Souris
Etude de l’effet du PEDF sur le processus d’ossification primaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une ablation de la moelle osseuse du fémur sous anesthésie, précédée d'injections de tétracycline dans l'abdomen cinq jours puis un jour avant la mise à mort : 228 souris vont être utilisées, 168 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 dans des procédures légères. Toutes sont tuées pour récupérer leurs fémurs. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans la formation de l'os, en analysant des embryons à 16,5 et 19,5 jours de gestation, des souriceaux d'un jour et des adultes de deux mois. Le RNT ne précise pas combien de femelles gestantes sont tuées pour fournir ces embryons, ni comment se répartissent les 228 souris entre les stades étudiés.
Objectifs
Le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du tissu osseux est mal connu alors que la mutation du gène codant pour cette protéine induit dès l’enfance des fractures nombreuses et sévères liées à une fragilité osseuse importante (ostéogénèse imparfaite de type VI). Nos premiers travaux ont porté sur un modèle de souris adultes chez qui cette protéine a été supprimée et qui présentaient des anomalies osseuses modestes. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’os et d’expliquer pourquoi les enfants sont affectés d’une maladie sévère dès leur plus jeune âge, nous nous proposons d’analyser le squelette et la formation osseuse d’embryons de souris à différents stades de développement. Par la suite nous préciserons les mécanismes affectés par l’absence de cette protéine en reproduisant les stades initiaux de la formation osseuse (ossification) dans un modèle de réparation osseuse chez des souris adultes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de cette protéine dans la formation osseuse et particulièrement sur le processus d'ossification primaire qui conditionne le devenir de l'os adulte. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre les processus pathologiques impliqués dans l'ostéogénèse imparfaite de type VI et de proposer des traitements adaptés.
Procédures
Injection intra-péritonéale d'une substance (5j et 1j avant mise à mort. Chirurgie au niveau du fémur sous anesthesie gazeuse à l’Isoflurane. Injection de burpénorphine pré et post opératoire en sous cutané.
Impact sur les animaux
Concerant l'injection intra-péritonéale de tétracycline, on s’attend à un léger stress après la manipulation. Cette procédure est donc de classe légère. L'ablation médullaire se fait sous anesthésie gazeuse par Isoflurane. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. Cette procédure est donc de classe modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les fémurs
Remplacement
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.
Réduction
Le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques varie selon la nature du parametre étudié .Pour réaliser une étude statistique solide, nous adapterons le nombre d’animaux nécesaire en fonction de la variabilité attendue des mesures. Dans la plupart des cas ce nombre est limité à 6 souris par groupe, porté à 8 pour l’immunohistochimie des fémurs ablatés, à 10 pour l’histomorphométrie+FTIR et à 12 pour l’expression génique.. Pour réduire le nombre d'animaux dans cette procédure, nous utiliserons le fémur droit de chaque souris comme contrôle.
Raffinement
Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris sera mise en place. Une surveillance adaptée (observation régulière des animaux et grille de scoring) sera mise en place post-ablation et permettra de limiter au maximum la souffrance. Une analgésie pré-opératoire sera fait par injection 30min avant chirurgie. La chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse. Une analgésie post-opératoire sera effectuée par injection 4h après chirurgie et sera renouvelée au besoin. Cette technique a déjà été utilisée dans notre laboratoire et elle est maîtrisée par un personnel compétent. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme.
Choix des espèces
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène du PEDF a été invalidé. Le mutant KO-PEDF chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites (Doll et al 2013), c’est donc actuellement le meilleur modèle. Nous étudierons le processus d'ossification primaire sur des souris embryonnaires à 16.5 et19.5 jours post conception ainsi que sur des souriceaux de 1 j. Ce processus d’ossification primaire sera reproduit par ablation médullaire sur des souris de 2 mois
Evaluation de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 600
Chaque animal peut recevoir jusqu'à quatre mois de traitement, deux injections par jour, et un inducteur d'inflammation dans l'eau de boisson une semaine sur deux, jusqu'à quatre fois. 1 600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 400 autres dans des procédures légères, tous tués à l'issue. Ils développent une inflammation intestinale reproduisant la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, avec perte de poids, douleurs abdominales et diarrhée. Le mode d'administration, la fréquence et la durée des candidats médicaments dépendent de "la demande du sponsor", ces molécules étant celles de clients du laboratoire.
Objectifs
Plus de 3 millions de personnes sont atteintes d'une maladie inflammatoire chronique intestinale en Europe, rendant toujours nécessaire le développement de médicaments plus efficaces et mieux tolérées. Lors des poussées inflammatoires, ces maladies se caractérisent le plus souvent par des douleurs abdominales, des diarrhées fréquentes, parfois sanglantes, ou encore une atteinte de la région anale (fissure, abcès). Ces symptômes font peser sur la maladie un certain tabou, rendant la vie des patients qui en souffrent particulièrement difficile. L’objectif du projet est donc de faire la preuve de concept pharmacologique de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale induite chez le rongeur. Ces composés chimiques vont induire une inflammation de la paroi intestinale et reproduire les symptômes rencontrés chez des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique.
Bénéfices attendus
Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques intestinales. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour à terme mieux prendre en charge les patients et les traiter de façon durable.
Procédures
1) Dans le cadre de ce projet, la maladie sera induite soit par prise hydrique avec un inducteur d'inflammation intestinale pendant une période de 7 jours au maximum pour le modèle aigu ou en alternance de périodes où les animaux reçoivent l'inducteur pendant la première semaine puis de l’eau la seconde et ceci jusqu’à quatre fois pour le modèle chronique. Soit par délivrance dans le rectum (environ 20 secondes hors temps d'anesthésie) pour le modèle avec le 2ème inducteur. 2) Les animaux seront soumis aux candidats médicaments à tester dont le mode d’administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du sponsor ((intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) pour une durée totale de traitement de 4 mois maximum). 3) Tout au long de l'étude, les animaux seront attentivement suivis à l’aide d'une pesée quotidienne et d’un score clinique. 4) La perméabilité intestinale pourra être évaluée une fois au cours de l'étude. Pour cela, après 2 heures de mise à jeun, les animaux recevront un composé fluorescent par gavage (30 secondes). 4 heures après l'administration du composé, un prélèvement de sang sera effectué (durée : 1 min maximum), puis les animaux auront de nouveau accès à la nourriture. 5) D'autres prélèvements de sang pourront être effectués tout au long de la procédure (5 prélèvements maximum sur toute la durée du protocle avec 1minute maximum pour chacun chacun et en respectant un teps de récupération nécessaire entre 2 prélèvements).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sur ce modèle animal sont une perte de poids, des douleurs abdominales associées à de la diarrhée, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injections (intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) et peuvent engendrer un stress de même que la mise à jeun (2h). Pour pallier à cela, les cages seront enrichies et les animaux seront habitués à être manipulés par les expérimentateurs. Les aiguilles et les sondes de gavage seront adaptés au poids des animaux et au mode d’administration employé.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il n'est pas envisageable d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles animaux pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique, avant de passer aux essais cliniques chez l'Homme. L'utilisation des rats et des souris semble pertinent de par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent.
