Souris

155 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux interventions chirurgicales de quarante-cinq à cent vingt minutes, la pose d'une prothèse sur la tête sous sédation, cinq semaines d'hébergement individuel, un entraînement progressif au port d'un appareil d'imagerie crânien, puis une tâche comportementale que le porteur qualifie de légèrement désagréable sans la nommer. Le modèle est une lignée transgénique présentée comme représentant l'autisme, et les retombées annoncées, une contribution possible à l'orientation d'essais cliniques, restent au conditionnel. Sur le remplacement, le porteur écrit que les études cliniques ne conviennent pas en raison de la fragilité de la population concernée et de la "nécessité" d'approches invasives.

Objectifs

Les difficultés d'attention sont fréquentes dans divers troubles neurodéveloppementaux tels que l'autisme, les troubles du déficit de l'attention et certaines maladies génétiques caractérisées par un retard de développement. Ces problèmes posent un défi important à l'intégration sociale, éducative et professionnelle des personnes concernées. Pour mieux comprendre les raisons biologiques de ces difficultés, nous proposons d'analyser l'activité des cellules nerveuses dans une région du cerveau impliquée dans ces troubles. Nous utilisons un modèle génétiquement modifié représentant l'autisme, qui manifeste des problèmes d'attention dans des conditions expérimentales. Notre projet comprend des tests de comportement et l'imagerie, ainsi qu'un traitement pharmacologique pour mettre en évidence ces déficits.

Bénéfices attendus

L'autisme est une condition complexe pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement médicamenteux spécifique. En raison de la diversité des origines et des manifestations de cette condition, il est peu probable qu'une seule molécule puisse traiter tous les symptômes. Face à cette complexité, une approche consiste à comprendre les modifications dans les circuits cérébraux liés à des symptômes spécifiques. Notre étude se concentre sur les problèmes d'attention, qui touchent environ 40% des personnes autistes et sont étroitement liés à d'autres symptômes comme les problèmes sensoriels. En s'appuyant sur des recherches antérieures, nos propres données préliminaires et notre programme de recherche, nous cherchons à identifier les changements dans l'activité de certaines populations de cellules nerveuses. Ces modifications pourraient servir de biomarqueurs tant sur le plan physiologique que comportemental, permettant d'évaluer l'impact de nouveaux traitements médicamenteux pour les problèmes d'attention liés à l'autisme. Nous pensons que notre travail pourrait éventuellement contribuer à orienter des essais cliniques chez l'homme. En outre, les avancées techniques réalisées dans le cadre de ce projet bénéficieront à d'autres projets de recherche de notre laboratoire, nous permettant d'améliorer nos méthodes techniques et scientifiques pour nos futurs travaux. Dans une perspective plus large, les connaissances que nous espérons tirer de notre étude pourraient également enrichir notre compréhension d'autres troubles neurodéveloppementaux impliquant des problèmes d'attention.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes. En outre, ils subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement. Les animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Les animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 30 minutes. Par la suite, les animaux effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d'environ 30 minutes en présence de l'appareil d'imagerie, qui sera positionné sur leur tête. Le lendemain, ils seront de nouveau exposés à la tâche comportementale, cette fois pendant environ 20 minutes. Certains animaux reçoivent un traitement pharmacologique d'un produit autorisé pour l'administration chez l'enfant (3 injections intra péritonéale ; durée : chacune 2s max).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale légèrement désagréable et stressante pour l'animal. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement. Les injections sont légèrement desagréable. Le produit injecté peut avoir un effect neuropharmacologique.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'exploration des changements comportementaux et neurobiologiques chez un modèle de maladies neurodéveloppementale. Les expériences proposées nécessitent l’utilisation d’un modèle animal vivant et il ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas appropriées pour notre objectif expérimental, en raison de la fragilité de la population clinique concernée et de la nécessité d'approches invasives pour répondre à nos questions scientifiques. Les structures cérébrales sont généralement bien préservées chez différentes espèces de mammifères, ce qui suggère une similitude fonctionnelle entre les rongeurs et les humains. L'utilisation de modèles animaux avec une sensibilité neuronale plus faible (tels que les invertébrés ou les poissons) ne convient pas à notre projet, car ces organismes ne possèdent pas la structure cérébrale spécifique ciblée par notre étude.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Afin d’estimer correctement le nombre d’animaux nécessaires, nous avons consulté deux experts dans le domaine. Nous avons également prévu une étude pilote, permettant l’étude de la faisabilité technique de certains aspects de notre projet. De plus, nous avons intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure et, si nécessaire, une réduction de nombre d’effectifs nécessaire à la réalisation de nos objectifs scientifiques.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation des techniques de manipulation prévu pour réduire le stress de la manipulation viii) Habituation à la salle de comportement, ix) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. x) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs en bien être animal, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

