Souris
Validation préclinique in vivo d’une nouvelle méthode de thérapie cellulaire destinée à réduire la réponse auto-immune dans un modèle murin de diabète de type 1.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Jusqu'à quinze ponctions de la veine de la queue, quinze injections d'anesthésiant, quinze injections de son antagoniste et treize prélèvements sanguins par souris : 2 688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux injections de streptozotocine leur provoquent un diabète, avec perte de poids rapide, diarrhée et une hyperglycémie que le porteur qualifie de potentiellement létale, avant une chirurgie de trente minutes pour greffer des îlots pancréatiques et l'injection intraveineuse de lymphocytes dirigés contre ces cellules. Le porteur décrit une mise à mort indolore, réalisée selon des méthodes "garantissant que les animaux ne souffrent pas", dans des procédures qu'il déclare par ailleurs de gravité sévère. La justification de l'effectif tient en une phrase, un calcul par logiciel statistique, sans qu'aucun nombre par groupe ne soit donné pour ces 2 688 souris.
Objectifs
Dans la pratique clinique, la production et la transplantation de structures pancréatiques sécrétrices d’insuline (îlots pancréatiques) dérivées de cellules souches constituent une option thérapeutique prometteuse pour les patients atteints de diabète de type 1. Cette approche permet de restaurer la production physiologique d’insuline et d’améliorer le contrôle de la glycémie. Cependant, la récidive de la maladie après la greffe demeure un obstacle majeur et nécessite le recours à un traitement immunosuppresseur important, associé à de nombreux effets secondaires. En effet, certaines cellules du système immunitaire continuent, en l’absence de blocage pharmacologique efficace, à attaquer les cellules productrices d’insuline après la transplantation. Cette réaction entraîne progressivement la destruction des cellules transplantées, provoquant une perte de fonction du greffon et le retour de l’hyperglycémie. Ces limitations soulignent la nécessité de développer de nouvelles stratégies visant à protéger les cellules greffées contre l’attaque immunitaire. Dans ce contexte, notre laboratoire a mis au point une approche innovante consistant à modifier certaines protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire par le système immunitaire. L’objectif est de rendre les cellules greffées moins visibles aux lymphocytes responsables de leur destruction, sans recourir à un traitement immunosuppresseur pharmacologique. Nos résultats préliminaires obtenus in vitro montrent que ces cellules génétiquement modifiées échappent à la reconnaissance et à la destruction par les systeme immunitaire du receveur, sans traitement pharmacologique. Ces résultats prometteurs ont conduit au dépôt d’un brevet et nécessitent désormais une validation dans un modèle murin pertinent. Cette étude permettra d’évaluer la capacité de nos îlots dérivés de cellules pluripotentes génétiquement modifiées à résister à l’attaque immunitaire tout en conservant leur capacité à sécréter l’insuline.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de confirmer l’efficacité de notre technique de modification génétique dans la production d’ilots pancréatiques fonctionnels et protégés de l’agression auto-immune du diabète de type I, ouvrant ainsi la possibilité de greffer les patients sans besoin de thérapies immunodépressive qui sont souvent accompagnées d’effets secondaires lourds, mais aussi d’améliorer le rendement de la greffe elle-même en limitant le rejet.
Procédures
Pendant la procédure, les souris recevront au total : - deux injections de streptozotocine afin d’induire le diabète (1 minute chacune) ; - une procédure chirurgicale (30 minutes) ; - une injection intraveineuse de lymphocytes réactifs contre les cellules pancréatiques (2 minutes) ; - un maximum de 15 injections sous-cutanées d’anesthésiant avant les analyses intravitales (1 minute chacune) ; - un maximum de 15 ponctionnes de la veine caudale sur souris vigiles pour suivi de la glycémie lors de l’induction du diabètes (10 secondes chacune); - un maximum de 15 injections intrapéritonéales d’antagoniste de l’anesthésiant après les analyses (1 minute chacune) ; - un maximum 13 prélèvements sanguins de 100 µL au niveau de la veine submandibulaire sur souris vigiles (une fois par semaine, 10 secondes chacun).
Impact sur les animaux
Les nuisances et complications éventuelles de la procédure incluent : (1) Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, les prélèvement de sang et la période de jeun avant injection de la Streptozotocine; (2) Les souris pourront développer des effets indésirables aigües lié au traitement STZ (perte de pois rapide, diarrhée) et des effets indésirables chroniques typique du diabète (hyperglycémie potentiellement létale, perte de poids progressive) , qui seront monitorés régulièrement; (3) Des complications peuvent survenir au cours et après la procédure chirurgicale, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe ou du site de l'injection des cellules et des médicaments. Ces complications sont rares (
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de l’expérience est nécessaire pour pouvoir analyser précisément les cellules injectées dans les tissus. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants sans leur causer de souffrance importante ou sans compromettre la qualité des résultats scientifiques. Les animaux sont euthanasiés de manière indolore : ils reçoiveront d’abord un traitement pour limiter toute gêne, puis une anesthésie profonde avant le prélèvement des échantillons. Cette procédure sera réalisée selon des méthodesreconnues, garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Remplacement
Les expériences réalisées en laboratoire ont permis de démontrer l’efficacité de notre approche, mais elles ne reproduisent qu’une partie du fonctionnement réel du système immunitaire, qui reste beaucoup plus complexe dans un organisme vivant. Seule l’utilisation d’un modèle in vivo permet de prendre en compte l’ensemble des phénomènes physiologiques liés à la greffe et au diabète, comme le manque temporaire d’oxygène des tissus, la reformation des vaisseaux sanguins autour du greffon ou encore les déséquilibres métaboliques. Tous ces éléments peuvent influencer l’efficacité réelle de notre stratégie de protection des cellules transplantées.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans l'étude est strictement calculé avec le logiciel statistique reconnu pour obtenir des résultats statistiquement concluants, tout en réduisant au maximum le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5 à 6, dans des cages enrichies afin de favoriser leur bien-être. Ils feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel animalier et les expérimentateurs, avec une attention portée à leur comportement, leur apparence et à l’apparition d’éventuels signes cliniques. Les souris immunodéficientes seront maintenues dans des conditions sanitaires renforcées afin de les protéger des infections. Elles seront hébergées dans des cages ventilées et manipulées dans un environnement stérile, selon des procédures spécifiques distinctes de celles des autres animaux. Les interventions chirurgicales seront réalisées dans des conditions limitant au maximum les risques d’infection et d’inconfort, avec désinfection du site opératoire, matériel stérile et maintien des animaux sur tapis chauffant pendant l’anesthésie. Une attention particulière sera portée au suivi des souris diabétiques, notamment au contrôle du poids, de la glycémie et à la surveillance de la cicatrisation, grâce à une grille d’évaluation adaptée permettant une prise en charge rapide en cas de besoin.
Choix des espèces
À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ni expérience réalisée uniquement en laboratoire ne permet de reproduire toute la complexité du système immunitaire et ses interactions dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle chez la souris est donc indispensable pour étudier la réaction du système immunitaire face aux cellules transplantés dans un contexte proche du diabète de type 1, notamment l’attaque des cellules produisant l’insuline par des cellules immunitaires issus de patients diabétiques. Cette étape est essentielle avant d’envisager une application chez l’être humain. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Le choix d’animaux adultes permet de travailler avec un organisme physiologiquement stable, ce qui améliore la fiabilité et la reproductibilité des résultats en limitant les variations liées à la croissance et au développement.
Evaluation de l’immunogénicité de candidats vaccins contre le virus Nipah dans le modèle de la souris 129/S2SvPas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Sept groupes de douze souris, six mâles et six femelles, chacun recevant un vaccin candidat différent contre le virus Nipah : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur sang et leur rate. La moitié de chaque groupe est tuée quinze jours après une injection unique, l'autre moitié reçoit une seconde injection à trente jours et est tuée quinze jours plus tard. Les souris sont identifiées par des encoches pratiquées dans les oreilles, geste qui provoque selon le porteur une douleur et un stress légers, et les prélèvements sanguins se font sous la mâchoire. Le projet ne mesure que l'immunogénicité, l'ampleur et la nature des réponses en anticorps et en lymphocytes, la protection réelle contre ce virus restant à établir dans des travaux ultérieurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer parmi les six candidats vaccins développés quels sont les plus immunogènes contre les antigènes majeurs du virus Nipah.
Bénéfices attendus
L’efficacité de la plateforme vaccinale utilisée dans ce projet a déjà été démontrée contre un premier virus très pathogène chez l’Homme. Cette plateforme a été utilisée à nouveau pour mettre au point différents candidats vaccins contre le virus Nipah, un virus hautement pathogène chez l’Homme. Grâce à l’analyse des prélèvements réalisés sur les animaux après chacune des deux injections de vaccins, nous pourrons mesurer l’évolution des réponses immunes aux antigènes du virus Nipah pour chaque vaccin et également comparer qualitativement et quantitativement ces différentes réponses immunes entre les vaccins. L’ensemble des résultats obtenus permettra de déterminer quels sont les vaccins les plus immunogènes, donc les plus susceptibles de protéger contre ce virus.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - Une identification (quelques secondes ) au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - La moitié des animaux subira une injection intrapéritonéale de vaccin, l’autre moitié subira deux injections de vaccin (injections durent quelques secondes réalisées à un mois d’écart). - Un prélèvement sanguin submandibulaire (quelques secondes) sera pratiqué sur tous les animaux quinze jour après chaque injection de vaccin.
