Souris
Biopsies caudales et/ou auriculaires chez les rats et souris de laboratoire pour caractérisation génétique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 20000
Amputés d'un bout de queue avant le sevrage ou perforés à l'oreille jusqu'à trois fois, 130 000 souris et 20 000 rats sont utilisés sur animal vigile, dans des procédures déclarées en souffrance légère. Le porteur, prestataire de génotypage, indique que les animaux au génotype recherché partent en expérimentation, en reproduction ou en prestation de service, et que ceux dont le génotype ne convient pas sont tués faute d'usage possible. Il reconnaît que la coupe de la queue ou la perforation de l'oreille peut être douloureuse et générer stress et limitation des activités normales. Il présente ce prélèvement comme répondant "aux principes des 3R" parce qu'il permet de sélectionner les individus utiles, argument qui justifie l'échelle de 150 000 biopsies par le tri qu'elles rendent possible.
Objectifs
Les modèles rongeurs sont devenus ces dernières décennies des modèles prédictifs de première importance pour beaucoup d’études scientifiques et pré-cliniques grâce à l’avènement de la génétique et des outils pour la modifier. Le fond génétique des rongeurs dits sauvages et des souris/ rats transgéniques ne peut être maîtrisé sans analyse de celui-ci. Ainsi la réalisation de biopsie pour cette caractérisation génétique permet d’identifier les animaux d’intérêt pour les études de nos partenaires et la gestion des colonies de rongeurs. En effet, par la caractérisation génétique des individus, nous pouvons à la fois optimiser la gestion des colonies en limitant le nombre d’individus la constituant et limiter le nombre d’animaux utilisés en protocole expérimental. Par cette caractérisation génétique des animaux, nous apportons donc le modèle adéquate aux objectifs scientifiques de nos partenaires.
Bénéfices attendus
Ce projet est centré sur le prélèvement de tissus destiné au génotypage de rongeurs. L'objectif principal est d'identifier les animaux d’intérêt des lignées qui sont les animaux prédictifs pour les tests de recherche et qui répond aux principes des 3R. Ce processus de sélection est crucial pour garantir l'efficacité et la précision des études scientifiques menées et une meilleure gestion des colonies.
Procédures
Prélèvements de bout de queue et/ou d'oreille durant moins d'une minute pour caractérisation génétique des souris et des rats. Le prélèvement se fait sur animaux vigiles, avant le sevrage pour le prélèvement d'un bout de queue et après l'âge de 14 jours pour le prélèvement d'oreille. Un seul prélèvement de queue sur un animal et/ou plusieurs prélèvements à l'oreille sont possibles (maximum 3 prélèvements pour chaque animal).
Impact sur les animaux
Douleur et Inconfort : La biopsie, en particulier le prélèvement d'un bout de queue, peut causer de la douleur et de l'inconfort aux animaux. Même si la procédure est rapide, la coupure d'un bout de queue ou la perforation de l'oreille peut être douloureuse. Stress et Anxiété : La manipulation des animaux pour biopsie peut causer du stress et de l'anxiété. Limitation des activités normales : suite à la biopsie, les animaux pourraient être temporairement limités dans leurs activités normales, notamment si la douleur ou l'inconfort les affecte.
Devenir
Les animaux au génotype pertinent sont utilisés dans des expériences ou comme reproducteurs ou pour nos prestations de service. Ceux au génotype non pertinent sont euthanasiés car aucune possibilité de les utiliser dans un autre projet.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris/rats (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris/rats car ces animaux correspondent au coeur-même des projets des utilisateurs. L'analyse génétique chez les souris/rats nécessite souvent le prélèvement de tissus spécifiques pour obtenir des résultats précis et fiables. Les tissus prélevés dans notre methode permettent une analyse spécifique et sensible de certaines mutations ou expressions génétiques, qui ne pourraient pas être détectées aussi efficacement par d'autres méthodes moins invasives. Les méthodes établies de prélèvement de tissus fournissent des données reproductibles et standardisées, essentielles pour la validation des découvertes scientifiques. Changer de méthode pourrait introduire des variables inconnues ou des biais, compromettant la comparabilité des études.
Réduction
La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire (d'une part pour l'évaluation du phénotype dommageable et d'autre part pour la production de lots expérimentaux). La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc).
Raffinement
Nous mettons l'accent sur la prise en charge des prélèvements et le suivi de la cicatrisation sur les animaux. Il est utilisé des méthodes rapides, précises et standardisées pour limiter les effets du stress et de la douleur. Pour réaliser des biopsies correctes et minimiser le besoin de répétition des prélèvements sur un même animal, il est crucial de manipuler l'animal avec respect et de manière calme, d'utiliser une technique combinant l'identification et le prélèvement, de recueillir les échantillons avec précaution pour éviter toute contamination croisée, de privilégier le génotypage avant le sevrage de l'animal, de collecter le minimum de tissu nécessaire à l'analyse, et de stocker immédiatement l'ADN dans de bonnes conditions avant expédition pour prévenir sa dégradation. Ces procédures sont effectuées par du personnel spécialement formé pour minimiser le stress et la douleur infligés aux animaux. Le suivi de la cicatrisation se fera par une observation quotidienne des animaux au niveau des points de collecte. Nous assurons également un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (frisottis, bâtonnet de bois, mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière, etc.).
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les modèles les plus employés en recherche (fondamentale et appliquée). Les biopsies caudales sont réalisées sur des animaux avant leur sevrage car le tissu est moins ossifié et la douleur est moindre (maturation inachevée des vertèbres). Pour les biopsies auriculaires, elles sont faites après l'âge de 14 jours (fin de développement des oreilles). Après l'âge de 14 jours, l’âge des animaux pour les biopsies auriculaires est déterminé par la demande du client en fonction de son axe de recherche.
Evaluation des composés médicamenteux par imagerie chez le rongeur dans le cadre de pathologies cancéreuses et/ou immunitaires
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
Rats : 200
Pour évaluer par imagerie des candidats-médicaments contre le cancer et les maladies immunitaires, 8 000 souris et 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués en fin d'étude pour prélever leurs organes. Ils reçoivent une greffe de tumeur, parfois par chirurgie, une irradiation pour permettre la prise de greffe, des injections répétées, jusqu'à dix micro-prélèvements de sang en six jours, et des séances d'imagerie sous anesthésie répétées pendant quatre-vingt-dix jours au plus. Le porteur reconnaît que la répétition des anesthésies constitue un risque cardiovasculaire et que le développement du greffon peut provoquer perte de poids et troubles fonctionnels. Il affirme que l'animal vivant reste le moyen "incontournable" d'établir ces données, et rattache aussi le projet à la formation professionnelle de son personnel.
Objectifs
Les objectifs du projet consistent à évaluer par imagerie les propriétés in vivo des composés thérapeutiques en développement ou des sondes d’imageries utilisées comme biomarqueurs pour suivre l’évolution des pathologies cancéreuses, immunologiques et inflammatoires au cours d’un traitement chez le rongeur. Les outils d’imagerie permettent de mener plusieurs types d’études : - Etude de la bio-distribution des composés ou sondes marquées et/ou leur pharmacocinétique et/ou pharmacodynamie en documentant la distribution des composés dans les tissus en fonction du temps, et d’élucider les relations existantes entre l’exposition du futur médicament à la cible thérapeutique et son effet sur les pathologies cancéreuses, et la réponse immunologiques potentiellement mobilisée par imagerie non invasive. - Evaluation et la caractérisation de l’efficacité de candidats médicaments sur des modèles tumoraux en tissus profonds dans l’organe d’origine de la tumeur ou dans des modèles métastatiques fidèles aux pathologies observées chez le patient et suivi par imagerie non invasive. Cette approche permet également de mettre en évidence le gain thérapeutique potentiel des candidats médicaments par rapport aux traitements standards utilisés chez le patient ou développés par les concurrents, ainsi que de mettre en évidence les synergies de traitement possibles grâce à l’emploi de nos candidats médicaments en combinaison avec d’autres traitements expérimentaux ou validés en clinique. L’ensemble de ces activités permet de valider les thérapies les plus prometteuses et de proposer des doses actives, efficaces et tolérées qui pourront être testées ensuite chez l’homme. Ce projet va permettre de contribuer au dossier pharmacologique préclinique nécessaire à l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché par les autorités de santé des composés testés en clinique.