Choix de l'espèce : Les expériences proposées pour cette étude nécessitent des mesures comportementales et neurophysiologiques (impliquent des interventions invasives). Nous avons donc besoin d’un modèle animale complexe et intacte, adapté à la réalisation des tests cognitifs, possèdant la structure cérébrale ciblée par notre étude, pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique. De plus, il est essentiel que l'espèce soit susceptible d'accepter des modifications génétiques pour reproduire les conditions génétiques humaines. Idéalement, le modèle devrait être bien validé par des études antérieures en tant que représentation fiable et éprouvée pour l'étude de l'autisme. La souris répond à tous ces critères et offre la cohérence avec les recherches précédemment menées au sein de notre équipe. Les modèles animaux avec une sensibilité neurophysiologique moindre, tels que les invertébrés ou les poissons, ne sont pas appropriés pour notre projet, car les approches techniques que nous envisageons ne peuvent pas être appliquées à ces organismes. De plus, les tests comportementaux chez ces animaux sont souvent trop limités pour modéliser de manière adéquate des maladies complexes comme l'autisme. Stade de développement : 4 à 6 semaines au début des procédures (c.a.d. l'acte chirurgical) et 10 à 12 semaines (jeunes adultes) au moment du test comportemental. Justification : Ce stade de développement a été choisi pour être en cohérence avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe, utilisant le même modèle transgénique et la même tâche comportementale. En effet, cette étude s'inscrit dans la continuité de notre programme de recherche, et il est très important de maintenir les mêmes conditions expérimentales afin de garantir la reproductibilité et la fiabilité de nos expériences, tout en facilitant la comparabilité de nos données avec celles obtenues précédemment. L'âge de 10 à 12 semaines a été choisi car il correspond au moment de maturité des circuits neuronaux ciblés. Bien que la condition étudiée se manifeste à tous les stades de la vie, une intervention thérapeutique sera plus efficace si elle est effectuée de manière la plus précoce possible. C'est pour ces raisons que nous utilisons des jeunes adultes.

Vingt et un jours enfermées dans un caisson où l'oxygène est abaissé à 9 %, ou recevant de l'élastase déposée dans les narines sous anesthésie, 288 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang, des poumons, du cœur, du foie, du rein et de la rate. Elles sont génétiquement modifiées pour surexprimer une protéine qui empêche la formation des vaisseaux pulmonaires, afin d'observer l'apparition d'une hypertension artérielle et d'un emphysème. Le porteur indique que les manipulations ont lieu en journée, pendant la phase de sommeil des souris, ce qui ajoute un stress, et affirme dans le même passage que l'hypoxie chronique n'apporte aucune douleur et ne provoque qu'une légère fatigue. Sur la réduction, il annonce des groupes de 8 souris sans exposer le calcul qui mène aux 288 animaux.

Objectifs

Avec l’âge et dans certaines maladies pulmonaires comme l’hypertension et l’emphysème, le réseau vasculaire décline et la structure des tissus se dégrade, ce qui affecte les poumons et provoque des difficultés respiratoires. L’un des mécanismes liés au déclin du réseau vasculaire implique la défaillance d’un facteur essentiel à la formation de nouveaux vaisseaux. L'action de ce facteur serait pertubée par une protéine dont l’expression augmente avec l’âge chez la souris, mais n’a pas encore été étudiée dans le poumon. Notre objectif est d'étudier l'effet de l'élimination de la vascularisation pulmonaire. Pour cela, nous souhaitons utiliser des souris génétiquement modifiées surexprimant la protéine empêchant la formation des vaisseaux pulmonaires. Nous nous attendons à observer chez ces souris transgéniques l'apparition de maladies pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l'effet de l'élimination de la vascularisation pulmonaire dans deux maladies pulmonaires liées à l’âge (hypertension artérielle et emphysème pulmonaires).

