Souris
Rôle de certains globules blancs dans le cancer du côlon inflammatoire chez la souris âgée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 096 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune suivie pendant vingt semaines, avec jusqu'à deux administrations par jour et trois pesées par semaine. Chaque souris reçoit d'abord un cancérogène, puis une substance dans l'eau de boisson une semaine sur trois, répétée trois fois, ce qui déclenche une inflammation intestinale et des tumeurs du côlon. Le porteur décrit une perte de poids, une baisse d'appétit et d'activité, des selles molles ou sanglantes, et prévoit la mise à mort de toute souris dont l'état se dégrade fortement. Les souris ont au moins dix-huit mois, âge que le porteur rapproche de 56 à 60 ans chez l'être humain, et les retombées annoncées restent des pistes qui pourraient contribuer à des approches futures, quand les tumeurs coliques, elles, sont provoquées.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines cellules de défense de l’organisme peuvent, dans certaines situations, favoriser le développement d’un cancer de l’intestin lié à une inflammation chronique. Normalement, ces cellules aident le corps à se protéger contre les infections. Cependant, des travaux récents suggèrent qu’elles peuvent aussi, de manière inattendue, contribuer à la croissance des tumeurs. Nous pensons qu’elles pourraient agir de deux façons principales : en modifiant l’environnement autour des cellules cancéreuses, ce qui faciliterait leur développement, et en réduisant l’efficacité des défenses naturelles de l’organisme contre les cellules anormales. Des premiers résultats obtenus en laboratoire indiquent que ces mécanismes pourraient rendre les tumeurs plus agressives et moins bien contrôlées par le système immunitaire. L’objectif de ce projet est de vérifier ces observations dans un modèle animal. Le projet s’intéresse également à l’effet de l’âge, car le fonctionnement du système immunitaire évolue avec le vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes qui favorisent le développement de certains cancers de l’intestin liés à une inflammation chronique et notamment chez les individus agées. À terme, les résultats pourraient permettre d’identifier de nouvelles pistes pour ralentir la progression de la maladie et améliorer la prise en charge des patients. Ces travaux pourraient ainsi contribuer au développement de futures approches thérapeutiques plus efficaces.
Procédures
Chaque souris recevra les interventions suivantes au cours de l’étude : - Une administration de l’AOM par animal à J0, d’une durée d’environ 30 secondes (contention de l’animal et administration). - Administration de la substance via l’eau de boisson pendant une semaine, selon un cycle répété trois fois, avec deux semaines d’eau de boisson standard entre chaque cycle. - Au maximum deux administrations quotidiennes par animal pendant 20 semaines, d’une durée d’environ 30 secondes chacune (contention de l’animal et administration). - Une pesée trois fois par semaine pendant toute la durée du suivi (20 semaines), d’une durée d’environ 30 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer une inflammation de l’intestin et des tumeurs du côlon, pouvant entraîner une perte de poids, une diminution de l’appétit et de l’activité, ainsi que des selles molles ou diarrhéiques, parfois avec présence de sang.
Devenir
À la fin du projet, toutes les souris seront mises à mort afin de prélever les organes nécessaires aux analyses biologiques et histologiques permettant d’évaluer l’évolution de la maladie et les effets des traitements testés.
Remplacement
Avant de travailler sur des animaux, nous avons d’abord utilisé des modèles en laboratoire (cultures de cellules). Ces expériences ont montré que certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle important. Toutefois, ces modèles ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant, où interagissent de nombreux types de cellules et de tissus, ni d’évaluer les effets pharmacologiques comme la durée de vie, la dégradation ou l’élimination des substances testées. C’est pour cette raison qu’il est nécessaire d’avoir recours à un modèle animal, afin de confirmer les résultats obtenus en laboratoire et d’étudier le comportement des traitements dans un contexte physiologique complet et réaliste.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été soigneusement calculé afin d’obtenir des résultats scientifiquement fiables tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir des données disponibles dans la littérature scientifique, des résultats préliminaires obtenus au laboratoire et affinés à l’aide d’études statistiques préalables robustes afin de garantir que le nombre minimal d’animaux nécessaire soit utilisé tout en assurant une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées par étapes. Les associations de traitements ne seront étudiées que si les traitements administrés seuls montrent au préalable un effet bénéfique significatif. Cette stratégie permet d’éviter la réalisation d’expériences inutiles et de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Lorsque cela sera possible, les mêmes animaux seront utilisés pour plusieurs analyses complémentaires et les groupes témoins seront mutualisés entre différentes expériences afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Des animaux mâles et femelles seront inclus afin que les résultats soient représentatifs des deux sexes et plus facilement transposables à la population humaine.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet. Les souris bénéficieront d’une période d’adaptation avant le début de l’étude et seront hébergées dans des cages enrichies favorisant leurs comportements naturels. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé afin de limiter le stress et l’inconfort. Les animaux feront l’objet d’un suivi régulier de leur état général, de leur poids et de l’apparition éventuelle de signes digestifs. Des critères d’arrêt précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. Tout animal présentant une dégradation importante de son état de santé sera pris en charge rapidement et, si nécessaire, mis à mort selon une méthode réglementaire validée.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris comme modèle d’étude, car elle présente de nombreuses similitudes avec l’être humain, notamment dans la manière dont le système immunitaire et les cancers évoluent. Les souris seront utilisées à 18 mois minimum, ce qui correspond à des souris âgées. Cet âge est comparable à celui d’un être humain d’environ 56 à 60 ans. Ce choix permet de mieux reproduire les conditions observées chez les personnes plus âgées, chez qui certains cancers, comme le cancer colorectal, sont plus fréquents.