Bénéfices attendus
A court terme ce projet permet d’optimiser la structure de candidats médicaments sur la base d’une bio-distribution optimisée entre les tissus cibles et les tissus d’élimination en fonction du temps, de valider le mécanisme d’action et de l’engagement de la cible ou des cellules immunitaires effectrices in vivo, d’identifier le potentiel thérapeutique de molécules ciblant un processus pathologique, une tumeur, une maladie immune et de déterminer la posologie optimal à envisager et permettre la démonstration d’une efficacité thérapeutique chez l’animal dans un modèle proche de la pathologie humaine, et ainsi permettre de valider ou de contribuer à l’arrêt ou à l’avancement des phases précliniques du projet considéré. A plus long terme, les données générées grâce à ce projet permettent d’augmenter les connaissances scientifiques sur les processus cancéreux, immunologiques ou inflammatoires impliqués dans diverses pathologies humaines et feront l’objet de publications et de partage des données collectées avec la communauté scientifique. Les données générées permettent de supporter l’entrée des composés retenus en phase clinique d’évaluation et de contribuer à la constitution des dossiers d’autorisations de mise sur le marché des nouveaux médicaments évalués. L’approche par imagerie permettra potentiellement d’envisager l’évaluation de méthodes comparables pour le diagnostic ou le suivi des pathologies citées.
Procédures
Génotypage des animaux génétiquement modifiés par une biopsie tissulaire unique en 5 secondes sur animal vigile: 2 mm de biopsie de queue réalisée entre 10 et 21 jours d’âge. Irradiation 30 secondes par cage pour immunosuppression transitoire (72h environ) permettant la prise de greffe. Epilation au niveau ventral ou dorsal, sous anesthésie générale 10 minutes par souris à fourrure sombre pour les besoins d’un suivi par imagerie optique. Injections uniques ou répétées (10 secondes) en intraveineux ou en intra-péritonéal ou sous cutané ou per os de composés ou de cellules. Chirurgie sous anesthésie générale (10 à 30 minutes) avec prémédication sous-cutanée d’anesthésique local au site d’incision et prise en charge de la douleur par injection de dérivé morphinique sur 24 à 36h (3 à 4 injections 10 secondes). Suivis par imagerie non invasive du développement de la pathologie (une semaine à 90 jours maximum) : Les animaux sont imagés (25 minutes) sous anesthésie quotidiennement sur une durée courte (1 semaine à 10 jours) ou 1 à deux fois par semaine pour des modèles pathologiques suivi entre 14 et 90 jours. Prélèvements sanguins par micro-prélèvements de 5µl de sang à la veine de la queue (30 secondes) sur souris vigiles (10 prélèvements sur 6 jours) ou prélevés à raison de 20µl de sang limité à 5 fois sur la première semaine et 20µl 1 à 2 fois par semaine ensuite sur 6 semaines maximum.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles tumoraux, et les transferts adoptifs de cellules immunitaires peuvent engendrer des nuisances en particulier si les techniques d’implantation tumorales nécessitent de la chirurgie. Le développement du greffon peut induire une perte de poids ou des problèmes fonctionnels en fin de développement. La répétition des anesthésies générales pour la prise d’images peut constituer un risque cardiovasculaire. Les procédures de traitements thérapeutiques, les contentions, les injections de cellules, les prélèvements sanguins, les injections des produits de contraste d’imagerie entrainent des stress de courtes durées, répétés dans le temps.
Devenir
Les souris et les rats sont euthanasiés en fin d’étude car les objectifs d’étude nécessitent des prélèvements d’organes.
Remplacement
Actuellement, l’utilisation d’animaux vivants reste le moyen incontournable de montrer les relations pharmacocinétique-pharmacodynamie, le devenir (bio distribution), la tolérance et l’efficacité du candidat médicament dans un organisme complexe. Pour s’assurer de la tolérance et de l’efficacité des médicaments, il est nécessaire de mettre en œuvre des études chez l’animal vivant mimant la complexité d’une pathologie (exemple : action de composés sur des cellules effectrices relayant l’action du système immunitaire sur la pathologie). De manière générale, seules les molécules thérapeutiques ayant préalablement démontré une activité inhibitrice de la réponse cancéreuse, immunitaire ou inflammatoire in vitro dans des essais fonctionnels (activité antiproliférative ou cytotoxique direct, ou réponse immunitaire induite) pourront faire l’objet d’une évaluation in vivo dans nos modèles.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Sur la base des données expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser à l’aide d’un test de puissance statistique en fonction de l’objectif et du design de l’étude (nombre de groupes d’animaux, type de comparaisons et répétition des mesures dans le temps), du nombre et de la variabilité des paramètres mesurés en fonction de la méthode d’imagerie employée et de l’importance des effets mis en évidence. Les méthodologies statistiques sont appliquées pour proposer une analyse des données appropriée afin de mener les études pour répondre à l’objectif fixé en réduisant au maximum les biais expérimentaux avec un minimum d’animaux. Les techniques d’imagerie permettent un suivi longitudinal multiparamétrique. Les paramètres de distribution du composé ou de l’évolution de la réponse au traitement sont mesurés de façon non invasive en fonction du temps pour chaque animal. Plusieurs paramètres sont suivis en simultané à chaque session d’imagerie permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés dans l’étude.
Raffinement
Les rongeurs sont hébergés en groupe de 4 à 5 par cage et un enrichissement standard est donné (tunnel carton, matériel de nidification). Les préhensions des animaux se font à l’aide des tunnels d’enrichissement si l’animal est dedans ou dans le creux de la main formant une coupe dans le cas des souris, ou par la peau du dos pour le rat. Les protocoles d’anesthésie et de gestion de la douleur sont revus avec le vétérinaire responsable. Une prémédication avec analgésique local et une couverture avec un opiacé sont mis en place pour les chirurgies en complément de l'anesthésie générale. Les sessions d’imagerie s’effectuent sous anesthésie gazeuse (ou fixe) en caisson chauffé à 37°C pour garder l’animal immobile et sans stress le temps de la prise d’image. Les animaux sont suivis jusqu’au réveil en armoire ventilée chauffante ou réchauffés à 25-28°C pour optimiser leur réveil. -Le recours à l’imagerie constitue un raffinement en soi puisqu’il permet de générer des informations spécifiques de la réponse au traitement de façon non invasive et répétée tout au long de l’étude, sur les mêmes animaux. Il permet de caractériser la cinétique de développement du modèle tumoral en tissu profond, et sur la base de données quantitatives d’imagerie, de définir des critères d’arrêt anticipés pour les études d’efficacité sur le modèle considéré. Les rongeurs immunodéprimés sont stabulés en racks stériles ventilés pour les préserver des risques d’infection lié à leur statut. Si les animaux sont irradiés, ils sont supplémentés en complément alimentaire hydratant trois jours avant l’irradiation pour éviter une déshydratation réactionnelle.
Choix des espèces
De nombreux modèles animaux souris et rat se sont imposés en recherche biomédicale. La présence de gènes équivalents à ceux de l’Homme et la facilité actuelle de modification du génome des rongeurs en font un outil indispensable dans la compréhension et le traitement des pathologies en étudiant les effets moléculaires, pharmacologiques et toxicologiques. La facilité d’utilisation, la compatibilité avec les méthodes d’imagerie non invasives nucléaires et optiques, la compatibilité avec l’étude des composés sur des effectifs pertinents d’un point de vue statistique, la disponibilité des modèles humanisés exprimant les cibles thérapeutiques d’intérêt, et de souris transgéniques exprimant un reporteur d’imagerie d’intérêt, ainsi que la faible variabilité de réponse attendue d’un animal à l’autre par rapport à d’autres espèces permettent de tester plus de traitements et de sélectionner ceux qui génèrent des effets plus robustes et reproductibles nous ont conduit à choisir la souris et le rat comme modèles. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes de façon à avoir un système immunitaire mature et stable permettant un développement tumoral et une réponse immunitaire reproductibles. Souris : en général à partir de 6-8 semaines Rats : en général à partir de 6-8 semaines
Rôle de Jam A dans la production des plaquettes sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Sur 418 souris, 400 sont tuées à l'issue d'expériences terminales et 18 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est génétiquement modifiée pour ne plus produire une protéine dans les cellules qui fabriquent les plaquettes. Selon les groupes, 270 souris reçoivent des traitements et trois prises de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, puis un prélèvement de sang à l'aorte, 30 subissent ce seul prélèvement, 100 sont opérées du crâne sous une anesthésie de trois heures au plus, sans réveil, et 18 passent une mesure du temps de saignement à la queue. L'équipe veut comprendre comment se forme le réseau de membranes internes de ces cellules, et le porteur renvoie les retombées pour les patients manquant de plaquettes "à plus long terme". Il affirme que ces expériences demandent "un animal adulte vivant", parce que ces membranes se développent mal dans les cellules en culture.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse et sont vitales pour l'arrêt des saignements. Les MKs possèdent la caractéristique unique de contenir un réseau complexe de membranes internes (DMS). Ce réseau joue un rôle essentiel dans la production journalière de plaquette puisqu’il forme la membrane plasmique des futures plaquettes. Ainsi, la production par chaque MK d’environ 2000 plaquettes nécessite une production abondante et régulée de ce réseau membranaire. Un développement anormal est associé à une diminution du nombre de plaquettes circulantes dans certaines maladies héréditaires hémorragiques. A ce jour, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des membranes internes sont encore largement méconnus. De façon remarquable, nous avons récemment observé la présence de jonctions serrées au niveau de ces membranes internes. Nous avons précédemment montré la présence d'une protéine particulière à ce niveau. Notre hypothèse est que cette protéine est un acteur clé du développement normal de ces membranes internes et dans la libération des plaquettes vers la circulation sanguine. Nous savons que ce réseau de membranes est sous-développé dans les MK en culture. C'est la raison pour laquelle le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, l'environnement de la moelle osseuse. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant plus cette protéine d'intérêt spécifiquement dans la lignée MK, qui sont disponibles au laboratoire, et ne présentent pas de phénotype dommageable.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre la biogénèse du réseau de membrannes internes du MK (DMS), une étape clé et indispensable de la formation des futures plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension de la formation des plaquettes permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par MK, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements chez les patients thrombopéniques
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 différents types d'interventions : 1- Anesthésie générale par voie injectable et prélèvement terminal à l'aorte : 30 souris. 2- Anesthésie gazeuse de 5 minutes au masque pour injection des traitements pharmaceutiques et suivi répétée de la numération à la queue (x3), puis anesthésie générale par voie injectable pour le prélèvement terminal de sang à l'aorte : 270 souris. 3- Anesthésie générale longue de 3h au maximum, par voie injectable, et chirurgie du crane pour 100 souris, la chirurgie est sans réveil. 4-Anesthésie gazeuse de 15 à 30 minutes pour la réalisation d'un temps de saignement à la queue : 18 souris. Total : 418 souris
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvements de sang répétés présentent un risque modéré de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés aux traitements pharmaceutiques ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère . En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie intravitale, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.