Procédures

Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) : un dépôt de gouttes contenant le traitement au niveau des narines de l'animal effectué sous anesthésie générale, lors d’une seule procédure rapide de 5 minutes. A la fin de la procédure d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectée grâce à une sonde.

Impact sur les animaux

Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, inhalation intranasale d’élastase, Flexivent) peuvent générer du stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal, lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cage. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit également un stress.

Devenir

L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

En parallèle des études menées sur la souris, une étude est portée sur des cellules primaires humaines pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. Différents types cellulaires sont isolés. La culture cellulaire permet de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l'élimination de la vascularisation au niveau pulmonaire, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de certaines maladies.

Réduction

Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.

Raffinement

L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire. 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance. 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris sous hypoxie. Si un animal présente un de ces points limites, il recevra une anesthésie et une analgésie adaptée à la mise à mort.

Choix des espèces

Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées.

Onze injections en quatre semaines et jusqu'à six prélèvements de sang par animal : 417 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur mammaire greffée, avec une gêne à la locomotion possible selon le volume et la position de la tumeur, et sont toutes tuées pour prélever ces tumeurs. Le projet vise à tester des peptides censés bloquer une protéine de l'environnement tumoral, dans le cancer du sein triple négatif. Le porteur écrit n'avoir "pas d'autres choix que d'utiliser le modèle animal", les tests cellulaires ne pouvant selon lui représenter les mécanismes d'un "organisme entier".

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu’une protéine de l'environnement tumoral est produite en excès par les cellules cancéreuses. Cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, cancer le plus fréquent chez les femmes en France, ce qui en fait une cible thérapeutique d’intérêt et notamment dans le cancer du sein triple négatif, un sous type pour lequel la plupart des stratégies thérapeutiques proposées sont déficientes. Il a été montré qu’une accumulation anormale de cette protéine stimule la prolifération d'un type de cellules saines particulières autour de la tumeur qui vont à leur tour stimuler et entrainer la multiplication des cellules cancéreuses. C’est donc dans ce contexte que différentes molécules ont été synthétisés afin de répondre à un besoin thérapeutique non satisfait dans le cancer. Ce projet permettra de déterminer l’effet anti-tumoral des différentes molécules développées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par ce traitement sont une diminution de la croissance tumorale liée à une diminution de la prolifération de cellules saines particulières autour de la tumeur et à une augmentation de la réponse immunitaire. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus par ailleurs sur des cellules et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée aux peptides dans un modèle complexe de progression tumorale chez l'animal. A plus long terme, et à l’issue d’analyses réglementaires, si des effets étaient observés au cours de ce projet, l'une des molécule testée pourrait faire l’objet du développement d’un nouveau candidat médicament dans le traitement du cancer du sein.

Procédures

Pour toutes les procédures, la première semaine une seule injection ne dépassant pas 2 minutes par animale, puis pendant les 3 semaines suivantes 10 injections, pour chaque animale ne dépassant pas 2 minutes, à raison de trois fois par semaine. Pour 4 procédures, un prélèvement de sang, pour chaque animale ne dépassant pas 2 minutes, 6 fois maximum par animal à raison d'une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Un perte de poids peut apparaître suite à l’injection des cellules tumorales et doit être prise en compte. Il est cependant peu probable qu’elle apparaisse durant les trois semaines de traitement prévues. En effet, il est connu que cette perte de poids apparaît généralement à un stade plus avancé dans le processus de développement tumoral (stade métastatique). Une gêne à la locomotion due au volume tumoral ainsi qu’à la localisation de la tumeur peut être observée. De plus un stress physique ou thermique de courte durée, et une douleur de courte durée à l’endroit des injections peuvent se manifester, liés aux différentes injections et prélèvementsde sang. Très rarement, il peut y avoir formation d’oedèmes ou possibilité d’infection.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés afin de prélever les tumeurs pour la réalisation d’analyses.

Remplacement

Une étude basée uniquement sur des tests cellulaires ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique des peptides développés.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation à raison de trois fois par semaine des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques permettra de prévenir toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera euthanasié. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe).

