’élevage et sélectionner uniquement les animaux de génotype d’intérêt pour les projets scientifiques.
Procédures
Prélèvement de tissu pour génotypage sur animal vigile de 6 à 10 jours d'une durée de 5 minutes environ, réalisé une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue des souriceaux induit une douleur légère de courte durée au point de biopsie ainsi qu’un stress au moment de la manipulation. Une autre source de stress est la séparation de quelques minutes des souriceaux de leur mère pendant la manipulation.
Devenir
Les animaux de génotype désiré seront dédiés au maintien des lignées, ou serviront à des expériences. Les animaux de génotype inutile seront mis à mort immédiatement après le génotypage en fin de procédure. Dans la mesure du possible, certains animaux ne présentant pas d’intérêt expérimental (génotype inutile) seront gardés en vie pour utilisation dans les études futures des équipes de recherche.
Remplacement
Les cellules en culture in vitro ne peuvent pas se substituer efficacement aux analyses in vivo pour modéliser l’ensemble des projets étudiés au sein des équipes. Les cellules in vitro accumulent des aberrations de méthylation de l'ADN en culture ainsi que des altérations protéiques dues à leur croissance sur une surface non physiologique. C’est pourquoi certaines expériences nécessitent des échantillons primaires isolés de souris.
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé en fonction des projets de recherche développés et calculé mathématiquement pour obtenir des résultats statistiques fiables et robustes.
Raffinement
Nous avons établi des points limites permettant de soustraire les animaux à la souffrance.
Choix des espèces
Les animaux déclarés dans cette procédure sont tous les nouveaux nés âgés entre 6 et 10 jours pour le génotypage. Le choix du modèle souris est justifié par le fait que les questions scientifiques posées ne peuvent pas être étudiées dans des organismes invertébrés et que nous pouvons utiliser chez la souris des animaux génétiquement modifiés pour répondre aux objectifs scientifiques.
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins (Modification 2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes infectées par des parasites du paludisme, et chez certaines une goutte de sang est prélevée au bout de la queue jusqu'à chaque jour pendant 20 jours consécutifs. Le parasite leur est injecté dans le coussinet plantaire, dans la veine ou dans la peau de l'oreille, ou transmis par des piqûres de moustiques infectés. D'autres actes s'ajoutent pour une partie d'entre elles : une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour une imagerie du foie suivie de la mise à mort sans réveil, ou une chirurgie avec réveil pour implanter un anneau en titane dans l'abdomen, retirer la rate ou greffer de la peau humaine. Toutes sont tuées avant la phase symptomatique, et le travail porte d'abord sur les interactions entre parasite et hôte, le vaccin préérythrocytaire restant ce que le porteur désigne comme son "but ultime".
Objectifs
L’ajout de 204 animaux nécessite une 2eme demande de modification. Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de cette phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou de nouvelles approches vaccinales et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée à l’extrémité de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de Plasmodium falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements de sang au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera le maximum par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental. Le rongeur anesthésié pourra être exposé à des injections intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, ou intraveineuse, ainsi que à de micro-injection dans la peau et à de piqûre des moustiques. Toutes ces procédures sont classifiées comme étant de sévérité légère. Pour l’imagerie intravitale du foie à court terme sans réveil, la souris anesthésiée sera soumise à une laparotomie avant la séance d’imagerie. Pendant la séance d'imagerie la souris sera maintenue constamment anesthésiée jusqu'à sa mise à mort à la fin de l'expérience. Pour l’imagerie intravitale à long terme du foie, de la rate, ou de la peau humaine greffée, l'intervention chirurgicale pour l'implantation d'un anneau d'imagerie ou de la greffe sera réalisée sur des souris anesthésiées. Des analgésiques seront utilisés pendant l’opération et les soins post-opératoires. Pendant la séance d'imagerie les souris seront maintenues constamment anesthésiées. Les procédures impliquant un acte chirurgical avec réveil sont classifiées comme étant de sévérité modérée.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les reutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité etique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide du logiciel SHADE qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont gérées par l'utilisation d’anesthésiques et antalgiques.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Augmenter la diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Jusqu'à vingt et une injections par animal et une opération de quinze minutes : 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des analyses post-mortem. L'objet est d'ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique pour faire entrer davantage de médicaments dans les glioblastomes, décrits comme les tumeurs cérébrales les plus agressives. Sur ce que subissent les souris, le porteur s'en tient à des "douleurs légères et de courte durée" liées aux injections et à des "nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales". Ni le mode d'implantation des tumeurs ni la répartition des 880 souris entre les procédures ne sont précisés.