Devenir
Lors de ce projet, sur les 418 animaux : 400 seront mis à mort puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales, et 18 animaux seront réutilisés (prélèvement d'organes).
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la compléxité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie, en particulier notre sujet d'étude, le DMS, diffèrent fortement dans des MKs en culture par rapport à ceux observés in vivo
Réduction
A la fin des expériences les animaux seront mis à mort et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est réduit au minimum mais déterminé afin d’obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes et traitements. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).
Raffinement
Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme, enrichi et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine en particulier pour la production de plaquettes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Les souris seront utilisées sans distinction à un stade de développement adulte de 8 à 35 semaines.
Caractérisation des phénotypes comportementaux d’un modèle murin porteur de deux mutations identifiées chez une patiente présentant une mort subite inattendue en épilepsie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 36 d'entre elles anesthésiées et tuées avant tout réveil. Porteuses de deux mutations relevées chez une jeune fille épileptique morte à 16 ans, elles reçoivent une puce sous la peau, boivent une eau acidifiée pendant quatre semaines, sont exposées à des sons de 110 décibels et reçoivent une injection d'agent convulsivant destinée à tester leur susceptibilité aux crises. Le porteur nomme les épreuves comportementales employées, labyrinthe à bras ouverts, arène, alternance, interactions sociales et test de mémoire, et indique qu'une souris qui convulse plus de trois minutes lors d'une manipulation est mise à mort. L'objectif déclaré se limite à vérifier si ces souris reproduisent les symptômes de la patiente, la validation du modèle conditionnant les recherches thérapeutiques annoncées ensuite.
Objectifs
Notre recherche porte sur la caractérisation in vivo de deux variants identifiés chez une jeune fille atteinte d’épilepsie frontale nocturne décédée brutalement au décours d’une crise d’épilepsie fatale. Les investigations génétiques ont permis d’identifier deux variants de deux gènes, chacun à l’état hétérozygote (où un seul chromosome porte la mutation). Les mutations liées à l'un des gènes sont rapportées dans l’épilepsie frontale nocturne et dans d’autres pathologies tel que le trouble du spectre autistique, mais pas aux crises d’épilepsie fatale. Plusieurs variants du deuxième gène ont été associés à des épilepsies focales héréditaires (dont l’épilepsie frontale nocturne) avec résistance aux médicaments et un risque accru de crise d’épilepsie fatale, mais le variant identifié dans notre cas n’a encore jamais été rapporté dans un cas de crise fatale. Notre objectif est ainsi de caractériser les souris portant les deux mutations afin de déterminer si elles reproduisent les phénotypes observés chez la patiente.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de valider les souris portant deux mutations pour deux gènes impliqués dans des crises d'épilepsie, mais également de mort subite et inattendue en épilepsie. En effet, le projet a pour but de déterminer les phénotypes comportementaux chez la souris et de les comparer à ceux observés chez la patiente afin de déterminer si les souris portant les deux mutations sont un bon modèle pour ces maladies humaines. Une fois le modèle murin validé, il permettra de caractériser les mécanismes physiopathologiques impliqués, ce qui facilitera l’identification des cibles thérapeutiques qui pourront ensuite être testées sur ce même modèle murin.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). - Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information, des sons à fréquence croissante seront présentés à l'animal sur plusieurs sessions (durée totale du test: environ 45 min). - test de susceptibilité aux crises épileptiques (injection d'un agent convulvisant): 5 sec; durée du test:20 minutes);
Impact sur les animaux
Le modèle murin étudié modélise la situation observée chez une patiente porteuse des deux mutations sur deux gènes différents présentant des crises hypermotrices frontales nocturnes, une forme d’épilepsie modérée pour laquelle elle était traitée depuis l’âge de 11 ans. Il est donc attendu que les souris porteuses de ces deux mutations présentent les mêmes symptômes d’épilepsie frontale survenant pendant le sommeil. Il faudra donc faire une surveillance renforcée des souris en journée pour voir si les souris (qui sont des animaux nocturnes) présentent des épilepsies. Les souris pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment de la journée, il est impossible de mettre en place un suivi permanent. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, ce projet comprend une implantation d'une puce RFID en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Le test acoustique présente quant à lui un inconfort léger notamment en raison des stimuli auditifs qui sont de 110dB et durent quelques ms.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des croisements ou de la réalisation de l'ensemble des expériences, pour prélever des organes en vue des analyses post-mortem.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. L’épilepsie étant causée par un déséquilibre de la balance excitation et inhibition dans le cerveau, il n’est pas possible d’étudier dans un modèle cellulaire l’impact de nos mutations sur le risque de survenue de crises épileptiques.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Nous appliquerons des analyses statistiques adéquates pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles) : nombre et durée des entrées dans les bras ouverts d'un labyrinthe; distance parcourue et temps passé dans le centre d'une arène; nombre d'alternance; nombre et type d'interactions ; performance lors du test du mémoire; caractérisation des crises épileptiques après administration d'un agent pro-convulsivant.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Afin de prévenir la survenue de crises épileptiques, nous éviterons les bruits au maximum et nous manipulerons les souris avec douceur, en utilisant un tunnel lors de chaque manipulation et change de cage. La manipulation par tunnel sera mise en œuvre dès le sevrage afin que l’animal s’y habitue. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, chacune des lignées sera maintenue à l'état hétérozygote pour chacune des mutations individuelles, pour ne pas induire de phénotype dommageable
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme. En particulier, deux gènes sont fortement conservés entre la souris et l’humain. Par ailleurs, grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations ponctuelles dans le génome de la souris et modéliser ainsi une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques et cellulaires. Enfin, des résultats sont disponibles sur des modèles de souris ne portant qu'une seule des deux mutations, pouvant permettre de comparer ces résultats à ceux qui seront issus du modèle souris mutées pour les deux gènes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 5 à 18 semaines. Cet âge a été choisi selon la symptomatologie clinique, la patiente portant ces deux mutations ayant présenté un tableau clinique à l'adolescence (âge du décès de la patiente à 16 ans).
ADAM10 dans la maturation des oligodendrocytes et myéline du système nerveux central
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génotypées par prélèvement d'un bout de queue vers sept jours de vie, puis traitées par voie orale dès la naissance, 3 288 souris sont soumises à des tests de mémorisation et de locomotion, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les tissus du cerveau et de la moelle épinière. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans la formation de la myéline, avec l'espoir déclaré d'ouvrir des pistes pour les maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques. Le porteur revendique un recours aux cultures de cellules et de tissus pour réduire le nombre de souris adultes utilisées, ces cultures reposant elles-mêmes sur des souriceaux tués à trois ou quatre jours.
