Souris

À partir de huit semaines, 30 souris, dont douze nourries d'une alimentation enrichie en fer, sont suivies pendant environ douze mois et pesées toutes les deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit cinq examens d'IRM sous anesthésie gazeuse, de deux heures au maximum, précédés d'un jeûne d'une heure, avec un risque d'hypothermie, de sécheresse oculaire et, exceptionnellement, de décès sous anesthésie. Le porteur écrit qu'un passage en clinique exige des preuves obtenues in vivo "sur un modèle animal pertinent tel que la souris". Huit souris seront tuées en cours d'étude pour prélever leur foie, leur cœur, leurs reins et leur rate, les deux couples reproducteurs après quinze mois, et le sort des vingt-deux dernières, âgées de quatorze mois, reste suspendu à un avis vétérinaire, entre maintien en vie et mise à mort.

Objectifs

La surcharge en fer correspond à une accumulation excessive de fer dans l’organisme pouvant avoir différentes origines. Son importance dépend de la cause sous-jacente et de la durée d’évolution sans traitement. Souvent peu symptomatique au début, elle est généralement diagnostiquée tardivement. Le foie est l’un des premiers organes touchés. L’excès de fer peut entraîner des lésions hépatiques progressives, notamment une fibrose hépatique, caractérisée par une accumulation anormale de tissu cicatriciel. L’évaluation de cette fibrose est essentielle pour suivre l’évolution de la maladie et adapter la prise en charge des patients. La biopsie hépatique constitue actuellement l’examen de référence pour évaluer la fibrose. Cependant, elle est invasive, douloureuse et peut souffrir d’un biais d’échantillonnage, le prélèvement n’étant pas toujours représentatif de l’ensemble du foie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir des informations anatomiques, structurelles, fonctionnelles et biomécaniques sur les tissus. Parmi les techniques disponibles, l’élastographie par résonance magnétique (ERM) fournit une cartographie non invasive de la rigidité hépatique, paramètre étroitement lié au degré de fibrose. Toutefois, la présence d’une forte concentration de fer dans le foie constitue une limite importante de cette technique. Le taux d’échec de l’ERM augmente avec la quantité de fer présente, rendant difficile, voire impossible, l’évaluation de la fibrose chez les patients souffrant de surcharge ferrique. L’objectif de ce projet est de valider une méthode d’imagerie alternative (ERM-alt), développée au sein du laboratoire, permettant d’évaluer la fibrose hépatique même en présence de fer. La faisabilité de cette approche a déjà été démontrée sur des objets tests puis in vivo chez des souris saines. Il est désormais nécessaire de la valider chez des souris présentant différents niveaux de surcharge ferrique afin de confirmer sa robustesse et d’envisager son transfert vers la clinique. Ce projet porte ainsi sur la validation expérimentale d’une méthode innovante destinée à améliorer le diagnostic non invasif de la fibrose hépatique chez les patients atteints de surcharge en fer.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche translationnelle permettra : 1. De comparer les teneurs en fera quantité de fer dans le foie hépatique mesurées par IRM avec les valeurs histologiques (technique de référence) sur des cohortes de souris malades. 2. De comparer laes rigidité du foies hépatiques mesurées par IRM avec les stadifications stade de fibrose hépatiqueréalisées par obtenue par analyse histologiquee sur des cohortes de souris malades. 3. De déterminer les seuils de fer hépatique compatibles avec les techniques IRM et dDe montrer que la technique IRM (ERM-alt) développée au laboratoire permet de surmonter les problèmes limitations de la méthode classiquesoulevés par la présence importante de fer. Les résultats positifs sur souris serviront alors de base pour une étude clinique chez l’humain sur sujets sains dans un premier temps puis sur patients souffrant de surcharge ferrique. La méthode proposée sera et ainsi offrir clé pour pouvoir faire une solution non-invasive pour stadifier la stadification non-invasive de la fibrose hépatique chez ces patients, ce qui n’est pas possible aujourd’hui évitant ainsi une biopsie du foie.

Procédures

Un groupe recevra une alimentation enrichie en fer pendant environ 12 mois, tandis que l’autre groupe suivra une alimentation standard. À partir de l’âge de 8 semaines, les souris seront suivies pendant environ 12 mois. Elles seront pesées toutes les deux semaines afin de vérifier leur état de santé et le bon suivi du régime alimentaire. Les animaux seront soumis à 5 examens. Chaque examen durera au maximum 2 heures et sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Avant chaque examen d’IRM, les animaux seront soumis à un jeûne d’environ 1 heure afin de standardiser les conditions d’imagerie.

