Souris

Gavées deux fois par voie orale sous contention de moins de trente secondes, des souris femelles gestantes sont ensuite tuées pour que leurs fœtus soient prélevés, puis tués à leur tour. 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur conclut que la mise à mort des femelles gestantes et de leurs fœtus fait qu'ils ne souffrent pas. Il ajoute qu'aucun ne peut être gardé en vie, réutilisé, adopté ni replacé, les testicules des fœtus mâles étant l'objet même de l'étude, consacrée au rôle de la vitamine A dans leur formation.

Objectifs

La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Pour agir pendant le développement embryonnaire, la vitamine A est transformée par des enzymes en un métabolite actif qui se fixe ensuite sur des récepteurs nucléaires qui relayent son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes qui dégradent ce même métabolite. Afin d’étudier et de comprendre le rôle de la vitamine A dans la différenciation des cellules constitutives du testicule chez la souris, nous proposons de comparer des fœtus normaux à des fœtus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans les différentes étapes de différenciation des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur ces évènements chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde. Comprendre le rôle de la vitamine A dans le testicule au cours du développement peut également fournir des pistes pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.

Procédures

Les souris femelles gestantes sont traitées par gavage oral pour permettre la mutation (recombinaison). Il s’agit de deux contentions simples qui durent moins de 30 secondes chacune. Les souris sont ensuite euthanasiées. Après prélèvement (quelques secondes), les fœtus sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention et l’administration de substance par gavage. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage sont déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. Immédiatement après le gavage, tout signe de fausse route (par exemple suffocation) sera suivi de la mise à mort immédiate de l'animal. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème. Dans le cadre de ce projet, les femelles gestantes et les foetus sont euthanasiées, de sorte que les femelles gestantes et les foetus ne souffrent pas.

Devenir

Tous les animaux décrits dans ce projet (femelles gestantes et fœtus) sont euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus sont euthanasiés pour les analyses moléculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.

Remplacement

Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ou d’organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions endocrines/paracrines. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.

Réduction

La stratégie des accouplements fait en sorte que parmi des fœtus obtenus, une moitié possède le génotype contrôle pour les allèles conditionnels et l’autre moitié possède le génotype mutant pour les allèles conditionnels. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique.

Raffinement

Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes. La qualité de la contention permet d’assurer un gavage efficace et rapide, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, analgésie, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par quatre dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et suffisamment de fibres pour la construction de nids afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.

Choix des espèces

De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte.

420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à des âges échelonnés de six jours à treize semaines. Les nouveau-nés reçoivent trois injections en trois jours, les adultes une injection intrapéritonéale par jour cinq jours par semaine pendant deux semaines, puis un prélèvement rétro-orbitaire et des mesures répétées de pression artérielle à la queue. Le porteur rattache ce travail sur une protéine des parois vasculaires à la prise en charge de l'anévrisme intracrânien, responsable selon lui de 36 000 hémorragies par an dans l'Union européenne, bénéfice qu'il situe à long terme. Aucun calcul n'appuie le chiffre de 420 souris, le porteur indiquant seulement que l'expérience de son équipe permettra d'en réduire le nombre.

Objectifs

La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.

Bénéfices attendus

La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.

Procédures

Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes. Procédure 5: 1 injection intrapéritonéale à 6 jours d'âge. L'injection dure moins d'une minute par animal

Impact sur les animaux

Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.

Devenir

Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Lot 7 : utilisés pour la procédure 5 pour analyse de la perméabilité vasculaire à 6 jours. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.

Remplacement

Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.

Réduction

Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.

Raffinement

Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).