Objectifs
La myéline est une substance qui entoure le prolongement des neurones et qui est responsable de la conduction nerveuse et donc de la transmission des commandes initiées par le système nerveux. La myéline est produite par des cellules appelées oligodendrocytes, localisés dans le cerveau et la moelle épinière. La perte de myéline ou d’oligodendrocytes peut survenir dans le cas de pathologies appelées maladies démyélinisantes (telle que la sclérose en plaques) ou lors de traumatismes (par ex. accidents de la route), et peuvent mener à de lourds handicaps. La formation de la myéline (myélinisation) et sa réparation (remyélinisation) sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux mécanismes dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est de comprendre l’implication d’une protéine, en recherchant son rôle dans le développement et maturation des oligodendrocytes et de la myéline chez la souris. Ce projet s’appuie sur des études précédentes montrant que l’activation de ce type de molécule est capable de protéger la myéline. Pour étudier l’implication de cette protéine uniquement dans les oligodendrocytes, nous caractériserons les souris d’intérêt d’un point de vue macroscopique (locomotion, cognition) mais aussi microscopique (état des tissus, organes, cellules). Le projet proposé nous permettra de mieux comprendre le rôle de cette protéine pendant le développement des cellules (âge précoce), puis leur maturation lors de la formation de la myéline (âge plus tardif). Ces expériences sont nécessaires pour mieux étudier les pathologies liées à la perte de myéline. De nombreux modèles alternatifs (cultures de cellules, ou de tissus) sont utilisés dans ce projet afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutique pour les maladies démyélinisantes, pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitements efficaces.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes.
Procédures
- Un prélèvement à la queue sera réalisé à l’âge de P7-10 sur l’ensemble des souris afin de vérifier leur génotype (lien de leur parenté). - Les souris seront traitées oralement à P0 (via une pipette) en utilisant le réflexe de succion, spontané à cet âge. Cette manipulation dure moins d’1min. - Les souris réaliseront des expériences de comportement afin de vérifier leur capacités cognitives et motrices (mémorisation, locomotion). Ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Elles se feront sur animal vigile et dureront chacune maximum 10 min.
Impact sur les animaux
- Nuisance de prélèvement lors de la biopsie de queue (douleur légère et de courte durée). -Le stress de contention dû aux traitements lors de la manipulation des animaux sera minimisé par un geste rapide et par l’utilisation du réflexe de succion spontané à P0. - Nos travaux précédents n’ont pas montré de phénotype dommageable sur notre lignée KOOLA10 traitée à P0. Les animaux qui seront gardés jusqu’à 21jours et 8sem seront attentivement surveillés dans le cas ou des effets indésirables surviendraient.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue des expérimentations, nous permettant de prélever les tissus d’intérêt et de les analyser.
Remplacement
Le modèle animal que nous utilisons permet de mimer certains aspects des pathologies que nous étudions (telle que la Sclérose en plaques), et pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Ce modèle est donc nécessaire pour mieux comprendre ces maladies. Les processus de myélinisation et de réparation de la myéline impliqués dans les maladies démyélinisantes que nous étudions induisent des processus biologiques et physiologiques complexes qui nécessitent l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet. Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser des modèles in vitro de cultures de cellules et ex vivo de culture de tissus nous permettant de réduire les études in vivo sur souris adultes et ainsi de réduire considérablement le nombre d’animaux vivants utilisés. Les animaux contrôles utilisés dans nos procédures sont indispensables pour établir des comparaisons fiables et tirer des conclusions précises. Ces animaux nous permettront de contrôler les variables externes, d’éliminer les biais et de mesurer les effets de nos traitements en les comparant aux groupes expérimentaux. Ils renforcent ainsi la validité de nos conclusions. De plus, nous avons limité au minimum le nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique suffisante nécessaire à l’interprétation des résultats. Ce nombre a été évalué́ à partir d’études précédentes (les expériences histologiques et biochimiques nécessitent au moins 6 animaux et les expériences comportementales en nécessitent au moins 10). Ces précautions permettent de limiter les variations inter-individuelles et d’aboutir à des conclusions rigoureuses. Les animaux issus des études comportementales seront ensuite utilisés pour les études des tissus prélevés, nous évitant ainsi d’avoir recours à de nouveaux lots de souris dédiés à cette analyse. De plus, plusieurs tissus d’intérêt seront prélevés sur chaque souris, permettant encore de réduire le nombre d’animal utilisé.
Raffinement
Nous avons choisi des tests comportementaux qui ne sont ni invasifs ni douloureux, et nous avons réduit la durée des études au maximum. Les animaux disposeront de coton pour enrichir leur environnement. Les animaux seront attentivement surveillés dans le cas ou des effets indésirables surviendraient à cause du traitement sur le long terme. Un suivi particulier du bien-être des animaux sera mis en place et une grille spécifique de prise en charge de la douleur sera utilisée pour définir des points limites adaptés au phénotype observé, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec l’Homme, en particulier au niveau génétique et neurologique. Elles constituent des modèles de choix pour (1) étudier les mécanismes des pathologies neurologiques humaines et (2) explorer des traitements potentiels de manière pertinente pour ces maladies. Les souris sont des organismes modèle bien établis en recherche biomédicale, et offrent une capacité élevée de reproduction et de cohérence dans les résultats expérimentaux, permettant des interprétations fiables et de tirer des conclusions robustes. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de notre molécule d’intérêt et l’état de la myéline (affectée dans la pathologie étudiée) sont très bien adaptées chez la souris. Afin de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés, nous envisageons des expériences in vitro de cultures de cellules et ex vivo de culture de tissus. Ces techniques nécessitent l’utilisation d’animaux à des stades périnataux (P3-4 et P7-10 respectivement) compatibles avec la survie en culture en boite de Pétri. Pour les études in vivo, les animaux sont âgés d’au moins 21 jours car il est connu que le processus de formation de la myéline autour des prolongements neuronaux est achevé à cet âge, mimant ainsi au mieux les processus pathologiques de la maladie étudiée. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de ce modèle animal, aux âges indiqués.
Contourner les récepteurs opioïdes pour une antalgie plus sûre : activation directe des canaux TREK1 en aval
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, 4 446 souris subissent l'induction de huit modèles de douleur différents, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 552 souris classées en souffrance sévère et 30 anesthésiées puis tuées sans réveil. Le porteur décrit une douleur inflammatoire de la patte chez 480 animaux, puis chez 184 souris chacune une douleur post-chirurgicale, une arthrite du genou, deux douleurs neuropathiques dont l'une provoquée par chimiothérapie anticancéreuse, deux douleurs coliques et une migraine, avec des durées d'entretien de la douleur allant de trois heures à dix-sept jours. Les tests comportementaux réalisés après injection des composés ne sont pas détaillés. L'objectif déclaré consiste à évaluer des activateurs du canal TREK1 comme alternative aux opioïdes, le porteur indiquant que la mise à mort devient "obligatoire" en fin d'expérience parce que les modèles de douleur interdisent toute réutilisation.
Objectifs
Les opioïdes constituent une classe de médicaments antalgiques efficaces mais dont les effets indésirables sont un obstacle au soulagement des patients et à l’origine d’une crise sanitaire grave. La recherche d’alternatives thérapeutiques est aujourd’hui basée sur une évolution des modalités d’activation du récepteur mu aux opioïdes et ne résout que partiellement ce problème. Nous avons montré que le canal potassique TREK1 était impliqué dans l’effet antalgique de la morphine mais pas dans ses effets indésirables, et que l’activation directe de ce canal était antalgique et bien tolérée. En s’appuyant sur le récent développement de nouveaux activateurs du canal TREK1, ce projet vise à (1) déterminer dans quels contextes physiopathologiques cette stratégie antalgique est la plus efficace, (2) définir si cet effet antalgique fait intervenir les canaux TREK1 du système nerveux central et/ou périphérique pour guider le développement de futurs composés, et (3) évaluer les potentiels effets indésirables liés à l’activation de TREK1, notamment au niveau central. Ce travail permettrait une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la douleur, du potentiel antalgique des activateurs de TREK1 ainsi que de la sécurité de cette stratégie. Les activateurs du canal TREK1 pourraient en effet offrir une alternative aux opioïdes et constituer une nouvelle classe de médicaments antalgiques efficaces et mieux tolérés.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous aurons une vision claire du bénéfice thérapeutique potentiel des activateurs de TREK1, de leurs effets indésirables ainsi que des indications les plus pertinentes pour ces produits. L'étude de la contribution des canaux TREK1 centraux et périphériques à l'effet antalgique des composés permettra d'orienter le développement de nouveaux activateurs du canal. En effet, si l'effet antalgique est principalement périphérique, il pourra être intéressant de synthétiser des composés ne passant pas la barrière hémato-encéphalique pour limiter l'exposition du système nerveux central et donc les effets indésirables potentiels.