Gestion de phénotypes dommageables précoces lors de l’élevage de lignées murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Les souris de ces deux lignées portent une mutation qui provoque la maladie de Dent de type 1 et une insuffisance rénale progressive à partir de dix mois. 837 souris vont être utilisées dans un élevage classé en niveau de souffrance sévère, dont la seule intervention décrite est un poinçonnage du pavillon de l'oreille de moins de trente secondes, pratiqué une fois sur animal vigile pour le génotypage. Le porteur écrit que les souris "ne devraient pas développer ces symptômes, car elles seront expédiées ou mises à mort avant l'âge de 10 mois", la gravité sévère tenant donc à la mutation elle-même et non aux gestes pratiqués. Le champ structuré du devenir compte 837 souris mortes, quand le texte décrit l'envoi d'une partie d'entre elles vers un autre établissement entre cinq et huit semaines, les autres étant tuées à dix mois ou plus tôt en cas de surplus ou de génotype non recherché.
Objectifs
Ce projet décrit la procédure d’élevage et la prise en charge du phénotype dommageable de deux lignées de souris développant progressivement la maladie de Dent de type 1. C’est une maladie génétique rénale rare causée par une mutation d’une protéine de transport, et qui entraîne une insuffisance rénale progressive. Les souris porteuses de la mutation développent les mêmes symptômes que les patients. L’étude approfondie de ces deux lignées a révélé l’existence d’atteintes précoces, apparaissant au cours des quatre premières semaines après la naissance et notamment la présence d’un retard de croissance chez les mâles disparaissant généralement après l’âge de quatre semaines. L’objectif de cet élevage est de produire des animaux reproduisant la maladie observée chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilisés dans des projets de recherche visant à développer de nouvelles pistes thérapeutiques, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par la maladie de Dent.
Bénéfices attendus
Il n’existe pour le moment aucun traitement de la maladie de Dent de type 1, une pathologie conduisant à l’insuffisance rénale. Ce projet permettra de générer des animaux nécessaires aux expérimentations qui permettront d’apporter de nouvelles perspectives conduisant au développement de pistes thérapeutiques, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par cette pathologie.
Procédures
Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l’oreille sera effectué après l’âge de 14 jours. Cette méthode consiste à prélever sur animaux vigiles un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez les souris porteuses de la mutation de la protéine de transport, un retard de croissance peut apparaître à la naissance et qui se résorbe après un mois. Une insuffisance rénale progressive apparaît à 10 mois. Chez la souris comme chez l'être humain, les signes d'une insuffisance rénale avancée sont assez généraux : fatigue, perte de poids, altération de l'état général et changements de comportement, comme un pelage moins soigné, une moindre réactivité ou une tendance à rester immobile. Toutefois, dans le cadre de cet élevage, les souris ne devraient pas développer ces symptômes, car elles seront expédiées ou mises à mort avant l'âge de 10 mois. Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due au prélèvement effectué pour le génotypage (douleur légère de courte durée).
Devenir
Une partie des souris portant le profil génétique recherché sera envoyée vers un autre établissement pour les expérimentations entre l'âge de 5 et 8 semaines (choisie après la disparition du phénotype dommageable observé à la naissance et avant l'apparition du phénotype dommageable qui survient plus tard). Une autre partie des animaux sera conservée pour l’élevage dans notre établissement. Ces souris seront mises à mort à l'âge de 10 mois, avant l'apparition du phénotype dommageable rénal, ou plus tôt si elles ne sont plus nécessaires à l'élevage (par exemple en cas de surplus d'animaux ou lorsqu'elles ne possèdent pas le profil génétique recherché). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation du bien-être animal seront mis à mort.
Remplacement
Les modèles cellulaires utilisés en laboratoire ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie. De plus, les lésions rénales semblent résulter de l'interaction entre plusieurs types de cellules présentes dans le rein. Dans ces conditions, il n'est actuellement pas possible d'étudier cette maladie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.
Réduction
Afin de répondre aux besoins expérimentaux pour le porteur de projet, le nombre d’accouplements sera limité au strict nécessaire pour obtenir les animaux requis. La production sera planifiée et suivie attentivement par l’expérimentateur et les personnels de l’animalerie afin d'adapter l'élevage aux besoins réels et d'éviter la naissance d'animaux en excès. À la fin du projet expérimental, l'élevage sera arrêté et le modèle restera accessible sous forme cryoarchivée pour utilisation ultérieure.
Raffinement
Tous les mâles porteurs de la mutation de la protéine de transport peuvent développer deux types de phénotype dommageable : un trouble observé dans les premières semaines de vie (avant 4 semaines), puis un autre touchant les reins à partir d’environ 10 mois. Dès la naissance et jusqu’à leur départ vers l’établissement d’expérimentation ou leur mise à mort, les animaux sont suivis régulièrement à l’aide d’une grille d’évaluation. Cette grille prend en compte différents critères comme l’aspect général, le comportement, la mobilité et différents paramètres cliniques. Selon les résultats de ce suivi, des mesures de raffinement peuvent être mises en place pour améliorer le bien-être des animaux, en accord avec la vétérinaire et/ou les instances de suivi du bien-être animal (sevrage retardé, disponibilité de la nourriture directement dans la cage, mise à disposition d’eau gélifiée pour réhydratation et/ou supplémentation en nutriments, suivi plus fréquent). Des points limites précoces ont été définis. Si un animal les atteint malgré ces mesures de raffinement, il sera immédiatement mis à mort. Les animaux sont envoyés entre 5 et 8 semaines, en dehors de l’âge d’apparition du phénotype dommageable. Ceux qui ne sont pas transférés pour les expérimentations sont conservés pour l’élevage, mis à mort avant 10 mois, c’est-à-dire avant l’apparition de l’insuffisance rénale.