Réduction
Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. Lorsque cela est possible, les composés de nos clients seront screenés sur culture cellulaire ou organe isolé en complément des tests sur les animaux. Aucune étude pilote ne sera effectuée de part la robustesse du modèle utilisé.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Le projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective. Les rongeurs seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, en unités ventilées: Tous les animaux bénéficient d’un logement, d’un environnement, d’une alimentation, d’un apport en eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Les conditions d’environnement et les paramètres d’ambiance dans lesquels les animaux sont utilisés font l’objet de vérifications quotidiennes. Un cycle jour/nuit de 12h/24h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Tous les animaux disposeront d’un espace suffisant présentant une complexité adéquate pour leur permettre d’exprimer un large répertoire de comportements normaux. Les normes d'hébergement appliquées prenent en compte le nombre, le poids des animaux et la dimension de la cage. Leur environnement sera enrichi (igloo, petite buchette, neslet pour les souris et tunnel, grande buchette, neslet pour les rats) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Il n'est pas prévu d'administrer de molécule autre que celle du client. Il n'y a donc pas de possibilité́ de réaliser un traitement anti-inflammatoire ou anti-douloureux sans compromettre les résultats de l'étude car le but du modèle est d'étudier l'effet de nouveaux composés sur le développement des maladies intestinales inflammatoires dont l'inflammation est une composante majeure. Ainsi, un traitement anti-inflammatoire ou analgésique pourrait interférer avec le composé testé et biaiser le score établi pour caractériser la maladie ainsi que les paramètres mesurés (masure de la production de cytokines inflammatoires, recrutement de cellules immunitaires…). En effet, ces composés utilisent les mêmes voies de signalisation que celles des composés clients à tester. Les animaux seront tout de même pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement après l'induction de la maladie et jusqu'à l'euthanasie par les expérimentateurs ayant connaissance du modèle (grilles de score spéifiques permettant de définir les points limites).
Choix des espèces
D'une part, l’utilisation de modèles animaux dans l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin est très largement documentée dans la littérature scientifique. D'autre part, l'utilisation de rats et de souris se justifie par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), lorsque toutes leurs fonctions biologiques sont matures, afin d’obtenir des paramètres d’induction de la maladie reproductibles.
Identification et génotypage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Les souris porteuses de la mutation recherchée passeront dans d'autres procédures autorisées, les autres, génotype sans intérêt et géniteurs, sont tuées. 45 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans ce projet d'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit avant le sevrage, entre cinq et dix jours de vie, un prélèvement de cinq millimètres de queue qui dure moins de trente secondes. Le porteur affirme qu'une soixantaine de lignées génétiquement altérées sont "indispensables" à l'activité de la plateforme, et que travailler in vivo reste "indispensable" faute de modèle capable de reproduire un cerveau entier.
Objectifs
L’objectif du projet est d’identifier et de génotyper les animaux génétiquement modifiés ne présentant pas d'atteintes dommageables qui sont élevés au sein de l’animalerie. En effet, notre plateforme héberge une soixantaine de lignées génétiquement altérées qui sont indispensables à une activité de recherche pluridisciplinaire. Ces modèles murins permettent notamment de caractériser anatomiquement des voies neuronales, de faire de l'imagerie ou des enregistrements de l'activité des neurones in vivo ou ex vivo afin de mieux comprendre le fonctionnement normal et/ou pathologique du système nerveux. L’étape d’identification et de génotypage est indispensable pour sélectionner les animaux d'intérêt qui seront par la suite utilisés à des fins expérimentales dans des procédures autorisées.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre la mise à disposition d’animaux du bon génotype des lignées de souris transgéniques nécessaires pour la compréhension de certains mécanismes du vivant et, plus particulièrement, le fonctionnement normal et/ou pathologique du système nerveux central.
Procédures
Les animaux seront soumis à un prélèvement de queue de 5mm. L'ensemble de la procédure dure moins de 30s.
Impact sur les animaux
Le prélèvement à la queue (moins de 5mm) peut quelque fois engendrer un léger saignement.
Devenir
Les animaux comportant la mutation ou transgène d’intérêt entreront selon le protocole d'utilisation continue dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le MESRI. Les autres animaux (génotype sans intérêt, géniteurs pour le maintien des lignées) sont mis à mort.
Remplacement
Bien que des méthodes in vitro et in silico se développent de plus en plus, elles ne sont pas encore capables de modéliser fidèlement un organe complet comme le cerveau et encore moins un organisme. A ce jour, il reste donc indispensable de travailler sur des modèles in vivo afin de poursuivre la compréhension des mécanismes mis en jeu dans la plupart des pathologies et en particulier les maladies neurologiques (affections vestibulaires, maladies neurodégénératives...) ou psychiatriques (stress et résilience, addiction …).
Réduction
L’élevage est raisonné et adapté à façon en fonction des projets de recherche. Nous connaissons bien les lignées transgéniques qui sont établies depuis de nombreuses années au sein de la plateforme (taille des portées, âge optimal des géniteurs, fond génétique…) ce qui est un fort avantage pour réduire au minimum le nombre d’animaux produit . Le nombre d’accouplements est calculé au plus juste pour satisfaire aux besoins des projets expérimentaux. Les animaux sont génotypés avant le sevrage pour anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêt pour les autres procédures expérimentales.
Raffinement
Ni douleur, ni souffrance particulière ne sont attendus dans ce présent projet d’élevage. Afin de réduire la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties, nous réalisons la biopsie de queue entre 5 et 10 jours, selon les recommandations et la bibliographie actuellement disponibles. Les bébés sont rendus le plus rapidement possible à leurs géniteurs. L’état de santé des animaux sont vérifiés quotidiennement par le personnel qualifié. Une adoption par une autre mère allaitante peut être réalisée si besoin. Tout animal dont l’état général serait manifestement altéré sera euthanasié immédiatement.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. C’est un des modèles de mammifères les mieux connus sur beaucoup de plans (anatomie, physiologie, histologie, comportement,...). C'est un bon modèle préclinique puisque sa physiologie est assez proche de celle de l'homme. De nombreuses techniques de génétique permettent de modifier son génome à façon. Cela autorise la création de modèles de pathologies humaines mais également l'expression contrôlée de gênes indispensables à l'étude d'organes complexes comme le cerveau. Enfin, nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge si besoin. Les animaux seront identifiés et prélevés pour génotypage entre 5 et 10 jours, c'est-à-dire bien avant le sevrage. Cela permet de déterminer le plus tôt possible le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux.
Evaluation de l’activité et d’absence de toxicité de produits synthétiques de transfert d’acides nucléiques chez la souris (Modification 2)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Chaque souris subit jusqu'à trois injections de produits de transfection puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins avant d'être tuée. 2 070 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour prélèvement d'organes et analyses histologiques. La finalité est commerciale, le porteur voulant valider avant vente des agents censés délivrer de l'ADN ou de l'ARN dans l'organisme, cette deuxième modification du projet ajoutant des animaux pour tester d'autres formulations lipidiques. Il annonce vérifier "l'absence de toxicité" des produits tout en listant les risques attendus, thrombose, réactions inflammatoires et troubles de la démarche.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés. Une 2è modification du projet initial est nécessaire pour tester d'autres formulations lipidiques, avec ajout d'animaux.
Bénéfices attendus
Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.
Procédures
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un ou plusieurs prélèvements sanguins (maximum 4) (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des injections (sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou intranasale). De plus ils subiront un ou plusieurs prélèvements sanguins. Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
Les systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.