Objectifs
Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales les plus agressives. La faible diffusion des médicaments au travers de la barrière hémato-encéphalique limite fortement leurs efficacités. Ainsi, le développement de stratégies thérapeutiques sur-mesure conçues pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique constitue un besoin clinique majeur. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Une molécule ciblant ces protéines a été développée et induit une ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule peut être utilisée pour augmenter la diffusion et l’efficacité des médicaments contre les tumeurs cérébrales.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les processus d’administration et de diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales, ainsi que d’augmenter leurs efficacités
Procédures
Maximum de 21 injections (< 1 minute par injection) par souris, avec un intervalle entre deux injections allant de 24h à 72h en fonction des traitements. Maximum de 1 procédure chirurgicale par souris (15minutes).
Impact sur les animaux
Douleurs légères et de courte durées liées aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro de perméabilité sur cellules endothéliales cérébrales ont été réalisées. Cependant, la complexité de la barrière hémato-encéphalique ne peut pas être entièrement répliquée in vitro. Cette complexité se retrouve conservée entre humains et souris, faisant de la souris un modèle nécessaire pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour éviter le stress et la douleur, les injections seront réalisées sous anesthésie générale associée en amont à une analgésie. Nous avons mis en place des points limites adaptés à chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est un modèle nécessaire pour cette étude de part : 1- La complexité de la barrière hémato-encéphalique qui ne peut pas être entièrement répliquée in vitro, mais qui est conservé entre humain et souris 2- L’existence de modèles de souris génétiquement modifiées avec une barrière hémato-encéphalique perméable ou imperméable. Des souris adultes entre 2 et 8 mois seront utilisées pour l’étude des effets de la barrière hémato-encéphalique sur la diffusion et l’efficacité́ des molécules thérapeutiques visant les tumeurs cérébrales.
Rôle des folates dans les modifications de l’expression génique dans un modèle de souris avec hépatocarcinome
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Parce que ce modèle "garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie", 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les premiers jours de vie, chaque souriceau est séparé de sa mère et reçoit une injection d'antibiotique sous la peau, puis, à partir de la quatrième semaine, un régime riche en graisses plus ou moins chargé en vitamine B9. Toutes sont tuées après six ou quatorze semaines pour prélever leur foie. Le porteur écrit que ce régime, qui fait passer les souris d'un foie gras à un cancer du foie, se déroule "sans douleur".
Objectifs
La maladie dite du « foie gras » peut évoluer en cancer du foie, une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Un manque en vitamine B9 pourrait favoriser le développement de cette maladie et le cancer du foie. Cependant, son rôle exact n’est pas encore clair et les mécanismes impliqués ne sont pas bien compris. Le but du projet est donc de voir si la vitamine B9 peut influencer cette maladie et le cancer, et par quels mécanismes. Pour répondre à ces questions et étudier l’évolution de la maladie du « foie gras » en cancer, il n’est pas possible d’utiliser de cellules en culture. Par contre, des souris nourries avec un régime gras et traitées avec un antibiotique spécifique développent la maladie comme chez l’humain : d’abord une accumulation de graisse, puis une inflammation et des cicatrices, et enfin un cancer du foie. Pour déterminer si la vitamine B9 joue un rôle dans cette évolution, ces souris recevront soit une quantité insuffisante, soit une quantité excessive de cette vitamine. On pourra ainsi étudier quels sont les mécanismes mis en jeu et qui sont influencés par la présence ou l’absence de vitamine B9.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à comprendre comment le cancer du foie se développe lorsque l’alimentation est riche en gras, et comment un manque ou trop de vitamine B9 peut y contribuer. Nous espérons pouvoir identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression des gènes liés au cancer et donc mieux comprendre comment l’expression de certains gènes est mal régulée lors du développement du cancer du foie. Nous pourrons aussi savoir si cette vitamine peut protéger ou aggraver la maladie, ce qui aidera à proposer des conseils alimentaires pour les personnes à risque (comme celles atteintes de la maladie du « foie gras »). A plus long terme, les résultats pourraient contribuer à la découverte de nouveaux outils pour diagnostiquer ou traiter ce cancer.