Choix des espèces
L’équipe de recherche a choisi de réaliser leurs expériences chez la souris, car seuls des modèles animaux permettent d’évaluer correctement l’effet d’un marqueur de lésions rénales et de tester des approches visant à ralentir l’évolution de la maladie de Dent de type 1. Ces travaux complètent également des expériences déjà réalisées au laboratoire sur la même lignée de souris. Les souris de profil génétique recherché seront envoyées pour expérimentation entre 5 et 8 semaines. Les autres animaux seront utilisés pour la reproduction à partir de l’âge de deux mois, lorsqu’ils atteignent la maturité sexuelle, et ce jusqu’à 10 mois (avant les nuisances rénales), ou mis à mort après qu’une analyse génétique confirme qu’ils ne présentent pas le profil génétique d’intérêt.
Caractérisation et traitement du glioblastome par des approches théranostiques innovantes sur tumeur en place et maladie résiduelle après résection
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Jusqu'à six séances d'imagerie IRM ou SPECT-PET-CT sur une même souris, et jusqu'à quatre actes expérimentaux de trente minutes à une heure, tel est le programme des 640 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Le protocole consiste à injecter des cellules de glioblastome dans le cerveau, à créer une cavité d'exérèse pour reproduire les conditions d'une récidive, puis à administrer une radiothérapie interne sur place. Sans traitement, l'injection de cellules tumorales dégrade l'état général et peut tuer la souris au bout de trente jours. Deux souches sont utilisées, des C57BL/6JRj pour les greffes de cellules murines et des CB17-SCID immunodéprimées pour les cellules humaines, le porteur indiquant que ces dernières ne permettent pas d'étudier le rôle de l'immunité.
Objectifs
Le glioblastome est une tumeur cérébrale particulièrement agressive, son incidence de 3,3/100 000 est en augmentation, avec une multiplication par 4 sur les 10 dernières années, en faisant un véritable problème de santé publique. Une étude approfondie des caractéristiques tumorales et la découverte de potentielles nouvelles cibles pour le traitement dans différents modèles de glioblastome sont essentielles. Le projet consiste à mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques de radiothérapie interne aussi bien pour traiter les tumeurs ou leur récidive. Ces nouvelles stratégies seront basées sur des molécules qui ont été testées en amont lors d’expériences in vitro et qui méritent une attention particulière pour des développements thérapeutiques pertinents.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique en ce qui concerne les glioblastomes ou leur récidive dans le but d’améliorer la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées (durées d'environ 30 minutes à 1 heure) telles que l'injection de cellules tumorales, la création de cavité d’exérèse, l’administration de thérapies spécifiques dans le cerveau et d’un suivi par imagerie IRM / SPECT-PET-CT. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 4. Le nombre d’IRM / SPECT-PET-CT maximal réalisé sur un même animal est de 6.
Impact sur les animaux
L’administration des traitements peut entraîner une certaine fatigue et un affaiblissement rapidement réversible (environ deux jours) de l'animal. L'induction d'une tumeur par injection de cellules entraîne en l'absence de traitement une détérioration de l'état général de l'animal pouvant entraîner la mort au bout de 30 jours.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour réaliser des prélèvements.
Remplacement
Le projet ici proposé a pour but le ciblage par une thérapeutique innovante sur tumeur en place ou dans des conditions mimant la récidive pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux pour valider les étapes finales d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par des vecteurs sur tumeur en place ou dans des cavités d’exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Il n'y a d’ailleurs pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoïdes, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces cellules tumorales in vitro ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables. L'utilisation de l'imagerie pré-clinique SPECT-PET-CT a son importance en ce qui concerne l'éthique puisqu'il permet de réduire le nombre d'animaux avec un suivi longitudinal où le même animal est son propre contrôle.
Raffinement
Les animaux sont stabulés dans un environnement favorable à leur bien-être, par ailleurs vérifié par la SBEA local. Pour chaque procédure, un suivi quotidien du comportement de l'animal et de sa cicatrisation est effectué suite à la chirurgie. Le suivi de la perte de poids sera réalisé 2 ou 3 fois/semaine puis quotidiennement à partir d’environ 20 jours après la chirurgie en rapport avec la croissance tumorale. Un suivi IRM ou SPECT-PET-CT est également réalisé de manière hebdomadaire pour surveiller la progression du volume tumoral dans le cerveau de l'animal. Les animaux bénéficient d’une surveillance accrue jusqu’à leur réveil afin de détecter précocement toute forme de souffrance. Ils bénéficient de soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur avec analgésique, conditions d'hébergement optimale, enrichissement du milieu. Les animaux seront hébergés dans un environnement dont la température, l’humidité, le renouvellement de l’air ainsi que le cycle d’éclairage sont contrôlés selon les normes légales en vigueur. Un enrichissement du milieu avec des petites maison et tunnel ainsi que des frisotis est mis en place du début à la fin. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Une anesthésie gazeuse sera appliquée aux animaux lors du suivi IRM ou SPECT-PET-CT hebdomadaire.