Procédures
Les interventions se limitent à des tests comportementaux réalisés dans les 3h suivant l'injection d'un composé chez des animaux, visant à évaluer l'effet anti-douleur et les éventuels effets indésirables de ce traitement. Chez certains animaux, un modèle de douleur est induit en amont de ces tests. Il s'agit de modèles de douleur inflammatoire de la patte : 3h30 chez 480 animaux - de douleur post-chirurgicale de la patte : 24h chez 184 animaux - d'arthrite du genou : 7 jours chez 184 animaux - de douleur neuropathique induite par chirurgie : 14 jours chez 184 animaux - de douleur neuropathique induite par chimio-thérapie anticancéreuse : 72h chez 184 animaux - de douleur colique inflammatoire : 12 jours chez 184 animaux - de douleur colique non-inflammatoire : 17 jours chez 184 animaux - de migraine : 9 jours chez 184 animaux
Impact sur les animaux
Les composés testés peuvent avoir une toxicité, que nous chercherons à évaluer par des échelles de doses. Ce projet nécessite également l'induction de modèles de douleur au sein de procédures qualifiées de modérées à sévèrees, et qui constituent de fait une nuisance pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des expérimentations car les traitements réalisés ne permettent pas leur réutilisation. De plus, des procédures impliquent l'induction d'un modèle de douleur, ce qui rend leur euthanasie obligatoire en fin d'expérience.
Remplacement
Les composés activateurs de TREK1 seront sélectionnés par une approche in vitro, permettant le remplacement complet de l'utilisation d'animaux. Pour la troisième phase du projet, les premiers travaux seront réalisés ex vivo/in vitro sur des tissus ou des cultures de neurones. Ces expériences nécessitent le sacrifice d'animaux, mais permettent d'obtenir une grande quantité de résultats par animal, limitant le nombre total d'animaux utilisés au minimum. L'utilisation d'animaux vivants est donc limitée au strict nécessaire, à savoir l'évaluation de comportements et paramètres physiologiques nécessitant une approche intégrative, et qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet à ce jour d'appréhender.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée grace à un outil statistique dédié. Certaines procédures sont adaptées pour obtenir plus d'information à partir des mêmes animaux (par exemple, les tests de douleur seront couplés à un test de sédation), lorsque les tests réalisés chez les mêmes animaux n'interagissent pas ensemble et que la multiplication des tests n'engendre pas de nuisance supplémentaire. Pour les études de toxicité, le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum par l'utilisation d'échelles de doses sur un petit nombre d'animaux (augmentation des doses jusqu'à atteindre la dose maximale ou apparition d'effets indésirables). Une banque de tissus sera maintenue pour les expériences d'histologie, réduisant le recours à de nouveaux animaux pour chaque expérience.
Raffinement
Afin d'obtenir un maximum d'information des animaux utilisés, des tissus seront prélevés en fin d'expérimentation comportementale lorsque cela est pertinent (pour l'étude de l'expression de TREK1 ou de l'activation neuronale chez les modèles de douleur notamment). Afin de prévenir une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie, et sacrifiés si un point limite est franchi. En effet, si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié. Les cages contiendront un enrichissement de type maisonnette ainsi que du coton pour la constitution d'un nid.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur le modèle souris car c'est sur ce modèle qu'ont été mis au point au laboratoire toutes les techniques d'investigation comportementale et électrophysiologique ainsi que les différents modèles de douleur utilisés. C'est également le modèle pour lequel nous disposons du plus de données dans la littérature. Enfin, notre animalerie est une animalerie petit rongeur concue pour l'hébergement des souris, modèle sur lequel notre personnel a le plus d'expertise. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (8-12 semaines). Si la douleur touche essentiellement des personnes âgées, travailler sur la souris âgée représenterait un risque et surcoût extrêmement important qui mettrait en péril le projet dans son ensemble (coût d'achat d'animaux âgés et surmortalité de ces animaux). L'animalerie et son personnel ne sont pas en mesure d'accueillir à grande échelle des animaux âgés demandant une surveillance et des soins accrus et adaptés. Enfin, les tests et modèles utilisés, comme les données disponibles dans la littérature, concernent sauf cas très spécifiques des animaux jeunes.
Étude de l’effet d’un anticorps sur le développement du cancer de l’ovaire, en absence et présence des prokinéticines
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus, 180 souris reçoivent des cellules de cancer de l'ovaire puis des injections répétées d'anticorps, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les injections intrapéritonéales répétées risquent de provoquer des péritonites, que la chirurgie de pose des mini-pompes peut causer douleur et infection, et que le développement tumoral peut entraîner perte de poids et inactivité. Chaque souris subit en outre une séance hebdomadaire d'imagerie par fluorescence sous anesthésie. Les retombées annoncées pour les patientes restent au conditionnel, et le porteur conclut que le recours au modèle animal est "indispensable" faute de pouvoir reproduire l'environnement tumoral in vitro.
Objectifs
Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès parmi les cancers gynécologiques. ll est responsable de plus de 140 000 décès chaque année dans le monde, représentant la cinquième cause de décès liés au cancer. Sa forme la plus commune est le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), généralement diagnostiqué à un stade avancé, avec plus de 95% des tumeurs malignes de l'ovaire. Les traitements standard actuels ne sont toujours efficace pour améliorer la survie des patientes car il y a des récidives à cause du développement de résistances au traitement. La complexité biologique et génomique des CEO a conduit chercheurs et cliniciens à explorer des stratégies ciblées et plus adaptées pour contourner la toxicité des molécules utilisées en chimiothérapie. A ce jour, l’ensemble des tentatives thérapeutiques n'ont que très rarement conduit à des résultats concluants. Depuis une quinzaine d’années, la recherche s’intéresse à l’étude d’une famille de protéines d’intérêt. Ces protéines sont spécifiquement exprimées dans les tissus endocrines (ovaire, testicule, cortex surrénal et placenta) où elles agissent sur les cellules endothéliales (cellules tapissant les vaisseaux sanguins). Nous avons démontré que les niveaux circulants d’une de ces protéines étaient significativement plus élevés chez les patientes atteintes de CEO, suggérant qu’elles joueraient un rôle important dans le développement et ou la progression de ce type de cancer. De plus, une collaboration récente avec des chercheurs du Pays-de-Galles a également mis en évidence l’implication d’un récepteur dans de nombreux cancers dont notamment celui de l’ovaire. Leur équipe ont pu mettre au point un anticorps dirigé contre ce récepteur qui a déjà démontré de son efficacité sur la croissance tumorale du cancer de l’endomètre. Par ailleurs, une étude préliminaire clinique nous a permis de démontrer que les récepteurs des protéines d’intérêt étaient fortement exprimés par les adipocytes (cellules permettant dans le stockage des lipides) et les cellules immunitaires de l’environnement tumoral, plus particulièrement par les macrophages et les neutrophiles. En raison de l’absence de l’environnement tumoral dans les études in vitro, nous souhaitons développer un modèle murin du cancer de l’ovaire afin d’évaluer l’efficacité, in vivo, de l’anticorps dirigé contre le récepteur en combinaison avec un traitement avec les protéines d’intérêt .
Bénéfices attendus
Les analyses, réalisées précédemment sur des échantillons cliniques (de patientes atteintes du CEO) et sur modèles précliniques, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans la croissance des tumeurs ovariennes par action directe sur l’environnement tumoral. L’action combinée entre un anticorps dirigé contre la tumeur et les prokinéticines pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique prometteuse, notamment chez les patientes qui développement des résistances aux traitement conventionnels. Le projet a pour but d’évaluer et de démontrer la valeur et l’efficacité thérapeutiques de l’anticorps seul ou en combinaison avec les prokinéticines dans le traitement de ce type de cancer.
Procédures
Les souris seront traitées par injection de l’anticorps sur animal anesthésié (durée : 1 minute), deux fois par semaine pendant 2 semaines, entre le 40ème et le 60ème jour après injection de cellules tumorales. La pose des mini-pompes dureront 20 minutes au maximum et Et seront installées pour deux semaines. Les souris seront imagées 1 fois/semaine par, un système d’imagerie utilisant la fluorescence. Cette procédure dure 15 minutes sous anesthesie. Au moment de l’euthanasie des animaux, un prélèvement sanguin qui durera au maximum 5 minutes, sera réalisé sur animaux préalablement analgésiés et anesthésiés.
Impact sur les animaux
L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées qui risquent de provoquer le développement de péritonites, un stress à la souris, un léchage de la région d’injection La chirurgie pour la mise en place des mini-pompes peut présenter un stress chez la souris et un léchage de la région opérée, ainsi que de la douleur si une inflammation et une infection se développent. Le développement tumoral chez les souris peut aussi causer une perte de poids et de l’inactivité.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer des prélèvement de sang pour des dosages sanguins et tissulaires pour faire différentes analyses comparatives du développement tumoral in situ en utilisant les techniques permettant d’étudier les protéines d’intérêt qui serviront à caractériser l’effet de l’anticorps et des protéines d’intérêts sur le développement tumoral
Remplacement
Une étude récente sur le cancer de l’ovaire a permis de faire la preuve de concept que les prokinéticines et leurs récepteurs sont directement impliqués dans l’ensemble des causes de ce cancer. Les protéines d’intérêts semblent agir directement sur l’environnement tumoral pour atténuer de façon indirecte sa croissance et progression. Ainsi, nous souhaitons avoir recours à des animaux, pour valider ces observations et combiner leurs actions avec celles de molécules qui agiraient directement sur la tumeur comme le nouvel anticorps. Les modèles in vitro ne nous permettant pas de démontrer les effets des cellules immunitaires sur la progression de ce cancer le recours au modèle animal est donc indispensable. Ces études sont à réaliser sur des animaux qui peuvent intégrer les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie.