Procédures
Les interventions seront effectuées sur les 90 souris : • Injection d'un antibiotique rapidement après la naissance, durant quelques minutes • Isolement de la mère pendant quelques minutes • Alimentation avec un régime riche en graisses avec une quantité normale, faible ou forte en vitamine B9 à partir de la 4 ème semaine jusqu'à la mise à mort de l'animal (après 6 semaines ou 14 semaines selon le groupe).
Impact sur les animaux
- Douleur liée à l’injection sous-cutanée de l'antibiotique. - Stress lié à la séparation du souriceau de la mère. - Une alimentation enrichie en graisses favorise la progression de la maladie du foie gras vers un cancer du foie dès la semaine 16, un processus potentiellement influencé par un manque de vitamine B9 ou par son enrichissement dans le régime alimentaire.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude. Le foie sera récupéré, afin d’étudier les mécanismes qui régulent l’expression des gènes.
Remplacement
Nous avons mené des études préliminaires sur des cellules de cancer du foie, cultivées avec ou sans vitamine B9. Nous avons trouvé que l’expression de certains gènes était modifiée quand il n’y avait pas de vitamine B9. Par contre, nous ne pouvons pas étudier avec ces cellules le développement de la maladie, tel qu’il se produit chez l’humain, avec la progression d'un foie gras vers le cancer. Seul le modèle animal permet de l'étudier.
Réduction
Pour cette étude, nous allons travailler avec 9 groupes de souris, en testant 3 types d’apport en vitamine B9 (normal, avec peu de B9, avec beaucoup de B9) à différents moments (3). Pour garantir des résultats fiables, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques qu’il nous faut 10 souris par groupe, soit 90 au total.
Raffinement
À leur arrivée, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les accouplements. Elles seront hébergées dans une animalerie répondant à tous leurs besoins (température, humidité, air filtré) et installées dans des cages ventilées avec des matériaux pour construire des nids. Les nouveau-nés recevront une injection unique d’antibiotique, réalisée par un expert, sans anesthésie car elle est rapide et peu invasive. Pour tout signe d'abandon ou d'isolement de plus d'une journée, l'animal sera placé avec une autre mère pour adoption. Si l'isolement persiste avec la nouvelle mère, l'animal sera mis à mort. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur bien-être, avec un suivi précis de leur état de santé et des pesées régulières. Après le sevrage, les souris seront nourries avec un régime riche en graisses qui provoque une progression de la maladie vers le cancer du foie, sans douleur. Elles seront regroupées par cinq dans des cages enrichies avec des objets pour jouer, se cacher, ronger et explorer, comme des tunnels, des dômes, et des bûchettes non toxiques. Tout est pensé pour leur assurer le meilleur confort possible. Si des signes de souffrance sont détectés et persistants, ou qu'une perte de poids trop importante est notée, les animaux souffrants seront mis à mort.
Choix des espèces
Les principaux modèles de maladie du foie gras ont été validés à l’échelle internationale sur des souris ou des rats. Nous avons choisi de travailler avec des souris car ce modèle, utilisé par nos collègues, garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie. Les souris utilisées proviendront de femelles gestantes, et les souriceaux débuteront le protocole avec l’injection d’un antibiotique rapidement après la naissance, qui permet d’instaurer un pré-diabète, une condition typique de la maladie du « foie gras ». Selon leur groupe, les souris seront suivies jusqu’à 4, 10 ou 18 semaines, correspondant respectivement aux étapes d’un foie normal, d’un « foie gras », et d’un cancer du foie. Ce protocole nous permet d’étudier les différentes étapes de l’évolution de la maladie du « foie gras » vers le cancer.
