Souris

Un millilitre de liquide abdominal par souris, prélevé entre 67 et 72 heures après l'injection, avant que le parasite ne tue l'animal au-delà de 80 heures : 50 000 souris femelles de réforme vont être utilisées sur trois ans, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent à produire les toxoplasmes entiers qui composent des kits de dépistage de la toxoplasmose, dont le porteur revendique 10 millions de tests fournis dans le monde. À partir de la soixantième heure, les parasites libérés dans la cavité abdominale provoquent une douleur et un inconfort que le porteur dit prendre en charge par un analgésique injecté dès la quarante-huitième heure. Un premier projet de remplacement a été arrêté en 2019 faute d'atteindre les performances visées, un autre est annoncé pour 2027, et l'entreprise indique avoir divisé par deux en dix ans le nombre de souris utilisées à volume de tests constant.

Objectifs

La production de suspension de toxoplasmes est utilisée dans la production de kits d’immunoessais pour le diagnostic de la toxoplasmose humaine. Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire dont les hôtes définitifs sont les félidés. Il est capable d’infecter l’Homme, en tant qu’hôtes intermédiaires sans symptômes apparents dans 50% des cas. On estime entre 200 000 et 300 000 nouvelles infections chaque année en France le plus souvent bénignes. Par contre cette affection transmissible de la mère au fœtus peut entrainer des séquelles très invalidantes pour l’enfant (150 cas par an), et peut être la cause de mortalité chez l’immunodéprimé (environ 200 cas par an en France). La séroprévalence de la toxoplasmose chez les femmes enceintes baisse régulièrement depuis une cinquantaine d’années. Elle varie selon les régions et est liée à des facteurs géo-climatiques et des habitudes de consommations alimentaires différentes. La baisse régulière de la séroprévalence de la toxoplasmose chez les femmes enceintes a pour corollaire une augmentation de la population des femmes séronégatives amenées à être suivies mensuellement (Santé Publique France). La France a instauré un programme de prévention unique au monde : le diagnostic de la toxoplasmose est obligatoire dans le cadre de suivi prénatal avec une sérologie en début de grossesse, qui entraine un contrôle mensuel sérologique des femmes non immunisées et la fourniture de conseils nécessaires pour prévenir la maladie et ainsi en éviter la transmission au fœtus. L’entreprise fabriquant les kits est pionnière de ce secteur et y occupe un positionnement unique. Ces trousses de diagnostic sont des matériels de référence, et donc utilisés en confirmation, en deuxième intention, pour éviter un diagnostic erroné. Les réactifs concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite. Les performances de ces tests sont basées sur l’utilisation d’un lysat parasitaire natif permettant d’assurer à la fois de très bonnes sensibilité (très peu de résultats faux négatifs) et spécificité (très peu de résultats faux positifs). Les laboratoires (notamment les laboratoires de référence, type CHU) ont souvent besoin de disposer de méthodes de diagnostic utilisant différentes compositions/natures d’antigènes pour asseoir leur diagnostic. Dans ce contexte fin 2022, 72 % des laboratoires CHU français utilisaient ces tests.

Bénéfices attendus

Les réactifs de diagnostic concernés par le projet permettent de diagnostiquer les infections récentes ou passées en dosant, dans le sérum des patients les immunoglobulines dirigées contre la forme proliférative du parasite. Ces kits de diagnostics concernés par le projet sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Les performances de ces tests sont basées sur l’utilisation d’un lysat parasitaire natif permettant d’assurer à la fois: une très bonne sensibilité (très peu de résultats faux négatifs) et une très bonne spécificité pour les immunoglobulines (très peu de résultats faux positifs). Les laboratoires (notamment les laboratoires de référence comme les C.H.U.) ont souvent besoin de disposer de méthodes de diagnostic utilisant différentes compositions/natures d’antigènes pour asseoir leur diagnostic. Dans ce contexte: fin 2022, 72 % des laboratoires hospitalo-universitaires français utilisaient ces tests.

Procédures

- injection en moins 5 secondes/animal - A 48 heures injection d’analgésique en moins 5 secondes/animal. - De 67 à 72 heures après inoculation initiale : euthanasie rapide. - aucun prélèvement sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les souris sont injectées avec une suspension contenant des parasites et des cellules. Ces dernières sont colonisées par les parasites intracellulaires stricts. Ils ne sont pas agressifs pour la souris car tant qu’ils sont hébergés dans les cellules, ils n'ont pas de conséquence sur l’état sanitaire de l’animal. Il est important de noter que la faible quantité de la suspension en cellules ne provoque pas de douleur à l’animal. A partir de 60 heures après l’injection, les parasites s’étant multiplier dans la cellule, se retrouvent libérés dans la cavité abdominale ce qui entrainera une douleur au niveau de l’abdomen et un inconfort pris en charge de façon prédictive et jusqu’à la fin du protocole, avec l’ajout d’un analgésique dès la 48ème heure.