Impact sur les animaux

Certaines souris auront une modification génétique entraînant une accumulation progressive de fer dans l’organisme. Un groupe de 12 souris recevra une alimentation enrichie en fer afin d’augmenter cette accumulation au niveau du foie, ce qui devrait entraîner des modifications modérées de la rigidité du foie correspondant à un stade précoce de fibrose. Le retour à une alimentation standard devrait permettre une réduction du niveau de fer hépatique et une régression de la fibrose. Les animaux seront âgés de 14 mois à la fin du projet, ce qui pourrait induire des problèmes de santé liés simplement à la vieillesse. Pendant le transport entre l’établissement hébergeur et le laboratoire les animaux peuvent subir un stress temporaire. Pendant l’anesthésie et l’examen d’IRM, les animaux peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une sécheresse oculaire. Les examens seront répétés plusieurs fois au cours de l’étude, ce qui peut entraîner un stress modéré supplémentaire lié aux manipulations répétées. Comme pour toute procédure réalisée sous anesthésie, un risque très faible de décès pendant l’examen existe, bien que cela reste exceptionnel au regard de notre précédente expérience d’imagerie chez des souris saines.

Devenir

Huit animaux seront euthanasiés au cours de l’étude afin de prélever certains organes (foie, cœur, reins et rate) nécessaires à la réalisation d’analyses histologiques permettant d’évaluer l’accumulation de fer et les lésions hépatiques. Les deux couples reproducteurs utilisés pour la constitution de la colonie seront également euthanasiés à l’issue de la période de reproduction, soit environ 15 mois après le début du projet. Les 22 autres animaux (8 du groupe 1, 8 du groupe 2 et 6 du groupe 3) auront environ 14 mois à la fin de l’étude. Leur devenir sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire référent de l’établissement. En fonction de leur état de santé et de leur âge, ils pourront soit être maintenus en vie pour d’éventuels projets compatibles, soit être euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

De plus, pour pouvoir passer à une étude clinique, il est demandé des preuves de l’applicabilité de la méthode IRM développée (ERM-alt) in vivo sur un modèle animal pertinent tel que la souris.La fibrose hépatique est une maladie complexe qui se développe sur plusieurs années. Elle implique des interactions entre différentes cellules et une organisation très précise du tissu hépatique. Aujourd’hui, avec les technologies disponibles (comme les cultures de cellules ou les organoïdes en laboratoire), il est impossible de reproduire fidèlement tous ces mécanismes. Comme cette étude vise à valider une nouvelle méthode d’imagerie médicale par IRM pour évaluer la fibrose du foie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris, car ils permettent de reproduire les processus biologiques réels de la maladie. Enfin, avant de tester cette méthode sur l’humain, il faut d’abord prouver son efficacité et sa faisabilité in vivo, ce qui n’est possible qu’avec des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum au maximum pour chaque groupe sans compromettre l'interprétation des résultats suite à une analyse robuste des résultats par des tests statistiques non paramétriquespour garantir des résultats fiables en termes de significativité statistique. Cette estimation tient compte des prélèvements d’organes réalisés à des fins depour les biopsies et d’une éventuelle mortalité au cours du protocole. Cela permet de garantir que les objectifs scientifiques pourront être atteints sans avoir recours à des animaux supplémentaires ni d’interrompre l’étude en cours faute d’animaux en nombre suffisant. Le groupe contrôle (G3) est également constitué du stricte minimum (3 mâles et 3 femelles) permettant de comparer les résultats entre les groupes tout en respectant les différences liées au sexe.d’avoir des résultats comparatifs avec les groupes 1 et 2 en fonction du sexe. Enfin, pour éviter d’utiliser davantage d’animaux, les mêmes animaux seront suivis au cours du temps. Cela permet de suivre l’évolution de la maladie, sans avoir besoin d’une quantité élevée d’animaux.

Raffinement

Les souris du groupe 1 auront une alimentation riche en fer pour qu’elles développent une surcharge de fer dans le foie. Cette solution permet d’obtenir le modèle expérimental sans nécessité d’acte invasif. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse par isoflurane) et pourront durer jusqu’à 2 heures. Une goutte d’Ocrygel sera instillée dans chaque œil juste après l’installation de l’animal sur le lit IRM afin de limiter le dessèchement oculaire. Une couverture chauffante sera utilisée pour maintenir la température de l’animal tout le long de l’examen. Cette température ainsi que la respiration de la souris seront suivies pendant toute la durée de l’examen. L'apport en isoflurane sera couplé à un concentrateur d'oxygène pour favoriser la respiration de l'animal et sa récupération au réveil. En fin de procédure, si l'animal a été anesthésié plus de 2 heures, il recevra une injection sous cutanée de 0,5mL de sérum glucosé chauffé à température corporelle pour recevoir une réhydratation rapide et éviter une possible hypoglycémie. La phase de réveil se fera en isolement dans une cage à part, l’animal sera déposé sur un tapis chauffant évitant une hypothermie. Des points limites prédictifs et spécifiques de ce projet ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux, avec une surveillance adaptée à chaque étape de la procédure jusqu’à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Choix des espèces