Etude en modèle murin du rôle d’un métabolite majeur de Streptococcus mitis, le lactate, sur la réponse à une pneumonie.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
6 354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou plusieurs injections, certaines sous anesthésie générale, pour installer dans leurs poumons une bactérie ou du lactate et provoquer une pneumonie. Le porteur indique une perte de poids transitoire de deux à trois jours après l'infection et prévoit des injections de morphinique selon le score clinique atteint. Les retombées annoncées pour les patients en réanimation restent au conditionnel, et il conclut que les modèles animaux sont "indispensables" à la compréhension des interactions entre microbiote respiratoire et immunité pulmonaire.
Objectifs
Les infections pulmonaires contractées à l’hôpital sont les plus fréquentes parmi les infections liées aux soins médicaux et représentent une des principales raisons de l’utilisation d’antibiotiques. Cependant, la résistance croissante des bactéries aux antibiotiques complique leur traitement, avec des échecs thérapeutiques observés dans environ 30 % des cas. Cette situation souligne l’urgence de développer de nouveaux traitements pour prévenir ou soigner ces infections. Des recherches récentes suggèrent que certaines bactéries naturellement présentes dans les poumons, pourraient jouer un rôle protecteur contre ces infections pulmonaires. Cependant, les interactions entre ces bactéries bénéfiques et celles responsables des infections sont encore peu connues, et leur influence sur les défenses immunitaires des poumons reste à approfondir. Notre projet de recherche explore, à l’aide d’un modèle animal, comment le lactate – une substance produite par une bactérie naturellement présente dans les poumons – agit sur la muqueuse pulmonaire et les cellules immunitaires, ainsi que son impact sur la réponse à une pneumonie.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à identifier les substances produites par les bactéries naturellement présentes dans les poumons qui aident à maintenir leur bon fonctionnement. Cela permettra de combler un manque de connaissances essentiel pour développer des traitements basés sur le microbiome pulmonaire. Ce travail pourrait avoir un impact majeur pour les patients souffrant de pneumonie. En effet, des études récentes montrent que l'administration de probiotiques, comme les bactéries lactiques, à des patients en réanimation pourrait réduire le risque de pneumopathie. Cependant, les preuves actuelles sont encore insuffisantes pour justifier des recommandations médicales.
Procédures
Tous les animaux recevront une ou plusieurs injections. Certaines injections seront réalisées sous anesthésie générale et ne dureront au maximum qu’1 minute, avec un réveil presque instantané. Les autres injections seront réalisées sur animaux vigiles et ne dureront que quelques secondes. En fonction de l’état général des animaux (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections de morphinique pourraient être réalisées.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection : Les modèles d’inflammation respiratoires aigües sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les animaux reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, une légère perte de poids. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleurs résiduelles ainsi que de stress supplémentaire. Suite à l’injection de bactérie ou de molécules en fonction des voies d’administration choisies et dans le cas d’injections multiples sur une durée maximum de 14 jours, les animaux pourraient ressentir un stress et une gêne.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre le microbiote respiratoire et le système immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Pour les tests pour lesquels une analyse statistique n’est pas prévue ainsi que pour certains groupes témoins, le nombre d’animaux sera réduit à 3 ou 5 animaux par groupe. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnelle aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections d’analgésiques seront réalisées. Afin de limiter la gêne potentielle consécutive à certaines administrations, la zone d’injection sera anesthésiée localement.
Choix des espèces
Le modèle murin de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature.
Développement d’un nouveau modèle souris de cancer de la prostate pour tester le potentiel d’une immunothérapie innovante
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
92 souris immunodéficientes vont être utilisées et toutes tuées, 87 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, cinq opérées sous anesthésie sans jamais se réveiller. 77 subissent une greffe de cellules tumorales prostatiques dans l'appareil génital, 58 une injection de moelle osseuse dans le sinus derrière l'œil suivie un mois plus tard d'un prélèvement de sang sous la mâchoire, 24 une exposition à un cocktail antigène-adjuvant par la même voie oculaire. Le porteur décrit des douleurs possibles au site d'implantation en fin de protocole, des métastases osseuses, pulmonaires et intestinales d'intensité variable, et une infection opportuniste qui tuerait l'animal en quelques jours. L'objectif immédiat reste de mettre au point un modèle, l'espoir d'expliquer la résistance des tumeurs de prostate à l'immunothérapie venant après.
Objectifs
L'immunothérapie présente des résultats très mitigés dans le cadre du cancer de la prostate. Mieux comprendre pourquoi les tumeurs de prostates sont aussi résistantes à cet axe thérapeutique représente un enjeu important. Ainsi, le premier objectif de ce projet vise à développer un modèle permettant de mieux comprendre les interactions entre la tumeur et l'infiltrat immunitaire. Dans ce modèle, les cellules prostatiques et immunitaires seront isolées à partir d'un même individu et manipuler en culture de cellule. Ceci permettra l’amplification des cellules et réaliser l'édition du génome sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les cellules, une fois obtenues, seront greffées de manière séquentielle sur une souris réceptrice immunodéficiente. Le second objectif, une fois le modèle en place, correspond à l'analyse de la réponse anti-tumorale par le conditionnement immunitaire via l’exposition de ce dernier à des « néo-antigènes » tumoraux (protéines ayant subi des modifications par suite de multiples mutations présentes dans la tumeur permettant de les distinguer des protéines « naturelles » de l’hôte). Ce projet a pour ambition de mieux comprendre la réponse immunitaire à l'exposition à ces « néo-antigènes » tumoraux et identifier des mécanismes permettant de contourner les mécanismes mise en place par les tumeurs pour échapper à l'immunosurveillance.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point d'un nouveau modèle d'étude du micro-environnement immunitaire des tumeurs prostatiques. Ce modèle permettra à terme de s'affranchir de l'utilisation de modèles transgéniques qui nécessite de nombreux croisements pour obtenir les génotypes d'intérêt et par conséquent des colonies d'animaux importante. Grâce à ce modèle, pratiquement toutes les souris implantées serviront de modèles d'étude. Quelques souris seront utilisées pour permettre l'amplification des cellules de moelle. Au final, ce projet devrait permettre d'établir un modèle pertinent pour comprendre pourquoi les tumeurs de prostate répondent mal à l'immunothérapie et trouver des stratégies alternatives pour contourner cette résistance.
Procédures
77 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale visant à réaliser la greffe orthotopique des cellules d'intérêt qui dure environ 15 minutes (procédure de mise en anesthésie + geste opératoire + réveil). 58 animaux seront soumis à une implantation de moelle qui sera réalisée, sous anesthésie gazeuse, par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire d'une durée de 3 minutes. Un mois post implantation, ces mêmes animaux subiront un prélèvement sanguin par voie sous mandibulaire d'une durée de 1 minute pour l'analyse des cellules circulantes et assurer la prise de la greffe. 24 animaux seront exposés à un cocktail antigène/adjuvant, sous anesthésie gazeuse, par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire d'une durée de 3 minutes.