108 souris, dont un tiers privées du gène kctd11 et un tiers porteuses d'une seule copie, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à 18 mois pour le prélèvement de leurs nerfs et de leur moelle épinière. À 6, 12 et 18 mois, chacune passe quatre tests, locomotion et équilibre, démarche, force musculaire mesurée en la tenant par la queue et en tirant, sensibilité de la plante des pattes à un filament appliqué jusqu'à cinq fois. À 12 et 18 mois s'ajoute la mesure des vitesses de conduction nerveuse, par aiguilles plantées à travers la peau des pattes sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique disposer de modèles cellulaires dérivés de cellules de patients et les utiliser, puis conclut que le remplacement reste impossible parce que ces modèles ne reconstituent pas le système nerveux périphérique complet.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer si le modèle murin dit « knock-out » (KO), dans lequel nous avons supprimé le gène kctd11, est un bon modèle pour la maladie humaine, causée par des mutations dans ce même gène KCTD11. Il s'agit de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, une maladie caractérisée par une dégénérescence progressive des nerfs du Système Nerveux Périphérique. Nous étudierons l'état des nerfs des souris KO en comparaison à des souris normales, grâce à des analyses de la structure des nerfs, à la mesure des vitesses de conduction nerveuse, ainsi qu’à l’évaluation des capacités locomotrices des souris, à différents âges (6-12-18 mois). Disposer de ce modèle va nous permettre de mieux comprendre comment la perte du gène KCT11 aboutit à une neuropathie et à définir des traitements pour la maladie.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si ce modèle de souris présente des caractéristiques de la maladie CMT et a le potentiel d’être un nouveau modèle de la pathologie afin de développer des traitements futurs pour les patients atteints de la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

Procédures

Les animaux subiront quatre tests comportementaux, peu ou pas invasifs, à trois âges différents (6, 12 et 18 mois). Ces tests visent à tester les fonctions locomotrices des souris et à repérer des troubles de la sensibilité (ex: toucher, douleur). Les 4 tests sont listés ci-dessous: 1) un test pour mesurer la locomotion et l’équilibre des souris. Ce test se déroule sur 2 jours : 1er jour pour habituation, 2ème jour pour mesure. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). 2) un test pour évaluer la démarche de l'animal. Durée : 15 minutes. 3) un test pour évaluer la force musculaire des souris. Le test dure environ 45 minutes (temps de repos inclus). Il est réalisé pour les pattes avant seulement puis répété pour les pattes arrière seulement. 4) un test pour analyser la sensibilité des souris à un stimulus mécanique au niveau des dessous des pattes. Durée : 10 minutes (temps de repos inclus). A 12 et 18 mois, on ajoute un cinquième test, qui sert à mesurer les vitesses de conduction des nerfs, par pose d’électrodes (aiguilles), sans chirurgie, au travers de la peau, au niveau des pattes inférieures. Nous réaliserons 3 mesures pour chaque patte, soit 6 mesures au total par animal. L’intervention dure environ 10-15 minutes par animal. A chaque âge, l’ensemble des tests, pour l’ensemble des souris, s’effectuera sur 3 semaines : La 1ère semaine : test 1 (2 jours) et test 3 (2 jours). La 2ème semaine : test 2 (4 jours) La 3ème semaine : test 4 (2 jours) et mesure des vitesses de conduction nerveuse (2 jours) (à 12 et 18 mois uniquement).

Impact sur les animaux

Les tests qui sont prévus dans ce projet ne sont pas ou peu invasifs. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus invasif est la mesure des vitesses de conduction nerveuse. On pose des électrodes au niveau des pattes inférieures. La pose des électrodes est non invasive (sans chirurgie) :les électrodes sont posées à travers la peau. Ce test n’est réalisé qu’à deux âges (12 et 18 mois). Pour éviter toute douleur ou inconfort, ce test est réalisé sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont maintenus au chaud grâce à un coussin chauffant et une couverture de survie. Enfin, afin d'identifier et de génotyper les animaux en procédure, ces derniers subiront la pose d’une puce RFID (puce électronique que l'on peut ensuite scanner à l'aide d'une scannette pour identifier facilement les animaux) et un petit poinçon à l'oreille à l'âge de 4 semaines. Ceci nécessite une contention des animaux de quelques secondes.

Devenir

A l'issue de l'expérimentation, les animaux seront âgés (18 mois) et nous avons besoin de récupérer leurs nerfs et la moelle épinière pour étudier quels sont les effets de la maladie sur la structure de ces tissus à long terme. Ainsi, les animaux seront mis à mort pour prélever ces tissus.