Les modèles de souris restent accessiblessont et compatibles bien adaptées à une analyse surpour la recherche dans le domaine de l l’imagerie’IRM préclinique, notamment en IRM, à haut champ magnétique de 7T (plusieurs papiers références) . Les techniques IRM mise en œuvre dans cette demande de projet sont couramment pratiquées au sein du laboratoire sur des souris saines. La proximité génétique entre les souris et l’homme permet d’étudier des mécanismes biologiques comparables. L’utilisation de souris génétiquement modifiées déficientes en hepcidine1 permettra de se rapprocher au mieux des modifications physiopathologiques observées chez l’homme dans le cadre de pathologies caractérisées par une accumulation excessive de fer dans le foie (hémochromatose) pouvant mener à la formation de tissus cicatriciel au niveau du foie (fibrose hépatique). car elles présentent des similitudes biologiques avec l’homme, ce qui permet d’étudier des maladies du foie proches de celles observées chez les patients, notamment l’accumulation excessive de fer (hémochromatose) et le développement d’une fibrose hépatique Les souris des trois groupes suivront le protocole d’imagerie IRM à partir de 8 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire soit mature et que le foie ait également atteint une rigidité stabiliséeLes examens d’IRM commenceront lorsque les souris auront 8 semaines. À cet âge, leur organisme est suffisamment développé et le foie a atteint un état stable (démontrée lors d’une étude antérieure sur une petite cohorte). Pour le groupe recevant une alimentation riche en fer, ce régime débutera également à partir de la 8ᵉ semaine afin de coïncider avec le début du suivi par IRM. Le suivi par imagerie durera 12 mois afin d’observer progressivement différents niveaux d’accumulation de fer dans le foie selon les groupes étudiés, ainsi que les premiers stades de fibrose hépatique, sans provoquer d’atteintes sévères chez les animaux.

Des souris âgées de 18 mois et une lignée génétiquement modifiée qui, selon le porteur, n'existe que chez cette espèce : 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont identifiées par poinçon à l'oreille, 40 reçoivent en plus une puce implantée, toutes reçoivent une injection quotidienne pendant cinq jours et passent six mesures de composition corporelle par résonance magnétique. Soixante-douze d'entre elles jeûnent douze heures, ce que le porteur associe à une perte de 10 à 15 % du poids, avant une administration orale de glucose, six prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures et un test de vitesse maximale de trente minutes sur tapis roulant, puis des tests comportementaux dont il ne dit pas lesquels. Les 160 souris sont tuées en fin de projet, le porteur indiquant devoir prélever de nombreux tissus pour ses analyses moléculaires.

Objectifs

Le vieillissement se traduit par atrophie musculaire, c'est à dire une perte de la masse musculaire, conduisant à la perte d’autonomie des personnes et à l’augmentation de leur mortalité. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de ce phénomène est donc d’un intérêt clinique non négligeable. Cette perte musculaire affecte un type particulier de fibres, les fibres à contraction rapide. De plus, le vieillissement est également associé à une perturbation de la régulation du taux de sucre dans le sang avec une résistance à l’insuline. Notre projet à deux objectifs : 1) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perte de muscles induites par traitement aux glucocorticoïdes (médicaments anti-inflammatoires utilisés fréquemment) et au cours du vieillissement 2) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perturbation de la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang et résistance à l’insuline) qui apparait en en cas d’obésité ou au cours du vieillissement

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la perte de la fonction musculaire au cours du vieillissement pour permettre à plus long terme d’augmenter la qualité de vie (favoriser le bien vieillir). De plus, nous nous intéressons à la vulnérabilité des fibres musculaires à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours de différentes pathologies (cancers, infections, sclérose latérale amyotrophique, insuffisance cardiaque et la broncho-pneumopathie chronique obstructive) ainsi qu’en cas de jeûne ou d’hypoxie (manque d’oxygène). Nos résultats pourraient donc être aussi intéressants pour de nombreuses autres pathologies.

Procédures

Tous les 160 animaux seront identifiés par poinçon à l'oreille (1 fois, 2 secondes) ET 40 D’ENTRE EUX AURONT UNE IMPLANTATION D’UNE PUCE RFID (COMME LES PUCES VETERINAIRES). Ils seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 5 jours. Ils seront également soumis à des tests de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire (équivalent d'un IRM à l'hopital) (6 répartis sur l'ensemble du protocole, soit 6 x1min30 ). Ensuite, 88 animaux recevront aussi 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 7 jours ET PARMI EUX 40 RECEVRONT 1 DERNIERE INJECTION 30 MINUTES AVANT L'EUTHANASIE. Le reste des animaux (SOIT 72) subiront aussi une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte espacés sur 2 heures (5 secondes par prélèvement) ainsi qu'un test de vitesse maximale aérobie sur tapis (1 fois, 30min). 72 ANIMAUX SERONT ISOLES POUR UNE DUREE INFERIEURE A 48H. Ils seront également soumis à des tests comportementaux (3 fois 5 min et 3 fois 10 secondes).