Impact sur les animaux
L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut entrainer, de manière occasionnelle, certaines douleurs: 1) au niveau du tractus génital (site d'implantation), douleurs qui peuvent être chroniques ou passagères mais de basse intensité et uniquement lorsque le volume de la tumeur atteint une taille critique en fin de protocole 2) formation de métastases au niveau d'organes distants (os, poumons, intestin) ces douleurs ont une intensité variable et très dépendant de l'état de dissémination, également apparition sur la fin du protocole. 3) altération du statut sanitaire de l'animal par une infection opportuniste, c'est un évènement extrêmement rare compte tenu des conditions d'hébergement. Conduit à la mort de l'animal en quelques jours. 4) possible inflammation de la zone de chirurgie ou grattage au cours de la cicatrisation.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'échantillons pour les analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Une étude sur les propriétés des cellules tumorales prostatiques sera réalisé, en amont, pour déterminer les paramètres "agressif" et "invasif" de chaque modèles cellulaires. Ces analyses seront complétées par des co-cultures de cellules immunitaires et cellules tumorales en système en 3 dimensions permettant d'appréhender les modalités d'interaction entre chaque type cellulaire. L'ensemble de ces travaux ont pour but de limiter le recours au modèle animal pour répondre à des questions biologiques ciblées (croissance tumorale, vitesse de prolifération, activité immuno-suppresive etc.). Néanmoins, ces modèles cellulaires possèdent certaines limites qui ne permettent pas de reproduire dans son intégralité la complexité du développement d'une tumeur dans un organisme mammifère, ce qui justifie donc de compléter cette étude par les expérimentations conduites in vivo proposées dans ce projet.
Réduction
Cette même étude pourrait-être conduite sur des modèles de souris transgéniques, en lieu et place de greffes sur un modèle receveur. Dans cette hypothèse le nombre d'animaux générés nécessiterait des colonies de souris conséquentes pour l'obtention des invidus d'intérêt (environ 5 à 10% seulement des souris produites seraient utilisées pour l'étude). Grâce à ce modèle, un animal généré correspondra à un animal utilisé pour les analyses. Par ailleurs, les effectifs proposés de 12 animaux par lot pour les études quantitatives sont nécessaire pour assurer une analyse statistique optimale. Le nombre d'animaux a été calibré pour tester de manière séquentielle 2 clones cellulaires, 2 cinétiques d'implantation des moëlles osseuses et 2 adjuvants pour les test d'exposition aux antigènes tumoraux. Ce déroulé du projet par étape permet sélectionner chacun de ces critères l'un après l'autre et donc limite le nombre d'animaux qui pourrait être utiliser pour chaque combinaison possible.
Raffinement
Le développement tumoral et/ou la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques mis en place le cas échéant quand cela sera possible. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal, à savoir, un tube cartonné, un pad fibre pour le nesting, des buchettes de peuplier pour les activités d'exploration. Les animaux seront, autant que possible, placé plusieurs par cage pour favoriser les interactions sociales. Les animaux seront manipulés en condition low-stress par des prises en main en coupelle et une manipulation fréquentielle sera mise en place en amont des procédures pour un renforcement positif des animaux permettant de limiter le stress au moment des manipulations de chirurgie et de prévèlements. Les animaux utilisés étant porteur d'une immunodéficience, afin d’éviter toute contamination, les animaux seront hébergés en portoirs ventilés dans un secteur spécifique pour les animaux fragiles, en animalerie exemptes d’organismes opportunistes et pathogènes spécifiques. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés. Sur ce plateau technique, l'eau est autoclavée, la nourriture est irradiée, l’air est filtré, les salles sont en surpression, nous réalisons un change de tenue et protections individuelles. Les animaux sont surveillés tous les jours pour vérifier l’absence de points limites.
Choix des espèces
Le modèle murin immunodeficient correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Le recours a des modèles comme le rat ou le cochon entrainerait un surcout économique et ne serait pas justifié d'un point de vue scientifique. La complexité biologique de modèles alternatifs tel que des organoïdes n'est pas possible car ne permet pas la recomposition du répertoire immunitaire comme observé in vivo et la complexité de la réponse immune attendu dans un organisme entier. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.
Etudes Comportementales de souris modèles d’autisme en milieu naturalistique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris de ce projet voient leur accès à l'eau restreint pour les contraindre à apprendre des règles, une puce ayant d'abord été implantée sous leur peau sous anesthésie. 879 souris porteuses de mutations liées à l'autisme vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur revendique un "intérêt majeur au niveau éthique" pour son dispositif, qui éviterait le stress de l'isolement et de la restriction alimentaire, tout en décrivant des souris retirées de l'expérience quand elles ne boivent plus pendant vingt-quatre heures et un modèle qui se blesse la peau à force de se toiletter. Toutes sont tuées à la fin, pour prélèvement et analyse post-mortem.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer le comportement et les capacités cognitives des souris modèles d'autisme avec une approche plus éthologique, en plaçant des groupes sociaux dans une grande cage d’élevage dans laquelle les animaux peuvent apprendre différentes tâches pendant plusieurs semaines, à différents moments du cycle circadien, et sans intervention d’un expérimentateur car les tâches sont programmées et la quantification des performances est automatisée.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à redéfinir le rôle du cervelet et à élargir les perspectives de la recherche sur l'autisme pour mieux répondre aux besoins de la société. Longtemps considéré comme une structure dédiée au contrôle des mouvements, le cervelet apparaît aujourd’hui comme un centre clé de l’intégration des informations sensorielles et des fonctions cognitives complexes, remettant en question les idées reçues en neurosciences. En étudiant l'impact de certaines modifications génétiques liées à l'autisme sur des circuits spécifiques du cervelet, ce projet explore des mécanismes encore méconnus qui pourraient expliquer les troubles sensoriels et cognitifs associés à l'autisme. Il apporte ainsi un éclairage novateur sur les bases neurobiologiques de ce trouble. L’évaluation automatique des comportements et des capacités cognitives dans notre dispositif permettra d a aussi un intérêt majeur au niveau éthique, car il permet de tester les souris dans leur lieu d’hébergement familier, enrichi par le contexte social et par une activité naturelle de recherche de boisson dans des zones différentes de la cage, en évitant tout stress lié à l’isolement, à la restriction en aliment, à l’anxiété induite par un environnement nouveau, ou à la manipulation par l’expérimentateur. Ce dispositif permet aussi l’obtention rapide de résultats sur des cohortes conséquentes de souris dans des conditions expérimentales stables, à la fois pendant les périodes diurnes et nocturnes.
Procédures
Une implantation sous-cutanée de transpondeurs (puce éléctronique) sera réalisée pour chaque souris au moyen d'une anesthésie gazeuse (durée inférieure à 2 minute par souris). Des groupes de 8 à 16 souris agées de 2 mois à 5 mois maximum seront hebergées pendant 2 à 4 semaines dans une grande cage automatisée permettant de mesurer differents comportements spontanés et différents apprentissages Les animaux seront testés pour leur capacité d’apprentissage et de mémoire (mémoire de travail, mémoire spatiale et mémoire associative) et auront pour cela accès à des récompenses (eau sucrée) ou des contraintes limitant de manière temporaire leur accès à l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Une légere gène pourrait être ressentie suite à l'implantation sous-cutanée de la puce nécessaire au suivi des animaux dans le dispositif. Certaines souris pourraient avoir des difficultés d’accès à la boisson du fait de la pression sociale susceptible de s’instaurer dans un grand groupe, ou dans certains protocoles impliquant une compétition sociale ou quand la règle à apprendre pour accéder à la boisson s’avère trop compliquée pour certaines souris modèles présentant un sévère déficit cognitif. L’un de nos modèles de souris peut parfois développer des plaies cutanées dues à un comportement exacerbé d’auto-toilettage. Par ailleurs, un autre modèle présente une sensibilité́ accrue aux bruits
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem : cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Aucun modèle mathématique ou in vitro n'existe actuellement pour décrire le lien entre des mutations génétiques de gènes liés à l'autisme et les troubles comportementeaux qui en découlent. Ainsi, l'utilisation d'animaux éveillés s'avère indispensable pour comprendre ces liens au travers différentes observations comportementale. Pour ce faire, l'emploi d'un modèle animal mammifère est essentiel afin d'obtenir des résultats pouvant être extrapolés à la compréhension du processus d’apprentissage humain. La souris représente un choix privilégié en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Humain.