Impact sur les animaux
L’identification des souris sera réalisée par des encoches aux oreilles ce qui peut provoquer une douleur et un stress léger chez les animaux. Des vaccins utilisant la même plateforme vaccinale ont déjà été utilisés chez la souris et aucun effets secondaires liés aux injections n’a été constaté. Les injections des vaccins peuvent néanmoins provoquer un stress, une douleur et un inconfort de sévérité légère et de courte durée. La manipulation des animaux peut induire une peur ou un stress physique de même que le prélèvement sanguin submandibulaire peut entrainer une douleur locale légère de courte durée liée à l’introduction de l’aiguille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au cours de la procédure car leur sang et leur rate doivent être prélevés pour analyser les réponses immunitaires aux vaccins inoculés.
Remplacement
Les réponses immunes à des antigènes sont un ensemble de mécanismes cellulaires répartis dans de nombreux types de cellules immunitaires au sein de différents organes et qui évoluent au cours du temps. Il est impossible à l’heure actuelle de reproduire par des expérimentations in vitro ces réponses immunitaires. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour tester l’immunogénicité de candidats vaccins.
Réduction
Ce projet implique 7 groupes de 12 animaux chacun constitué de 6 mâles et 6 femelles. Chaque groupe sera inoculé avec un vaccin différent. La moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort 15 jours après la première inoculation pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires à la vaccination. L’autre moitié des animaux recevra une seconde injection 30 jours après la première injection et sera mise à mort 15 jours plus tard pour effectuer des prélèvements qui permettront de mesurer les réponses immunitaires après une seconde vaccination. La mise à mort de six animaux par groupe (3 femelles et 3 males) après chaque vaccination constitue un effectif minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser ainsi des tests statistiques robustes de comparaison de groupes (one way anova principalement) et pour s’assurer également que les résultats obtenus ne sont pas dépendants du sexe des animaux. Les résultats obtenus lors d’un précédent protocole basé sur des effectifs identiques ont montré que les résultats des mesures des paramètres immunitaires obtenus à partir des prélèvements sur les animaux pouvaient être assez dispersés mais que les effectifs étaient suffisants pour réaliser ces tests statistiques. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des résultats, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour comparer l’immunogénicité de ces vaccins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé, conçu pour garantir leur bien-être et limiter tout risque de perturbation extérieure. Leur habitat sera régulièrement nettoyé et stérilisé, et leur alimentation ainsi que leur hydratation seront adaptées pour répondre à leurs besoins physiologiques. Des mesures spécifiques seront mises en place pour enrichir leur environnement (matériaux de nidification, cachettes, etc.) et favoriser leur confort, notamment en cas de besoin accru en eau ou en chaleur. Lors des manipulations (injections, prélèvements), des précautions rigoureuses seront prises pour minimiser les risques d’inconfort ou d’infection. Les zones concernées seront désinfectées avant et après chaque intervention, et les gestes techniques seront réalisés dans des conditions optimales de sécurité. En cas de réaction locale (rougeur, gonflement) au point d’injection, des soins adaptés (nettoyage antiseptique) seront appliqués sans délai. Un suivi quotidien sera assuré, avec une attention particulière dans les jours suivant chaque vaccination. Les animaux seront observés pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de modification de leur état général (perte d’appétit, changement de comportement, altération de l’apparence). En cas de perte de poids supérieure à 10 % par rapport au poids initial, ou d’apparition de signes cliniques persistants tels que la prostration, la fermeture partielle des yeux ou une inflammation locale au site d’injection, les animaux seront mis à mort. L’ensemble de ces mesures vise à garantir le respect des animaux tout au long du projet, en appliquant les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) et en s’appuyant sur les bonnes pratiques reconnues en matière de bien-être animal.
Choix des espèces
La lignée de souris utilisée est un modèle largement employé pour analyser les réponses immunes induites par des vecteurs vaccinaux et que nous avons déjà utilisé. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Nouvelle thérapie anti-inflammatoire dans des modèles murins de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Une ouverture de la peau du cou pour injecter un agent inflammatoire directement dans la trachée, jusqu'à cinq injections par semaine, et une nécrose possible de la queue après les injections répétées de bléomycine : 1 868 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Dans les protocoles longs, elles développent une fibrose pulmonaire, des difficultés respiratoires et une perte de poids importante, tout en recevant un traitement trois fois par semaine pendant trois semaines et un prélèvement sanguin hebdomadaire sur animal vigile. Le projet teste des molécules censées bloquer l'installation de l'inflammation, présentées comme une réponse à la résistance qui apparaît chez 30 % des patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique après six mois de traitement. Le calcul annoncé porte sur vingt-deux souris par groupe, sans que le total de 1 868 souris soit rapporté au nombre de groupes prévus.
Objectifs
Les bronchopneumopathies chroniques obstructives (BPCO) ont une incidence en constante augmentation ce qui en fait la 3eme cause de mortalité dans le monde. Les BPCO sont caractérisées par une diminution progressive et irréversible des capacités respiratoires associée à une réponse inflammatoire chronique. Elles sont à l’origine d’obstruction des voies respiratoires et d’emphysème. Les traitements actuels ne peuvent que ralentir l’évolution de la maladie à l’aide d’une prise en charge multidisciplinaire (arrêt tabac, réhabilitation respiratoire) associée à des molécules non-spécifiques. Ces dernières années, de gros progrès ont été faits dans la compréhension de la réponse immunitaire et il est évident aujourd’hui que le système immunitaire, qui est le principal acteur dans les maladies inflammatoires, est une cible prometteuse. Les nouvelles stratégies d’immunothérapies cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires. Ces approches vont cibler des populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. De nouvelles cibles ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de l'inflammation. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer une de ces cibles et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de fibroses pulmonaires
Bénéfices attendus
Les traitements actuels utilisés contre les Fibroses Pulmonaires Idiopathiques font appel à des traitements de type anti-fibrotique limitant l’installation de la fibrose pulmonaire et ralentissant le déclin respiratoire. Une résistance à ces traitements apparait chez 30% des patients au bout de 6 mois de traitements. De plus le changement de traitement par un nouvel anti-fibrotique n’améliore pas la survie de ces patients, montrant une désensibilisation des patients à ce type de traitements. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules diminuent l’installation de l’inflammation et permettraient potentiellement de ralentir l’installation de la fibrose et d’améliorer les fonctions respiratoires. Chez l’animal nous espérons diminuer l’infiltration pulmonaire aux temps précoce et diminuer l’installation de fibrose au temps tardif du modèle. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle voie thérapeutique.
Procédures
Les agents inducteurs seront injectés sur animaux anesthésiés et analgésiés, allant d'une injection à 5 injections par semaine par différentes voies d'administrations . Les traitements seront administrés 3 fois par semaines sur une durée de 3 semaines. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigile (1 fois par semaine maximum tout au long du protocole).
Impact sur les animaux
L’injection intratrachéale induira de la douleur chez l’animal dû à l’ouverture de la peau du cou puis à l’injection d’un agent inflammatoire dans la trachée. Dépendant du modèle, l’inflammation pulmonaire sera de courte durée (24h) où de longue durée (J28) avec pour les modèles longs des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire ainsi qu’une perte de poids significative mais contrôlé. L’injection en intraveineuse de bléomycine (Ajout) ou de cellules humaines sur animaux vigiles engendrera une douleur modérée lors de l’injection ainsi qu’une nécrose possible de la queue à la suite des injections répétées de bleomycine sur ce site. Ce modèle induira une perte de poids ainsi que des difficultés respiratoires dû à l’installation de la fibrose pulmonaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses
Remplacement
Le meilleur moyen pour étudier le rôle d'une molécule sur une réponse immune qui est complexe et qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires est in vivo et ce en utilisant des animaux. En effet, nos molécules d’intérêt pouvant être exprimées par de nombreux types cellulaires et jouant un rôle sur de nombreux acteurs de l'immunité, il n'est pas possible de reconstituer un modèle de dommage tissulaire et d'étudier l'homéostasie d'un tissu dans des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 2 études pilotes permettront de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant validé le plus de critères de la pathologie et le moins de nuisances sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire.
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront de l'analgésique 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton
Choix des espèces
Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.