Réduction
Au total nous envisageons d’utiliser 180 animaux répartis en 2 groupes : 60 animaux dans le groupe 1 et 120 animaux dans le groupe 2. Nous avons choisi d’inclure 20 souris pour chaque condition dans le groupe 1 (et 20 souris pour chaque condition dans le groupe 2 pour avoir le nombre nécessaire de souris différentes par technique envisagée dans ce projet. Ce nombre a été déterminé afin d’atteindre des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) quotidiennement. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le poids des souris sera mesuré tous les jours. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte afin de veiller au bien-être des animaux. Les interventions seront realisées sur animal anesthésié.
Choix des espèces
Le projet a pour but de déterminer l’efficacité d’un anticorps dans le contexte du cancer de l’ovaire et de caractériser le rôle des protéines d’intérêts dans l’environnement tumoral de ce cancer. Les souris utilisées dans nos expériences sont des souris immunocompétentes, c’est-à-dire possédant un système immunitaire complet et compétent. Ce modèle nous permettra d’étudier les interactions complexes entre les différents composants du système immunitaire et la cellule tumorale du cancer de l’ovaire. Plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude entre le développement tumoral chez la souris et chez la femme et dans l’expression et la régulation des gènes tumoraux et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse (phénomène de nouveaux vaisseaux sanguins) et de l’inflammation. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles.
Evaluation de thérapie génique dans un modèle murin de pathologie dominante liée à RYR1
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour tester une thérapie génique contre les mutations dominantes du gène RYR1, 336 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 40 d'entre elles anesthésiées et tuées avant tout réveil. Elles reçoivent un poinçon à l'oreille pour le génotypage, une injection unique dans l'abdomen ou dans le muscle, puis des tests de comportement destinés à mesurer leur force musculaire, dont la nature n'est pas précisée, toutes les deux semaines pendant deux mois. Le porteur indique que l'anesthésie peut déclencher chez les souris porteuses de la mutation une crise d'hyperthermie maligne, avec montée de température et contraction musculaire généralisée aux effets parfois fatals, et que le traitement lui-même peut entraîner une fonte musculaire. Toutes sont tuées pour prélever les muscles, le porteur affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la force musculaire ou la sensibilité aux anesthésiques.
Objectifs
Le récepteur à la ryanodine RYR1 est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Les mutations dans le gène qui code pour cette protéine conduisent chez l’homme à plusieurs maladies graves, héréditaires et rares du muscle squelettique. Les mutations dominantes de RYR1 peuvent ainsi conduire à la myopathie à cores centraux, ou à une maladie déclenchée comme l'hyperthermie maligne, les deux pouvant être associées chez un même patient. Il n'y a pas de traitement pour ces maladies qui peuvent être mortelles. La myopathie à cores centraux se caractérise par une faiblesse musculaire de sévérité variable chez les patients, prise en charge uniquement par kinésithérapie et corticothérapie en l'absence de tout traitement curatif. L’hyperthermie maligne est un accident d'anesthésie d'origine génétique induit par l'exposition à des certains produits anesthésiques. Elle se traduit lors de l'anesthésie par une augmentation rapide de la température du patient associée à une contracture généralisée qui conduisent à la mort si le patient ne reçoit pas rapidement un traitement adapté. La fréquence de l’hyperthermie maligne est d'environ 1/50 000 anesthésies. Ces deux pathologies étant intimement liées, après l'identification d'une mutation dans le gène RYR1, un patient myopathe est considéré comme sujet à risque d'hyperthermie maligne. Pour étudier les mécanismes physiopathologiques qui découlent de mutations dans le gène RYR1, plusieurs modèles de souris ont été développés. Dans ce projet, nous souhaitons développer une thérapie génique pour toutes les mutations dominantes de RYR1, quelque soit la pathologie qui en découle. Nous avons établi la preuve de concept dans des modèles de cellule en culture du bénéfice de cette approche, et nous souhaitons maintenant l'étudier chez l'animal. Nous utiliserons un modèle de souris porteur d'une mutation dominante qui conduit chez la souris à l'hyperthermie maligne.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de mutation dominante, sur les deux copies du gène RYR1, une copie est porteuse de la mutation alors que l'autre copie est saine. Nous souhaitons enlever la copie mutée et ne conserver que la copie saine, qui assurera à elle seule la fonction normale du muscle. Nous avons montré dans des cellules musculaire en culture que les fonctions essentielles la protéine RYR1 étaient améliorées avec cette approche thérapeutique, et nous allons maintenant montrer que ces fonctions sont améliorées également dans un organisme entier. Cette stratégie est novatrice car la même approche pourrait s'appliquer à tous les patients porteurs de mutation dominante dans le gène RYR1, mais également dans d'autres gènes associés à d'autres maladies génétiques.
Procédures
Le génotype des animaux sera vérifié sur un prélèvement réalisé par un poinçon à l'oreille, le prélèvement durera quelques secondes (moins de 5 s). Chaque animal subira au maximum une injection (soit dans l'abdomen, soit dans le muscle) d'une durée de moins de 20 secondes par animal, 1 seule fois dans sa vie. Sa force musculaire sera éventuellement mesurée par des tests de comportement réalisés pendant 2 mois toutes les deux semaines et d'une durée de 30 min maximum. Il subira une anesthésie gazeuse de 20 min maximum.
Impact sur les animaux
Les souris du modèle de l'hyperthermie maligne ne présentent pas de signe en dehors de l'anesthésie. Cependant, des nuisances apparaissent chez les animaux porteurs de la mutation lors d’une anesthésie réalisée avec certains composés conduisant à l'apparition d’une crise d'hyperthermie maligne, associant une montée en température et une contraction musculaire généralisée au cours de l'anesthésie. Concernant les autres nuisances potientielles, nous pouvons attendre : 1- Chez certains animaux le traitement pourra entraîner une myopathie progressive avec une fonte musculaire et une perte de la force musculaire. 2- Les injections abdominales et dans le muscle (1 seule fois) peuvent aboutir à des hématomes au site d’injection. 3- Des effets indésirables liés à une hausse de la température centrale corporelle qui peuvent être fatals durant l'anesthésie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort et les muscles prélevés pour réaliser des analyses moléculaires et biochimiques essentielles à la confirmation des phénotypes observés lors des tests comportementaux ou de sensibilité à l'anesthésique.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, permettant l’évaluation de la force musculaire ou la sensibilité à certains produits anesthésiques, et confirmant ainsi l'efficacite du traitement que nous voulons tester. Les outils ont été préalablement sélectionnés sur des cellules musculaires en culture et seul les meilleurs seront testés chez l'animal.
Réduction
Afin de limiter le nombre conditions et donc de réduire le nombre d'animaux vivants utilisés, nous réaliserons un criblage sur des cellules musculaires en culture, et seuls les outils validés seront testés chez les animaux. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de répétitions des expériences sont déterminés à l'aide de tests statistiques appropriés tout en optimisant l'interprétation statistique des informations recueillies. Le projet a été désigné pour une mise au point des étapes préliminaires sur un nombre réduit d'animaux, avant de tester uniquement la méthode optimale sur un plus grand nombre.
Raffinement
1- Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du premier février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Les animaux sont hébergés en groupe, en milieu adapté, à température constante, éclairage alterné (12h/12h), avec boissons et aliments sans restriction. 2- Les injections sont réalisées à l'aide d'aiguilles fines et changées à chaque animal. 3- Les tests de comportement sont réalisés après une période d'entraînement permettant de limiter le stress de la nouveauté. 4- Une grille de cotation adaptée est établie afin d'identifier les points limites les plus précoces, et de mettre en place les actions correctrices à apporter (antidouleur dans l'eau de boisson; aliment hydraté dans la cage).
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a permis de comprendre de nombreuses pathologies humaines, et la plupart des modèles animaux de maladies humaines sont des modèles souris. Ainsi, nous disposons d'une souche de souris, le modèle murin R163C, permettant de modéliser une altération observée chez des patients atteints d’hyperthermie maligne. Nous avons la possibilité également de croiser des souris de différents fonds génétiques afin d’utiliser la variabilité génétique naturelle existant entre les lignées de souris pour valider nos outils thérapeutiques. Des souriceaux seront utilisés à l'age de 15 jours. Cet âge est choisi comme le plus précoce permettant de réaliser une injection abdominale sur des animaux de faible poids et donc de diminuer les quantités de vecteurs viraux à injecter. Cet âge sera destiné a apporter une preuve de concept de l'efficacité maximale de notre stratégie en se placant à un stade précoce. Des souris adultes seront utilisées à 8-10 semaines. Cet âge correspond à l'âge jeune adulte des patients chez lesquels on découvre une mutation dominante dans le gène RYR1 associée à une susceptibilité à l’hyperthermie maligne (lors d’une anesthésie le plus souvent) ou une myopathie. Cet âge sera destiné à se rapprocher des conditions cliniques réelles pour les patients atteints de pathologie dominante liée à RYR1.