Impact sur les animaux

Tous les animaux POURRONT RESSENTIR UNE DOULEUR LEGERE LORS DE LEUR IDENTIFICATION PAR MARQUAGE A L'OREILLE OU PAR PUCE. Ils subiront des tests non-invasifs pour caractériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur métabolisme. Ces tests pourront induire du stress. Les tests de capacités fonctionnelles sur les tapis pourraient engendrer du stress chez les animaux. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables du traitement avec les glucocorticoïdes sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement qui sera arrêté si un changement important de comportement est observé. Les animaux subiront un stress léger lié à la manipulation lors des tests de composition corporelle (2 minutes/semaine), de motricité (3 fois 5 min). Lors de la mesure du métabolisme respiratoire (48h) on peut attendre un stress modéré lié à l’individualisation nécessaire pour l’analyse. Pour le test de tolérance au glucose, on peut attendre une perte de poids de 10 à 15% liée au jeûne (12h sur la nuit, de 20h à 08h) et les animaux subiront une administration orale de glucose. Les prélèvements sanguins à la queue et le marquage à l'oreille induisent une douleur légère. Pour l'étude de l'influence d'un régime hypercalorique, qui reprend les mêmes tests mais sur des animaux ayant une nourriture plus riche, on attend les mêmes effets indésirables. Les injections induisent une douleur légère.

Devenir

Pour mener notre une étude et identifier les mécanismes d’interaction liant fonte musculaire, vieillissement, inflammation et obésité, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure. Cela nécessite d’euthanasier les animaux en fin de projet.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite qu’avec des animaux car il n’y a pas de modèles cellulaires alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibres musculaires. De plus le vieillissement et la résistance à l’insuline sont des problèmes pathologiques impliquant de nombreux facteurs et de nombreux organes ce qui ne permet pas non plus le remplacement par des méthodes in vitro.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel de calculs statistiques pour définir le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous utiliserons un seul groupe contrôle pour plusieurs procédures. L’utilisation des deux sexes nous permettra d’inclure tous les animaux à l’étude et d’éviter les mises à mort inutiles lors de la production des lots expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord 1 minute sans mouvement, puis 1 minute à vitesse réduite. L’habituation sera répétée 2 fois, espacées de 24h, avant le test. Le tapis roulant utilisé sera un nouveau modèle sur lequel l’utilisation de stimulation électrique pour motiver la souris à courir est remplacée par un système qui envoie de l’air sur l’arrière train de l’animal. De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque geste permettant d’éviter une trop grande fatigue, le stress ou la blessure. Par expérience nous n'avons jamais vu de blessure, cependant si c’était le cas, l’animal serait soigné et sorti du protocole. Chez les animaux obèses, la nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives. Pour le change et la réalisation des tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (2 min environ). Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des souris obèses, nous utiliserons la grille de score adaptée. ENFIN, LES ANIMAUX POURRONT ETRE MAINTENUS EN GROUPE LORS DE L'ANALYSE DE L'ACTIVITE EN VIDEO-TRACKING INFRA-ROUGE GRACE AU SYSTEME DEVELOPPE (4 ANIMAUX ANALYSES EN MEME TEMPS).

Choix des espèces

Les conditions de perte de muscles chez l’humain que nous souhaitons étudier plus précisément sont bien reproductibles dans le modèle souris. De plus, nous utiliserons un modèle génétiquement modifié qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. D'autre part, des souris âgées seront utilisées pour étudier la perte de muscle qui s’installe à partir de 18 mois.

La production des données précliniques exigées par la réglementation avant tout essai chez l'humain fait partie de la finalité déclarée de ce projet sur le syndrome de Sanfilippo de type B, aux côtés de l'évaluation d'une thérapie génique et d'un traitement anti-inflammatoire. 2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées par perfusion intracardiaque après anesthésie profonde pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1 320 reçoivent une injection dans la veine de la queue à l'état vigile, 660 subissent une chirurgie cérébrale de quarante minutes avec pose d'une canule guide, et 1 408 passent des tests d'anxiété, d'activité locomotrice et de reconnaissance d'objets. Le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet de suivre la biodistribution du vecteur et les réponses immunitaires, et écrit que les données de cette lignée murine sont "indispensable avant tout essai chez l'humain".