Réduction
En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux réalisés en en milieu semi-naturalisé et des analyses statistiques similaires, nous estimons le nombre nécessaire de souris par groupe à 16 souris. Des tests statistiques seront réalisés afin d'avoir une interprétation stable des résultats. Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble du projet, 879 souris seront nécessaires.
Raffinement
Une semaine avant le début de l’étude, une courte anesthésie (moins de 2 minutes) permet d’injecter sous la peau une petite puce. Une analégsie sera réalisée avant l'injection de la puce. Cette puce sert à suivre l’activité de chaque souris. L’intervention est réalisée par du personnel qualifié et formé à cette procédure. Ensuite, les souris évoluent dans un dispositif expérimental qui leur sert aussi d’habitat. Cet environnement est conçu pour limiter leur stress : elles y vivent en groupe, sans être isolées ni manipulées, et y recherchent leur boisson de manière naturelle, dans différentes zones de la cage. La lumière et la température sont contrôlées pour rester identiques aux conditions habituelles de l’animalerie. Le dispositif comprend quatre abris où les souris peuvent se reposer ou se regrouper. Elles y sont progressivement familiarisées en y vivant en continu pendant plusieurs semaines. Un logiciel surveille leur accès à l’eau et alerte en cas de problème. La quantité de boisson consommée par chaque souris est contrôlée chaque jour pour s’assurer qu’elle boit suffisamment (au minimum 2 à 3 ml par jour pour les protocoles les plus stricts). Si une souris ne boit pas pendant 24 heures, elle est immédiatement retirée de l’expérience pour être hydratée. Si cela arrive pendant la phase de familiarisation, elle peut être réintroduite après une heure si elle ne montre aucun signe de souffrance et a bien bu. En revanche, si elle ne boit toujours pas dans les 12 heures suivantes, elle est retirée définitivement et euthanasiée. Le bien-être des souris est suivi attentivement après l’anesthésie et en cas de retrait du dispositif, grâce à des grilles d’observation spécifiques.
Choix des espèces
La souris représente un choix privilégié pour étudier les alterations comportementales liés à l'autisme en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Humain. Il s’agira de souris adultes âgées de 2 à 6 mois nous permettant d’étudier le comportement sur un cerveau stable d'un point de vue développemental (2 mois). Nous arrêtons les tests avant l'effet du vieillissement cérébral (6 mois)
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Quatre cents souris de ce projet passeront ensuite dans un projet de formation interne aux gestes techniques, à condition que la maladie ne leur ait pas été induite. Au total 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié classée sévère, les autres mises à mort en fin d'étude ou à l'atteinte des points limites. Elles subissent des injections intra-rectales de composés dilués dans l'éthanol, des endoscopies pouvant léser ou perforer l'intestin, des prélèvements sanguins et des jeûnes allant jusqu'à douze heures par semaine. Le porteur indique qu'aucun calcul statistique n'a servi à fixer l'effectif, établi d'après le nombre d'études des années passées et une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie invalidante caractérisées par une inflammation de la paroi du tube digestif entraînant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de candidats médicaments issus de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Administration vigile ou sous anesthésie générale : durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Administration des composés à visées thérapeutiques : durées de 10 à 15 secondes chacune. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements : chaque prélèvement aura une durée d’environ 15 à 30 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des volumes maximaux sont prédéfinis selon le poids des souris. Insertion de sonde caméra (endoscopie) : sous anesthésie pour analyse des intestins, 3 à 4 minutes par analyse. La fréquence est définie par le protocole d’étude et est généralement de 1 par cycle. Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de traitement solubilisé dans l'éthanol (douleur) ainsi que par les prélèvements sanguins (hématome, douleur), l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique ainsi que par l'endoscopie (lésion de la muqueuse digestive, perforation). Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, une perforation de l'intestin. L’injections intraveineuse de plasmides peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, les minutes suivants l’injection.
Devenir
Tous les animaux en fin d'étude, ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasié. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet de formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris, sous réserve d’un avis vétérinaire favorable si la pathologie n'a pas été induite sur les souris. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 2000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 40 études précliniques de 50 souris. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus maximum. Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires (diet gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins des volume maximaux sont définis, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les administrations intra-rectales (hors endoscopie) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et un volume maximal d'injection est défini. L’endoscopie sera réalisée sous anesthésie générale avec un volume d’injection maximal défini.
Choix des espèces
Les modèles décrits dans ce projet ont été validés chez la souris, de plus, dans le cadre des études conduites par l’entreprise, celle-ci met à disposition des souris humanisées qui peuvent être utilisées dans le cadre de ces projets. Elles permettent d’étudier les interactions entre système immunitaire, pathologie, traitement et aspect toxicologique tout en réduisant la barrière d’espèce homme-animal. Pour obtenir des données scientifiquement valides, il est important d’assurer une comparabilité des résultats entre souches humanisées et non-humanisées, et donc que les études soient réalisées sur souris. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Évaluation de la spécificité de radiopharmaceutiques pour le marquage du thrombus en imagerie TEP chez des souris mâles (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
216 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune subissant huit contentions, quatre anesthésies, quatre injections, une chirurgie et un transport routier. La chirurgie qui provoque la thrombose dure jusqu'à une heure quarante-cinq, et le porteur classe la douleur qui suit comme sévère pendant 24 heures. Le transport entre les deux établissements, jusqu'à cinq heures, est lui aussi déclaré comme une nuisance sévère. Le gain attendu est diagnostique, distinguer un caillot récent d'une séquelle pour ajuster les anticoagulants, quand la douleur des souris, elle, est décrite comme certaine et immédiate.
Objectifs
La maladie veineuse thromboembolique (MVTE) est la conséquence de la formation d'un caillot de sang (thrombus), obstruant partiellement ou totalement une veine. Les deux principales présentations cliniques de la MVTE sont l’embolie pulmonaire et la thrombose veineuse profonde ou phlébite. La fréquence et la gravité de la MVTE n'ont pas changé au cours des 20 dernières années, malgré les progrès majeurs au niveau thérapeutique. La MVTE est une pathologie grave et fréquente qui peut devenir chronique. Pour améliorer la prise en charge et le diagnostic, il est important de faire la différence entre un nouvel évènement de thrombose et une récidive qui se distinguent par une composition différente du thrombus. Cependant avec les modalités d’imagerie médicale actuellement disponibles, il est seulement possible de déterminer s’il y a un thrombus ou non sans aucune information sur sa composition. Notre projet propose de réaliser deux modèles de thrombose veineuse chez la souris mâle induit par la chirurgie qui permettront de tester de nouveaux radiopharmaceutiques pour l’analyse du thrombus veineux en utilisant la technologie de tomographie par émission de positons (TEP). Le projet se déroulera dans deux EU.