Production de modèles de pathologies humaines de plaquettes à partir des mégacaryocytes dérivés des iPSC de patients
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Irradiées puis greffées de cellules humaines, 1 530 souris subissent quatre injections, une injection dans le fémur, une prise de sang et la section du bout de la queue pour mesurer leur temps de saignement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, une partie par laparotomie sans réveil, pour prélever tissus et organes. Le projet vise à tester l'effet de mutations rares sur la coagulation et la sécurité de plaquettes produites à partir de cellules souches, en vue de transfusions. Le porteur affirme être "contraint" de travailler sur la souris et indique que la thrombose ne peut s'étudier qu'in vivo, l'espèce étant retenue parce qu'elle tolère les greffes de cellules de patients.
Objectifs
Ce projet a pour objectif 1) étudier l’effet de différentes mutations trouvées dans les pathologies très rares sur la coagulation, évènement qui est impossible d’étudier in vitro, et tester l’effet des drogues identifiées dans une étude sur la coagulation réalisée en parallèle in vitro à partir de cellules souches de patients. 2) étudier la fonctionnalité des plaquettes générées à partir des plaquettes dérivés de cellules souches adultes, notamment leur capacité à participer à la formation de caillot ; et tester la sécurité de ces plaquettes dans le but de leur utilisation pour la transfusion (pas de développement d’hémopathies malignes).
Bénéfices attendus
1) Identification et validation de drogues permettant l’arrêt de saignement dans les maladies rares conduisant à des thrombopénies/thrombopathies 2) Développement de stratégie de production de plaquettes in vitro dans le but de transfusion, notamment test de fonctionnalité et sécurité des plaquettes produites in vitro à partir des cellules souches adultes plaquettaires.
Procédures
Irradiation par rayonnements ionisants à faible dose, pas d'effet délétère. Injections (n=4, durée 1 minute sous anesthésie locale). Injection intra-fémorale (n=1), durée 5 minutes sous anesthésie générale puis analgésie bi-modale., Prise de sang (n=1, durée 1min) .Mesure de temps de saignement : par section de l'extrémité de la queue sous anesthésie générale (durée maximale 10 minutes). Laparotomie sous anesthésie générale en procédure terminale, sans réveil.
Impact sur les animaux
Nous n’anticipons aucun effet indésirable après l’injection de MKs ou plaquettes dérivées de cellules souches. Les principales nuisances seront celles dues aux interventions. Injections simples, de contrainte légère sous anesthésie locale. L'irradiation a faible dose n'a pas d'effet délétère. L'injection intra-fémorale peut entraîner une gêne modérée transitoire. La section d'une petite partie de la queue pour étudier le temps de saignement entraîenra une contrainte légère et de courte durée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour études sur tissus et organes, certains à l'issue d'une procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Bien que les plaquettes soient étudiées chez les patients, il est rarement possible d’étudier toutes les étapes dérégulées et aboutissant à la pathologie. Ainsi, il est difficile de les étudier chez l’homme. Nous sommes donc contraints de travailler sur souris afin de comprendre le dysfonctionnement dans la production plaquettaire dans les thrombopénies héréditaires qui sont des maladies rares. Cela est possible uniquement sur un modèle animal avec un suivi sur une durée prolongée. Par ailleurs, pour bien comprendre les mécanismes sous-jacents à la pathologie, il est important de les valider sur un nombre de sujets valable sur le plan statistique, possible uniquement sur le modèle animal. De plus, nous nous intéressons, dans chaque pathologie étudiée, à la dérégulation de la thrombose qui peut être étudiée uniquement in vivo.
Réduction
Les effectifs des lots par condition ont été déterminés grâce à l'expérience antérieure du laboratoire et en tenant compte du taux de prise de greffe. Si nous nos résultats obtenus avec les cellules souches contrôles sont reproductibles entre trois expériences indépendantes, nous ferons les expériences uniquement avec les cellules souches mutées sans et avec la drogue ce qui permettra de réduire le nombre de souris greffées avec les cellules souches contrôles. Si certaines drogues sont inefficaces sur les souris greffées avec les cellueles souches mutése, elles ne seront pas re-testées dans les 2 autres expériences pour valider le résultat négatif. Les résultats seront analysés par analyse de variance.
Raffinement
Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Un régime énergétique adapté sera ajouté dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...). Dans un souci de bien-être animal, les souris greffées, sous traitement ou non, seront suivies quotidiennement, les injections et prélèvements sanguins seront réalisés sous analgésie ou anesthésie et des points limites définis afin de limiter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris car nous voulons étudier l’impact de certaines mutations humaines sur un modèle animal tolérant les greffes de cellules de patients. Ainsi, les techniques de transgénèse et greffes sont bien documentées et maîtrisées chez la souris. De plus, en vue de nombreuses publications sur les modèles murins, cette dernière constitue un modèle pertinent pour les projets que nous menons. Les souris sont également adaptées à l’étude d’inhibiteurs que nous testons dans un but thérapeutique. Enfin, la souris semble plus adaptée à l’étude de la formation d’une thrombose in vivo car une étude similaire a déjà été publiée. Cette dernière est à approfondir sur certains aspects, ce que nous souhaitons faire. De plus, nous possédons l’expertise et les moyens techniques nécessaires (vidéomicroscopie chez le petit animal) pour apporter les réponses aux question posées. Pour certaines études, des contraines physilogiques (masses graisseuses autour des vaisseaux chez les animaux plus âgés empêchant la visualisation en vidéomicroscopie) nous imposent d’utiliser des souris âgées de 3 à 5 semaines (jeunes). Pour les autres études nous utiliserons des souris de 8 à 15 semaines (adultes).
Mécanismes moléculaires de la mise en place de l’hypersensibilité mécanique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour comprendre comment s'installe l'hypersensibilité mécanique, 306 souris reçoivent une injection sous-cutanée de la molécule testée ou d'un placebo, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement de tissus. 114 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel sous anesthésie et 114 autres l'injection d'un composé inflammatoire dans la patte. La sensibilité de la patte lésée est mesurée avec des filaments calibrés la veille et le lendemain, le porteur indiquant que ces lésions accroissent la sensibilité et peuvent entraîner une perte de poids. Il déclare viser à terme la prescription de la molécule comme antidouleur en clinique, et affirme que la douleur ne peut pas être dissociée du système physiologique global de l'animal.
Objectifs
Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4. Cette molécule est présente naturellement en petite quantité dans notre organisme et celui des souris. Si on supprime cette molécule chez la souris, on transforme une douleur aigue en douleur chronique quel que soit le type de lésion. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion, c’est-à-dire qu’après une lésion, les souris sont moins en douleur. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeuthique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Recemment, nous avons montrés que l'injection de Tafa4 avant une lésion post opératoire (type chirurgie) empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, ou de la douleur chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeuthique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.
Bénéfices attendus
Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre comment l'hypersensibilité se met en place ouvrira un nouveau panel de solution pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.
Procédures
Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons ammenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutannée sur toutes les souris (306). 114 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie général. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 114 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.
Impact sur les animaux
Avec les differents modèles de lésions post-opératoires et inflammatoires, la sensibilité des souris au niveau de la patte lésée sera acrue. Ces lésions peuvent entrainer une perte de poids. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Il y aura une surveillance accrue les jours suivant les chirurgies.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et nottamment l’effet préventif de TAFA4.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non-animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. .
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique sera effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrit chez la souris. La recherche sur la douleur est menée sur les rongeurs mâles depuis des décennies. Pourtant, plusieurs études ont montré que les femmes ont des seuils de douleur aiguë plus bas que les hommes et qu’elles sont prépondérantes parmi les patients souffrant de douleurs chroniques, ce qui suggère fortement des mécanismes sexuellement dimorphiques impliqués dans la perception, la modulation et le traitement de la douleur. Nos travaux seront donc réalisés sur des souris mâles et femelles. Lorsque les phénotypes étudiés sont comparables entre mâles et femelles, les données seront regroupées. Cela aura alors un impact considérable sur le nombre total de souris utilisées
Evaluation des mécanismes de mort des cellules hépatiques au cours de la maladie du foie gras reproduit chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes reçoivent une injection intraveineuse de vecteur viral sous anesthésie, 980 sont soumises à un régime hypercalorique pendant douze ou vingt-quatre semaines et 500 à des prises de sang, rétro-orbitales pour partie, tous les quinze jours. Le porteur affirme que la maladie du foie gras induite "reste indolore" et ramène les atteintes à un manque d'appétence initial, tout en signalant que l'un des régimes provoque un diabète de type 2 et une polyurie. Il conclut que seuls les modèles in vivo reproduisent le caractère multifactoriel de cette pathologie.