Objectifs

Le syndrome de Sanfilippo de type B (ou MPS IIIB) est une maladie pédiatrique génétique rare, touchant environ 0,5 naissance sur 100 000 en Europe. Elle est causée par un déficit d'une enzyme lysosomale qui entraîne l’accumulation de certaines molécules appelées oligosaccharides d’héparane sulfate dans le cerveau et d’autres tissus. Cette accumulation provoque des problèmes cellulaires, notamment un dysfonctionnement lysosomal, un stress oxydatif, une neuroinflammation et l’activation des cellules immunitaires du système nerveux, qui contribuent aux lésions neuronales et à la progression de la maladie. Les patients présentent un déclin intellectuel progressif et des troubles du comportement, avec une espérance de vie moyenne de 17 à 19 ans. Malgré les avancées en thérapie génique et en traitement enzymatique, aucun traitement ne permet aujourd’hui d'arrêter ou de ralentir l’évolution de la maladie. L’objectif de notre projet est de développer une approche thérapeutique pour le syndrome de Sanfilippo de type B, sur un modèle murin approprié, selon deux stratégies complémentaires : - Une thérapie génique, visant à restaurer l’activité enzymatique déficiente chez les enfants asymptomatiques, afin d’évaluer son potentiel curatif à un stade précoce de la maladie. - Un traitement anti-inflammatoire, destiné aux enfants non éligibles à la thérapie génique, visant à réduire la neuroinflammation, ralentir la progression des symptômes et améliorer la qualité de vie. Pour cela nous utiliserons le modèle de souris génétiquement modifiée MPSIIIB développé par le laboratoire Jackson. Il s'agit du seul modèle murin MPSIIIB qui reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine, notamment l'accumulation de HSO, la neuroinflammation, le déclin comportemental et la mort prématurée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de développer et d’évaluer deux stratégies thérapeutiques complémentaires pour le syndrome de Sanfilippo type B. L’utilisation du modèle murin MPSIIIB permettra d’obtenir des données précliniques essentielles pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces approches et indispensable avant tout essai chez l’humain. En effet, les données générées constituent un prérequis réglementaire pour toute application clinique. Au plus long terme, elles contribueront au développement de thérapies innovantes pour une maladie pédiatrique grave et actuellement incurable et à une meilleure compréhension des maladies lysosomales et neuroinflammatoires.

Procédures

Les interventions concerneront: 1) une injection IV dans la veine caudale sur animaux vigiles (1320 souris, chaque injection prend quelques minutes); 2) une injection intracerebroventriculaire un type de chirurgies sous anesthésie générale (660 animaux, 40 minutes); 3) traitement par alimentation pendant 21 jours; 4) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1408), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal); 5) un prélèvement sanguin à la veine caudale ou mandibulaire (sous anesthésie) pour test sérologique (2240 animaux, quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour l’injection IV, l’injection intraveineuse à la queue est susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans l’appareil de contention et/ou de la douleur chez l'animal sur une durée inférieure à cinq minutes. Pour l’injection ICV, malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Pendant les 48 premières heures post-chirurgie, l’injection intra-cérébrale et l’installation des canules guide peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration, anxiété et perte de poids. L'installation de la canule guide chez l'animal peut également entraîner de légères douleurs post-opératoires les premières 48 heures. Durant l'expérimentation, les animaux seront prélevés une ou deux fois en cours d'étude (prélèvement de sang) à la veine mandibulaire ou caudale, ce qui peut provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.