Remplacement

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une maladie génétique du Système Nerveux Périphérique, composé par l'ensemble des nerfs craniens et les nerfs "spinaux"qui servent à innerver tous les muscles du corps pour les faire bouger ou à transmettre au cerveau, à partir des extremités, une information de type douleur par exemple. Chez l’homme, le Système Nerveux Périphérique est inaccessible et impossible à étudier. L’utilisation de modèles cellulaires, à base de cellules souches adultes, dérivées de cellules (peau ou sang) prélevées chez un patient, peut dans certaines circonstances, constituer une bonne alternative, et nous les utilisons. En effet, nous savons, à partir de ces cellules souches, fabriquer les neurones du Système Nerveux Périphérique, mais pour l'instant nous ne parvenons pas à reconstituer, en tube, le Système Nerveux Périphérique complet. Ils sont un modèle extrêmement simplifié, qui ne permet pas notamment de reproduire la complexité du Système Nerveux Périphérique et de ses interactions avec les muscles. Il existe un autre modèle in vitro de la maladie, mais qui est obtenu à partir d’embryons de rongeurs (rat ou souris, génétiquement modifiés ou non) et qui donc nécessite l’utilisation des animaux. Pour finir, nous travaillons sur des anomalies du système neuromusculaire et devons donc pouvoir étudier la locomotion et la sensibilité à la douleur chez des animaux vivants. C’est pourquoi, malgré l’existence de modèles cellulaires alternatifs, que nous utilisons pour réduire et raffiner, le remplacement n’est pas possible et cette étude nécessite l’utilisation de modèles souris. Le passage au modèle animal est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.

Réduction

Nous aurons trois groupes d'animaux (mutés (KO), hétérozygotes pour la mutation (HET) et sauvages (WT)). Le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation du projet est de 36 animaux par groupe. Ce nombre a été calculé, par un test statistique, au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur les paramètres que nous allons évaluer.

Raffinement

Le phénotype des souris est très léger et leur survie est identique à celle des animaux contrôles.Il n'y a aucune chirurgie dans ce projet. Les tests sont décrits au paragraphe 5.6.1. Lors de chaque test, la salle est réservée et seule la personne expérimentatrice est présente dans la salle. Pour tous les tests, les animaux sont habitués au minimum 30 min dans la pièce expérimentale, avant le début de l’expérience. Après l’expérience, (et un temps de repos selon les tests), les souris sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Afin de limiter le stress des animaux durant l’expérimentation, on procède toujours à une habituation, en particulier pour les tests 1 et 2. Lors de la manipulation, nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Les tests 1 et 2 entrainent peu d’inconfort aux souris. L’habituation permet aux souris de limiter le stress qu’elles pourraient ressentir.Le test 3 nécessite de tenir la souris par la queue et de tirer légèrement pour tester la force des pattes avant ou arrière. Ceci peut générer un peu d’inconfort que l’on limite en laissant la souris, bien au calme, 30 minutes avant et après l’expérimentation. Le test 4 entraîne un inconfort de courte durée, suite à l’exposition à un petit filament qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Cette procédure est répétée 5 fois maximum par animal avec des temps de repos pour limiter l’inconfort de l’animal. Le test le plus stressant est le test de mesure des vitesses de conduction nerveuse. Il sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’anesthésie sera suffisamment profonde, les animaux seront placés sur un coussin chauffante pour éviter l’hypothermie. Une petite couverture de survie pourra être placée sur l’animal pour bien maintenir sa température corporelle. Après les mesures, les souris sont maintenues sur le coussin chauffant, recouvertes d’une couverture de survie, jusqu’au réveil, puis placées dans une cage une dizaine de minutes sous surveillance. Lorsqu’elles sont bien réveillées, elles sont replacées dans leur cage d’origine, avec leurs congénères, puis surveillées selon la grille de scoring. Tout le long de la procédure, des points limites sont définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption définis.