Devenir

La nature du parasite inoculé ne peut conduire à une autre issue que l’euthanasie de l’animal à la fin du protocole. Au-delà de 80 heures le parasite provoquerait la mort de l’animal. De ce fait le liquide d’intérêt doit être prélevé avant la mort de l’animal.

Remplacement

Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits actuels sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Ce protocole est le seul mode de production aujourd’hui validé pour garantir les performances requises des kits de diagnostic concernés : sensibilité et spécificité des kits. Un premier projet de remplacement a été stoppé en 2019 car les objectifs de performance de cette nouvelle génération de tests n’ont pas été atteints. A ce jour un développement de nouvelles générations de kits est en cours afin de remplacer l’origine des antigènes en les produisant par culture. La durée du développement a été fixée à 8 ans à minima. La stratégie est de définir les bonnes conditions de culture garantissant un antigène présentant tous les épitopes d’un lysat parasitaire et ce, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Le lancement des premières commercialisations en Europe est prévu au premier semestre 2027.

Réduction

L’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet d’amplifier la production de toxoplasmes et donc de réduire le nombre d’animaux (le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict). Cette méthode optimisée entraine la production d’un volume moyen de 1mL de liquide d’intérêt très concentré en toxoplasmes par souris de 30g. Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. La quantité produite par animal est constante et le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. Plusieurs projets ont été menés pour réduire le nombre d’animaux utilisés : l’amélioration des conditions de vie des souris : enrichissement, adaptation du nombre d’animaux par cage, la rationalisation et l’optimisation des processus, l’ajout d’un analgésique. Ces projets ont permis de diviser par 2 l’utilisation annuelle des souris en 10 ans, alors que les volumes de tests vendus sont restés constants. Le développement de nouvelles générations de kits va permettre de réduire de façon conséquente le nombre d’animaux utilisés pour la production de ces toxoplasmes. 50 000 souris sont nécessaires sur les 3 années à venir. Ce nombre de souris permettra de produire et de mettre à disposition 10 millions de tests de diagnostic à travers le monde, au service de la santé publique.

Raffinement

Les animaux entrent en production après une période d'acclimatation, de manière à ce qu'ils s'habituent aux conditions d'élevage, limitant ainsi le stress lors des différentes manipulations. Ils sont hébergés sur litière (sciure/lanières de carton) assurant l'enrichissement du milieu et permettant aux souris de faire leur nid. Un tunnel PVC est introduit dans la cage permettant aux souris de répondre à un besoin physiologique de bien-être animal. Un suivi quotidien par cage permet de contrôler l’état sanitaire des souris. Les animaux continuent de se mouvoir dans la cage et de s’alimenter. Toutefois si un animal présente des signes de dégradation de son état sanitaire il est immédiatement euthanasié. Ces signes sont : isolement, apathie, dos voussé, yeux plissés, poil piqué. De même l’injection couplée de toxoplasmes et de cellules sarcome TG180 permet de limiter la colonisation des cellules de la souris de la 1ère heure à la 60ème heures et donc d’en diminuer l’impact : le toxoplasme étant un parasite intracellulaire strict, il n'est pas agressif pour la souris tant qu'il est dans la cellule et n'a pas de conséquence sur son état sanitaire. Les cellules ne peuvent pas se multiplier et donc ne sont pas toxique pour l’animal et provoquer les nuisances qu’elles pourraient causer si elles étaient inoculées seules, à savoir la production d’une quantité importante d’ascite après une dizaine de jours d’incubation. De plus le protocole ne dure que trois jours, il n’y a pas de début de production d’ascite. Au-delà de la 60ème heure le toxoplasme a lysé la totalité des cellules et se retrouve libéré dans le péritoine. Il colonise alors les cellules de la souris et devient agressif et des signes d’inconfort apparaissent. Pour diminuer ceux-ci, il est prévu systématiquement, 48 heures après l’inoculation une analgésie par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien de type Kétoprofène. Cette molécule est dotée d’une puissante activité anti-inflammatoire, antalgique et antipyrétique. La concentration maximale est atteinte en une heure et reste constante et élevée au niveau des sites inflammatoires pendant 30 à 36 heures, ce qui couvre la totalité du protocole. Les animaux sont alors euthanasiés puis le liquide d’intérêt est récolté.