Choix des espèces

L’espèce utilisée dans ce projet est la souris, des travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle dans le cadre de l’évaluation de molécules dont le mode d’action correspond à celui des peptides que nous souhaitons évaluer. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, donc exposées à une dégradation de leur état général au moindre contact avec un agent infectieux. 340 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales pouvant durer quinze minutes sous anesthésie gazeuse, puis une injection de la molécule à tester, des mesures de tumeur trois fois par semaine, quatre observations à travers la peau, et pour quarante d'entre elles sept prélèvements de sang. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le porteur indiquant qu'aucune méthode d'imagerie ne permet de suivre sur des temps aussi longs la distribution des molécules dans un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif du projet est de quantifier et d’analyser, au sein de l’organisme entier et plus spécifiquement au sein de la tumeur, la distribution de huit nouvelles molécules innovantes issues de travaux menés au laboratoire pour le diagnostic et/ou le traitement de cancers pulmonaires, de cancers du feuillet enveloppant la cage thoracique et de cancers du sein. La caractérisation de ces nouvelles molécules ou de leur distribution au sein des tissus ou d’un organisme entier est nécessaire afin de s’assurer que ces molécules, après leur administration, soient bien adressées vers les cellules cancéreuses qu’elles ciblent privilégiement.

Bénéfices attendus

Les études de distribution dans les tissus, et plus spécifiquement dans la tumeur, réalisées dans ce projet vont permettre de définir la spécificité des molécules testées pour leur cible biologique après que ces molécules auront été administrées au sein d’un organisme entier. La validation de la distribution tumorale de ces nouvelles molécules fera de ces molécules une solution prometteuse pour le diagnostic et/ou le traitement des cancers qu’elles ciblent.

Procédures

Une seule brève (30 secondes) injection ou une plus longue (15 minutes) injection de cellules tumorales sur animal sous anesthésie gazeuse. Une seule brève (30 secondes) injection de molécule d’intérêt sur animal sous anesthésie gazeuse. Des mesures de la taille des tumeurs réalisées 3 fois par semaine (2 minutes) sur animal sous anesthésie gazeuse. Quatre observations à travers la peau pendant 5 minutes sur animal anesthésié par voie gazeuse. Un seul prélèvement de sang (1 minute) sous une anesthésie gazeuse, sauf pour 40 animaux du projet où 7 prélèvements d’un tout petit volume de sang (1 minute) seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les procédures seront réalisées chez des souris immunodéficientes qui constituent des lignées à phénotype dommageable, c’est-à-dire des lignées dans lesquelles l'état général des animaux est altéré s’ils sont exposés à des agents infectieux. Les effets indésirables attendus lors de l’étude sont une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injections qui ne devraient pas s’étendre à plus de quelques heures après l’injection, une souffrance et/ou une nécrose occasionnée par le développement tumoral qui ne devraient pas s’étendre au-delà de 24 heures, une perte de sang lors de prélèvements et un stress dû aux manipulations des animaux pendant les procédures expérimentales qui ne dureront que quelques brèves minutes.

Devenir

L’étude de la biodistribution des molécules d’intérêt au sein des tissus tumoraux nécessite de prélever les organes des animaux qui doivent donc être euthanasiés. Il n’existe pas d’autre méthode d’imagerie qui permette d’étudier cette biodistribution sur des temps longs.