Choix des espèces

Le laboratoire a identifié un nouveau gène muté dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), une maladie génétique des nerfs périphériques (nerfs qui servent à faire bouger les muscles), qui entraine des troubles de la locomotion et de la sensation (toucher, douleur). C'est une maladie neurologique progressive aujourd'hui incurable. A l’heure actuelle, le rôle de ce gène dans le déclenchement de la maladie n'est pas bien compris, mais cette compréhension est nécessaire pour pouvoir mettre au point des traitements. Malgré le développement de modèles cellulaires alternatifs, nous avons besoin d'étudier un modèle animal, dans lequel le gène incriminé est invalidé, pour regarder quelles sont les anomalies des nerfs de ces souris, comprendre les mécanismes par lesquels l'invalidation du gène mène à ces anomalies, et tester des traitements qui permettent de supprimer les anomalies. le choix d'un animal dans lequel le gène est invalidé est justifié par le fait que chez les patients, les mutation qui causent la maladie aboutissent à une perte de fonction de la protéine représentée par le gène muté. Les expériences proposées dans ce projet sont réalisées à partir de mois et jusqu'à 18 mois, car la neuropathie, dont sont atteints les patients mutés pour le gène, est une maladie neurologique lentement progressive. Il faut donc pouvoir étudier des animaux agés. De plus à plus long terme, avant d'envisager un essai thérapeutique chez l'homme, il sera nécessaire de tester les traitements sur un modèle murin.

Ponctions de sang au sinus rétro-orbital, administrations par voies intraveineuse, intranasale, orale, vaginale et oculaire, puis mise à mort par dislocation cervicale : ce sont les gestes que des personnes en formation apprennent sur 160 souris et 160 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Un même animal peut subir jusqu'à trois gestes différents par jour, cinq jours de suite. Le porteur affirme que ces formations visent à limiter l'inconfort et l'anxiété des animaux non-humains pendant l'expérimentation, tout en reconnaissant qu'un geste réalisé par une personne peu expérimentée peut provoquer stress, inconfort et douleur locale. Ces séances sont des formations internes à une entreprise, initiales ou continues, adossées aux études de pharmacocinétique exigées par la réglementation du médicament.

Objectifs

Ce projet a pour but de décrire les formations du personnel avec des rats et souris, notamment les gestes techniques nécessaires pour faire des études pharmacocinétiques et les études mécanistiques de devenir du médicament dans l’organisme qui répondent aux exigences règlementaires. Les formations peuvent inclure : - la bonne contention - l’anesthésie d’un animal - les prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, des organes ou des fluides chez le rat et la souris - l’administration par voie intraveineuse, intramusculaire, intranasale, per os, sous-cutanée, intra-vaginale, topique, intra-auriculaire et oculaire (topique) - la mise à mort d’un animal (dislocation cervicale). La formation est adaptée à la personne et à la fonction exercée. Pour une formation initiale dans l’entreprise, l’acquisition des notions théoriques et des gestes et techniques devant être réalisées seront évalués et, selon le degré de maitrise, seront validés ou nécessiteront une formation complémentaire. Pour la formation continue, les personnes concernées se forment uniquement aux nouveaux gestes nécessaires pour leur travail. Toute formation est faite en présence d’un formateur expérimenté qui maitrise la technique en question. La formation pour chaque geste est terminée quand le formateur juge que la technique est maitrisée.

Bénéfices attendus

Ces formations permettent aux expérimentateurs d’acquérir des gestes techniques parfaitement maîtrisés. Ceux-ci visent à limiter au maximum l’inconfort et l’anxiété de l’animal pendant l’expérimentation. De plus, la qualité des résultats expérimentaux obtenus pour le développement de médicaments à usage humain sera améliorée par la maîtrise de ces gestes et permettra de ne pas réaliser ces expérimentations sur un plus grand nombre d’animaux que nécessaire (réduction du nombre d’animaux utilisés).

Procédures

Le même animal sera utilisé pour plusieurs gestes si possible, par exemples, plusieurs types d'administration et prélèvement du sang. La durée des interventions sera comprise entre quelques secondes (par exemple pour les intraveineuse, Orales, Intrapéritoneale, Sous cutanée, occulaire et intra-auriculaire) et une minute (administration rectale, vaginale). La durée d’un prélevement rétro-orbital sera d’environ 10 secondes. Un maximum de 3 gestes (différents) par jour, par animal et sur un maximum de 5 jours ne sera pas dépassé. Administration par différentes voies, prélèvement du sang, mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie, prélèvement d’organes après mise à mort.

Impact sur les animaux

Les gestes ou actions expérimentales effectuées par une personne peu expérimentée peuvent générer du stress, un inconfort ou une douleur locale.