Choix des espèces
Pour ce projet, il est nécessaire de travailler avec la souris car il est prévu d’implanter des lignées cellulaires murines (modèle syngénique de gliobastome avec la souche C57BL/6JRj). Pour les modèles xénogéniques de gliobastome, des lignées cellulaires humaines seront implantées et nécessiteront cette fois-ci la souche CB17-SCID. La raison pour laquelle il est envisagé d’utiliser des cellules murines mais aussi humaines, donc d’utiliser deux souches différentes de souris, est de pouvoir réaliser à la fois des tests à partir de cellules humaines de glioblastome mais également de pouvoir étudier le rôle de l’immunité qui n’est pas possible d'évaluer avec les modèles de glioblastomes humains. Les souris seront utilisées de 8 à 12 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.
Rôle des cellules dendritiques conventionnelles de type 1 dans l’activité antitumorale des cellules NK
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour prélèvement d'organes à la fin de chaque procédure, 1 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque souris reçoit une injection de cellules de lymphome dans la veine de la queue, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, une administration transdermique ou intragastrique de tamoxifène, et pour certaines une chirurgie d'injection dans la rate. Le porteur indique que l'injection intraveineuse disperse les cellules tumorales dans tout l'organisme, ce qui peut faire pousser des tumeurs dans le foie ou le cerveau, ou paralyser la souris par atteinte de la moelle osseuse. La grille de score règle la suite, un score léger n'entraînant aucune mesure, ce que le porteur présente comme témoignant de l'absence de souffrance, un score modéré donnant lieu à de la nourriture gélifiée et à une surveillance accrue, un score sévère à la mise à mort.
Objectifs
Le cancer est une maladie grave qui touche des millions de personnes chaque année dans le monde, et reste l’une des principales causes de décès. Ces dernières années, de nouveaux traitements appelés immunothérapies, qui utilisent les défenses naturelles de notre corps, ont permis de mieux soigner certains cancers et d’augmenter la durée de vie des patients. Ces progrès sont possibles grâce à une meilleure compréhension du système immunitaire, en particulier grâce à des études chez la souris dont le fonctionnement est proche de celui de l’humain. Parmi les cellules du système immunitaire, les cellules Natural Killer (ou cellules NK) sont très importantes : elles sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement, dans beaucoup de cas, ces cellules deviennent moins efficaces au fil du temps, comme si elles s’épuisaient. Notre projet cherche à comprendre pourquoi les cellules NK perdent leur efficacité face au cancer. Dans un modèle de lymphome chez la souris que nous avons développé, les cellules NK réagissent d’abord bien aux tumeurs, mais finissent par devenir inactives. Nous pensons que certaines cellules du système immunitaire appelées cellules dendritiques (ou DCs), produisent des substances (les cytokines) qui aident à maintenir l’activité des cellules NK. Mais, quand la tumeur grandit, elle perturbe ce soutien, ce qui rend ces dernières moins efficaces. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour étudier de plus près les échanges entre cellules NK et cellules dendritiques au cours du processus tumoral. Grâce à ces recherches, nous espérons mieux comprendre comment les cellules NK s’épuisent face à un cancer, quel rôle les cellules dendritiques jouent dans ce processus, et surtout, comment agir pour renforcer les cellules NK. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer les traitements contre le cancer.
Bénéfices attendus
Les immunothérapies ont révolutionné le traitement des cancers mais leur efficacité reste hétérogène et de nombreux patients meurent encore de cancers. Il est donc important d'améliorer l'efficacité et la compréhension des immunothérapies, afin d’en augmenter le taux de succès et donc d’allonger significativement l'espérance de vie des patients. Notre projet apportera des clés importantes pour comprendre à court terme le mécanisme d'épuisement des cellules NK en condition tumorale, le rôle des DCs dans ce processus, et ouvrira à plus long terme des nouvelles pistes d’amélioration des traitements basées sur nos résultats.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique de cellules tumorales dans la veine caudale, d’une durée de quelques secondes. La manipulation des souris lors des pesées ou de la contention entraînera un stress de courte durée. Les animaux inclus dans les différentes procédures recevront au maximum cinq injections intrapéritonéales de courte durée, ou une administration par voie transdermique ou intragastrique, également réalisée en quelques secondes. Ils pourront également subir une intervention chirurgicale unique, sous anesthésie de courte durée, permettant l’injection intrasplénique de cellules tumorales.
Impact sur les animaux
Un inconfort temporaire sera induit par l’injection de cellules tumorales dans une veine de la queue, effectuée sur des animaux éveillés, pouvant entraîner un léger stress ou une petite douleur passagère. Les manipulations nécessaires pour peser les animaux ou les maintenir immobiles provoquent un stress de courte durée. La technique d’administration de substance par voie intragastique peut être modérément douloureuse, le temps de l’intervention, si le geste n’est pas maitrisé. Les injections intrapéritonéales de certains produits peuvent générer un léger stress ou une petite douleur passagère. Le développement des tumeurs elles-mêmes peut entraîner des douleurs chez les animaux. En effet, l'injection par voie intraveineuse des cellules tumorales entraîne leur dissémination dans tout l'organisme, ce qui peut favoriser le développement tumoral dans des organes vitaux (foie, cerveau) ou entrainer une paralysie suite à l’atteinte de la moelle osseuse. D'autres effets indésirables peuvent être observés tels qu'une perte de poids ou une modification du comportement (prostration). Enfin, l’injection intrasplénique, nécessitant une chirurgie, peut entraîner une douleur post-opératoire, du stress, ainsi qu’un risque de saignement, d’infection et de complications liées à l’anesthésie, que nous limiterons par l’utilisation d’antibiotiques et d’anti-inflammatoires, ainsi que par une surveillance accrue.