Étude des perturbations du sommeil chez les souris modélisant les troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées au crâne pour quarante-quatre d'entre elles afin d'y retirer localement une protéine, puis placées seules quatre fois vingt-quatre heures dans une cage instrumentée, 176 souris porteuses de mutations liées à l'autisme voient ensuite leur sommeil enregistré pendant quarante-huit heures. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur n'annonce aucun effet indésirable attendu hormis d'éventuels signes de stress ou de grattage, et prévoit de demander une dérogation aux conditions d'hébergement si l'isolement de quarante-huit heures est jugé trop long. Toutes sont tuées à la fin, le porteur écrivant n'avoir "rien d'autre à étudier avec eux" et ne pas souhaiter garder ces lignées dans son animalerie.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique sont fréquemment accompagnés de perturbations du sommeil, comme des insomnies, une fragmentation des cycles veille-sommeil ou des difficultés à maintenir un sommeil réparateur. Ces problèmes ont un impact significatif sur la qualité de vie et peuvent aggraver les symptômes comportementaux associés à l’autisme. Dans ce projet, nous utilisons des souris porteuses de mutations génétiques similaires à celles retrouvées chez les individus autistes, ce qui permet de modéliser ces troubles de manière précise. Nous allons analyser leurs comportements de sommeil en mesurant des paramètres tels que la durée totale du sommeil, la fréquence des réveils et les transitions entre les différentes phases du cycle veille-sommeil. L’objectif est d’identifier, parmi ces souris, celles dont les troubles de sommeil sont les plus marqués. Une attention particulière sera portée au rôle du cervelet, une structure clé dans la coordination des fonctions motrices et cognitives, mais également impliquée dans la régulation des rythmes veille-sommeil. Cette identification est cruciale pour mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents et guider nos recherches futures vers des stratégies thérapeutiques ciblées.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce travail permettra de mieux comprendre les troubles du sommeil dans des modèles de souris porteurs de mutations liées à l’autisme, apportant des informations précieuses sur les mécanismes biologiques impliqués. Ces connaissances pourront éclairer comment les anomalies génétiques affectent les circuits cérébraux qui régulent le sommeil, et comment ces perturbations contribuent aux symptômes comportementaux associés à l’autisme. En identifiant les liens spécifiques entre mutations, troubles du sommeil et fonctionnement neuronal, cette recherche ouvre la voie à une compréhension plus intégrée des interactions complexes entre sommeil et développement neurocognitif.
Procédures
Nous utiliserons quatre lignées de souris différentes, toutes modèles du spectre autistique, les 44 souris Shank3 fl/fl recevront une injection stéréotaxique (de 20 minutes) comprenant également trois injections sous-cutanées de xylovet (20 s) 3 min avant l’incision pour l’injection stéréotaxique et en fin de chirurgie (20 s) et 24h après la chirurgie (20 s). Cette intervention permettra de retirer localement une protéine. Tous les animaux de l’étude (10 jours après leur chirurgie pour les Shank3 fl/fl) seront placés individuellement dans une cage spécialement conçue pour enregistrer les mouvements de la souris, grâce à un tapis de sol. Ce dispositif permet d’enregistrer leur sommeil, tout en préservant un cadre de vie confortable et le plus proche possible de leurs conditions naturelles. Ainsi les souris seront placées 4 fois 24h pour habituation dans ces cages, puis 1 fois pendant 48 h pour l’enregistrement de sommeil.
Impact sur les animaux
Si des signes de stress ou de grattage survenaient, une attention particulière sera apportée à ces animaux pour limiter leur souffrance et leur douleur.
Devenir
À la fin de ces expérimentations, les animaux seront euthanasiés, car ils n’entrent dans aucune autre procédure, nous n’avons rien d’autre à étudier avec eux et nous ne souhaitons pas garder ces lignées dans notre animalerie.
Remplacement
L’habituation plusieurs fois 24h avant l’enregistrement est un raffinement qui vise à diminuer le stress des animaux du au changement d’environnement. Cette étape permet de réduire l’impact des facteurs émotionnels sur les paramètres physiologiques étudiés et vise à améliorer la fiabilité et la reproductibilité des données. Par ailleurs, les objectifs scientifiques de cette étude nécessitent des enregistrements des comportements de sommeil, qui ne peuvent être réalisé sur des modèles alternatifs (in silico, in vitro, ou sur tissu isolé). Le recours à l’animal vivant est donc indispensable à la compréhension des mécanismes sous-tendant la régulation du sommeil.
Réduction
Nous avons choisi un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire. Ce nombre d’animaux choisi correspond également à ce que l’on retrouve dans d’autres études similaires, où la variabilité liée au sommeil est déjà bien documentée.
Raffinement
Tout au long de la procédure, les souris seront régulièrement surveillées afin de détecter Pour les souris subissant une chirurgie, une anesthésie sera réalisée. Tout au long des procédures, les souris seront régulièrement surveillées afin de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Des points limites strictes et spécifiques à ce protocole ont été définis (perte de poids, prostration, automutilation, anomalies comportementales persistantes, etc.). L’expérimentation sera immédiatement interrompue si ces critères sont atteints, avec administration de soins appropriés et d’une analgésie, et le cas échéant, euthanasie sans délai, afin de prévenir toute souffrance inutile. Une demande de dérogation aux conditions standards d’hébergement prévues à l’article R. 214-95 du Code rural et de la pêche maritime sera formulée si l’isolement en cage individuelles pendant 48h est perçu comme trop long.