Bénéfices attendus
Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui présentent un risque hémorragique important et que les patients doivent le plus souvent prendre à vie. Dans le contexte de MVTE, l'imagerie moléculaire permet un ciblage direct et non invasif des différents constituants du thrombus veineux avec une sensibilité et une spécificité élevée, et un potentiel d'imagerie corps entier. Les modalités d’imagerie actuelles ne permettent pas de caractériser les composants du thrombus. Par conséquent, il est impossible de déterminer s’il s’agit d’un thrombus récent qui nécessitera un traitement anticoagulant ou d’un thrombus résiduel, voire d’une séquelle vasculaire pour laquelle un traitement n’est pas obligatoire. Cette distinction est cruciale pour mieux adapter les traitements et réduire le risque d’hémorragies associées aux traitements anticoagulants. L'objectif de ce projet est de développer de nouveaux radiopharmaceutiques pour le diagnostic de la MVTE à l’aide de la technologie en tomographie par émission de positons (TEP) ayant une sensibilité plus élevée et une meilleure résolution spatiale que la tomographie par émission monophotonique (TEMP). Nous avons choisi des dérivés de traceurs déjà évalués chez l'homme avec la technologie TEMP, et de les tester sur des modèles précliniques de thrombose. Une meilleure caractérisation du thrombus veineux par l’imagerie médicale permettant une meilleure adaptation des traitements et donc un bénéfice pour la prise en charge des patients.
Procédures
Dans l'EU 1, afin d’induire une thrombose veineuse, les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie (durée 1h30 à 1h45). Le suivi de la formation du thrombus sera assuré par une échographie sous anesthésie (durée 15 minutes). Dans l'EU 2, l’injection du radiopharmaceutique en intra-veineuse pour la biodistribution n’est pas douloureuse (durée 5 min). Enfin la procédure d’imagerie TEP sous anesthésie gazeuse et lit chauffant est sans douleur (Durée 10 minutes). Le prélèvement sanguin terminal est fait sur souris endormies et analgésiées avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les actes que subissent les 216 animaux : 8 contentions, 4 injections, 1 chirurgie 4 anesthésies, 1 transport et une imagerie TEP. Les nuisances suivantes sont anticipées : - Le stress lié à la contention et à la douleur liée à l’injection de l’analgésique : La nuisance subie est légère et d’une durée de 1 minute maximum. - Dans l'EU1, le stress lié à l’entrée des animaux dans la boîte à induction de l’anesthésie gazeuse avant la chirurgie et l’échographie-doppler : durée 4 minutes maximum, d’intensité légère. - La douleur générée par la chirurgie : (1) Douleur, durcissement de la zone de chirurgie, sensation de chaleur au niveau de la veine cave inférieure, (2) Occlusion intestinale, (3) Douleur au niveau de la zone suturée. Durée 24 h en post-chirurgie d’intensité sévère. - Le stress et l’angoisse générés par le transport des animaux entre les 2 EU : La nuisance subie est sévère et d’une durée de 5h maximum. - Dans l'EU 2, Le stress lié à la contention et à la douleur liée à l’injection du radiopharmaceutique : durée 5 minutes, intensité légère. - Le stress et l’angoisse générés l’imagerie TEP est léger et d’une durée de 10 minutes.
Devenir
A l'issue de la procédure, nous devrons prélèver du sang et des organes sur tous les animaux, pour cela ils seront tous mis à mort.
Remplacement
Concernant le remplacement, nous avons eu recours à des expériences in vitro (formation de caillot de sang ou de plasma) pour valider la spécificité des 3 radiopharmaceutiques que nous souhaitons tester. Toutefois ces études ont des limites. En effet la maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et globules blancs) et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate). Les modèles in vitro ou ceux de modélisation informatique sont encore incomplets et ne permettent pas de prendre en compte la complexité de cette pathologie.
Réduction
Les animaux seront réceptionnés sur plusieurs commandes dans l'EU 1, nous ajusterons ces commandes en fonction de nos besoins. Nos précédents projets ont montré que des groupes de 10-12 animaux au minimum sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Pour information, le nombre d'animaux a été réduit au maximum pour assurer une robustesse statistique des résultats. Quand nous aurons inclus 8 animaux par groupe, nous ferons un point sur les données obtenues à l’aide de tests statistiques adaptés. L’utilisation de l’échographie doppler nous permettra d’identifier les animaux qui ont thrombosés et qui pourront être envoyés dans l'EU 2.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous avons mis en place des mesures de raffinement adaptées à notre modèle expérimental. Au cours de la chirurgie, nous préviendrons : - La survenue d’une infection (travail en condition aseptique) - La douleur (analgésie et anesthésie) - L’hypothermie (tapis chauffant) - La déshydratation (administration de sérum physiologique) - Le desséchement oculaire (gel ophtalmique). En post-opératoire, nous utiliserons de façon systématique un gel d’hydratation qui sera supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie. Le bien-être et la douleur seront évalués à l’aide d’une grille de score , 4-6h après la chirurgie, à J1 (avant et après le transport), à J2 et à J3. Chaque animal ayant atteint les points limites sera pris en charge immédiatement par les responsables du projet. Au cours de l’imagerie TEP, nous préviendrons : - L’hypothermie (tapis chauffant) - Le desséchement oculaire (gel ophtalmique). Le trajet entre les 2 EU se fait par transporteurs agréés. Au fond des cages sera disposé 5ml/souris d'un gel nourrissant (MedigelSucralose, Clear H2O) contenant 10µg de buprénorphine.
Choix des espèces
Le modèle de thrombose veineuse chez la souris que nous souhaitons utiliser est un modèle de référence pour l’étude de la maladie veineuse thromboembolique. Il est très bien caractérisé dans la littérature, fiable, reproductible et reconnu par nos pairs. La maladie thromboembolique veineuse touche les adultes, tous les animaux que nous utiliserons serons âgés de 7 à 12 semaines.
Effets d’une administration orale du composé X chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse et hébergée à thermoneutralité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Tester le composé anti-obésité d'un laboratoire client : 30 souris mâles rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent 36 jours seules en cage, subissent 22 gavages, neuf pesées et un jeûne de huit heures avant un test de tolérance au glucose. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour un animal social, et que l'obésité induite réduit leur capacité de mouvement. L'étude ne portera que sur des mâles, tester aussi les femelles imposant de doubler les effectifs, une seconde étude n'étant prévue qu'en cas d'efficacité observée chez le mâle.