Devenir
A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles.
Remplacement
Ce projet nécessite la comparaison de différents modèles murin pour réaliser des mesures de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours du développement tumoral. De plus, dans ce projet, nous avons besoin de mesurer différentes réactions du système immunitaire pendant un développement de tumeur, directement dans un organisme vivant. Cela s’explique par la complexité du système immunitaire, qui repose sur de nombreuses interactions entre différents types de cellules. Ces échanges sont essentiels au bon développement des réponses immunitaires et à leur capacité de réagir face à une tumeur. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle vivant complet, comme la souris, pour pouvoir observer ces mécanismes dans leur ensemble, dans des conditions proches de la réalité. Les modèles alternatifs dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre cellules immunitaires dans le développement tumoral du lymphome
Réduction
Nous ferons tout pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet, tout en garantissant la qualité des résultats. Pour cela, nous travaillerons avec une souche de souris, qui a l’avantage de donner des résultats plus homogènes entre les individus. Cela nous permet de limiter le nombre de souris à 3 ou 10 par groupe, selon les expériences. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique garantissant la fiabilité des résultats obtenu. Chaque expérience sera reproduite plusieurs fois (jusqu’à 2 fois), car la croissance des tumeurs peut varier d’une souris à l’autre. La stratégie expérimentale a été conçue afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse des résultats. Une approche progressive est mise en place, avec des phases d’optimisation en amont (procédures 1 à 4) permettant de définir précisément les conditions expérimentales (modalités de déplétion, doses, cinétiques), afin d’éviter la répétition d’expériences in vivo inutiles. De plus, si lors des expériences principales aucune différence n’est observée entre les groupes traités et les groupes témoins, nous pourrons réduire le nombre de répétitions pour ces derniers, ce qui contribuera encore à limiter l’utilisation d’animaux dans l’ensemble du projet. Enfin, la procédure 7 permettra d’évaluer une méthode alternative d’injection des cellules RMA-KR, visant à limiter la variabilité interindividuelle et à éviter les décès liés à la dissémination dans les organes vitaux observée avec l’injection intraveineuse, ce qui contribuerait à réduire le nombre de souris nécessaires pour de futurs expériences.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Pour les animaux provenant de fournisseurs, une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera observée avant leur inclusion dans les procédures. Le poids, l’apparence et l’activité de l’animal seront observés quotidiennement. Des points limites définis et spécifiques ont été mis en place selon une grille de score. Si le score cumulé est considéré comme léger, aucune mesure ne sera prise témoignant de l’absence de souffrance. Si le score cumulé est considéré comme modéré alors des mesures correctives seront prises et seront adaptées à la situation (introduction d’enrichissement, surveillance accrue, mise à disposition de nourriture humidifiée ou gélifiée). Enfin, si le score cumulé est considéré comme sévère alors les animaux seront mis à mort. Pour l’administration du tamoxifène, nous privilégierons des méthodes douces, notamment l’administration transdermique. En cas d’échec, une administration par voie intragastrique sera effectuée par du personnel formé, dans le but de minimiser le stress pour les animaux. De même pour les injections intrapéritonéales, dans la veine caudale et l’injection intrasplénique.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus adapté pour ce type d’étude, car elle se reproduit rapidement, sa taille est pratique pour la recherche, et son patrimoine génétique est bien connu. Cela nous permet de réaliser des manipulations précises, y compris avec des souris génétiquement modifiées, indispensables pour nos expériences. Le fonctionnement de l’organisme de la souris est assez proche de celui de l’humain, en particulier pour ce qui concerne le système immunitaire. Étudier la souris nous aide donc à mieux comprendre les mécanismes immunitaires chez l’homme. Nous utiliserons des souris des 2 sexes âgées de 7 à 30 semaines, car, à cet âge, leur système immunitaire est arrivé à maturité. Pour éviter les différences liées à l’âge au sein d’un même groupe, nous veillerons à ce que les souris d’un même groupe aient au maximum 2 semaines d’écart, ce qui garantit une meilleure fiabilité des résultats.
Traitement par nanoparticules des cancers hépatobiliaires dans des souris 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Pour tester le chauffage de tumeurs par nanoparticules sous laser ou champ magnétique, 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Elles subissent une chirurgie d'implantation de tumeurs des voies biliaires, des injections dans la tumeur et par voie générale, jusqu'à quatre séances de traitement de dix minutes sous anesthésie, des échographies de suivi et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Le porteur qualifie de légers et de courte durée le stress et la douleur liés à chaque geste, sans décrire ce que produit la croissance tumorale elle-même. Il indique développer en parallèle des cultures cellulaires en trois dimensions pour trier les molécules en amont, ce qui réduirait le nombre de souris, et conclut que ces cultures ne suffisent pas pour évaluer les effets indésirables ni la réponse immunitaire.