Détermination chez la souris des impacts sur la croissance squelettique, dont l’éruption dentaire, de certains agents pharmacologiques utilisés en pédiatrie et/ou d’agents chimiques auxquels peuvent être exposés les jeunes enfants.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Sept cents souriceaux seront tués pour étudier leur squelette et leur éruption dentaire, les cent mères étant gardées en vie pour être réutilisées. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souriceaux reçoivent quatre injections d'agents pharmacologiques ou chimiques sous anesthésie gazeuse pendant leur première semaine de vie, leurs mères étant anesthésiées à chaque séance et hébergées seules pendant les cinq jours précédant la mise bas, et le porteur signale que la manipulation des nouveau-nés peut conduire la mère à rejeter sa portée. Les agents testés sont choisis à partir d'un questionnaire d'exposition rempli par des patients, et le porteur écrit qu'aucun dispositif in vitro ne peut recréer "la complexité d'un organisme entier en croissance".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer les impacts sur la croissance squelettique, en particulier l’éruption dentaire, de certains agents pharmacologiques utilisés en pédiatrie et/ou d’agents chimiques auxquels peuvent être exposés les jeunes enfants. Ces dernières années une augmentation des défauts d’éruption dentaire nommés rétentions primaires a été observée en clinique et la question de l’origine de ces défauts s’est posée. A côté de l’origine génétique observée pour certains patients avec présence de mutations génétiques, une origine environnementale est suspectée correspondant à une exposition à des agents pharmacologiques ou chimiques pendant l’enfance, plus spécifiquement entre 3 et 12 ans. Les agents à évaluer seront donc déterminer à partir d’un questionnaire d’exposition remplit par chaque patient listant les traitements pharmacologiques reçus ainsi que les expositions possibles à des agents chimiques selon le(s) lieu(x) de résidence pendant cette période. La finalité est d’identifier les agents induisant des défauts primaires d’éruption afin d’anticiper leur survenu et de les prendre en charge cliniquement avant qu’ils s’installent irréversiblement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir les agents pharmacologiques et les autres agents chimiques ayant un impact sur la croissance squelettique et plus spécifiquement l’éruption dentaire lorsque des enfants y sont exposés entre 3 et 12 ans. La prévalence de l'ensemble des rétentions dentaires primaires est estimé à 1/500 et le coût sociétal est difficilement quantifiable mais sans aucun doute important. Le but de ce projet n’est pas de remettre en cause l’utilisation de certains agents pharmacologiques dont l’intérêt pour les jeunes patients n’est plus à démontrer (antibiotiques, agents de chimiothérapie…) mais d’identifier leur possibles effets « secondaires » sur le squelette en croissance afin de pouvoir les prendre en charge le plus tôt possible avant que ces effets deviennent irréversibles.
Procédures
Les femelles gestantes seront en hébergement individuel pendant 5 jours (5 jours d'acclimatation correspondant à la fin de gestation ). Les souriceaux recevront une injection sous anesthésie (4 fois, durée de l'acte moins d'une minutes) sur tapis chauffant. Les mères ne recevront aucune injection. Les mères seront anesthésiées 4 fois correspondant aux séances d'injection (anesthésie gazeuse légère inférieure 10 minutes) sur tapis chauffant.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles sont : (i) les manipulations des souriceaux, surtout dans les premiers jours de vie, qui peuvent induire un stress chez la mère pouvant aboutir au rejet des petits, (ii) les injections qui pourront induire une douleur de courte durée aux animaux, (iii) les nuisances liées à l'anesthésie telles que la baisse de la thermo-régulation et la détresse cardio-respiratoire dans de rares cas, et (iiii) l'hébergement individuel des femelles gestantes (en fin de gestation durant la période d'acclimatation qui correspond à la période de nidification).
Devenir
Afin d’analyser les conséquences sur le squelette en croissance et en particulier l’éruption dentaire des différents agents testés, les animaux (700) seront euthanasiés et leur squelette étudié. Les mères (100) seront gardées en vie pour être réutilisées.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier l’impact d’agents pharmacologiques/chimiques sur la croissance squelettique (incluant l’éruption dentaire) qui est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires et de nombreuses régulations hormonales. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier en croissance avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu ainsi que toutes les signalisations hormonales et autres impliquées.
Réduction
800 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. S’agissant d’évaluer l’impact sur la croissance et l’éruption dentaire chez le nouveau-né d’injections d’agents pharmacologiques ou chimiques, l’unité de base est la portée. Deux portées par agent à évaluer a été retenu sachant que l’impact de chaque agent sera initialement évalué sur une portée euthanasiée au jour 14 et que si et uniquement si un effet est observé alors la deuxième portée sera engagée pour évaluer l’irréversibilité de l’effet observé avec une euthanasie de la portée au jour 28. Dans cette démarche de réduction du nombre d’animaux impliqués, des contrôles internes seront utilisés au sein de chaque portée correspondant à un ou deux petits, selon le nombre de petits dans la portée, injecté(s) uniquement avec la solution saline servant de solvant de l’agent testé.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont standards. Les femelles en fin de gestation sont hébergés 5 jours en cage individuelle auprès de leurs congénères (contacts visuels) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Cette période de 5 jours en cage individuelle correspond à la période d'acclimatation des femelles gestantes ainsi qu'à leur période de nidification. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum dont des frisotis et/ou du coton compressé permettant la réalisation du nid et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Une anesthésie gazeuse légère de la mère et des petits est mise en place pour les injections aux petits afin de limiter le stress chez la mère et de réduire la douleur des injections chez les petits. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Lors des anesthésies un tapis chauffant est systématiquement utilisé pour éviter les baisses éventuelles de la thermorégulation chez les animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix concernant les études de la croissance des mammifères. Les étapes et la physiologie de la croissance sont bien connues et très homogènes dans les lignées consanguines. Le nombre de petit par portée permet d’avoir des contrôles internes à la portée important pour l’analyse d’effet d’injections de substances en limitant les biais que pourrait induire le travail avec des animaux non-sevrés issues de mères différentes. Afin d’analyser l’impact d’agents pharmacologiques et chimiques sur la croissance squelettique les souris seront traitées par 4 injections au cours de la première semaine de vie et euthanasiées aux jours 14 ou 28 de vie. Cette cinétique est la plus adaptée pour l’analyse de la croissance du squelette en particulier au niveau crâniofacial.
Effet de régimes alimentaires et d’émulsifiants sur la virulence de souches E. coli associées à la maladie de crohn
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
Pour établir si des additifs alimentaires et des régimes déséquilibrés en fibres et en graisses favorisent l'implantation de bactéries Escherichia coli associées à la maladie de Crohn, 260 souris mâles porteuses d'un gène humain vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune suit un régime particulier pendant huit semaines dès le sevrage, reçoit par gavage les bactéries puis un traceur fluorescent, et subit deux prélèvements sanguins sous anesthésie, le second sans réveil. Les collectes de fèces imposent un isolement de dix minutes chaque semaine pendant six semaines, puis trois fois par semaine pendant deux semaines, et soixante souris reçoivent en plus quatorze gavages quotidiens de composés bactériens. Toutes seront tuées pour mesurer l'inflammation intestinale, l'épaisseur du mucus et la composition du microbiote, au service de traitements que le porteur présente comme contribuant au "bien-être" des patients, mot qu'il met lui-même entre guillemets.
Objectifs
Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin telle que la maladie de Crohn. Certaines populations de bactéries dites ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Une catégorie particulière de bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives aux propriétés pro-inflammatoires, colonise anormalement l’intestin grêle de patients atteints de maladie de Crohn. La surexpression d’une protéine au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients favorise l’implantation de ces bactéries. Précédemment, il a été montré que l’expression de la protéine humaine au niveau de l’intestin grêle de souris favorise l’implantation de ces bactéries Escherichia coli, offrant un modèle d’étude précieux pour pouvoir tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif du projet est d’évaluer les effets de divers facteurs alimentaires sur le microbiote de l’intestin grêle et plus particulièrement sur ces bactéries adhérentes et invasives. Ce projet permettra de mettre en évidence la capacité de certains additifs alimentaires ou régimes alimentaires déséquilibrés en fibres et en graisses à favoriser l’implantation des bactéries Escherichia coli et à augmenter leurs propriétés agressives. La compréhension des mécanismes sous-jacents permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant ces bactéries. La finalité du projet est d’utiliser l’ensemble de ces connaissances pour proposer 2 candidats d’intérêt (microorganismes ou produits issus du microbiote) qui seront testés dans ce modèle murin pour leur capacité à lutter contre le développement des Escherichia coli adhérentes et invasives et ainsi aider à améliorer le bien-être intestinal en rétablissant l’équilibre du microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les investigations chez l’animal permettront de mieux comprendre les mécanismes qui permettent l’implantation des souches Escherichia coli adhérentes et invasives au niveau de la partie terminale de l’intestin grêle (leur zone de prédilection chez l’Homme) et leur répercussion sur l’écosystème intestinal et sur l’hôte de manière globale. Ce projet prend en compte également un facteur essentiel : l’alimentation. Ce projet permettra de mieux comprendre l’impact de certains régimes alimentaires et des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et sur les bactéries adhérentes et invasives. La finalité du projet est de proposer aux patients atteints de maladie de Crohn des stratégies thérapeutiques personnalisées, visant ces Escherichia coli. Ces options thérapeutiques personnalisées seraient proposées aux patients hébergeant ces bactéries délétères dans le but de maintenir les phases de rémission et/ou d’améliorer l’effet des traitements, contribuant ainsi à leur « bien-être ».