Objectifs
Le présent projet sera mené pour le compte d'un laboratoire pharmaceutique client qui développe des thérapies de première classe pour traiter les causes sous-jacentes du dysfonctionnement organique chez les patients atteints de troubles métaboliques graves, notamment l'obésité et le diabète. Parmi ses thérapies en développement, notre client souhaite tester le composé X qui a été développé afin d'augmenter les dépenses énergétiques et diminuer l'appétit, de façon à améliorer la santé métabolique et cardiovasculaire des patients souffrant d'obésité et de troubles métaboliques associés. L'étude faisant l'objet de la présente demande visera a tester l'efficacité in vivo du composé X, à deux doses, chez un modèle de souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse. Compte tenu du mécanisme d'action du composé X qui conduit à une activation des dépenses énergétiques via la production de chaleur par le corps, les souris seront hébergées à une température de 28-30°C, de façon à limiter la production de chaleur par l'organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mis sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (9 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de placébo ou du candidat médicament par voie orale (22 administrations; durée : 1 minute); 3) Analyse de la composition corporelle (1 mesure; durée : 2 minutes); 4) Un hébergement individuel en cage standard (36 jours pour tous les animaux).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements oraux (placébo, composé X et Glucose), ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 8h préalable a la réalisation du test de tolérance au glucose, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultérieures (imagerie, histologie, dosage de protéines impliquées dans les dépenses énergétiques...).
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire, les dépenses énergétiques et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de première étude sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par gavage seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 17 semaines (24 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 11 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Caractérisation et ciblage des cellules initiatrices des leucémies aiguës lymphoblastiques B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris sont analysées au moment où elles atteignent leurs points limites, c'est-à-dire quand la leucémie s'est déclarée. 3 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie, jusqu'à une fois par mois pendant toute leur vie, une irradiation, puis une greffe de moelle ou de cellules leucémiques humaines suivie de chimiothérapie. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, développer "à long terme" de nouvelles thérapies contre le cancer pédiatrique le plus fréquent, quand les prélèvements répétés et la maladie induite, eux, courent sur toute la vie des animaux.
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques B (LAL-B) touchent principalement les enfants, et constituent le cancer pédiatrique le plus fréquent. Les traitements actuels de ces leucémies sont efficaces pour induire une rémission à long terme. Cependant, les cellules souches leucémiques (CSLs) peuvent échapper au traitement et servir de réservoir pour les rechutes de la maladie, ces dernières étant de très mauvais pronostique clinique. Le projet que nous développons représente un challenge important en recherche translationnelle, et a pour objectif d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les fonctions aberrantes des CSLs. A cette fin, nous développons des modèles murins génétiquement modifiées pour exprimer des facteurs de transcription oncogéniques, et qui récapitulent efficacement le développement de la leucémie humaine. Nous développons également des modèles de xénogreffes de LAL-B humaines couplés a des traitements de chimiothérapie pour accéder aux cellules responsables des rechutes de la maladie. Par l’utilisation de ces modèles, nos travaux démontrent que les oncogènes sont capables de reprogrammer des propriétés fonctionnelles et moléculaires de cellules souches à une sous-population de progéniteurs lymphocytaires normaux, les convertissant en CSLs résistantes aux traitements, mimant ainsi les caractéristiques des cellules responsables des rechutes de la maladie chez le patient. Nos modèles permettent donc un accès reproductible et non restrictif aux CSLs qui représentent une population cellulaire de premier choix pour le développement de nouvelles thérapies ciblées. Dans ce contexte, nous proposons dans ce projet d’explorer, de caractériser et de cibler les CSLs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir notre connaissance sur les cellules qui initient les leucémies aigues lymphoblastiques de l’enfant et de développer à long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Le prélèvement de moelle osseuse et/ou de sang ainsi que les transplantations de moelle osseuse dans des souris receveuses irradiées au préalable se feront sous anesthésie (animal surveillé jusqu'au réveil). Les prélèvements de moelle osseuse, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont des procédures de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements médullaires, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de 2 minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont donc une procédure de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes. Les souris sont surveillées attentivement dans les heures qui suivent l’irradiation, et du gel hydratant est ajouté dans la cage durant la première semaine.
Devenir
A l’âge voulu, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.
Remplacement
En complément à nos approches in vivo, notre travail consiste également à confirmer nos observations par des approches expérimentales in vitro sur les cellules de souris mais également sur les cellules humaines. Nous avons notamment validé au laboratoire par des approches in vitro, que les cellules initiatrices de la leucémie sont quiescentes et résistantes aux traitements de chimiothérapie, ce qui constitut une stratégie complémentaire à nos approches de transplantation in vivo. De plus nous utilisons massivement des outils d’analyse à large échelle des données de la littérature, ce qui nous permet d’avancer dans nos démarches scientifiques sans utiliser d’animal.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et une analyse statistique adaptée aux petits échantillons, optimisant ainsi nos protocoles et réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Les travaux de la littérature nous aident à déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour garantir la valeur scientifique de l'expérience et éviter qu'elle ne doive être reproduite. De plus, les études longitudinales nous permettent de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental comprenant l'utilisation de cylindres de coton pour réduire le stress potentiel et la présence d'igloos rigides rouges dans toutes les cages pour offrir un abri sécurisé. En cas de comportement inhabituel tel que la prostration, un pelage terne et hirsute, ou des signes de blessures infligées par d'autres animaux, l'individu concerné est isolé et reçoit une attention renforcée. Une perte de poids soudaine dépassant 20% du poids initial de l’animal est également surveillée (selon une grille de scoring en annexe). Des soins appropriés sont alors prodigués, incluant la désinfection des plaies ou un accès facilité à la nourriture si nécessaire. Si aucune amélioration n'est constatée malgré ces mesures, des décisions seront prises pour mettre fin à la vie de l'animal de la manière la plus humaine possible afin de prévenir toute souffrance inutile, en accord avec les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les souris immunodéficientes sont hébergées dans un environnement répondant aux normes pour prévenir l'apparition de phénotypes dommageables (manipulation PSM, isolateur). Les prélèvements médullaires (de degré de sévérité modérée) sont réalisés sous anesthésie et analgésie, avec l'animal placé sur une plaque chauffante et surveillé attentivement jusqu'à son réveil. Les personnes effectuant ces prélèvements sont formées à cette technique et possèdent les compétences nécessaires pour manipuler les souris et effectuer les gestes techniques dans le respect du bien-être animal.
Choix des espèces
La communauté scientifique internationale privilégie l'utilisation de modèles murins pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans les pathologies hématologiques, en raison de la conservation des gènes et des voies de signalisation entre l'Homme et la souris. Ainsi, les résultats obtenus chez la souris en hématopoïèse sont souvent extrapolables à l'humain. Nous allons mener des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, incluant des périodes à un jeune âge (1 et 3 mois) ainsi qu’au stade leucémique (analyse au moment du développement de la maladie lorsque les souris auront atteint leurs points limites). Ces différents stades miment le processus multi-étapes du développement de la maladie, de l’initiation à la transformation tumorale.
Déterminer l’origine des cellules de Langherans de la langue
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Huit minutes d'irradiation quasi totale sous anesthésie, puis une injection de moelle osseuse derrière l'œil : 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 96 d'entre elles en gravité sévère. Les souriceaux donneurs, âgés de 7 à 10 jours, ont le bout de la queue coupé pour le génotypage, un geste que le porteur décrit comme peu ou pas douloureux à cet âge. Les receveuses reçoivent ensuite du tamoxifène par sonde gastrique, des injections dans l'abdomen alors qu'elles sont conscientes, et un prélèvement de sang sous la mâchoire. L'effectif a été fixé "en utilisant un calculateur en ligne", sans autre précision.