Remplacement

L’étude de la biodistribution des molécules au sein des tissus tumoraux nécessite de prélever les organes et il n’existe pas d’autre méthode d’imagerie qui le permette sur des temps aussi longs. La caractérisation de ces molécules au sein d’un organisme entier est donc nécessaire. De plus, nous avons opéré une pré-sélection chimique et pharmacologique in vitro de chacune des molécules innovantes analysées in vivo dans ce projet qui sont destinées au diagnostic et/ou au traitement de cancers chez l’Homme.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux : - Chaque procédure sera réalisée sur le plus petit nombre d’animaux par groupe déterminé via l’utilisation d’une application calculant les tailles d'échantillons nécessaires. - Les procédures ont pour but d’observer la distribution des molécules au sein de la tumeur. Les résultats seront considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par sexe et par groupe. - Une seule dose des molécules testées a été sélectionnée grâce à des analyses bibliographiques et des expériences in vitro. - Nous utilisons des modèles tumoraux qui ont déjà été décrits et mis au point par nos collègues chez la souris immunodéprimée ce qui permet de ne pas réaliser de tests de développement de tumeur chez des animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi comprenant des maisons et des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoirs en papier pour leur nid, et des bâtonnets en bois à ronger. Les animaux seront hébergés au minimum 7 jours à l’animalerie avant d’entrer en procédure. Une surveillance quotidienne des animaux est assurée par des personnes habilitées et formées. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs à l’injection unique de cellules tumorales et à l’injection unique de la molécule testée, ces deux injections seront réalisées pour chaque animal dans une pièce au calme sans passage et sous une anesthésie gazeuse. Un suivi attentif de l’évolution de la taille de la tumeur sera mené trois fois par semaine. Un suivi attentif de l’apparence de la tumeur sera aussi mené trois fois par semaine afin de déceler toute apparition d’une éventuelle nécrose. Les animaux seront observés attentivement trois fois par semaine. Des paramètres ont été définis permettant de prendre les décisions adéquates en cas de suspicion de douleur ou souffrance. Chaque animal sera sous une surveillance accrue durant les 24 heures après l’administration de la molécule afin de déceler tout comportement anormal ou tous signes éventuels de douleur ou souffrance. Tout animal présentant des signes de douleur ou souffrance sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est une espèce pertinente dans les études de biodistribution des molécules. Nous utiliserons des souris immunodéprimées, ce qui facilite l’implantation de cellules tumorales et le suivi dans la tumeur des molécules. Nous sélectionnerons des animaux adultes car les molécules testées dans ce projet sont destinées à des études cliniques chez des patients adultes.

Quinze jours d'acclimatation en cage chronobiologique, dix à quinze jours d'habituation au tapis roulant, puis un test d'endurance pouvant durer quatre-vingt-dix minutes, avec jusqu'à cinquante stimulations électriques pour forcer la course. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après le test, une scarification de la veine de la queue permet de doser le lactate et le sucre dans le sang, et l'entraînement se poursuit à raison de trois séances de vingt à quarante-cinq minutes par semaine. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, sauf jusqu'à quarante souris qui refuseraient de courir et seraient alors basculées vers d'autres procédures en cours.

Objectifs

Ce projet explore le rôle d’une protéine influencée par l’horloge biologique qui joue un rôle clé dans la gestion des sucres et des graisses, ainsi que dans le bon fonctionnement des muscles. Pour mieux comprendre son impact, les chercheurs ont développé un modèle animal dans lequel cette protéine est absente spécifiquement dans les muscles. Bien que cette absence ne provoque pas de changement visible au repos, les premières analyses suggèrent qu’elle pourrait affecter la capacité du corps à s’adapter à l’effort. Les chercheurs examineront comment les muscles de ces souris réagissent à un effort ponctuel à différents moments de la journée, comment ils s’adaptent à un entraînement prolongé et quelles sont les conséquences sur l’équilibre énergétique et inflammatoire du corps. Les résultats pourraient améliorer notre compréhension des mécanismes régulant l’endurance musculaire et ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la santé et du sport. Nous ne disposons pas de modèle de remplacement, cependant le raffinement et la réduction sont particulièrement appliqués. En outre, les procédures sont réalisées durant la phase de veille (donc d'activité) de la souris. A chaque étape du protocole, la règle des 3Rs sera appliquée.

Bénéfices attendus

Ce projet, pleinement justifié d’un point de vue scientifique et conforme à la règle des 3Rs, vise à explorer le rôle d’un gène impliqué dans le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que dans la physiologie du muscle squelettique. Son objectif est d’approfondir l’influence de ce gène, dont l’expression fluctue au cours de la journée et est stimulée par l’exercice physique, sur la fonction musculaire et la coordination des réponses métaboliques et immunitaires à l’effort, soulignant ainsi l'importance du rythme circadien dans ces mécanismes. À court terme, nous pourrons évaluer son impact sur l’endurance, la récupération et l’adaptation musculaire à l’exercice, renforçant ainsi notre compréhension des interactions entre l’horloge biologique, l’activité physique et le métabolisme. L’étude tiendra également compte de l’influence du moment de la journée sur la physiologie de l’exercice. Sur la base des résultats obtenus, nous élargirons l’analyse aux voies de régulation et aux processus métaboliques et immuno-métaboliques les plus affectés par l’inactivation de ce gène dans le muscle squelettique. Par ailleurs, nous examinerons comment le désalignement du rythme circadien perturbe le métabolisme et comment l’exercice musculaire pourrait contribuer à sa régulation. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à une optimisation des recommandations en matière d’activité physique, de nutrition et de gestion du rythme circadien, avec des implications majeures pour la santé et la performance physique.