Choix des espèces

A l’origine la culture de toxoplasmes a été validée sur souris pour assurer la performance des tests de diagnostic in vitro. Pour assurer la révélation des anticorps dirigés contre les toxoplasmes, ces kits actuels sont composés de toxoplasmes entiers produits sur souris. Ce mode de production permet une affinité forte et une reconnaissance complète des différents types d’anticorps existants. L’intérêt est de garantir la fiabilité du résultat rendu : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. De plus ces trousses de diagnostic sont considérées comme matériel de référence et sont utilisés en confirmation, c’est-à-dire en deuxième intention (pour éviter un diagnostic erroné). Ils permettent la prise de décision en cas de résultats sur des sera à résultats douteux. Les animaux utilisés sont des souris femelles de réformes d’un poids de 20-39g de souches robustes, calmes et permettent une manipulation aisée. L’utilisation de souris de cette tranche de poids permet d’avoir un liquide d’intérêt de bonne qualité. Des essais menés sur des animaux plus jeunes et d’un poids inférieur ont montré que le liquide d’intérêt était de moins bonne qualité car souvent hémolytique et bien moins concentré . Après une période d'acclimatation les animaux entrent en production.

Infectées sous anesthésie par Mycobacterium abscessus, puis soumises pour certaines à une ou deux injections quotidiennes d'antibiotiques pendant dix jours, 2 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, au plus tard trente jours après l'infection, pour mesurer la charge bactérienne dans leurs organes. Le porteur écrit que la bactérie persiste plusieurs semaines "sans donner de signes de maladie", et décrit par ailleurs des injections répétées susceptibles de provoquer un grattage, une inflammation locale ou une plaie. Il ajoute que l'impact de ces injections sur le bien-être des souris sera évalué au cours de deux expériences préliminaires, menées sur des souris elles aussi injectées.

Objectifs

Mycobacterium abscessus est une bactérie responsable d'infections chroniques et de la détérioration des poumons chez les patients atteints de mucoviscidose ou d’autres affections pulmonaires. L'éradication de cette bactérie est extrêmement difficile car elle est résistante à un large éventail d'antibiotiques. Le traitement de la maladie pulmonaire causée par cette bactérie nécessite l'administration à long terme de plusieurs antibiotiques, ce qui entraîne des effets indésirables graves. Cependant, même les antibiotiques cliniquement pertinents ne sont pas très efficaces et l'infection à Mycobacterium abscessus est toujours considérée comme une maladie chronique incurable pour la plupart des patients, ce qui souligne le besoin urgent de développer des stratégies thérapeutiques alternatives. Au-delà de la résistance, nous émettons l'hypothèse que la tolérance aux antibiotiques, c’est-à-dire la capacité à survivre aux antibiotiques pendant une période de temps plus ou moins longue, contribue également aux mauvais résultats du traitement des infections à Mycobacterium abscessus. La tolérance est un phénomène adaptatif en réponse à des conditions de stress environnemental. Plusieurs études chez différents pathogènes bactériens ont établi que la tolérance aux antibiotiques a des implications cliniques importantes dans la gestion des infections chroniques, car elle contribue à allonger la durée du traitement antibiotique, à l'échec du traitement et à la rechute des infections chroniques, et à l'émergence de mutations conférant la résistance aux médicaments. Cependant les fonctions et adaptations qui contribuent à la tolérance aux antibiotiques chez Mycobacterium abscessus restent largement méconnues. Ce projet s’inscrit dans ce contexte et vise 1) à identifier les fonctions et adaptations bactériennes qui favorisent la tolérance aux antibiotiques chez cette bactérie lors de l’infection, 2) à tester si les traitements antibiotiques in vitro et chez les patients sélectionnent des bactéries qui survivent mieux aux antibiotiques et si ces bactéries ont un comportement différent chez l’hôte, et 3) à évaluer si bloquer les fonctions contribuant à la tolérance augmentent l’efficacité des traitements in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez Mycobacterium abscessus et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes de Mycobacterium abscessus altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre les infections mycobactériennes dans le but de réduire leur durée.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés avant d’être infectés (durée 2 à 3 minutes). Les bactéries utilisées persistent dans les organes pendant quelques semaines sans donner de signes de maladie chez les animaux infectés. La durée de l'expérience n’excèdera pas 30 jours. Certains groupes d'animaux recevront quotidiennement une ou deux doses d’antibiotiques administrée(s) par injection sur des animaux vigiles (durée 1 minute) pendant une durée maximale de 10 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’anesthésie et de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques (effets secondaires). Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (piqûre et contention) d’une durée d’environ 1 min/injection. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une ou deux injections quotidiennes (1min/injection) pendant 10 jours. Si plusieurs antibiotiques sont utilisés, ils seront injectés en même temps dans 1 injection. L’impact de ces injections sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires mais les injections répétées pourraient conduire à un grattage, une inflammation locale ou une plaie. Le niveau attendue de ces nuisances est modéré.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que Mycobacterium abscessus. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission et pour l'étude de la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans celles-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’homme.