Choix des espèces
Les animaux génétiquement modifiées n’existent dans aucune autre espèce de vertébrés homéothermes que les souris, tout du moins concernant les mutations que nous souhaitons étudier. Elles nous permettent par conséquent d’entreprendre l’étude des mécanismes physiologiques complexes du système nerveux central tels que l'alternance veille /sommeil avec une approche causale du rôle d’un gène pour une fonction étudiée. Le rythme de sommeil, initialement très irrégulier avant le sevrage, mature progressivement. Le rythme de sommeil est considéré comme de type adulte 5 à 6 semaines après la naissance. De même, la thermorégulation, absente chez les souriceaux nouveau-nés, se met en place progressivement. Nous enregistrerons donc le sommeil lorsqu’il est stable, sur des souris adultes entre 2 et 4 mois.
Effet de différents traitements dans des modèles de lupus érythémateux systémique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Les souris qui montrent des "signes de douleur insupportable" sont tuées avant la fin du protocole. 12 000 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles développent un lupus, avec atteinte des reins, inflammation généralisée, douleurs articulaires et lésions cutanées, et reçoivent une puce sous la peau, des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines, des prises de sang à la mâchoire toutes les deux semaines et des tests de sensibilité à un stimulus mécanique. Le chiffre de 12 000 couvre 130 études dont le porteur écrit qu'il ne peut pas fixer le nombre à l'avance, celui-ci dépendant "de nos partenaires et de nos molécules en développement".
Objectifs
Le lupus est une maladie auto-immune chronique et complexe caractérisée par la production d’auto-anticorps affectant plusieurs organes (reins, peau, articulations, sang…). Il s’agit d’une maladie du tissu conjonctif dont le symptôme caractéristique est une inflammation associée au système immunitaire. Il touche principalement les femmes (9 femmes pour 1 homme) en âge de procréer. C’est une maladie difficile à prendre en charge, car son évolution est imprévisible, les symptômes varient d’un patient à l’autre, et les traitements actuels, souvent lourds, ne permettent pas de guérir. Ils visent surtout à réduire les poussées inflammatoires et à prévenir les complications. Découvrir de nouvelles solutions thérapeutiques est crucial afin d’offrir des traitements plus efficaces, mieux tolérées et personnalisées améliorant la qualité de vie et réduisant la morbidité et la mortalité. Après une phase de sélection de molécules prometteuses, leur mode d’action sera étudié, et les plus pertinentes seront testées dans des modèles expérimentaux de lupus, qui reproduisent les grandes caractéristiques de la maladie humaine. Les molécules testées auront un potentiel anti-inflammatoire, immunomodulateur ou viseront des cibles biologiques impliquées dans le développement du lupus. Ces recherches, menées dans le cadre d’un programme de maturation préclinique, permettront d’évaluer la sécurité, la tolérance et l’efficacité de ces traitements potentiels avant toute phase clinique. L’objectif final est de proposer des solutions thérapeutiques innovantes qui amélioreront la qualité de vie des patients, tout en respectant les principes éthiques de la recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet au sein du lupus érythémateux systémique. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement de nouvelles thérapeutiques permettant de réduire la mortalité liée au lupus, de soulager les patients atteints de cette maladie, afin qu’ils aient une meilleure qualité de vie.