Procédures

Les souris devront réaliser un test de performance physique d'endurance dont la durée peut atteindre 90 minutes selon leurs capacités. La stimulation à la course durant ce test peut nécessiter l'utilisation de la stimulation électrique et dans ce cas, la souris peut recevoir au maximum 50 stimulations électriques à intensité faible induisant un léger picotement. En pratique le recours à la stimulation n'est pas souvent utile lorsque la souris se trouve dans sa phase de veille (active) lors du protocole d'exercice. Une scarification sur la veine de la queue pour prélever une microgoutte de sang, pour doser à l'aide d'une bandelette la lactatémie et la glycémie post-exercice, sera réalisée. Elle peut génèrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de l'acte (

Impact sur les animaux

Il y a peu d’effets indésirables dans ce projet. Avec les systèmes de cycles inversés dans les cages de chronobiologie, nous avons pu observer une forte activité des souris durant la nuit. Le test de performance physique d’endurance et l’entrainement des souris seront effectués pendant la phase active nocturne des souris ce qui limite considérablement le stress lié aux procédures et le recours à un système de stimulation électrique (les souris courent la plupart du temps spontanément après habituation). L’intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir, s’il le faut lors du test d’endurance uniquement, sera la plus faible possible. Elle est désagréable mais n’induit pas de douleur. Elle ne sera pas forcément utilisée et ne le sera pas du tout lors de l'entrainement et l'habituation des souris. En effet, les souris courent spontanément, sans contrainte et sans s'arrêter, alors qu'elles en ont la possibilité. Une nuisance pourrait être lié au fait de les confiner pour une durée maximum de 90 minutes sur un couloir de course (la largeur de 7 cm est suffisante pour que la souris coure sans se retourner ou se dévier latéralement ; la longueur de 50 cm permet d'avoir une distance suffisante pour éviter tout stress dû à un espace trop restreint et la hauteur des parois latérales de 15 cm minimise l’effet de confinement). Le fait qu'elles soient habituées à cette situation et qu'elles courent durant la procédure de manière volontaire ainsi que leur comportement, nous laisse penser que cette nuisance est minime. Une légère scarification sur la veine de la queue pourrait être considérée comme une nuisance. Elle est effectuée pour prélever une microgoutte de sang pour doser, à l'aide d'une bandelette, la lactatémie et la glycémie post-exercice et pourrait engendrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de la scarification sans autre effet indésirable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes. Les animaux pouvant être réutilisés dans le cadre d'autres procédures en cours, sont ceux qui pourraient refuser de courir à l'issue de la période d'habituation au tapis roulant et qui ne seraient pas inclus dans les procédures. Cela peut concerner au maximum 40 souris pour l'intégralité des 2 procédures.

Remplacement

Nous utilisons des cultures de cellules musculaires et des traitements imitant les effets métaboliques de l'exercice pour étudier leurs réactions. D'autres types de cellules, comme des cellules graisseuses et immunitaires, sont également analysées après exposition aux substances libérées par les cellules musculaires traitées. Dans le cadre d’un projet de recherche, nous collaborons avec des équipes spécialisées pour examiner les fibres musculaires et développer un modèle mathématique du fonctionnement des muscles. Ces méthodes permettent de réduire l’utilisation d’animaux. Cependant, elles ne reproduisent pas les effets réels de l'exercice et de l'entraînement physique sur un organisme entier. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux reste nécessaire pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été défini de manière à utiliser le minimum nécessaire pour détecter une différence statistiquement significative avec une puissance minimale de 80 %, tout en tenant compte d’une marge de 20 % de souris potentiellement exclues de l’étude (souris non coureuses). Ainsi, 10 animaux par groupe sont requis pour la procédure 1 (exercice) et 12 pour la procédure 2 (entraînement). Afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et ainsi respecter le principe de réduction de la règle des 3R, nous avons optimisé l’organisation des expériences. Pour éviter de multiplier les manipulations, certaines analyses seront réalisées sur des souris sauvages au cours de la procédure 1. Cela permettra d’évaluer la faisabilité des protocoles et d’effectuer des mesures métaboliques (consommation d’oxygène) ou immunitaires (cytométrie en flux) nécessitant un traitement immédiat des échantillons après prélèvement. Des tests statistiques seront appliqués pour analyser nos résultats.