Réduction

Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Toutes les expériences impliquant des animaux font l’objet d’un protocole expérimental écrit et validé par le responsable de l’animalerie. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: anesthésie et analgésie lors de l’infection, limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et des injections d’antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. Pour l’expérience impliquant une injection quotidienne d’antibiotique, nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté. Un suivi particulier des animaux sera réalisé pour évaluer les nuisances associées à ces injections et d’éventuelles réactions secondaires : inflammation locale, grattage, plaie. Les injections seront réalisées en alternance sur 4 sites des flancs avec des seringues à insuline. En première intention, les injections seront réalisées sur animaux vigiles (rapidité et absence d’hypothermie). En cas de stress important des animaux, nous pourrons utiliser un anesthésique.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à étudier la persistance en présence ou absence d’antibiotiques, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistances variables à la pathologie, ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité protectrice chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Dans cette étude, notre laboratoire utilisera une lignée de souris qui présente une bonne résistance à l’infection par Mabs mais dans laquelle le pathogène peut persister pendant plusieurs semaines. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.

L'objet déclaré est d'immuniser des souris pour en tirer des anticorps monoclonaux à usage recherche ou thérapeutique, à raison de cinquante études sur cinq ans. 1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à cinq administrations d'antigène et quatre d'ARNm, plus des microprélèvements de sang jusqu'à deux fois par jour, avec pour effets annoncés des poils hérissés, une perte de poids transitoire et une modification du comportement. Celles dont la réponse immunitaire est jugée "satisfaisante" sont tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, les autres sont tuées aussi.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à immuniser des souris avec un antigène (peptide/protéine, plasmide, cellule ou vésicule) et/ou de l’ARNm transcrit in vitro (IVT) afin d’obtenir, in fine, des anticorps monoclonaux à usage recherche ou thérapeutique. Ces anticorps pourront devenir des candidats médicaments pour de la thérapie humaine ou des outils pour développer des méthodes analytiques nécessaires pour les études en oncologie.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus importants dans de nombreux domaines et particulièrement dans celui de la thérapie humaine. Ces molécules émergent de plus en plus dans le domaine de l’immuno-oncologie afin de traiter les patients atteints de nombreux types de cancer différents. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la génération de potentiels candidats médicaments pour de l’immunothérapie ainsi que d’outils de développement de méthodes analytiques, nécessaires à un projet scientifique.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration de l’antigène (5 fois maximum hebdomadairement ou quinzomadairement, 15 s) ; Administration de l’ARNm (4 fois maximum hebdomadairement, 15 s) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois /jour, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (4 fois maximum, 30 s) ; Administration de l’antigène (1 injection, 15 s) ; Administration de l’ARNm (4 fois maximum hebdomadairement, 15 s).

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’administration de l’antigène. Stress et douleur légère lors de l’administration de l’ARNm. Possibilité d’effets indésirables légers et/ou modérés liés à l’injection de l’antigène ou de l’ARNm : Poils hérissés, modification temporaire du comportement, perte de poids transitoire.

Devenir

Les animaux présentant une réponse immunitaire « satisfaisante », contre l’antigène d’intérêt, seront mis à mort pour la collecte des organes lymphoïdes. Ces derniers permettront, par la suite, la production in vitro des anticorps monoclonaux. Les animaux non-prélevés seront, quant à eux, euthanasiés afin de limiter les nuisances sur leur bien-être et éviter tout effet indésirable à long-terme. En cas d’atteinte de point limite justifiant l’euthanasie en cours d’étude, les animaux seront également mis à mort.