Procédures
Les procédures incluses dans ce projet, comprenant 260 souris, suivent toutes le même schéma expérimental incluant : -une administration de régimes alimentaires spécifiques sous forme de croquettes pendant 8 semaines à partir du sevrage -un prélèvement de fèces par semaine sur animal vigile pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines (isolement des souris le temps de la collecte, maximum 10 minutes). -un gavage sur animal vigile avec les bactéries (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un gavage sur animal vigile avec un traceur fluorescent (préhension + geste = 10 secondes maximum) -un prélèvement de sang (100-150µL) sur animal anesthésié -un prélèvement de sang (200-300µL) 7 à 10 jours après le dernier prélèvement de sang sur animal anesthésié, sans réveil. Une des procédure concernant 60 animaux inclut 14 gavages supplémentaires pour administrer les candidats thérapeutiques.
Impact sur les animaux
-Suite à l’infection des souris par les bactéries adhérentes et invasives, nous attendons un faible impact sur le poids, pouvant être dû à un stress post-gavage, et une inflammation au niveau intestinal en raison de l’implantation des bactéries. -Chez les animaux infectés par les bactéries Escherichia coli, certains régimes alimentaires peuvent favoriser l'implantation intestinale de ces souches, induisant une inflammation intestinale supplémentaire. -Deux prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie sur l'ensemble des animaux, et peuvent induire un stress chez l'animal en périodes péri-anesthésiques et au moment de la contention de quelques secondes de l'animal sous anesthésie. -Lors des prélèvements de feces, les animaux sont isolés le temps de la collecte (10 minutes maximum) une fois par semaine pendant 6 semaines, puis 3 fois par semaine pendant 2 semaines, ayant pour conséquence d'induire un stress chez l'animal en raison de l'isolement. -Les animaux vont recevoir des bactéries ou composés par voie orale (gavage). Ce geste impose une contention de l'animal pendant 2-3 secondes ce qui induit un stress. L'administration quotidienne par gavage de composés bactériens thérapeutiques pendant 14 jours dans une des procédures de ce projet peut induire un stress supplémentaire chez l'animal.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés lors de ces procédures (260 mâles) sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il sera prélevé un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques ou encore les données inflammatoires suite à des dosages dans les fèces des animaux : niveaux d’inflammation au niveau des tissus intestinaux, analyses histologiques, mesures de l’épaisseur de la couche de mucus, analyse de microbiotes.
Remplacement
L’effet des régimes alimentaires sur le microbiote intestinal sera étudié en amont de ce projet en systèmes in vitro, telles que des micro-fermenteurs ensemencés avec des selles de patients atteints de maladie de Crohn. Cela permettra de tester un ensemble de régimes et d’additifs alimentaires pour leurs effets sur la stabilité d’un microbiote complet, sain ou pathologique, et sur la virulence de certaines bactéries. Cependant, le but ultime du projet est de se positionner au sein de l’écosystème complet de l’intestin grêle, site de prédilection de certaines bactéries impliquées dans l’inflammation chez les patients atteints de maladie de crohn. Les études en micro-fermenteurs ont une limite : ils ne prennent pas en considération l’hôte : la muqueuse de l’intestin grêle et le mucus qui la recouvre ainsi que le système immunitaire. Or, l’interaction entre l’hôte et le microbiote est cruciale : la réponse immunitaire de l’hôte façonne le microbiote intestinal, et les microorganismes et les produits de leurs métabolismes influent également sur l’hôte en modulant sa réponse immunitaire. L’alimentation est un autre facteur qui peut jouer un rôle fondamental dans cet équilibre, de manière bénéfique ou au détriment de l’hôte. Il est donc nécessaire de travailler à l’échelle de l’organisme entier pour pouvoir étudier les effets de régimes alimentaires spécifiques sur la virulence des de certaines souches de bactéries, dont les Escherichia coli adhérents et invasifs, et sur le microbiote de l'intestin grêle pour pouvoir ensuite proposer des stratégies thérapeutiques participant à rééquilibrer ce microbiote.
Réduction
-Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet (260 souris) a été réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Précédemment, une étude publiée dans le même modèle murin a montré qu’un nombre de 6 souris par lot était suffisant pour analyser le comportement des bactéries Escherichi coli adhérentes et invasives au niveau de l'intestin. Les coefficients de variation des données de colonisation obtenues lors de cette expérience étaient acceptables pour une étude exploratoire (10-40% en log10). Le projet concerné par cette DAP implique d’étudier l’impact de régimes et d’additifs alimentaires sur ces bactéries adhérentes et invasives. Or, les réponses vis-à-vis de régimes peuvent varier selon les individus, en particulier en raison de la composition de leur microbiote intestinal. En effet, une variabilité inter-individu a été observé dans un autre modèle murin placé sous un régime riche en sucre et en graisse. Pour pallier à cette hétérogénéité de la réponse biologique, nous avons décidé d'augmenter le nombre d’animaux à 10 individus par lot pour l’ensemble du projet, afin d'espérer conserver un coefficient de variation équivalent à l'expérience exploratoire (10-40%), voire de le diminuer. -De plus, dans le but de diminuer encore le nombre d’animaux au strict nécessaire dans le cadre de ce projet, une des procédures ne sera réalisée que si les effets biologiques recherchés dans la procédure précédente sont notables.
Raffinement
L’expérimentation débutant par la mise à disposition d’un régime alimentaire spécifique pendant 8 semaines dès le sevrage, la période d’acclimatation est de ce fait, intégrée. Pendant cette période, le poids des animaux est mesuré une fois par semaine. Lors de ce contrôle, un prélèvement de fèces est réalisé afin de détecter d’éventuels troubles digestifs en réponse aux traitements et de doser l’inflammation au niveau fécal. Ce contrôle entraine/habitue l’animal à la présence de l’expérimentateur et à la préhension. Lors des 2 à 3 dernières semaines des procédures, après infection des animaux, la surveillance est renforcée : les animaux sont contrôlés 3 fois par semaine. Une grille de score est utilisée pour le suivi des animaux. En fonction de ce score, il faut soit renforcer les surveillances, soit prévoir un mode de soulagement, soit modifier le protocole expérimental. Il sera administré aux souris montrant des signes de souffrance un traitement analgésique pour réduire leur douleur. En fonction de l’évolution de l’état général de l’animal dans les heures qui suivent, un deuxième avis peut être demandé, mais en l’absence d’amélioration, l’euthanasie est considérée. L’animal est immédiatement sorti du protocole, anesthésié et mis à mort selon la réglementation en cours.
Choix des espèces
Le modèle choisi est la souris, modèle fréquemment utilisé dans l’étude de ce type de pathologie et qui dispose d’un grand nombre d’outil de diagnostic et d’analyses. Nous disposons d’un modèle de souris transgénique exprimant une protéine humaine servant de récepteurs pour les bactéries Escherichia coli adhérentes et invasives qui sont étudiées dans le cadre de ce projet. L'expression de cette protéine humaine au niveau de l’intestin grêle chez l’animal est nécessaire pour favoriser l’implantation de ces bactéries. Concernant le stade de développement, les animaux doivent entrer dans le protocole dès le sevrage (environ la 4ème semaine de vie) afin d'être placés sous régime alimentaire spécifique dès qu'ils commencent à s'alimenter par eux-mêmes et ce, pendant 8 semaines. En effet, le microbiote intestinal va subir un changement radical dans sa composition au sevrage en raison du changement d'alimentation. De ce fait, pour ne pas risquer de masquer les effets des régimes alimentaires spécifiques à étudier, il est préférable d'administrer directement ces régimes post-sevrage, sans passer par un régime alimentaire transitoire.
Rôle d’une protéine dans l’athérosclérose et la maladie du foie gras.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Injectées une seule fois, quatre jours de suite ou cinq fois en quatorze jours selon les groupes, 336 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur foie et leurs cellules immunitaires. Les substances administrées peuvent provoquer une gêne abdominale, une baisse d'activité et une réaction inflammatoire modérée, ou perturber temporairement des fonctions immunitaires. L'objet du projet est le rôle d'une protéine des macrophages dans l'athérosclérose et la maladie du foie gras, les retombées thérapeutiques restant à l'état de pistes. Le porteur justifie le recours à cette espèce en indiquant que le fonctionnement biologique de la souris est proche de celui de l'être humain et que de nombreux outils génétiques et moléculaires y ont été développés.