Devenir

A l'issue des 3 procédures, les 2244 souris seront mises à mort par perfusion intracardique après anesthésie profonde, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires (fibroblastes de patients MPSIIIB et lignée de microglie murine) qui ont démontré l’effet bénéfique des procédures thérapeutiques proposées dans ce projet. La thérapie génique et les traitements anti-inflammatoires agissent sur plusieurs tissus et impliquent des interactions immunitaires complexes. Seul un organisme entier permet de suivre la biodistribution du vecteur ou du traitement, d’évaluer l’efficacité dans le cerveau notamment par des tests de comportement et cognitifs, de mesurer les effets collatéraux ou indésirables, et d’observer les réponses immunitaires et inflammatoires au niveau systémique. Par conséquent, les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Une telle pertinence est essentielle pour garantir la robustesse des résultats et leur transposabilité dans des applications cliniques.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires pour les souris MPSIIIB et de 10 pour le groupe Wild-type. Pour les procédures 1 et 3, nous répéterons les expériences à 3 temps post-traitement différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour la procédure 2, nous répéterons les expériences à 5 temps post-traitement différents. Le calcul de puissance réalisé avec G*Power, basé sur une différence attendue de 20% entre groupes, une variabilité estimée à 15 % et une puissance de 70 %, indique un effectif nécessaire de 10 animaux par groupe. Pour le groupe MPSIIIB, nous prévoyons 12 souris par groupe afin de tenir compte d’une éventuelle mortalité ou exclusion. Ce nombre garantit la détection de l’effet recherché tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict minimum et avoir des résultats significatifs. Nous maximiserons également les données par animal : réalisation de multiples analyses (tests comportementaux, histologie, biologie moléculaire, analyses biochimiques...) sur les tissus prélevés afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Comme dans nos études précédentes, l’expérimentateur principal reste systématiquement en aveugle vis-à-vis du génotype et du traitement administré.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée soit par l’expérimentateur soit par le personnel de la zootechnie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48 heures se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - perte de poids >10 % du poids normal maintenue sur 72 heures ; -hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion; - lésion non résorbée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les soins; - infection non contrôlée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les antibiotiques. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement. Pour la procédure 2 – chirurgie pour injection intracérébrale et installation de la canule guide- un tapis chauffant sera positionné sous l’animal pendant l’anesthésie ainsi que sous la cage pour le réveil des animaux afin de prévenir l’hypothermie et un gel oculoprotecteur sera appliqué systématiquement aux souris anesthésiées afin de prévenir le dessèchement oculaire. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et par administration d'analgésique ( administrée 1 heure avant la chirurgie et toutes les 24 heures en fonction de l’état des souris dans les 48 heures postopératoires). La pose d'une canule guide va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'elle implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la canule guide sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré-, per- et post-opératoire. Enfin, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés, spécifiquement la souris MPSIIIB. Cette souche mutée pour l’enzyme lysosomale est le seul modèle à reproduire fidèlement les caractéristiques humaines : accumulation d’héparane sulfate, dysfonction lysosomale, neuroinflammation, troubles cognitifs et comportementaux et réduction de l’espérance de vie. De plus, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, une très bonne adaptation aux conditions expérimentales et surtout être un modèle de choix pour les études comportementales. Les animaux seront utilisés à 1 mois, ce qui correspond à l’âge avant l’apparition des symptômes de la maladie pour mimer l’état des patients asymptomatiques qui seront éligibles à ce type de traitement (thérapie génique). De plus, ça permet de laisser 1 semaine entre le sevrage et le début de l’expérimentation pour limiter le stress dû au sevrage. les animaux seront également utilisés à partir de 2 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Et des animaux seront utilisés à partir de 21 jours afin d'étudier l’efficacité de la modulation de l’inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire.

Huit souris seront tuées en cours d'étude pour prélever foie, cœur, reins et rate, les deux couples reproducteurs après la période de reproduction, et le sort des autres, âgées de 14 mois à la fin, reste ouvert : le porteur écrit qu'elles pourront être maintenues en vie pour d'éventuels projets compatibles ou être tuées. Le champ structuré du résumé annonce pourtant 4 mises à mort et 26 réutilisations sur 30 souris, un décompte que cette narration ne recoupe pas. Certaines sont génétiquement modifiées pour accumuler du fer, douze reçoivent une alimentation enrichie en fer pendant environ douze mois, et toutes passent cinq examens d'IRM sous anesthésie gazeuse pouvant durer deux heures, précédés d'un jeûne, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que la faisabilité de sa méthode d'imagerie est déjà démontrée chez des souris saines et qu'il est désormais "nécessaire" de la valider chez des souris en surcharge de fer.