Remplacement

La génération d’anticorps est un mécanisme complexe issus d’une réponse immunitaire spécifique et adaptative à un antigène. Il nécessite l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires et permet ainsi d’aboutir à un anticorps de qualité dont la spécificité et la sélectivité sont généralement supérieures à un anticorps généré à partir de banques synthétiques. En effet, ce dernier nécessite une étape secondaire in vitro qui ralentit le développement des candidats médicaments de plusieurs mois et donc l’offre thérapeutique aux patients. Bien que ne garantissant pas la développabilité future d’anticorps, la génération d’un anticorps in vivo augmente les probabilités de réussite et permet de générer des candidats dont la séquence ne serait pas présente avec une banque synthétique, par définition plus restreinte. Par ailleurs, dans le cas où la production d’anticorps nécessite le développement d’hybridomes murins ou l’utilisation de protéine purifiée, il n’est pas possible d’utiliser de méthode alternative. C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux reste, à ce jour, indispensable à la production de nos anticorps.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 5 souris maximum par stratégie d’immunisation seront utilisées. Plusieurs stratégies d’immunisation pourront être menées pour une même cible. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 50 études sera mené sur 5 ans. Le projet n’implique pas d'analyse statistique, et repose uniquement sur la présence ou non d’anticorps chez les animaux. Une fois l’étape de génération de l’anticorps in vivo chez l’animal effectuée, les organes d’intérêt seront prélevés et la production d'anticorps sera entièrement réalisée dans des systèmes de production cellulaire in vitro.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L‘antigène ou l’ARNm injecté pourront induire une perte de poids de l’animal, plusieurs jours post-injection. Pour limiter l’impact de l’injection et faciliter la récupération des animaux, un gel aqueux enrichi en nutriments sera mis en place en pré et post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Après cette période, la fréquence d’observation et de pesée des animaux sera de nouveau réduite à 1 fois/semaine. Elle pourra être augmentée en cas de nouvelle dégradation de l’état de l’animal. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi lors des mesures de poids (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme animal est basé sur la bonne connaissance de son système immunitaire et sa capacité à générer des réponses antigéniques efficaces permettant d’obtenir des cellules B exprimant des anticorps spécifiques de haute affinité. De plus, sa petite taille, sa grande fécondité et son coût de production et d’entretien relativement peu élevés en font un animal de choix. La disponibilité de lignées de souris génétiquement altérées spécifiques permet, également, la génération d’anticorps humains sans passer par l’étape d’humanisation des anticorps générés. Dans le cas d’utilisation de myélome pour la production d’hybridomes, celui-ci est compatible avec la souche consanguine BALB/c, très largement utilisée pour la production d’anticorps monoclonaux à visée recherche ou thérapeutique. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 12 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature. En effet, il a été décrit que la souris développait une réponse immunitaire plus forte contre les antigènes externes à cet âge.

Une injection dans le cerveau sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes, un jeûne de vingt-quatre heures, un isolement de quarante-huit heures : 360 souris porteuses de la mutation responsable de la maladie de Huntington vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection intraveineuse du composé testé et deux injections quotidiennes de traceur cellulaire pendant trois jours, avant des tests comportementaux. Le porteur qualifie ces nuisances de "mineures" et n'attend ni point limite ni mort prématurée. Il écrit que les résultats obtenus sur cellules "nécessitent désormais une validation sur animal en vue de proposer la thérapie aux patients", pour une maladie qui touche cinq personnes sur 100 000 et reste sans traitement curatif.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (5 cas pour 100 000 individus) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de troubles moteurs et intellectuels conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires puis inexorablement à leur décès). La maladie de Huntington est dûe à une mutation sur le gène de la protéine nommée huntingtine, lui conférant une structure anormale. Cela entraîne un gain de fonctions toxiques mais aussi une perte des fonctions physiologiques de la huntingtine. La protéine ainsi mutée ne peut plus assurer son rôle dans le transport de molécules essentielles à la survie neuronale provoquant la mort des neurones. La mutation induit également le déclin des capacités des précurseurs neuronaux et donc la production de nouveaux neurones. En reproduisant des réseaux neuronaux en laboratoire, nous avons pu démontrer que l’expression d’une molécule thérapeutique couplée à l’utilisation d’un composé chimique destiné à réduire les niveaux de protéine mutée était capable de restaurer certaines fonctions de la huntingtine dans un modèle de la maladie de Huntington. Ce projet a donc pour but de tester cette approche thérapeutique, validée sur cellules, afin de restaurer les capacités des précurseurs neuronaux pour rétablir la production de neurones ainsi que les défauts dans les neurones qui conduisent à leur dégénérescence en présence de la mutation. L’objectif final est donc de soutenir la génération de neurones et de limiter la dégénérescence neuronale pour limiter voire abolir les symptômes de la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

Aucun traitement n’existe à ce jour pour soigner les patients atteints de la maladie de Huntington. Nous proposons donc d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Les résultats prometteurs obtenus sur cellules nécessitent désormais une validation sur animal en vue de proposer la thérapie aux patients.

Procédures

4 actes expérimentaux impliqueront d’éventuelles nuisances mineures à l’animal: 1/ Lors de l’injection dans le système sanguin de la molécule d’intérêt (anesthésie de 5 minutes) 2/ Lors de l’injection dans le cerveau de la molécule thérapeutique complémentaire (anesthésie de 30-45 minutes) 3/ Lors de l’injection dans le système sanguin de molécules permettant de marquer les cellules (2 fois par jour pendant 3 jours). 4/ Lors des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

1) Nous ne nous attendons pas à observer de points limites ni de mort prématurée chez ces animaux dus à la mutation car chez la souris, la pathologie ne se développe pas de manière aussi sévère que chez l'Homme. En effet, chez la souris, les symptômes de la maladie de Huntington ne sont observés qu’au cours de stimulations comportementales bien précises. 2) Un léger stress peut être induit lors des tests de comportements impliquant une mise à jeun de 24h ou un isolement de 48h. 3) Une légère douleur peut survenir lors des injections dans le système sanguin et dans le cerveau. 4) Un stress modéré peut également survenir lors de la contention des souris pour la réalisation des injections du traceur cellulaire.