Objectifs
La candidose est une infection fréquente de la langue causée par un champignon naturellement présent dans notre corps. Ce champignon, habituellement inoffensif, peut devenir problématique dans certaines situations, comme chez les bébés, les personnes âgées ou celles dont le système immunitaire est affaibli.Nos recherches montrent qu’un type de cellules immunitaires présentes dans la langue, appelées cellules protectrices, joue un rôle essentiel pour lutter contre cette infection. Ces cellules ont besoin d’une molécule spécifique pour survivre et rester dans les tissus. Dans un modèle de souris où cette molécule est absente, ces cellules immunitaires disparaissent presque complètement.Cependant, après une infection par ce champignon, nous avons observé que le nombre de champignons dans la langue augmente dans un premier temps, avant de diminuer. Cette baisse coïncide avec l’apparition de nouvelles cellules protectrices, même sans la molécule habituellement nécessaire à leur survie. Nous ne savons pas encore d’où proviennent ces nouvelles cellules ni quelle autre molécule pourrait les aider à rester actives dans le tissu. Nous avons également observé qu’en présence de cette molécule, les cellules protectrices sont plus nombreuses après une infection. Cela soulève des questions sur les mécanismes à l’œuvre en fonction de la présence ou non de cette molécule. Ce projet vise à : Identifier la molécule et les cellules responsables de la production ou du maintien des cellules protectrices dans les tissus infectés. Comprendre d’où proviennent les nouvelles cellules protectrices recrutées après l’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre comment le corps produit certaines cellules immunitaires, essentielles pour se défendre contre les infections. En étudiant l'origine des cellules protectrices après une infection causée par un champignon normalement inoffensif, les chercheurs espèrent découvrir comment ces cellules se régénèrent dans les tissus. Le projet vise également à comprendre comment, même en l’absence d’une molécule clé, l’organisme parvient à réduire la quantité de champignons. Ces découvertes pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches pour lutter contre les infections fongiques, particulièrement chez les personnes ayant un système immunitaire affaibli. Enfin, en approfondissant nos connaissances sur le rôle des cellules immunitaires dans la protection et la santé des tissus, ce projet pourrait contribuer au développement de traitements pour des maladies auto-immunes ou inflammatoires..
Procédures
Les souris donneuses subiront un prélèvement de la partie terminale de la queue (appelé prélèvement caudal) pour permettre le génotypage. Cette intervention, qui dure environ 1 minute, sera réalisée sur des souriceaux âgés de 7 à 10 jours. Les souris receveuses subiront, sous anesthésie chimique, une irradiation quasi-totale pendant 8 minutes afin d'éliminer leur moelle osseuse. Ensuite, elles recevront une injection de moelle osseuse provenant des souris donneuses. Cette injection, d’une durée d’environ 1 minute, sera effectuée par voie oculaire, c'est-à-dire via une injection dans la zone située derrière l'œil, ce qui permet un accès rapide au système sanguin. L'anesthésie chimique sera administrée par injection intrapéritonéale, ce qui signifie que la substance anesthésique sera injectée directement dans la cavité abdominale des souris conscientes. Cette injection prend environ 1 minute par souris. Certaines souris receveuses seront traitées avec du tamoxifène, une molécule qui permet de moduler l'expression génétique. Ce traitement sera administré par nourriture forcée (c'est-à-dire directement dans l'estomac à l'aide d'une sonde) en moins de 10 secondes par intervention, réalisée deux fois à 7 jours d'intervalle. D'autres souris recevront une injection intrapéritonéale, d'une durée d’environ 1 minute, également sur animaux conscients, pour l’administration d'une molécule permettant de mesurer les cellules en prolifération avant leur euthanasie. Enfin, toutes les souris receveuses subiront un prélèvement sanguin de courte durée (environ 1 minute par souris) au niveau du sinus submandibulaire, une zone située sous la mâchoire, qui permet un accès rapide et efficace aux vaisseaux sanguins pour effectuer la collecte de sang.
Impact sur les animaux
- Prélèvement de la queue : Une petite partie de la queue sera coupée sur les souris 10 jours après leur naissance. À cet âge, la douleur ressentie est très faible ou inexistante car les nerfs de la queue ne sont pas encore complètement développés. - Nourriture forcée : une molécule sera administré par voie orale à l'aide d'une petite seringue, ce qui peut causer un léger inconfort et stress pendant environ 10 secondes. - Anesthésie : Les souris seront endormies avant l'irradiation pour pouvoir protéger leur tête avec un bouclier en plomb. - Irradiation : Les souris recevront une irradiation partielle de leur corps, sauf la tête, pour affaiblir leur système immunitaire sans endommager certaines cellules spécifiques de la langue. Cela peut causer plusieurs effets secondaires chez les souris. Elle provoque une suppression immunitaire, rendant les animaux vulnérables aux infections. Cette procédure peut également entrainer une réduction des globules rouges et des plaquettes. Les souris sont plus sensibles aux infections opportunistes en raison de leur système immunitaire affaibli. - Transplantation de moelle osseuse : Les souris recevront une greffe de moelle osseuse par une injection dans une veine située derrière l'œil.
Devenir
À la fin des procédures, les animaux sont mis à mort et les organes prélevés post mortem pour analyse .
Remplacement
L'utilisation du modèle animal est indispensable ici, car il n'est pas possible de reproduire la complexité des interactions entre les différents types de cellules immunitaires, telles que les cellules qui protègent l'organisme contre les infections, et notre champignon naturellement présent dans le corps (appelé commensal), au niveau de la langue, dans des modèles en laboratoire. Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaires pour notre étude en utilisant un calculateur en ligne, en prenant en compte des critères scientifiques importants comme la précision des résultats, le niveau de confiance et la différence attendue entre les groupes étudiés. Pour analyser les données, nous utiliserons des tests statistiques adaptés qui ne supposent pas que les données suivent une distribution particulière.
Raffinement
Notre animalerie suit des normes strictes pour minimiser les risques d'infection et assurer le bien-être des animaux. Les souris sont logées dans des cages conformes aux directives européennes, avec suffisamment d'espace pour se déplacer et exprimer leurs comportements naturels. Chaque cage contient des matériaux pour que les souris puissent construire des nids, et les conditions de température, d'humidité et de lumière sont soigneusement contrôlées. Lors de certaines procédures, les souris sont anesthésiées pour éviter toute douleur, et nous prenons plusieurs précautions pour leur confort, comme l'utilisation de coussins chauffants et de gel pour les yeux. Nous utilisons une souche de champignons qui ne cause pas d’infections graves aux souris, et nous surveillons de près leur état de santé pour intervenir rapidement si nécessaire. Pour minimiser le stress, les injections sont faites par des professionnels expérimentés. En cas de faiblesse immunitaire temporaire due aux traitements, un antibiotique est ajouté à l'eau de boisson des souris pour les protéger. Nous nous engageons à respecter le bien-être animal tout au long de l'étude.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation, et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal pour l’étude du système immunitaire. De plus, le modèle murin est un modèle de choix grâce à l'existence de souris génétiquement modifiées. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit à partir de 6 semaines, car c'est à ce stade que leur système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel. Cela garantit des résultats pertinents et reproductibles pour les études portant sur les réponses immunitaires, qui pourraient différer chez des animaux en cours de développement.