Procédures
Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Tous les animaux recevront une injection en sous-cutanée pour l'implantation des puces d'identification RFID. Également, les animaux recevront des administrations de traitements. Plusieurs voies d'administrations sont envisagées en fonction du mode d'administration du composé testé. Le traitement sera administré une à sept fois par semaine, jusqu’à deux fois par jour, en fonction de la molécule étudiée et de la voie d’administration, pendant plusieurs semaines. Toutes les deux semaines maximum, les animaux pourront subir un prélèvement de sang au niveau mandibulaire. Ces prélèvements se feront sur animal anesthésié. Des tests de comportement pourront être effectués, jusqu'à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude, en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation, soit un test durant 15 minutes en tout). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour évaluer leur état général.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les souris utilisées vont développer des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes de lupus, une maladie causée par un déséquilibre du système immunitaire. Ces signes peuvent avoir un impact sur leur état général et leur espérance de vie. Par exemple, les souris peuvent développer des dysfonctionnements aux reins, une inflammation généralisée, des douleurs articulaires, des problèmes de peau et de multiples atteintes notamment aux organes sièges de l'immunité tels que la rate et les ganglions lymphatiques. Ces dommages peuvent entraîner une perte de poids et une diminution de l'activité. Ces symptômes peuvent varier en intensité selon les modèles utilisés. Tout au long de l'étude, ces différents paramètres seront surveillés en observant l'état de chaque animal. Leur comportement, leur consommation de nourriture et de boisson, ainsi que leur poids seront régulièrement contrôlés, entre 2 et 5 fois par semaine. Les traitements administrés sont prévus à des doses non toxiques, basées sur des études préliminaires ou la littérature et ne devraient pas entraîner d'effets secondaires importants, hormis une légère gêne transitoire liée aux injections. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de ne pas provoquer de douleur et en respectant les recommandations éthiques des volumes prélevés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir évaluer l’effet de notre molécule sur la maladie.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, sur l’auto-immunité et sur la douleur implique de disposer de modèles animaux mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce souris à travers nos différents modèles reproduit plusieurs aspects du lupus humain. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour évaluer et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation, la production d’auto- anticorps, la prolifération de lymphocytes, la douleur et sur l’aspect histologique des organes, il est essentiel d’examiner l’animal vivant entier.
Réduction
Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de la molécule candidate). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux. Pour ce projet nous prévoyons d’effectuer 130 études avec l’utilisation de 12000 animaux sur 5 ans. Toutefois, ce sont des estimations larges car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement, de l’efficacité des molécules, du choix du modèle translationnel pour aller en clinique ainsi que les souches d’animaux choisies en fonction du modèle. En effet, dans le cadre de demande d’autorisation, il est nécessaire d'inclure toutes les souches animales potentielles qui pourraient être utilisées. Chaque souche citée doit être associée à un nombre précis d’animaux, même si, dans la pratique, certaines souches pourraient ne pas être sélectionnées en fonction des besoins des projets en cours et des pilotes. Par conséquent, il est prévu en total un nombre d'études plus élevé que le besoin exact anticipé pour éviter des interruptions administratives ou des retards en cas de changements dans les souches animales requises si nous ne prévoyons pas cette marge dès le début du projet.
Raffinement
Pour minimiser les impacts sur les animaux de laboratoire, des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux pour préparer une étude plus large. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie gazeuse (implantation des puces d’identification, prélèvements sanguins) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les procédures d’implantation des puces d’identification et de prélèvements sanguins sont réalisées sous anesthésie gazeuse (un anesthésique volatile reconnu pour son induction et son réveil rapide, minimisant ainsi le stress et l’impact sur l’animal). L’implantation de la puce est une procédure rapide (quelques secondes) et bien que légèrement invasive, elle ne provoque qu’un inconfort transitoire. De même, les prélèvements sanguins sont effectués de manière à limiter le traumatisme local pour minimiser la douleur et l’inflammation post-procédure. Toutefois, les animaux seront surveillés attentivement après chaque intervention. Une grille de score pour évaluer la douleur sera mise en place incluant un arbre décisionnel avec critères d’arrêt de souffrance. Si des signes de douleur ou d’inconfort prolongés étaient observés (léthargie, prostration, diminution de l’alimentation), un analgésique sera administré toutes les toutes les 6 à 12 heures jusqu’à 48 heures. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude pour détecter les signes de douleur insupportable et euthanasiés en fin d’expérimentation pour des analyses supplémentaires. Les souris seront regroupées par 5 à 6 par cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent se cacher et ronger. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux et/ou un marqueur sanguin ou urinaire. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.
Choix des espèces
En accord avec les recommandations et la littérature, la souris représente un modèle très développé pour étudier le lupus. En effet, chez la souris le lupus ressemble beaucoup au lupus chez l’homme, notamment en ce qui concerne les problèmes rénaux et la production d’autoanticorps. Les modèles murins de lupus se répartissent en deux catégories principales : spontanés et induits. Afin de pouvoir étudier la progression de la maladie, les souris seront âgées de 6 semaines minimum et pourront être étudiées tout au long de leur vie. Ce stade nous permettra de réaliser des études présymptomatiques, symptomatiques et d’étudier l’effet de traitements jusqu’à la fin de la vie des souris.