Devenir

L’approche thérapeutique proposée consiste en l’injection dans le système sanguin d’un premier composé suivi d’une injection d’une molécule complémentaire dans le cerveau dans le but d’empêcher les effets toxiques de la protéine mutée dans la maladie de Huntington. Pour attester de l’efficacité de ce protocole , ces souris seront ensuite soumises à des tests comportementaux dont les résultats seront confirmés à l’issue de leur euthanasie, nécessaire pour prélever le cerveau à étudier et réaliser divers marquages.

Remplacement

Notre projet correspond à un travail de phase préclinique visant à tester l'effet thérapeutique de notre protocole pour traiter les symptômes de la maladie de Huntington et d’évaluer son mécanisme d’action dans le cerveau. C'est donc un passage obligé vers la clinique et l'Homme. Il n'existe pas actuellement de modèle in vitro permettant de mimer les modèles comportementaux et de reproduire la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post-mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement afin d’augmenter la puissance des tests statistiques.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et de matériaux permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de poids jusqu'a leur mise à mort. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie de son cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Pour cela, nous utilisons des souris transgéniques (knock-in). Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les symptomes de la maladie de Huntington apparaissant à l'âge adulte, nous souhaitons tester notre approche thérapeutique à un stade pré-symptomatique et à un stade symptomatique. Les souris modèles de la maladie de Huntington développent des troubles moteurs et cognifits observables en étude de comportement à 6 mois. Ainsi, en étudiant des souris âgées de 1 et 6 mois, nous pourrons voir l'efficacité du protocole thérapeutique sur l'apparition des symptomes. Le but de ce projet est donc de voir le ralentissement de la progression de la maladie voire d'empêcher l'apparition des symptomes.

Pesées deux fois par semaine pendant huit semaines, dont la moitié sous régime hypercalorique jusqu'à peser près de 50 grammes et devenir prédiabétiques, 144 souris reçoivent ensuite un gavage de glucose ou une injection d'insuline, puis six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Quarante-huit autres passent seize heures à jeun avant deux prélèvements, et vingt-quatre subissent une contention de trente minutes, un stress que le porteur présente comme "nécessaire" à l'activation de l'axe nerveux étudié. Au total 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, pour analyser leur métabolisme du glucose et leur régulation du stress.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de l’équilibre de la glycémie (concentration de sucre (ou glucose) dans le sang), notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Dans cet optique, le récepteur de glucose SGLT3 (pour sodium-glucose transporter 3) est une cible de choix. En effet, l’expression ce récepteur, présent dans les neurones de l'intestin grêle et dans les régions du cerveau qui contrôle la faim– est diminuée chez des souris obèses et varie également après une chirurgie gastrique, un traitement très efficace de l'obésité sévère, en particulier chez les patients diabétiques. Néanmoins, ces différentes études anatomiques et fonctionnelles restent aujourd’hui incomplètes pour définir le rôle de SGLT3 dans la détection du glucose et l’équilibre de la glycémie. Ce projet vise à déterminer si la détection du glucose par le récepteur SGLT3 est important dans le contrôle de la glycémie et du poids et, à plus long terme, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre de l’obésité et du diabète. Pour cela, nous étudierons une lignée de souris transgéniques qui n’expriment pas le récepteur de glucose SGLT3.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter les travaux sur les mécanismes de détection du sucre-glucose et de transmission des informations de l’alimentation envoyées par l’intestin. En effet, plusieurs études ont suggéré que SGLT3 est impliqué dans le métabolisme du sucre, notamment dans des situations pathologiques telles que l’obésité. Néanmoins ces travaux n’ont pas encore permis de montrer précisément le rôle de SGLT3. Ce projet nous permettra peut-être d’identifier une nouvelle cible de choix dans la lutte contre l’obésité et ses complications.

Procédures

-144 souris (72 nourries avec un régime standard et 72 nourries avec un régime hypercalorique) seront pesées et leur prise alimentaire sera mesurée deux fois par semaine pendant 8 semaines. Ces souris recevront ensuite soit un unique gavage avec une solution de glucose, soit une unique injection d’insuline (d’une durée d’environ 45 secondes par souris pour chaque geste). Des mesures de glycémie par prélèvement d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue seront réalisées 0,15,30,60,90 et 120 minutes après le gavage ou l’injection. - 48 souris seront mises à jeun pendant 16h et subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue. - 24 souris subiront un test de contention d’une durée de 30 minutes ainsi que 3 prélèvements d’une goutte de sang (d’une durée d’une dizaine de secondes) au bout de la queue.