Objectifs
L’athérosclérose (AS) est une maladie chronique des vaisseaux sanguins caractérisée par l’accumulation de dépôts graisseux dans les artères, favorisant des complications cardiovasculaires graves. Les cellules immunitaires jouent un rôle important dans le développement de cette maladie en participant aux réactions inflammatoires et à l’accumulation de lipides dans les artères. De même, au cours de la maladie du foie gras (MASH), une réponse inflammatoire chronique se développe et contribue au développement de la pathologie. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle d’une protéine, présente dans les macrophages, au cours des maladies métaboliques, dont l’AS et la MASH. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin d’étudier comment cette protéine influence les réactions inflammatoires et le comportement des macrophages dans des situations proches de ces maladies. L’objectif global du projet est de mieux comprendre comment l’inflammation fonctionne dans ces maladies métaboliques et d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies fréquentes et dévastatrices.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment les cellules du système immunitaire détectent les changements de leur environnement et comment ces mécanismes participent au développement des maladies métaboliques inflammatoires. Les résultats obtenus pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Une injection unique (environ 5 secondes) sera réalisée sur 56 animaux. Quatre injections consécutives (une injection par jour pendant 4 jours, environ 5 secondes par injection) seront réalisées sur 224 animaux. Cinq injections seront réalisées à intervalles de 72 heures sur une période de 14 jours (environ 5 secondes par injection) chez 56 animaux.
Impact sur les animaux
Les substances utilisées dans le projet peuvent entraîner un inconfort temporaire, une légère diminution de l’activité ou une gêne abdominale passagère. Certaines d’entre elles peuvent également induire une réaction inflammatoire modérée ou perturber temporairement certaines fonctions immunitaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs tissus : le foie pour étudier l’inflammation et le métabolisme, et les cellules immunitaires afin d’analyser leur fonctionnement.
Remplacement
Les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et leur environnement sont très complexes et ne peuvent pas être reproduites en laboratoire avec des cellules isolées. Pour les étudier dans leur intégrité il est nécessaire d’utiliser un modèle animal. La souris est l’espèce la plus adaptée, car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain.
Réduction
Nous avons calculé le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Pour garantir que nos conclusions soient pertinentes pour les deux sexes, chaque expérience sera réalisée à la fois sur des mâles et des femelles. Pour chaque souris, plusieurs analyses seront réalisées ce qui permet d’obtenir un maximum d’informations sans utiliser d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de malaise. Une grille d’évaluation permettra au personnel formé de suivre leur état de santé et d’agir si nécessaire. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement sera notée. Les animaux concernés seront alors suivis et peuvent éventuellement recevoir un traitement contre la douleur. Si certains signes de mal-être persistent, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour cette étude car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain. De nombreux outils génétiques et moléculaires ont été développés chez la souris, permettant de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses maladies. Les expériences seront réalisées sur des souris dont les principaux systèmes étudiés (notamment le foie et le système immunitaire) ont atteint un niveau de développement et de fonctionnement stable, afin d'obtenir des résultats fiables et représentatifs des mécanismes biologiques étudiés.
Etude du développement du système biliaire dans un nouveau modèle génétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
858 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles gestantes reçoivent six gavages de trente secondes, que le porteur décrit comme provoquant une douleur modérée et passagère, avec un risque de saignement vaginal et de perte de poids, et les souriceaux subissent deux injections, quatorze gavages et le prélèvement d'un à deux millimètres de queue pour le génotypage. Ceux qui développent la malformation des voies biliaires présentent une jaunisse et un retard de croissance, avant d'être tués à vingt-huit jours. Le bénéfice annoncé reste indirect, la création de lignées de souris sur lesquelles des cibles thérapeutiques pourront ensuite être testées, et le porteur affirme que les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer l'étude in vivo du développement de l'arbre biliaire.
Objectifs
l’objectif de ce projet est l'utilisation de souris pour l'étude de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces par rapport aux publications précèdentes.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra le développement de nouveaux modèles génétiques de la malformation des voies biliaires chez la souris. Ils permettront d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes de la maladie. Cela permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourront être testés sur nos nouveaux modèles de souris par la suite.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. Les nouveaux-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue de 1 à 2 millimètres sera prélevé pour le génotypage entre 7 et 10 jours après la naissance. 6 gavages de 30sec chez la femelle gestante entrainant une douleur modérée et passagère . 2 injections chez les nouveaux nés pendant 10sec sur les nouveaux nés engendrant une douleur légère et passagère. 14 gavage de 30sec chez les souriceaux.
Impact sur les animaux
Risque de saignement vaginal et perte de poids pour la femelle gestante. Lors des procédures le gavage est un mode d’administration entrainant une douleur modérée et passagère. l’injection entraine une douleur légère et passagère sur un nouveau-né. Dans le cas où les animaux développent la maladie les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés).
Devenir
Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 28 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour l'étude du développement du foie et de la mise en place de la fibrose et de l'inflammation et l'étude de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse..
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux nous utiliserons les deux sexes car nos études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une lampe chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. L’injection et le gavage seront réalisés avec des sondes et des aiguilles adaptées à la taille de l’animal seront utilisés. Des points limites spécifiques ont été établis.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation des mécanismes de l'homéostasie métabolique physiologiques et physiopathologiques dans le foie entre l'humain et la souris. Elle a été confirmée par de nombreuses études. En particulier,le développement de l’arbre biliaire est similaire entre espèces. Par ailleurs, nous disposons également de nombreux outils spécifiques pour la souris. Animaux adultes et femelles gestantes entre 6-8 semaines d'âge. Souriceaux entre 1 et 28 jours après la naissance.
Evaluation d’immunogénicité de vaccins dans les modèles souris et hamster
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Hamsters dorés : 3600
9 600 rongeurs, 6 000 souris et 3 600 hamsters dorés, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun recevant jusqu'à quatre injections, subissant jusqu'à onze prélèvements sanguins et jusqu'à dix lavages nasaux. Les lavages nasaux peuvent irriter les muqueuses ou provoquer des saignements, et les injections entraîner des douleurs musculaires, une chute transitoire de la température corporelle et une perte de poids inférieure à 5 %. Les vaccins candidats viennent de collaborateurs du laboratoire, et le porteur affirme qu'aucune alternative non animale n'existe en recherche préclinique sur les vaccins, l'étude des réponses immunitaires exigeant selon lui "un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé". La moitié d'entre eux sera tuée faute de pouvoir être "ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés" après des gestes qui altèrent définitivement leur système immunitaire, l'autre moitié, 3 000 souris et 1 800 hamsters, étant réutilisée dans une épreuve infectieuse ou tumorale.
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris et chez le hamster de l’immunogénicité et de l’efficacité de différents candidats vaccins développés par nos collaborateurs. Les capacités de stimulation du système immunitaire seront aussi évaluées dans des modèles de souris et de hamster afin de transposer l’efficacité potentielles en clinique. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques ou de déterminer les corrélats d'immunité contre un pathogène donné (un corrélat est l’observation de marqueurs biologiques par exemple un certain type et taux d’anticorps, une sous population de lymphocytes T). Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs ou thérapeutiques contre des maladies infectieuses transmissibles, à risque pandémiques, ou encore des maladies non infectieuses (auto-immunes, cancers), d’impact majeur en santé publique. L’immunogénicité et l’efficacité des vaccins candidats sera évaluée avec des critères clairs in vivo et ex vivo comme la présence d’une quantité suffisantes d’anticorps contre des protéines du pathogène ou de lymphocytes T activés spécifiques du pathogène. Dans certains cas, des vaccins contrôles pourront être évalués en parallèle pour comparer l’immunogénicité du prototype.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle rongeur permet de démontrer leur efficacité et de définir les doses et schémas vaccinaux. L’immuno-monitorage par les prélèvements sur l’animal ou après la mise à mort permettront d’établir si le prototype vaccinal permet une réponse humorale (anticorps neutralisants ou de liaison) et cellulaires (réponse innée ou T cytotoxique par exemple) à un pathogène donné. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs ou thérapeutiques contre plusieurs pathologies infectieuses (transmissibles, à risque pandémique, d’impact majeur en santé publique) et non infectieuses (cancers ou maladies auto-immunes) graves pour lesquelles le besoin médical est avéré.
Procédures
Pour les souris: - administration par voie parentérale sur souris vigiles (intra musculaire, intra nasale, intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée) ou anesthésiées (intradermique) (1 à 4 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 3 à 5 semaines) - prélèvement sanguin (4 à 10 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 1 à 5 semaines) - lavage nasal (2 à 9 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 1 à 5 semaines) Pour les hamsters: - administration par voies intramusculaire, intrapéritonéale, sous-cutanée : sur animal vigiles ou anesthésiées : intra nasale, intraveineuse, intradermique) (1 à 4 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 3 à 5 semaines) - prélèvement sanguin sous anesthésie (4 à 11 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 1 à 5 semaines) - lavage nasal sur animaux anesthésiés (2 à 10 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 1 à 5 semaines)
Impact sur les animaux
Le projet s’articule autour de 2 procédures de sévérité légère. Les injections et les prélèvements sanguins de petits volumes ne requièrent qu'une contention et l’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste, les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée (quelques minutes). Chez les hamsters, les prélèvements et certaines injections seront réalisées sous anesthésie. Dans certains cas (la lignée des animaux, la dose de vaccin, la voie d’injection), l’injection aura un impact léger sur l'état de santé des animaux, avec une perte de poids inférieure à 5 % et transitoire (quelques jours). Certains prélèvements nasaux peuvent être irritants ou causer des saignements (saignement immédiat et arrêté immédiatement avec une compresse). Effets indésirables potentiels liés à l’administration de produits vaccinaux (antigènes, vecteurs ou adjuvants) prophylactiques ou thérapeutiques chez les animaux : - stress de quelques minutes au moment des gestes d’injection et prélèvements - douleurs au point d’injection pour toutes les injections - douleurs musculaires systémiques liées à l’inflammation quelques minutes à une heure - chute de la température corporelle transitoire après l’injection du prototype (résolution normale en moins de 6h).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure lorsqu’ils ne doivent pas être utilisés pour vérifier l’efficacité du vaccin, et car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés (ils auront subi des gestes expérimentaux qui altèreront pour toujours leur système immunitaire (réponse humorale et cellulaire mémoire notamment). Lorsque l’efficacité des vaccins doit être testée, et pour optimiser le nombre d’animaux utilisés, les animaux vaccinés peuvent être réutilisés dans une procédure d’épreuve (infectieuse, ou tumorale).