Objectifs
Les cancers des voies biliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA), sont difficiles à traiter. Le développement de nanoparticules permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements systémiques conventionnels. Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'une thérapie anticancéreuse localisée par nanoparticules en association ou non avec une thérapie par voie générale et une exposition à un rayonnement Laser ou un champ magnétique. L’évolution du volume tumorale sera suivie par échographie. L’imagerie permettra aussi de suivre la diffusion et l’élimination des nanoparticules utilisées. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux les plus efficaces avec les meilleures diffusions et sans effet indésirable à long terme.
Bénéfices attendus
Les cholangiocarcinomes (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressifs. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche de traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposées seules ou en combinaison avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet a pour objectif de tester dans des modèles expérimentaux murins, le traitement par nanohyperthermie dans des tumeurs de CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral de la nanohyperthermie dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux locorégional applicable en santé humaine, permettant de réduire à la fois les doses de chimiothérapies et les effets secondaires de ceux-ci dans le cas d'un traitement combinatoire. Au-delà du CCA, la nanohyperthermie pourrait être également utilisée pour traiter d’autres cancers digestifs (péritoine, tubes digestifs, foie, pancréas).
Procédures
- Injections durée 10-20 secondes/animal - Traitement sur souris anesthésiées 10 minutes/souris, répété 4 fois max. - Anesthésie gazeuse durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins sur animal vigile, durée 5 min/souris.
Impact sur les animaux
-injections cutanées : stress et douleur légère de courte durée -anesthésie et chirurgie d'implantation de tumeurs : stress et douleurs modérée -Injections intratumorale et systémiques : stress et douleurs légères de courte durée - Prélèvement sanguin vigile : stress et douleur légères e de courte durée - Anesthésie Gazeuse : un stress légéer de courte durée.
Devenir
Les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Il n'est actuellement pas possible de simuler le développement d'un cancer avec tous ses aspects dans un modèle in vitro. Neanmoins, nous développons également des modèles cellulaires in vitro en 3 dimensions afin de sélectionner les molécules, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque l'effficacité de certaines molécules pourra être testée en amont. Cependant ces expériences menées sur ces modèles cellulaires ne sont pas suffisants et ne permettent pas de remplacer les animaux, notamment pour évaluer la réponse avec un système immunitaire ou pour évaluer les effets indésirables.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Compte tenu des données existantes et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique sera utilisé en pré-opréatoire et en post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence des expériences et études en cancérologie car elle permet de représenter le comportement d'une tumeur se développant chez le patient (réponse immune, diffusion des traitements dans l'organisme). La possibilité de disposer d'animaux de fond génétique défini permet limiter les variabilités biologiques et de mieux identifier les effets des thérapies. Les animaux seront utilisés à l'âge de 5 à 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection des cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop agées induirait un biais dans l'expérimentation.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies oligonucléotidiques pour moduler l’expression de l’alpha-synucléine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une chirurgie de trente minutes à une heure pour atteindre le cerveau, puis des injections répétées toutes les deux semaines par cathéter pendant six mois, voilà ce qui attend une partie des 2 075 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. D'autres reçoivent des injections sanguines hebdomadaires, également jusqu'à six mois, et peuvent être gardées six mois de plus après la dernière. Le travail cherche à réduire la production d'une protéine impliquée dans la maladie de Parkinson, chez des souris porteuses du gène humain entier. Les molécules retenues pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques, formulation que le porteur emploie deux fois, quand la douleur modérée, le risque d'infection et la perte de poids sont annoncés au présent.
Objectifs
Notre équipe travaille sur des traitements potentiels pour la maladie de Parkinson. Cette maladie peut parfois être liée à des changements dans certains gènes, qui perturbent le fonctionnement et la survie des neurones. Un de ces gènes joue un rôle important car il peut entraîner l’accumulation d’une protéine dans le cerveau, ce qui contribue au développement de la maladie. Notre approche consiste à trouver des futurs traitements capables de réduire la production de cette protéine, dans le but de ralentir ou limiter la progression de la maladie, et qui pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier un ou plusieurs outils thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de la maladie de Parkinson. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules efficaces et qui pourraient ensuite être testées dans de futurs essais cliniques.
Procédures
Chaque animal ne reçoit qu’un seul type d’injection (dans le sang ou le cerveaux) avec une seule molécule, pour voir si elle est efficace. Les injections dans le sang sont rapides (moins d’une minute) et peuvent être répétées toutes les semaines, jusqu’à 6 mois. Les injections dans le cerveau nécessitent une chirurgie qui dure entre 30 minutes et 1 heure. Elles peuvent aussi être répétées (durée d’environ 5 minutes, sans chirurgie grâce à un cathéter, ) toutes les deux semaines, pendant un maximum de 6 mois. Les souris pourront être gardées jusqu’à 6mois après la dernière injection.
Impact sur les animaux
Les injections dans le sang ou dans le cerveau peuvent induire une douleur modérée sur de courte période. Elles peuvent également entraîner un risque de faible perte de poids et de risque d’infection.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’analyser, au niveau des organes, les effets des molécules injectées.