Impact sur les animaux

- Des hypoglycémies peuvent survenir lors du test de tolérance à l’insuline. Le contrôle régulier de la glycémie permettra d’anticiper une baisse de la glycémie trop importante. - Le jeûne de 16h ainsi que le test de contention vont entrainer un stress de l’animal, nécessaire à l’activation de l’axe nerveux que nous étudions ici. - Le régime hypercalorique favorise la prise de poids et l’induction du diabète. Après 8 semaines de régime, les souris WT sont prédiabétiques et en surpoids (environ 50g) mais sans impact sur leur mobilité. - Les souris recevant un gavage de glucose oral pourront présenter une légère irritation de l’œsophage.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort afin d’étudier différents paramètres de leur métabolisme glucidique ainsi que de leur régulation du stress.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose a des impacts sur l’ensemble du corps et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit 6, 9 ou 18 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus. La mesure de prise alimentaire se fait par la pesée des croquettes dans la mangeoire. Toutes les souris étant hébergées 3 par cage, il est nécessaire de se baser sur le nombre de cage et non sur le nombre d’animaux, pour calculer la taille nécessaire d’échantillon. Ainsi, avec 18 souris par groupe, nous fixons une taille d’échantillon de 6 par groupe. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Enfin, la réalisation de la procédure 3 est conditionnée aux résultats obtenus au cours de la procédure 2. Si nous n’observons pas de différences dans la contre-régulation induite par le jeûne de 16h, nous ne réaliserons pas cette dernière procédure. Au total, ce projet nécessitera au maximum 216 souris.

Raffinement

Les souris contrôles seront commandées à l’âge de 4 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des tests à l’âge de 14 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, les animaux seront observés et pesés régulièrement. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Pour les différentes procédures, les animaux seront en groupe et manipulés dans le calme pour éviter tout stress superflu. Pour prévenir la douleur due à l’incision de la queue, de la crème anesthésiante à base de lidocaïne (anesderm) est appliquée localement sur la queue des souris, 30min avant l’incision. Pour limiter le stress des animaux, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales. Pour minimiser le stress lié à l'éclairage, nous utiliserons un éclairage diffus et faible (

Choix des espèces

Le rôle du récepteur SGLT3 dans le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles. Les animaux provenant d’un éleveur agréé seront commandés à 4 semaines afin qu’ils soient hébergés dans les mêmes conditions que les animaux transgéniques (sevrés à 4 semaines). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (à partir de 14 semaines). Les résultats décrit dans la littérature ne proviennent que de souris mâles. Notre objectif est d’approfondir ces résultats mais également d’étudier si nous observons les mêmes résultats chez les femelles. Nous utiliserons donc à la fois des souris mâles et femelles.

Les souris utilisées développent spontanément un diabète, perdent du poids et s'affaiblissent jusqu'à la mort en trois semaines environ. 802 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections dans la peau du dos sous anesthésie en trois semaines, jusqu'à six administrations intranasales d'insuline modifiée, une injection rétro-orbitaire et un prélèvement de sang, pour mettre au point une allergie cutanée à l'insuline que le porteur décrit comme jamais décrite dans la littérature. L'apparition du diabète, d'érythèmes sévères ou d'un état général affaibli déclenche la mise à mort anticipée.