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Des modèles de souris et de hamster seront utilisés et choisis en fonction du vaccin à étudier, et par extension de la pathologie contre laquelle il est produit.
Réduction
Sur la base de nos expériences antérieures, nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique de nos résultats. 1. Optimisation de la taille des cohortes : nos calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont par une analyse biostatistique afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs avec une puissance de 80 % tout en évitant une surutilisation. 2. Maximisation des données obtenues par animal : nous utilisons des approches multimodales sur un même animal (étude des réponses humorales et cellulaires), ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. 3. La standardisation de nos protocoles expérimentaux permet de minimiser la variabilité et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique. Ne faut-il pas mentionner ici l’optimisation de l’utilisation des groupes contrôles en maximisant le nombre de groupes interventionnels ? En combinant ces stratégies, nous nous engageons à minimiser nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la pertinence scientifique de nos travaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les conditions réglementaires. Les nouvelles substances seront utilisées seulement après évaluation de la toxicité au préalable par exemple par l’animalerie centrale dans le cadre d’un autre projet. Pour les hamsters, les prélèvements sanguins seront réalisés systématiquement sous anesthésie. Les animaux seront surveillés après les injections et les prélèvements, et des soins seront pratiqués suite aux injections et prélèvements si nécessaire (massages et application d’eau tiède ou de sérum physiologique après l’injection ou le prélèvement, ajout d’un gel nutritif dans la cage).
Choix des espèces
L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris et un modèle de hamster sont utilisés pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins car les réponses humorales et cellulaires chez le rongeur de petite taille comme la souris et le hamster sont souvent de même nature et de même amplitude que les réponses humaines. Ainsi, en vaccinologie et immunothérapie préclinique, il est recommandé de commencer par un modèle préclinique rongeur. Age moyen des animaux : entre 6 et 16 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique (cela dépend des espèce set lignées utilisées). L’âge peut influencer l’importance, la qualité, et la durabilité des réponses immunes. Il est possible que, dans certains projets analysant les mécanismes d’action des vaccins et la variabilité de la réponse immune liés à l’âge ou l’état de l’hôte, des animaux plus âgés soient utilisés (jusqu’à 16 semaines).
Evaluation in vivo du rôle de molécules impliquées dans l’inflammation au cours d’une maladie thrombotique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris peuvent développer des microthromboses qui altèrent leur mobilité, et leur respiration ralentit après l'induction de la maladie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et en réaliser des coupes colorées. Le porteur écrit pourtant que les souris "ne subiront que très peu de contraintes" et résume les perturbations attendues à une douleur d'injection et à la gêne de la contention. L'objet du projet est de départager le rôle de deux molécules inflammatoires, désignées A et B, dans les lésions cardiaques d'une maladie rare, et le bénéfice annoncé se limite à envisager un traitement plus personnalisé lors des crises.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre le rôle exact de deux molécules, appelées pour simplification A et B, dans la gravité des problèmes sanguins et des lésions au cœur dans une maladie rare. Cette maladie, causée par un manque d’une protéine spécifique, provoque la formation de petits caillots dans les vaisseaux sanguins, ce qui peut bloquer la circulation et endommager des organes comme le cœur. Des recherches précédentes ont montré qu’un médicament qui bloque l’action à la fois de A et de B pouvait réduire les dommages au cœur et au cerveau dans un modèle de souris atteintes de cette maladie. Cela suggère que l’inflammation causée par A et B joue un rôle important dans les lésions observées. On sait aussi que A et B favorisent la libération de substances impliquées dans la formation des caillots et peuvent aggraver les baisses de cellules sanguines. Cependant, on ne sait pas encore précisément quel rôle joue chacune de ces deux molécules A et B. L’objectif du projet est donc de tester, chez la souris, l’efficacité de traitements qui ciblent spécifiquement A ou B ou une molécule liée l’apparition de A et B, pour prévenir les dommages dans le cœur au cours de cette maladie. À ce jour, aucune étude n’a encore permis de déterminer clairement le rôle respectif de A et de B dans cette maladie et les données de ce projet pourront permettre à termes, une thérapie plus précise pour les patients atteints de cette maladie qui souffrent souvent de complications cardio-vasculaires.
Bénéfices attendus
Si nous constatons que A ou B est impliqué préférentiellement dans cette pathologie, nous pourrons envisager un traitement plus personnalisé aux patients lorsqu’ils développent des crises de cette pathologie.
Procédures
Les animaux sont mis en cage d'inhalation pour induire une anesthésie. Ils seront soumis à de la contention et à des injections pouvant leur occasionner un stress et une douleur minime. La douleur est contrôlée par l’utilisation de gouttes analgésiques et d’injection d’analgésique si besoin, en fonction d’une grille de douleur établie préalablement et sur laquelle nous nous appuyons. Les imageries seront d'une durée maximale de 30minutes. A la fin du protocole, les animaux recoivent une anesthésie profonde et constatée et un prélèvement est réalisé afin de récupérer le sang des souris. Ces gestes durent 10 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée à une injection et de la gêne par la contention. Les animaux peuvent également développer des microthromboses qui altèrent leur mobilité. Lors de l'induction de la pathologie, la respiration des animaux est un peu plus lente et revient en moins de 5 minute à la normale. L’imagerie et l'injection de traceurs nécessiteront une anesthésie et pourront engendrer un stress, ainsi qu'une hypothermie. Les
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, quelle qu'elle soit, afin de récupérer les organes des animaux et réaliser de l'immuno-histochimie sur ces organes, c'est à dire une coupe des organes et des colorations de ces coupes d'organes
Remplacement
La réalisation de ce projet est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. A ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un vaisseau avec ce qui recouvre les vaisseaux, la totalité des cellules qui circulent dans le sang et les molécules solubles du plasma participant à l’activation des vaisseaux. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum après calcul du nombre de sujet nécessaire pour démontrer un effet des traitements. Le calcul du nombre d'animaux est défini grâce à un logiciel de statistique.
Raffinement
Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée par l'utilisation d'analgésiques. Tous les gestes pratiqués sur les animaux sont réalisés sous anesthésie. Les cages seront enrichies avec du coton, un dôme et/ou un tunnel. De plus, la douleur et la souffrance seront évaluées lors des protocoles tous les jours et la souffrance évaluée par une grille permettant d'établir un score. Cette grille est précise et permet de définir la douleur de l'animal grâce à des critères établis au préalable et reconnus par les vétérinaires. Les animaux ne sont pas seuls dans les cages. Ils seront hébergés dans des cages comprenant au maximum 5 animaux du même sexe, afin d'éviter tout conflit entre eux. Ils sont hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonté. Les salles sont spécialement conçues dans une animalerie agréée avec une température vérifiée quotidiennement et stable, une ventilation continue, et une visite des animaux est organisée quotidiennement avant que l'expérience ne soit réalisée. Une personne est responsable du bien-être de ces animaux
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elle ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaines correspond à une souris jeune adulte. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.
Étude préclinique de tolérance d’analogues d’une bithérapie ciblant le métabolisme de la méthionine chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Sélectionner entre quatre et huit molécules candidates parmi des analogues d'une bithérapie ciblant le métabolisme de la méthionine : 686 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque souris reçoit soit une injection unique, soit des injections quotidiennes pendant six semaines, soit un dispositif implanté sous la peau lors d'une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie, et suit un régime alimentaire particulier qui peut lui faire perdre du poids. Les prélèvements sanguins ont lieu deux à trois fois sous anesthésie, complétés par des tests d'activité de dix à quinze minutes une à deux fois par semaine, sans que le porteur précise lesquels. Il indique qu'aucune méthode ne permet d'évaluer la sécurité et la toxicité à long terme de ces molécules sans animal, "car seule l'étude sur un organisme entier permet d'observer leurs effets sur différents tissus et fonctions".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la suite de travaux ayant permis de découvrir une molécule, associée à un régime alimentaire spécifique, capable de ralentir la croissance de certaines tumeurs. L’objectif est de tester des versions améliorées de cette molécule, toujours associées à ce régime, afin d’identifier entre 4 et 8 candidats finaux présentant le meilleur compromis entre efficacité et tolérance. Pour cela, la dose optimale, la manière dont ces traitements agissent dans le temps, ainsi que leurs éventuels effets indésirables seront étudiés, afin de mieux comprendre leurs effets bénéfiques et secondaires. Les résultats aideront à sélectionner le candidat le plus prometteur pour le développement de futurs traitements chez l’Homme.