Devenir

Les mêmes animaux utilisés pour la formation de l’administration peuvent être également utilisés pour les formations de prélèvement. Dans la mesure de possible, les animaux sont utilisés pour collecter des organes ou du plasma nécessaire aux méthodes de dosages de bioanalyses) à la fin de l’ensemble des procédures.

Remplacement

La formation pour l’administration et le prélèvement ne peux pas être fait avec un autre modèle. La réglementation pour le développement de nouveau médicament exige les tests chez les rongeurs. Afin de pouvoir répondre à cette demande, une formation aux gestes techniques est obligatoire pour les études de pharmacocinétique.

Réduction

Avant l’utilisation des animaux, une formation théorique sera dispensée sur la bonne manipulation et la contention afin de réduire le stress et l’inconfort de l’animal. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les gestes sont montrés dans un premier temps pendant des études pharmacocinétiques liés à un autre projet autorisé (phase d’observation). La formation pratique sera ensuite faite sur les animaux. Aucun animal n’est spécifiquement commandé pour la formation.

Raffinement

La personne à former reçoit d’abord une formation théorique et une formation à la manipulation et contention de l’animal sans geste de prélèvement ou d’administration. Quand le formateur juge que la personne maitrise ces techniques, les autres formations peuvent commencer. L’animal sera anesthésié si la procédure le nécessite. De plus, lors de l’hébergement des animaux, l’enrichissement du milieu comprend l’utilisation de maisonnettes et boules de coton pour les souris, de tubes en carton et blocs de bois pour les rats. L’hébergement est réalisé en groupe stable.

Choix des espèces

Rat ou souris pour les essais règlementaires de pharmacocinétique nécessaires au développement de nouveaux médicaments à usage humain. Les animaux utilisés ont entre 6 et 12 semaines conformément à la règlementation.

Seize heures sans nourriture avant un test d'olfaction de dix minutes : 96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance légère, toutes tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur système nerveux central. Quarante-huit subissent trois tests comportementaux nommés, motricité fine, olfaction, anxiété et motricité générale, le premier répété jusqu'à six fois. Les quarante-huit autres partent vers un second établissement pour une heure d'imagerie cérébrale sous anesthésie, dont six minutes de stimulation visuelle et trente-cinq minutes de stimulation pharmacologique. Le projet cherche à savoir si le chlordécone, insecticide interdit dans les années 90 mais toujours présent aux Antilles, favorise les syndromes parkinsoniens, le porteur écartant les organoïdes qu'il juge "prometteurs mais pas encore développés au laboratoire".

Objectifs

Le chlordécone est un insecticide organochloré utilisé aux Antilles pour lutter contre le charançon noir, un insecte ravageant les bananeraies. Compte tenu notamment de sa neurotoxicité à des doses élevées cet insecticide a été interdit dans les années 90. Malheureusement, cet insecticide est très persistant et a contaminé durablement l’environnement, les animaux et la population Antillaise. Pour l’heure les effets neurologiques éventuels d’une exposition à long terme sont mal connus. Toutefois, plusieurs éléments suggérant un effet délétère existent, notamment sur le neuro-développement chez les jeunes garçons nés de mères exposées. De plus, l’heptachlore, un autre insecticide organochloré à l’origine d’une contamination environnementale et humaine à Hawaï a un effet délétère chez la souris dans les régions du cerveau atteintes lors de la maladie de Parkinson et a été associé à des lésions cérébrales chez l’homme. L’objectif scientifique du projet est l’étude de l’effet sur la viabilité et la physiologie des neurones du système nerveux central chez des souris après une exposition au chlordécone par voie alimentaire chez la souris adulte d’une part et d’autre part après une exposition au chlordécone au cours de la période foeto-maternelle. Il s’agit d’un projet multisite qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La finalité de ces approches est d’évaluer un lien potentiel entre une exposition au chlordécone et le déclenchement ou l’accélération de la maladie de Parkinson et de documenter les évènements physiopathologiques associés à ce mode d’exposition.