Objectifs

L'allergie à l'insuline est une complication rare mais qui pose de sérieux problèmes pour la prise en charge des patients diabétiques. Les manifestations allergiques incluent urticaire, éruption cutanée, hypotension, essouflement. Dans des cas extrêmes, ces réactions intenses et rapides sont susceptibles de provoquer la mort. Elles sont induites par des anticorps IgE dirigés contre l'insuline injectée. Les traitements actuels consistent en l’utilisation d’agents anti-histaminiques, de corticoïdes, mais également la sélection de préparations d’insuline moins allergènes et des pompes à insuline intrapéritonéale plus invasives. Cependant, aucun traitement de référence n’existe ciblant les causes immunologiques de cette maladie. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une nouvelle stratégie visant à diminuer les réponses allergiques, et induire ainsi une désensibilisation vis-à-vis de l’insuline. Nous utiliserons de l’insuline modifiée qui sera administrée par voie intranasale, ayant comme objectif d’être le moins invasif possible pour à terme facifiter le transfert à la clinique de cette stratégie. Ce choix a été motivé par un intérêt clinique grandissant pour cette voie d'administration pour délivrer des anticorps, combattre l'inflammation et bénéficier des mécanismes de tolérance immunitaire associés aux muqueuses. Dans ce projet, nous travaillerons dans un modèle de souris qui développe un diabète. Tout d'abord, nous mettrons au point un modèle de réaction allergique cutanée induite par sensibilisation d'insuline (mimant ainsi ce qui se passe chez les patients diabétiques), modèle qui n'a jamais été décrit dans la littérature. Nous testerons ensuite notre approche thérapeutique avec l'insuline modifiée administrée par voie intranasale et nous analyserons les mécanismes immuntaires induits.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter la preuve de concept des effets thérapeutiques de notre insuline administrée par voie intranasale dans le contexte de l’allergie à l’insuline. Ainsi, en cas de succès, ces recherches pourraient aboutir rapidement à des essais cliniques chez les patients diabétiques présentant une allergie à l’insuline, pour laquelle il n’existe aucun traitement de référence à l’heure actuelle. Des résultats positifs sur les manifestations allergiques pourraient à plus long terme permettre d’envisager une application de la thérapie intranasale par insuline dans d’autres indications, en particulier le diabète de type 1 qui touche principalement les enfants et adolescents. En effet, des efforts sont développés pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à prévenir cette maladie. Les thérapies envisagées doivent montrer une grande spécificité d’action et l’utilisation d’une voie d’administration non invasive pour être attractives pour une application clinique. Notre insuline intranasale remplit ces exigences.

Procédures

Injection intradermiques (au niveau de la peau du dos) sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois, 2 fois par semaines pendant 3 semaines. Administration intranasale sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée 6 fois maximum (1/jour). Injection intraveineuse (rétro-orbitaire) sous anesthésie généralependant 5 minutes, effectuée seule 1 fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 5 minutes, effectué 1 seule fois.

Impact sur les animaux

Les souris femelles que nous utilisons développent un diabète (hyperglycémie). Elles perdent alors du poids et s’affaiblissent jusqu’au décès en environ 3 semaines. L'allergie cutanée à l'insuline, développée par le protocole mis en place, peut se manifester par des démangeaisons locales modérées et de courte durée (quelques minutes) ou des irritations légères de la peau. Enfin, les souris peuvent subir un léger stress lié aux injections intradermiques ou à l’anesthésie.

Devenir

Les souris sont mises à mort pour récupération de différents organes nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des tests in vitro appropriés seront utilisés pour répondre à des questions mécanistiques précises visant à analyser l’impact de notre protéine sur les réponses immunitaires. Cependant l’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo l’efficacité thérapeutique de la stratégie proposée pour le traitement de l’allergie à l’insuline et comprendre les mécanismes immunitaires responsables de la pathologie et de l’effet thérapeutique observé. Les espérimentations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro, qui par ailleurs ne peuvent reproduire les différents stades de la réponse allergique.

Réduction

Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Pour chaque souris allergique, plusieurs organes seront prélevés, incluant le tissue nasal, poumons, rate, ganglions, et peau pour de multiples analyses afin d’obtenir le maximum d’information biologiques et mécanistiques. Aussi, afin de diminuer le nombre de souris utilisé nous ferons un premier élevage très restreint des souris afin de définir quelle est la lignée la plus adaptée pour l'induction de l'allergie à l'insuline avant de lancer un plus grand élevage pour les expériences d'immunothérapie avec l'insuline intranasale.

Raffinement

La réponse allergique cutanée sera induite par injections intradermiques d’insuline sur la peau rasée des souris. Afin de réduire au minimum la douleur et le stress des animaux, cet acte se fera sous anesthésie générale. Les souris sont sujettes à une surveillance accrue pendant les 20 minutes suivant l’anesthésie avec un réveil complet et une récupération de la mobilité. Aussi l’endroit de l’injection sera surveillé plusieurs fois par semaine afin de s’assurer qu’il n’y a pas d’irritation majeure de la peau suite à l’injection. De plus, travaillant sur un modèle de souris susceptible au diabète, des tests de glucosurie (concentration du glucose dans les urines) seront réalisés une fois par semaine afin de suivre l’évolution de la maladie. Enfin, de manière générale, la consommation d’eau, de nourriture, la motricité et le comportement de l’animal seront surveillés de manière hebdomadaire par les soigneurs et les expérimentateurs. La survenue du diabète (hyperglycémie), d’érythèmes sévères ou l’observation d’un état général affaibli entraineront la mise à mort anticipée de l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans les études de l’allergie cutanée étant donné la bibliographie existente sur le sujet et la caractérisation des réponses allergiques chez cette espèce, et leur similitude avec les observations chez l'homme. Nos expériences seront réalisées chez des souris adultes (entre 8 et 15 semaines d’âge) avec un système immunitaire mature..