Bénéfices attendus
L’objectif est de déterminer une dose adaptée et sûre d’utilisation. Si les résultats sont satisfaisants, ils permettront de poursuivre le développement de ce traitement dans des études plus avancées. À terme, ce projet pourrait contribuer à la mise au point d’une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du cancer du pancréas chez l’Homme.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique ou des injections quotidiennes (hors week-end) pendant 6 semaines, réalisées sur animaux vigiles. Dans certains cas, un petit dispositif sera placé sous la peau lors d’une intervention chirurgicale mineure (environ 15 minutes) sous anesthésie, afin d’administrer le traitement de façon continue. Des tests simples d’activité (quelques minutes à 10–15 minutes, 1 à 2 fois par semaine) seront réalisés sur animaux vigiles. Les prélèvements sanguins (2 à 3 fois) seront effectués sous anesthésie, en plus des prélèvements réalisés en fin de procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées pour limiter le stress et l’inconfort.
Impact sur les animaux
Le régime alimentaire spécifique peut entraîner une légère perte de poids. Les animaux recevront soit des injections, soit un petit dispositif sous la peau, pouvant provoquer une gêne locale temporaire, prise en charge par des traitements contre la douleur. Les interventions sous anesthésie peuvent entraîner une sécheresse des yeux ou une baisse de température, prévenues par des mesures adaptées. Un isolement temporaire peut être nécessaire après chirurgie pour la surveillance et la protection du site opératoire. Les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans des conditions adaptées afin de limiter le stress et assurer leur bien-être.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude ou plus tôt en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole. Certains animaux satellites pourront également être utilisés à des temps définis pour des analyses biologiques, biochimiques et anatomopathologiques. Ces derniers permettent d’évaluer l’exposition au traitement, la pharmacocinétique et la toxicité précoce, sans affecter le suivi des autres animaux de l’étude. La mise à mort sera réalisée selon des méthodes réglementaires sous anesthésie générale, afin de limiter toute douleur et stress, et permettra la réalisation de prélèvements nécessaires aux analyses scientifiques. Cette organisation permet de concilier le bien-être animal et les objectifs scientifiques de l’étude.
Remplacement
Cette étude fait suite à des travaux ayant identifié une molécule prometteuse associée à un régime alimentaire spécifique. L’objectif est maintenant de tester des molécules proches afin d’identifier celle qui est la mieux tolérée par l’organisme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer complètement la sécurité, la toxicité et les effets secondaires à long terme de ces molécules sans utiliser l’animal, car seule l’étude sur un organisme entier permet d’observer leurs effets sur différents tissus et fonctions. Ces études sont donc nécessaires pour vérifier la sécurité globale avant un éventuel passage chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. L’étude est réalisée de manière progressive, en commençant avec un nombre restreint d’animaux, puis en élargissant uniquement si nécessaire. Les animaux sont surveillés en continu afin de détecter rapidement tout effet indésirable et d’adapter ou arrêter l’étude si besoin. Cette organisation permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats fiables.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires seront mises en place pour limiter au maximum les effets indésirables liés aux manipulations et aux procédures expérimentales. Le bien‑être des animaux sera évalué quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort. Avant toute intervention, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours, avec des séances de familiarisation pour les habituer progressivement au contact humain et réduire le stress. Toutes les interventions seront réalisées dans un environnement calme, par du personnel qualifié et formé, afin de limiter la durée des manipulations et les réactions de stress. La douleur ou l’inconfort sera surveillé chaque jour. En fonction du niveau de douleur observé, un traitement adapté sera administré. Si la douleur ne peut pas être soulagée ou si la situation l’exige, l’animal sera immédiatement mis à mort afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J constituent un modèle de référence pour les études précliniques de tolérance et sont largement documentées dans la littérature. Cette souche présente un fond génétique stable et homogène, ce qui réduit la variabilité interindividuelle dans les paramètres essentiels évalués en toxicologie (poids, marqueurs biochimiques, analyses histologiques, comportement). Par ailleurs, leur utilisation étendue en pharmacologie, en toxicologie et en neurosciences offre un important historique de données comparables et reproductibles, renforçant la pertinence scientifique de leur choix pour cette étude. Les souris seront accueillies dans l’établissement utilisateur entre 6 et 8 semaines de vie et début des procédures entre 7 et 9 semaines de vie, comme décrit majoritairement dans la bibliographie.
Développement de nouveaux modèles combinant génétique et facteur environnemental pour l’étude d’une maladie métabolique du foie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Deux gavages chez la femelle gestante, cinq injections chez les nouveau-nés, un bout de queue de un à deux millimètres prélevé au septième jour pour le génotypage : 884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes les interventions étant réalisées sur animal vigile. Les souriceaux qui développent la maladie visée présentent une jaunisse et un retard de croissance, la biopsie de queue entraînant selon le porteur une douleur modérée et passagère. L'objet déclaré est de combiner la délétion d'un gène du foie avec des molécules toxiques pour les canaux biliaires, afin d'obtenir une malformation des voies biliaires à un âge plus précoce que dans les travaux publiés. Tous les souriceaux seront tués à vingt et un jours et les adultes des croisements à la fin de la procédure, sans autre raison donnée que le fait qu'ils sont "nécessaires pour notre étude".
Objectifs
L’objectif de ce projet est l'étude de souris dans des modèles environnementaux de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire en utilisant des molécules potentiellement toxiques pour les canaux bilaires couplé à la délétion d'un gène impliqué dans le fonctionnement hépatique. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement d’un modèle combinant la délétion génétique avec un facteur environnemental pouvant expliquer la cause de la maladie, c'est à dire des molécules pharmacologiques dans ce contexte. Il permettra également d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes précoces de la maladie et pourront être utilisés à l'avenir pour la découverte de nouveaux traitements.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. 5 injections de 10sec chez les nouveaux nés. 2 gavage de 30sec chez la femelle gestante. Prélèvement d'un bout de queue 1 à 2 mm le 7ème jour post natal.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances seront les injections sur les nouveaux nés et les gavages chez les femelles gestantes. Elles entrainent une douleur légère et passagère. Dans le cas où les animaux développent la maladie, les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés). Pour le génotypage un prélèvement d'un à deux millimètres de queue sera prélevé entre 7 jours après la naissance ce qui entraîne une douleur modérée et passagère.
Devenir
Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Cette étude permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Les cultures cellulaires ne peuvent pas complétement remplacer les études in vivo pour l'étude de la mise en place de la fibrose et l'étude du développement de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux les deux sexes seront utilisés car les études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. De multiples paramètres seront analysés pour chaque souris. Afin de vérifier que les résultats sont statistiquements significatifs des tests adaptés seront utilisés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Afin de limiter le stress des animaux seul l’expérimentateur du projet sera amené à manipuler les animaux durant la période de croissance des nouveaux nés. Les manipulations seront effectuées le plus rapidement et calmement possible. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une table chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. Des aiguilles adaptées à la taille et au poids (volumes adaptés) de l’animal seront utilisés pour les injections. Pendant toutes les procédures une grille de score avec des points limites spécifiques ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi journalier pour les nouveaux nés.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation des mécanismes de l'homéostasie métabolique physiologiques et physiopathologiques dans le foie entre l'humain et la souris. Elle a été confirmée par de nombreuses études. En particulier, le développement de l’arbre biliaire est similaire entre espèces. Les souris néonatales (P1 à P21) pour étudier le développement du foie et de l’arbre biliaire ainsi que des souris adultes gestantes (de 6 semaines minimum).
Exploration de la toxicité retardée sur les cellules de Purkinje de produits de référence administrés par voie intra-cérébroventriculaire chez la souris pour le traitement de maladies neurologiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Un abord chirurgical de trente minutes sous anesthésie gazeuse pour injecter un produit directement dans les ventricules du cerveau, puis six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures sur souris vigiles, chacune maintenue en contention deux minutes. 324 souris mâles jeunes adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le produit dit positif est choisi parce qu'il détruit les cellules de Purkinje du cervelet, et le porteur écrit pourtant que les produits de référence "ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués", les signes neuro-locomoteurs n'apparaissant selon lui que lors d'évaluations dédiées. Toutes les souris ayant reçu une injection sont tuées pour prélever leurs organes et chercher des marqueurs précoces de cette toxicité, seules celles écartées avant la chirurgie pouvant être transférées vers d'autres projets.