Objectifs
Au cours de la maladie du foie gras (ou NASH), la mort des cellules principales du foie (hépatocyte) alimente l’état inflammatoire au sein de l’organe, participe à la chronicité et à l’aggravation de la maladie. Des travaux ont évalué indépendamment les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, nécroptose et pyroptose), suggérant que chacune d’elle pourrait contribuer à la mort des hépatocytes. En parallèle, des interconnexions entre ces différentes voies de mort cellulaire programmée ont été découvertes. Ces interconnexions peuvent conduire à un basculement d’une voie de mort cellulaire à une autre si l’une d’elle est inhibée. Une thérapie basée sur l’inhibition de la mort des hépatocytes devra donc cibler les différentes voies impliquées. Pour preuve, un inhibiteur de l’apoptose aggrave la NASH chez l’Homme probablement en favorisant une voie de mort pro-inflammatoire (nécroptose et/ou pyroptose). L’objectif de notre projet vise à évaluer la pertinence d’un ciblage multiple des principales voies de mort cellulaire programmée. Pour cela des lignées de souris génétiquement modifiées pour rendre les hépatocytes résistants à l’apoptose ou/et à la nécroptose ou/et à la pyroptose seront soumises à un protocole expérimental induisant une NASH. Nous comparerons alors la susceptibilité des différentes lignées à développer la maladie afin de déterminer quelle(s) combinaison(s) pourraient permettre de les protéger de la NASH.
Bénéfices attendus
Lors de la maladie du foie gras (NASH), la mort des cellules principales du foie, l’hépatocyte, alimente l’état inflammatoire du foie et contribue à la chronicité de l’hépatite et donc à son aggravation. Ce projet a pour but d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’inhiber individuellement ou en combinaison les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, pyroptose et nécroptose) qui pourraient être activées au sein de l’hépatocyte au cours de la NASH. Ce projet permettra d’évaluer l’éventuelle nécessité d’un ciblage multiple de 2 ou des 3 types de mort cellulaire programmée. En effet, non seulement, différentes voies de mort cellulaire programmée pourraient être induites dans des hépatocytes distincts mais l’existence d’interconnexions entre elles pourrait permettre un basculement vers une voie de mort cellulaire programmée alternative lorsque celle initialement activée est inhibée. Evaluer l’intérêt d’un ciblage multiple sur les différentes voies de mort cellulaire programmée est donc un préalable pour envisager une thérapie visant à prévenir la mort des hépatocytes lors de la NASH.
Procédures
Différents protocoles expérimentaux seront appliqués sur des périodes de temps différentes s’étalant sur 2 semaines au minimum ou sur 25 semaines maximum. La totalité des animaux (1080) recevront une injection intraveineuse sous anesthésie générale pour inoculer soit un vecteur viral contrôle qui n’induit aucune réaction, soit un vecteur viral capable d’induire une recombinaison génétique ciblée. La procédure incluant la mise sous anesthésie, l'injection et le début du réveil dure moins de 5 min. Pour induire une NASH, des groupes de souris (980) seront soumis à un régime hypercalorique, sur une période de 12 ou 24 semaines selon le type de régime, capable d’induire la maladie du foie gras qui reste indolore. Pour suivre l’évolution de la maladie au cours du temps et permettre de réduire le nombre d’animaux à intégrer à l’étude, un prélèvement sanguin (inférieur à 150 µL) sera effectué tous les 15 jours sur toute la période de mise sous régime hypercalorique, sur une partie des animaux (500). Cette procédure de prélèvement intermédaire s'effectueant sous anesthésie durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
La maladie induite (NASH) est une pathologie indolore. Au cours du protocole expérimental, le seul léger désagrément transitoire ressenti par l’animal sera lié au manque d’appétence initiale pour les régimes alimentaires hypercaloriques. Par ailleurs, l'un de ces régimes induit après plusieurs semaines un diabète de type 2 pouvant résulter en une polyurie nécessitant un suivi régulier de l’état hygrométrique de la litière. Ce régime induit également une prise de poids plus importante qu’un régime standard.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie.
Remplacement
Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite (maladie du foie gras) dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissus adipeux, intestins et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constituent le foie. Par conséquent, compte tenu de la nature multifactorielle de la physiopathologie de la NASH, de la composition hétérogène du microenvironnement cellulaire et de la contribution du microbiote intrahépatique, seuls les modèles précliniques in vivo permettent jusqu’à présent de reproduire les diverses caractéristiques d’un organisme multicellulaire atteint par cette pathologie.
Réduction
La stratégie expérimentale a été définie de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs tout en évitant des réplicas inutiles. En se basant sur les données de la littérature scientifique utilisant des modèles murins de maladie du foie gras induits par un régime alimentaire hypercalorique, un test statistique de calcul d’effectif minimal a été réalisé. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe permettra de déceler de faibles variations quantitatives entre les groupes expérimentaux tout en prenant en compte la variabilité inter-individuelle et en conservant une sécurité en cas de perte accidentelle d’un individu lié au hasard. Par ailleurs, la conception du projet en étapes successives permet de limiter l’effectif nécessaire à la réalisation de l’étude. Ainsi, un arbre décisionnel d’intégration des lignées dans les étapes successives a été établi. La première étape sert à valider les vecteurs viraux sur un nombre limité de souris avant d’engager les étapes suivantes impliquant un plus grand nombre d’animaux. Alors que les 7 lignées de souris seront intégrées à l’étape suivante, seules celles présentant un phénotype spécifique de protection ou d’aggravation seront incluses aux étapes ultérieures. Enfin, un suivi longitudinal de l’évolution de la maladie par prises de sang régulières évite la constitution de groupes de souris supplémentaires pour des points de cinétique intermédiaires additionnels.
Raffinement
Les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Un suivi régulier de l’état des animaux sera mis en œuvre, a minima de façon hebdomadaire lors des pesées ou plus régulièrement si nécessaire. Par ailleurs, un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les manipulations sur les animaux seront réalisées sur des temps courts par un personnel expérimenté, dans une pièce d’expérimentation dédiée distincte de la pièce d’hébergement où résident leurs congénères. Toutes les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant d’intégrer un protocole expérimental. Pour conserver une sociabilisation, les animaux d’une même fratrie seront hébergés à plusieurs au sein des cages. En cas de nécessité d’hébergement individuel lié à de l’agressivité de dominance, les cages disposeront d’un enrichissement approprié. Une anesthésie générale sera effectuée pour les injections ou les prélèvements retro-orbitaux et un anesthésique locorégional sera appliqué pour diminuer l’inconfort induit.
Choix des espèces
Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathologie humaine sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo les conséquences de l’absence d’expression au sein de l’hépatocyte d’une ou plusieurs protéines potentiellement impliquées dans la pathologie. D’ailleurs, des animaux génétiquement modifiés sont déjà disponibles auprès de la communauté scientifique pour cibler spécifiquement les protéines d’intérêts identifiées pour ce projet. Les souris seront incluses aux protocoles expérimentaux au stade d’adultes (8 semaines). En effet, la pathologie du foie gras (NASH) se développe essentiellement chez les adultes. L’âge est d’ailleurs un facteur de risque majeur dans le développement de la NASH.
Thérapie génique de la perte d’audition
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Toutes tuées à l'issue, y compris les reproducteurs transgéniques tués à six mois puis remplacés, 8 132 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour tester des vecteurs de thérapie génique contre la surdité. Elles subissent cinq à six tests auditifs sous anesthésie, des injections intrapéritonéales de tamoxifène et une chirurgie intracochléaire de vingt minutes. Le porteur reconnaît que cette chirurgie peut léser l'oreille injectée et faire perdre l'audition, tout en indiquant qu'il ne s'attend à aucun signe de souffrance ni d'inconfort, la surdité provoquée restant unilatérale. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, faute de pouvoir mettre en culture les systèmes auditifs périphérique et central.
Objectifs
Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.
Procédures
Les animaux des modèles de surdité seront soumis à des tests auditifs, au nombre de 5 à 6 maximum, avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à P16. Des animaux seront soumis à des injections avec une dose unique ou fragmentée (3 fois maximum sur une même semaine) par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui seront réalisées par voie intra cochléaire une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Pour réaliser nos analyses histologiques sur les oreilles internes, les animaux seront mis à mort. Post mortem nous prélèverons donc les cochlées pour évaluer infra cliniquement performances de nos stratégies de vectorisation.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire. De plus nous nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 0 et 21 jours après la naissance. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence.
Choix des espèces
Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.