Remplacement
La recherche en bioinformatique de candidats et les analyses réalisées sur modèles cellulaires permettent d’effectuer un premier criblage des molécules. Cependant, aucun modèle cellulaire ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est donc indispensable de mener ces études dans un modèle animal, qui permet d’évaluer l'efficacité de la molécule.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats représentatifs et fiables. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon les conditions réglementaires en vigueur. La fréquence des injections pourra être réduite si les résultats initiaux indiquent une efficacité suffisante de la molécule. De la nourriture en gelée sera mise à disposition dans les cages des individus fragiles ou ayant subi une procédure, afin de faciliter leur prise alimentaire. De plus, toutes les interventions douloureuses seront précédées de l'administration d’un antidouleur et se feront sous anésthésie. Un suivi, accompagné d’une grille d’évaluation, sera assuré tout au long de la procédure et des mesures seront prises afin d'éviter toute souffrance inutile (utilisation de points limites ou critère d’arrêt précoce).
Choix des espèces
L’utilisation de souris portant le gène humain entier nous permettra d’évaluer la capacité de nos molécules à diminuer l’expression de la protéine responsable de la progression de la maladie dans le cerveau. La souris étant l’un des modèles les plus utilisés et les mieux documentés en recherche préclinique, ce modèle est particulièrement pertinent pour ce type d’étude. L’objectif étant de diminuer l’expression de la protéine responsable de la progression de la maladie de Parkinson qui se développe chez l’adulte, les études seront réalisées à partir du stade jeune adulte chez la souris jusqu'à un âge plus avancé.
Etude de la pharmacocinétique sanguine de l’amoxicilline, la ceftriaxone et la gentamicine chez la souris
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
46 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit trois injections, deux d'antibiotiques et une d'anesthésique, puis subit une ponction de sang directement dans le cœur sous anesthésie fixe, pour suivre pendant deux heures le passage de l'amoxicilline, de la ceftriaxone et de la gentamicine dans le sang. Aucune souris n'est infectée, et l'efficacité de l'association antibiotique contre la listériose sera testée plus tard, dans un autre projet. Sur le remplacement, le porteur écrit que le recours à la lignée murine s'avère actuellement "indispensable" et que le passage par l'animal reste "une étape obligatoire et réglementaire", tout en reconnaissant que des données de pharmacologie de ces trois antibiotiques existent déjà dans la littérature.
Objectifs
L’objectif du projet est de caractériser la pharmacocinétique sanguine de 3 antibiotiques sur une période de 2h après injection, chez la souris non infectée. Cette caractérisation permettra d’évaluer le devenir des molécules, depuis leur entrée jusqu'à leur élimination en fonction du temps et ainsi d’avoir les bonnes concentrations et fréquence d’administration dans un modèle sain pour en évaluer leur efficacité ultérieurement (dans un modèle d’infection à Listeria).
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice susceptible de découler de ce projet est une nouvelle association de deux des antibiotiques testés afin de soigner l’infection invasive à Listeria, en comparaison au traitement de référence. Cette efficacité sera testée ultérieurement dans un autre projet.
Procédures
Les interventions sont : - les deux injections d’antibiotique (l’une en intrapéritonéal, l’autre en sous-cutanée), ainsi que l’injection de l’anesthésique en intrapéritonéal. Chaque injection dure 20secondes, soit une durée totale estimée à 1min par animal. - Une ponction intracardiaque de sang sera également réalisée sous anesthésie fixe. Cet acte, incluant la préparation et le prélèvement, dure maximum 1min par animal.
Impact sur les animaux
L’effet indésirable principal est lié à la douleur, légère, et de courte durée générée par les trois injections (l’une en sous cutanée, l’autre en intra-péritonéal, et enfin, une dernière en intra-péritonéale pour l’administration de l’anesthésie fixe).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de doser les différents composés étudiés.
Remplacement
La principale stratégie de remplacement de l’expérimentation animale reposerait sur l’utilisation de modèles in vitro (cultures cellulaires, tests enzymatiques, modélisations pharmacocinétiques). Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire fidèlement la complexité physiologique d’un organisme vivant. Ainsi, le recours au modèle murin s’avère actuellement indispensable, car il constitue la seule approche permettant de relier les concentrations plasmatiques observées à la réalité de la réponse biologique. Pour l’heure, le recours à l’animal reste une étape obligatoire et réglementaire dans le développement de nouvelles associations thérapeutiques à visée anti-infectieuse. Des données de pharmacologie de ces 3 antibiotiques sont disponibles dans la littérature. Néanmoins, elles restent limitées, réalisées dans des modèles murins différents (espèces, âge, sexe) qui ne permettront pas de s’assurer d’obtenir une pharmacocinétique précise dans notre modèle. L’étape suivante étant dans un projet ultérieur de tester l’efficacité de différents schémas antibiotiques, et d’en évaluer la synergie, il est indispensable d’obtenir des données fiables de pharmacocinétique pour en interpréter les résultats. La synergie du couple antibiotique ceftriaxone et amoxicilline étant obtenue in vitro à partir d’une concentration de ceftriaxone de 2 mg/L, il est impératif de s’assurer d’obtenir de telles concentrations sanguines sur un temps prolongé dans notre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux hypothèses a été réduit à 4 par groupe (par temps d’évaluation) pour la caractérisation de la pharmacocinétique de ces 3 antibiotiques. Nous administrerons les 3 antibiotiques aux mêmes animaux, au lieu de réaliser l’administration de chaque antibiotique sur des animaux distincts afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire et dans la mesure où l’injection concomitante de ces 3 antibiotiques n’est pas associée à une modification de leur pharmacocinétique. Aucun test statistique comparatif ne sera appliqué aux résultats des dosages, l’objectif étant avant tout descriptif.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées par du personnel formé et habilité. Les données de la littérature disponibles ne montrent pas de toxicité de ces 3 antibiotiques aux concentrations testées. Un suivi clinique rigoureux sera mis en place tout au long de l’expérimentation (état général, comportement, activité, respiration, poids), permettant une détection précoce de toute souffrance. Le choix d’un temps expérimental court permet une observation continue des souris et d’anticiper au mieux l’atteinte des points limites. L’environnement expérimental sera adapté (enrichissement du milieu, période d’acclimatation, hébergement en groupe de 5 ou 10) afin de favoriser le bien-être animal.