Objectifs
Les troubles neurologiques constituent la première cause de handicap et de morbidité mondiale, touchant plus de 3,4 milliards de personnes. Face à l'absence de traitements curatifs pour ces pathologies graves affectant le cerveau et la moelle épinière, la Recherche et Développement accélère le déploiement de thérapies innovantes, notamment les oligonucléotides antisens (ASO). Cette stratégie thérapeutique bloque la production de protéines toxiques avant l’apparition de lésions cérébrales. Le principal obstacle réside dans la difficulté pour ces thérapies de franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE), filtre protecteur qui isole le cerveau de la circulation sanguine. Pour contourner ce problème, les médicaments sont injectés directement au niveau des lombaires entre les méninges chez l'Humain. Chez la souris, cette méthode n'est pas possible en raison de sa petite taille, et les médicaments sont administrés directement dans le cerveau par la voie intra-cérébroventriculaire dite ICV. Cependant, l’administration de certains ASOs par voie ICV chez la souris peut provoquer des effets indésirables structurels, notamment la perte de cellules de Purkinje (type de neurones du cervelet, crucial pour le contrôle moteur fin). Ces modifications anatomiques, souvent asymptomatiques au début, peuvent altérer gravement les fonctions neurologiques à terme. L’enjeu de ce projet est d’identifier des biomarqueurs précoces de cette toxicité retardée à la suite de l’injection par voie ICV de produits de référence (provoquant une perte des cellules de Purkinje) chez la souris. C’est un modèle présentant une forte homologie physiologique avec l’Humain et pour lequel cet effet indésirable a déjà été observé. Un suivi de deux semaines maximum post-injection, incluant des prélèvements biologiques à différents temps sont programmés pour effectuer des analyses approfondies. L'objectif scientifique de ce projet est donc de caractériser ces anomalies en intégrant une recherche de biomarqueurs précoces prédictifs d’une potentielle toxicité cérébrale avant même l'apparition de lésions irréversibles telles que la perte de cellules de Purkinje et l’apparition de signes cliniques. L’exploitation des résultats de ce projet pourra être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments (ASOs), dans le cadre d’un autre projet. En identifiant ces signaux d'alerte dès les phases non cliniques, cela permettra de garantir la sécurité des patients lors des futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
Ces études s’inscrivent dans l’optique d’accélérer la mise à disposition de thérapies innovantes pour le traitement de pathologies neurologiques et d’offrir de meilleures perspectives aux patients touchés par ces maladies. Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme il permettra la détection de biomarqueurs précoces susceptibles de prédire les effets potentiellement toxiques (anomalies cérébrales) des produits de référence. L’exploitation des résultats de ce projet pourra ensuite être appliquée aux évaluations ultérieures de candidats médicaments en développement (à moyen terme) pour renforcer leur profil de sécurité dans le cadre d’un autre projet. A plus long terme, le bénéfice sera de sécuriser l’utilisation de ces thérapies chez les patients
Procédures
• injection unique du produit de référence/véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • injection d’analgésique en pré, péri et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et avant l’euthanasie (moins de 10 sec) • prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de moins de 30 sec.
Impact sur les animaux
• injection unique du produit de référence ou du véhicule dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie générale gazeuse et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ), la phase d’induction de l’anesthésie gazeuse peut générer un stress léger et de courte durée. La phase de réveil post-opératoire peut générer une douleur modérée • Injection de l’analgésique pré et post opératoire (maximum 2 fois par jour pendant 2 jours) et lors de l’euthanasie (moins de 10 sec) douleur légère et de courte durée à l’injection • A des prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum durant l’étude, contention de 2 minutes maximum, générant une douleur légère au moment de la ponction de moins de 30sec et stress lié à la contention nécessaire. - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : • Les produits de référence administrés pourraient induire une perte de cellules de Purkinje débutante (produit positif) mais ne devraient pas induire de signes cliniques modérés ni marqués. Toutefois des signes neuro-locomoteurs légers peuvent déjà être observées précocement et uniquement lors d’évaluations comportementales et neuro-locomotrices dédiées pouvant provoquer un inconfort léger pour l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un produit de référence ou d’un véhicule seront euthanasiés à l’issue de ce projet pour l’analyse de biomarqueurs et d’organes pour examen de leur structure (analyse histologique) ou analyse de l’activité des gènes (transcriptomique) et des protéines produites dans ces tissus (protéomique)selon les groupes. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les souris pour lesquelles au moins une première administration d’analgésique en préparation de la chirurgie a été réalisée et qui n’ont pas été opérées et n’ont donc pas reçu de produit de référence ou véhicule. Ce cas peut se produire dans de rares cas suite à une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre animal traité du même groupe par exemple. Ces animaux ayant déjà reçu au préalable une injection d’analgésique avant la chirurgie pourront dans ce cas être réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet a pour but d’identifier des biomarqueurs précoces prédictifs d’une toxicité retardée post administration de produits de référence induisant ou non une perte de cellules de Purkinje. Cette approche permet d’identifier de potentiels marqueurs précoces de cette toxicité pouvant être observée avec les ASOs administrés dans le système nerveux. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet, pour permettre l’identification de biomarqueurs prédictifs de l’apparition d’une toxicité retardée suite à l’injection de ces produits de référence (ASOs). L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et la souris est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (toxicité observée dans cette espèce, processus physiologiques très proches de l’Humain).
Réduction
Les produits de référence sont sélectionnés à l’aide de screening vitro et/ou silico et des études vivo de sécurité avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux prévu par étude est de 9 par temps de prélèvement (3 temps envisagés au total par produit de référence/véhicule). Ce choix est dicté par la nécessité de garantir la robustesse des données face à plusieurs sources de variabilité. Par groupe, 5 animaux seront nécessaires pour les analyses biochimiques, analyse de l’activité des gènes et de la synthèse des protéines et 4 pour l'examen des tissus. Ce nombre est nécessaire pour obtenir des résultats robustes pour les analyses complexes ex vivo envisagées et permet de compenser l’hétérogénéité liée à l’injection intra-cérébroventriculaire (diffusion du produit variant d’un sujet à l’autre) et les variabilités interindividuelles. Ainsi le nombre d’échantillons produit permettra d’assurer des données exploitables lors des analyses en laboratoire. Cette approche permettra de détecter avec certitude des signaux d'alerte (biomarqueurs) qui prédisent une toxicité retardée, garantissant ainsi la robustesse de nos conclusions. C’est une approche efficace afin d’atteindre les objectifs de la procédure, générer des données consolidées pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible. Le choix de ce nombre est basé sur la littérature et sur l’expérience interne (chaque équipe effectuant les analyses ex vivo ayant une bonne connaissance de la variabilité observée chez la souris et spécifique à son type d’analyse). Les études de ce projet permettent la mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids) ou terminaux (prélèvement d’organes…) et des cinétiques complètes sur un même animal. Le design expérimental de ce projet est optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus, la sélection préalable des produits de référence qui seront utilisés dans ces études (produit positif induisant des anomalies cérébrales, produite négatif ne présentant pas de toxicité retardée) permet d’explorer dans les meilleures conditions les biomarqueurs prédictifs de toxicité.
Raffinement
Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Le jour de la chirurgie, l’ensemble des animaux sera suivi grâce à une grille de scoring comportemental effectué 1h/3h et 24h (si applicable) post-opératoire. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base sur le score d’une grille éthique de points limites spécifique à l’espèce étudiée et au projet, mise en place dès l’apparition de signes cliniques marqués. L’utilisation des produits de référence dans ce projet ne devrait pas induire de signes cliniques modérés ni marqués sur la durée de l’étude. Cependant, des signes légers ont déjà pu être observés précocement avec ces produits de référence lors des évaluations hebdomadaires comportementales et neuro-locomotrices dédiées. Par mesure de précaution, la grille éthique dédiée à ce projet pourra être utilisée si jugée nécessaire. L’administration par voie ICV est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Les administrations ICV se font de manière séquentielle afin de s’assurer du bon déroulement de la chirurgie et de ne pas inclure l’ensemble des animaux dans la procédure si des signes cliniques venaient à survenir, bien que les produits de référence soient injectés à une dose précédemment évaluée et ne devant pas induire de signes cliniques. Les animaux sont régulièrement manipulés par l’ensemble du personnel technique formé pour permettre un renforcement positif afin de générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont hébergés dans des conditions strictes de confinement avec à disposition un enrichissement spécifique (tunnel, éléments de nidification) et manipulés par du personnel formé au bien-être animal. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé chez la souris car : - La souris présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Humain et ainsi une forte valeur translationnelle. - La perte des cellules de Purkinje, qui constitue une toxicité potentielle liée à l’administration d’ASOs dans le système nerveux, a été observée dans cette espèce (et dans l’espèce Primate également) et doit être investiguée afin d’éviter que cet effet indésirable ne survienne chez l’humain en clinique. Les souris utilisées sont des jeunes adultes mâles et correspondent au sexe et à l’âge des animaux utilisés chez lesquels cette toxicité retardée a été observée avec les produits de référence.