Raffinement

Pour assurer le raffinement de l’expérimentation et garantir le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place. Tout d'abord, les procédures seront effectuées lors de la phase active de la souris et en lumière rouge afin de ne pas perturber les rythmes veille-sommeil des souris. Les souris seront préalablement acclimatées et de manière progressive durant 15 jours aux cages chronobiologiques. L'environnement dans la cage est enrichi. De plus, les souris seront progressivement habituées à l’exercice sur tapis roulant pendant 10-15 jours afin de limiter leur stress et favoriser l'exercice volontaire sur tapis. Nous limiterons par ces biais le recours à la stimulation électrique qui peut être stressant pour la souris. Les souris seront surveillées quotidiennement par les animaliers et régulièrement par les expérimentateurs pour détecter rapidement tout signe de souffrance et y remédier. Enfin nous utiliserons la méthode "en cup" pour prendre une souris, une technique de manipulation douce et non stressante, qui consiste à soulever l'animal en formant une coupe avec les mains plutôt qu'en le saisissant par la queue. Pour éviter tout stress inutile, les souris destinées à l’euthanasie seront placées dans une salle séparée et les manipulations post-euthanasie se dérouleront dans une autre pièce. Nous veillerons à ce qu’aucune souris ne soit isolée dans sa cage lors des procédures.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice sur la santé, car son métabolisme et son système immunitaire sont proches de ceux de l’humain. La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène-cible peuvent être générés. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses immuno-métaboliques des tissus prélevés. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques en question, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. Les souris utilisées auront entre 2 et 6 mois, car c'est à cet âge que des études précédentes ont montré une baisse d’endurance.

Les souris dont l'état se dégrade sans répondre aux mesures prévues sont tuées avant le terme du protocole. 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un allergène sur une narine sous anesthésie, quatre fois en douze jours ou vingt fois en cinq semaines, puis une infection par un virus du rhume, et pour certains groupes une mesure quotidienne de la respiration dans un système clos pendant cinq à neuf jours, après inhalation d'une molécule qui contracte les bronches. Toutes sont tuées, les poumons devant être prélevés à deux moments, au pic de l'exacerbation asthmatique et en fin d'expérience.

Objectifs

L’asthme est une maladie pulmonaire chronique complexe aboutissant à une obstruction bronchique réversible, qui affecte les enfants et les adultes. Dans le monde, en 2019, on estime que 262 millions de personnes souffraient d’asthme et que cette maladie a entraîné 461 000 décès. Cependant, ces chiffres sont très probablement sous-estimés. L’asthme est sévère pour environ 10% des patients qui souffrent de symptômes persistants malgré une bithérapie de fond incluant des fortes doses de corticoïdes inhalés. Les exacerbations ou aggravations des symptômes d’asthme restent un problème majeur dans le suivi et l’évolution des asthmatiques, qu’ils soient sévères ou non. Elles représentent le motif principal de recours aux soins, et peuvent conduire à l’hospitalisation voire entraîner le décés des patients. Environ 50 à 80% des exacerbations sont associées à des infections virales respiratoires (chez les adultes et les enfants, respectivement). Parmi les virus impliqués, 50-60% sont des rhinovirus, virus qui provoquent un rhume chez les individus sains sans autre conséquence. Même si certains mécanismes impliqués dans les exacerbations ont été identifiés, les connaissances restent insuffisantes pour développer des traitements efficaces. Il y a donc un réel besoin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui conduisent aux exacerbations viro-induites des asthmatiques. Les cellules natural killer (NK) sont une sous-famille de globules blancs. Ce sont des cellules immunitaires impliquées dans la réponse précoce contre les virus, qui sont présentes en grande quantité dans les poumons. Cependant, leurs rôles dans les exacerbations de l’asthme induites par les virus sont largement méconnus. Des études in vitro ont montré que la fonction des cellules NK humaines dirigée contre les rhinovirus était diminuée chez des patients atteints d’asthme sévère. L’objectif de ce travail est de mettre en place un modèle d’exacerbation de l’asthme induite par un rhinovirus chez la souris, afin de caractériser les cellules NK pulmonaires et leurs fonctions et de tester des thérapeutiques capables de restaurer leurs fonctions.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur le rôle de cellules immunitaires particulières (les cellules natural killer) dans l’asthme et ses exacerbations induites par les virus. Mieux comprendre cette maladie est essentiel pour proposer de nouvelles thérapeutiques. En effet, certains patients et surtout les plus sévères échappent aux traitements actuels. A court terme, ce projet permettra de proposer et d’évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le traitement des exacerbations viro-induites de l’asthme chez l’adulte.