Objectifs

La surcharge en fer correspond à une accumulation excessive de fer dans l’organisme pouvant avoir différentes origines. Son importance dépend de la cause sous-jacente et de la durée d’évolution sans traitement. Souvent peu symptomatique au début, elle est généralement diagnostiquée tardivement. Le foie est l’un des premiers organes touchés. L’excès de fer peut entraîner des lésions hépatiques progressives, notamment une fibrose hépatique, caractérisée par une accumulation anormale de tissu cicatriciel. L’évaluation de cette fibrose est essentielle pour suivre l’évolution de la maladie et adapter la prise en charge des patients. La biopsie hépatique constitue actuellement l’examen de référence pour évaluer la fibrose. Cependant, elle est invasive, douloureuse et peut souffrir d’un biais d’échantillonnage, le prélèvement n’étant pas toujours représentatif de l’ensemble du foie. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir des informations anatomiques, structurelles, fonctionnelles et biomécaniques sur les tissus. Parmi les techniques disponibles, l’élastographie par résonance magnétique (ERM) fournit une cartographie non invasive de la rigidité hépatique, paramètre étroitement lié au degré de fibrose. Toutefois, la présence d’une forte concentration de fer dans le foie constitue une limite importante de cette technique. Le taux d’échec de l’ERM augmente avec la quantité de fer présente, rendant difficile, voire impossible, l’évaluation de la fibrose chez les patients souffrant de surcharge ferrique. L’objectif de ce projet est de valider une méthode d’imagerie alternative (ERM-alt), développée au sein du laboratoire, permettant d’évaluer la fibrose hépatique même en présence de fer. La faisabilité de cette approche a déjà été démontrée sur des objets tests puis in vivo chez des souris saines. Il est désormais nécessaire de la valider chez des souris présentant différents niveaux de surcharge ferrique afin de confirmer sa robustesse et d’envisager son transfert vers la clinique. Ce projet porte ainsi sur la validation expérimentale d’une méthode innovante destinée à améliorer le diagnostic non invasif de la fibrose hépatique chez les patients atteints de surcharge en fer.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche translationnelle permettra : 1. De comparer les teneurs en fera quantité de fer dans le foie hépatique mesurées par IRM avec les valeurs histologiques (technique de référence) sur des cohortes de souris malades. 2. De comparer laes rigidité du foies hépatiques mesurées par IRM avec les stadifications stade de fibrose hépatiqueréalisées par obtenue par analyse histologiquee sur des cohortes de souris malades. 3. De déterminer les seuils de fer hépatique compatibles avec les techniques IRM et dDe montrer que la technique IRM (ERM-alt) développée au laboratoire permet de surmonter les problèmes limitations de la méthode classiquesoulevés par la présence importante de fer. Les résultats positifs sur souris serviront alors de base pour une étude clinique chez l’humain sur sujets sains dans un premier temps puis sur patients souffrant de surcharge ferrique. La méthode proposée sera et ainsi offrir clé pour pouvoir faire une solution non-invasive pour stadifier la stadification non-invasive de la fibrose hépatique chez ces patients, ce qui n’est pas possible aujourd’hui évitant ainsi une biopsie du foie.

Procédures

Un groupe recevra une alimentation enrichie en fer pendant environ 12 mois, tandis que l’autre groupe suivra une alimentation standard. À partir de l’âge de 8 semaines, les souris seront suivies pendant environ 12 mois. Elles seront pesées toutes les deux semaines afin de vérifier leur état de santé et le bon suivi du régime alimentaire. Les animaux seront soumis à 5 examens. Chaque examen durera au maximum 2 heures et sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Avant chaque examen d’IRM, les animaux seront soumis à un jeûne d’environ 1 heure afin de standardiser les conditions d’imagerie.

Impact sur les animaux

Certaines souris auront une modification génétique entraînant une accumulation progressive de fer dans l’organisme. Un groupe de 12 souris recevra une alimentation enrichie en fer afin d’augmenter cette accumulation au niveau du foie, ce qui devrait entraîner des modifications modérées de la rigidité du foie correspondant à un stade précoce de fibrose. Le retour à une alimentation standard devrait permettre une réduction du niveau de fer hépatique et une régression de la fibrose. Les animaux seront âgés de 14 mois à la fin du projet, ce qui pourrait induire des problèmes de santé liés simplement à la vieillesse. Pendant le transport entre l’établissement hébergeur et le laboratoire les animaux peuvent subir un stress temporaire. Pendant l’anesthésie et l’examen d’IRM, les animaux peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une sécheresse oculaire. Les examens seront répétés plusieurs fois au cours de l’étude, ce qui peut entraîner un stress modéré supplémentaire lié aux manipulations répétées. Comme pour toute procédure réalisée sous anesthésie, un risque très faible de décès pendant l’examen existe, bien que cela reste exceptionnel au regard de notre précédente expérience d’imagerie chez des souris saines.

Devenir

Huit animaux seront euthanasiés au cours de l’étude afin de prélever certains organes (foie, cœur, reins et rate) nécessaires à la réalisation d’analyses histologiques permettant d’évaluer l’accumulation de fer et les lésions hépatiques. Les deux couples reproducteurs utilisés pour la constitution de la colonie seront également euthanasiés à l’issue de la période de reproduction, soit environ 15 mois après le début du projet. Les 22 autres animaux (8 du groupe 1, 8 du groupe 2 et 6 du groupe 3) auront environ 14 mois à la fin de l’étude. Leur devenir sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire référent de l’établissement. En fonction de leur état de santé et de leur âge, ils pourront soit être maintenus en vie pour d’éventuels projets compatibles, soit être euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur.