Procédures

Dans l’établissement utilisateur 2 : l’Imagerie cérébrale est réalisée une fois sur 48 animaux : elle est réalisée sous anestésie générale. La procédure complète dure environ 1 heure et comprends 6 minutes de stimulation visuelle et 35 minutes de stimulation pharmacologique via une injection intra-péritonélae. Dans l’établissement utilisateur 1 : les 48 autres animaux sont soumis à trois tests comportementaux : le premier test mesurant la motricité fine dure 10 minutes et est répété 6 fois (3 habituations et 3 tests) ou 2 fois (1 habituation et 1 test) selon le groupe d’étude, le second test évaluant les capacités d’olfaction dure 10 minutes (après une privation de nourriture de 16 heures) et est répété 2 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude et le dernier test mesurant l’anxiété et la motricité générale dure 15 minutes et est répété 3 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude.

Impact sur les animaux

Une procédure expérimentale similaire a déjà été mise en oeuvre au laboratoire sur une durée de 4 mois mais à l’aide d’une exposition par injection intrapéritonéale et aucun signe de souffrance n’a été détecté, pas de perte de poids ni de décès chez les souris mâles exposées. Les modalités d’exposition sont présumées ne pas induir d’effets indésirables. L’ensemble des interventions sont susceptibles d’engendrer des nuisances de classes légères aux animaux : -Les tests comportementaux peuvent potentiellement induir un stress pour les animaux -Les perfusions intra-cardiaque représentent un risque de souffrance lors de l’injection des produits anésthésiants -Le transport des animaux vers le second etablissement utilisateur peut induir un stress -L’anesthésie, la contention et la stimulation chimique lors de la réalisation de l’imagerie cérébrale peuvent induir à la fois un stress de l’animal et de la souffrance

Devenir

L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique du chlordécone, pour ce faire il est nécessaire d'euthanasier les animaux afin de disposer du système nerveux central.

Remplacement

A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Il existe des modèles d’étude utilisant des lignées de cellules neuronales mais ces derniers ne permettent pas d’étudier l’effet d’une exposition sur les interconnexions neurales ou l’impact sur les cellules gliales. Des travaux plus récent proposent l’utilisation d’organoïdes, ces approches sont prometteuses mais pas encore dévelopées au laboratoire.

Réduction

Le nombre de souris est réduit jusqu’au nombre d’animaux minimal permettant d’attendre des résultats statistiquement significatifs dans les différentes approches proposées.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les expérimentations ont été optimisées afin de réduire la douleur au minimum, les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans un environnement enrichi. En début de procédure, à la réception des animaux au laboratoire, un temps d’acclimatation d’environ 2 semaines est respecter. Un temps d’acclimatation est également respecté lors du transfert des animaux dans le second établissement utilisateur. Pour les animaux soumis aux tests comportementaux une étape d’habituation est également prévue. De plus, le personnel est attentif à la planification de ces tests afin de ne pas soliciter plus de 3 fois les animaux dans la même semaine. Cette alimentation supplémentée en Chlordécone n’a jamais été utilisée dans notre laboratoire en conséquence la quantité de nourriture ingérée par cage chaque semaine sera monitorée en plus du suivi du poids des animaux afin d’identifier le plus tôt possible un défaut d’appétence des croquettes

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des souris conventionnelles C57Bl/6, cette lignée de souris est fréquemment utilisée dans les études du système dopaminergique. En effet, la physiologie de cette population neuronale est proche de celle de l’espèce humaine et la taille de sa population autorise des dénombrements précis. Par ailleurs cette lignée a déjà été utilisée dans notre laboratoire, nous pourrons ainsi comparer les résultats obtenus avec nos premiers résultats après deux et quatre mois d’exposition par injection intra-péritonéale. Le projet prévoit d’utiliser des souris adultes à l’âge de 2 mois au début du protocole d’exposition, ceci nous permettra de comparer les résultats de cette voie d'exposition avec notre projet précédent dans lequel les souris avaient subi une exposition similaire mais par voie intrapéritonéale. Le deuxième groupe d'animaux est constitué de souris exposées tout au long de la période de gestation et maintenues soit jusqu’à la fin de la période de sevrage soit jusqu'à l'âge de 2 mois. Cette partie du projet permettra d'obtenir des données quant à l'effet d'une exposition au chlordécone au cours de cette période du dévellopement.