Procédures

Les animaux recevront sous anesthésie une petite goutte d’un allergène (molécule vis-à-vis de laquelle on peut être allergique) déposée sur une narine. L’allergène sera donné 4 fois en 12 jours, ou 20 fois en 5 semaines, selon le modèle. Les souris seront infectées avec un virus du rhume 1 seule fois, de la même manière : une goutte sur une narine, sous anesthésie. Certains groupes recevront en plus 1 injection unique en intraveineuse avec un traitement, sous anesthésie. Enfin, dans certains groupes, la respiration sera mesurée sur animaux vigiles se déplaçant librement dans un système clos (1 fois par jour pendant 5 à 9 jours).

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole sur les animaux sont : • L’anesthésie peut provoquer un stress, une hypothermie, et un risque faible d’arrêt cardiorespiratoire • L‘injection d’anesthésique peut entraîner une courte douleur (moins de 5 minutes) • L’infection avec un virus du rhume peut entrainer des symptomes viraux, inférieurs à ceux de la grippe • La mesure de la respiration peut être source de stress pour les animaux qui peuvent se déplacer librement mais sur une surface réduite. • Certaines mesures de la respiration doivent se faire après avoir respiré une molécule nébulisée induisant une contraction des bronches. Chez les animaux non asthmatiques, il ne se passe rien. Les animaux asthmatiques en exacerbation pourraient présenter des difficultés respiratoires.

Devenir

Afin de caractériser l’inflammation au niveau des poumons pour confirmer l’exacerbation de l’asthme, et évaluer l’effet des traitements, nous devons récupérer les poumons à 2 temps de l’expérience : au moment de l’exacerbation et à la fin de l’expérience. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de l’ensemble des animaux du projet. L’étude cellulaire et moléculaire du poumon est indispensable pour mieux comprendre les mécanimes de l’exacerbation de l’asthme induite par les virus, et evaluer l’effet et l’efficacité des traitements testés.

Remplacement

Il s’agit de l’étude d’une pathologie faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux paramètres dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro, ou modélisées. Nous allions néanmoins ce travail à des études in vitro analysant les fonctions des cellules NK de patients asthmatiques qui pourront enrichir le projet présenté ici, et orienter le choix des molécules ciblées par la thérapeutique.

Réduction

Les effectifs sont ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous effectuons une étude pilote afin d’obtenir des données préliminaires solides et de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires en utilisant un outil informatique. Les nombres d’animaux présentés sont donc des nombres maximaux, et sont susceptibles d’être revus à la baisse.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Elles seront anesthésiées avant chaque administration (allergène, virus, traitement) et le jour de la mise à mort. Un test de reflexe des extrémités sera effectué pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Une fiche d’observation sera remplie quotidiennement afin d’assurer un suivi de l’état des animaux et de prendre les mesures adaptées (surveillance accrue, apport de nourriture gélifiée) le plus précocément possible. Si ces mesures sont insuffisantes, et que l’état de l’animal ne s’améliore pas ou se dégrade, il sera euthanasié avant la mise à mort prévue initialement.

Choix des espèces

Les modèles animaux souris sont des modèles de base pour étudier le système immunitaire, et reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreux anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines au début des protocoles) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet. En outre, notre projet est focalisé sur l’asthme de l’adulte et ses exacerbations.