Remplacement

De plus, pour pouvoir passer à une étude clinique, il est demandé des preuves de l’applicabilité de la méthode IRM développée (ERM-alt) in vivo sur un modèle animal pertinent tel que la souris.La fibrose hépatique est une maladie complexe qui se développe sur plusieurs années. Elle implique des interactions entre différentes cellules et une organisation très précise du tissu hépatique. Aujourd’hui, avec les technologies disponibles (comme les cultures de cellules ou les organoïdes en laboratoire), il est impossible de reproduire fidèlement tous ces mécanismes. Comme cette étude vise à valider une nouvelle méthode d’imagerie médicale par IRM pour évaluer la fibrose du foie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris, car ils permettent de reproduire les processus biologiques réels de la maladie. Enfin, avant de tester cette méthode sur l’humain, il faut d’abord prouver son efficacité et sa faisabilité in vivo, ce qui n’est possible qu’avec des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum au maximum pour chaque groupe sans compromettre l'interprétation des résultats suite à une analyse robuste des résultats par des tests statistiques non paramétriquespour garantir des résultats fiables en termes de significativité statistique. Cette estimation tient compte des prélèvements d’organes réalisés à des fins depour les biopsies et d’une éventuelle mortalité au cours du protocole. Cela permet de garantir que les objectifs scientifiques pourront être atteints sans avoir recours à des animaux supplémentaires ni d’interrompre l’étude en cours faute d’animaux en nombre suffisant. Le groupe contrôle (G3) est également constitué du stricte minimum (3 mâles et 3 femelles) permettant de comparer les résultats entre les groupes tout en respectant les différences liées au sexe.d’avoir des résultats comparatifs avec les groupes 1 et 2 en fonction du sexe. Enfin, pour éviter d’utiliser davantage d’animaux, les mêmes animaux seront suivis au cours du temps. Cela permet de suivre l’évolution de la maladie, sans avoir besoin d’une quantité élevée d’animaux.

Raffinement

Les souris du groupe 1 auront une alimentation riche en fer pour qu’elles développent une surcharge de fer dans le foie. Cette solution permet d’obtenir le modèle expérimental sans nécessité d’acte invasif. Les examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse par isoflurane) et pourront durer jusqu’à 2 heures. Une goutte d’Ocrygel sera instillée dans chaque œil juste après l’installation de l’animal sur le lit IRM afin de limiter le dessèchement oculaire. Une couverture chauffante sera utilisée pour maintenir la température de l’animal tout le long de l’examen. Cette température ainsi que la respiration de la souris seront suivies pendant toute la durée de l’examen. L'apport en isoflurane sera couplé à un concentrateur d'oxygène pour favoriser la respiration de l'animal et sa récupération au réveil. En fin de procédure, si l'animal a été anesthésié plus de 2 heures, il recevra une injection sous cutanée de 0,5mL de sérum glucosé chauffé à température corporelle pour recevoir une réhydratation rapide et éviter une possible hypoglycémie. La phase de réveil se fera en isolement dans une cage à part, l’animal sera déposé sur un tapis chauffant évitant une hypothermie. Des points limites prédictifs et spécifiques de ce projet ont été établis afin d'anticiper tout effet dommageable sur les animaux, avec une surveillance adaptée à chaque étape de la procédure jusqu’à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Choix des espèces

Les modèles de souris restent accessiblessont et compatibles bien adaptées à une analyse surpour la recherche dans le domaine de l l’imagerie’IRM préclinique, notamment en IRM, à haut champ magnétique de 7T (plusieurs papiers références) . Les techniques IRM mise en œuvre dans cette demande de projet sont couramment pratiquées au sein du laboratoire sur des souris saines. La proximité génétique entre les souris et l’homme permet d’étudier des mécanismes biologiques comparables. L’utilisation de souris génétiquement modifiées déficientes en hepcidine1 permettra de se rapprocher au mieux des modifications physiopathologiques observées chez l’homme dans le cadre de pathologies caractérisées par une accumulation excessive de fer dans le foie (hémochromatose) pouvant mener à la formation de tissus cicatriciel au niveau du foie (fibrose hépatique). car elles présentent des similitudes biologiques avec l’homme, ce qui permet d’étudier des maladies du foie proches de celles observées chez les patients, notamment l’accumulation excessive de fer (hémochromatose) et le développement d’une fibrose hépatique Les souris des trois groupes suivront le protocole d’imagerie IRM à partir de 8 semaines afin de s’assurer que le système immunitaire soit mature et que le foie ait également atteint une rigidité stabiliséeLes examens d’IRM commenceront lorsque les souris auront 8 semaines. À cet âge, leur organisme est suffisamment développé et le foie a atteint un état stable (démontrée lors d’une étude antérieure sur une petite cohorte). Pour le groupe recevant une alimentation riche en fer, ce régime débutera également à partir de la 8ᵉ semaine afin de coïncider avec le début du suivi par IRM. Le suivi par imagerie durera 12 mois afin d’observer progressivement différents niveaux d’accumulation de fer dans le foie selon les groupes étudiés, ainsi que les premiers stades de fibrose hépatique, sans provoquer d’atteintes sévères chez les animaux.