Choix des espèces
Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la pharmacocinétique. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection invasive à Listeria dans d’autres projets. Souris de 8-10 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-25g.
Nouvelle thérapie cellulaire dans le cancer de l’ovaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour tester des lymphocytes tueurs associés à des anticorps contre le cancer de l'ovaire, 2 160 souris vont être utilisées sur quatre ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est totalement immunodéficiente, dépourvue de toute cellule immunitaire, afin d'évaluer l'effet de la thérapie cellulaire seule. Toutes reçoivent une injection de cellules tumorales puis un traitement, 360 sont anesthésiées à l'isoflurane deux fois par semaine, et toutes subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie. Elles sont tuées soit parce qu'elles ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur. Le porteur annonce une thérapie plus efficace et mieux tolérée pour des patientes, quand le résultat attendu du projet se limite à démontrer un effet sur des tumeurs greffées, et signale une perte de poids et une nécrose tumorale déjà observées lors d'études préliminaires.
Objectifs
En france, le cancer de l'ovaire touche environ 4500 femmes chaque année et entraîne près de 3000 décès ce qui en fait le cancer gynécologique le plus meurtrier. Dans le monde, il figure parmi les cancers féminins les plus fréquents et il est souvent diagnostiqué tardivement car les symptômes sont peu spécifiques. Résultats : les traitements arrivent à un stade avancé de la maladie. Les traitements actuels reposent sur la chirurgie et la chimiothérapie et permettent d’obtenir une rémission chez de nombreuses patientes mais les rechutes sont fréquentes et les effets secondaires importants. Il existe donc un besoin urgent de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées. Notre projet s’inscrit dans un effort de recherche visant à utiliser les défenses naturelles de l’organisme pour lutter contre le cancer. Il a pour objectif de développer une nouvelle thérapie qui permet de mieux cibler les cellules cancéreuses tout en limitant les effets sur les tissus sains. L’idée est de proposer à terme des traitements plus efficaces et plus sûrs pour les patientes. Nous nous intéressons à un type particulier de cellules du système immunitaire, que l’on peut considérer comme des « cellules tueuses » naturelles. Ces cellules ont plusieurs avantages : elles sont capables de reconnaître et de détruire des cellules cancéreuses sans modification particulière, elles peuvent être facilement multipliées à partir d’un simple prélèvement sanguin, et elles peuvent être utilisées chez différents patients, même lorsqu’elles proviennent d’un donneur. Un autre atout important est leur capacité à s’associer à des anticorps, c’est-à-dire des molécules qui reconnaissent très précisément les cellules cancéreuses. En combinant ces cellules tueuses avec des anticorps, nous pouvons les « guider » pour qu’elles ciblent spécifiquement les cellules tumorales, tout en épargnant les cellules saines. Pour tester cette approche, après les tests en laboratoire, nous utilisons des modèles de tumeurs chez l’animal qui reproduisent les tumeurs humaines. Cela permet d’évaluer plus précisément l’efficacité du traitement, et de vérifier toxicité et l’efficacité globale de la thérapie. L’originalité de notre projet repose sur la combinaison de deux approches innovantes : des anticorps de nouvelle génération, conçus pour mieux reconnaître les cellules cancéreuses, et l’utilisation de ces cellules tueuses « armées » pour les attaquer.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer, sur un modèle de tumeur primaire et métastsatique ovariennes que l’utilisation d’une thérapie cellulaire innovante basée sur des Lymphocytes en combinaison avec des anticorps thérapeutiques déjà utilisés en clinique permet d’améliorer les effets du système immunitaire tout en réduisant les effets secondaires. Cette approche a deux objectifs principaux : 1. Améliorer la spécificité du traitement. 2. Favoriser son efficacité.
Procédures
Au cours du projet, les souris seront soumises à plusieurs types d'interventions, réalisées sous anesthésies et avec prise en charge de la douleur lorsque nécessaire. L'ensemble des animaux (2160 souris) recevront une injection de cellules tumorales (15 secondes/souris) puis une injection de traitements médicamenteux (10 secondes par souris). Sur l'ensemble des animaux 360 seront anesthésiées par isoflurane deux fois par semaine (10 min/animaux). Une analgésie et une anésthésie générale sont systématiquement utilisées et les animaux sont surveillés après l'intervention jusqu'à leur réveil complet. À différents moments de l'étude, l'ensemble des animaux feront l'objet d'un prélèvement sanguin, réalisé sous anesthésie afin d'éviter toute douleur. Cette intervention dure en moyenne 20 secondes par animal. Ce prélèvement permet d'analyser la présence de cellules tumorales et d'ADN tumoral dans le sang.
Impact sur les animaux
On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des souris. La douleur associée à l'injection de cellules est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs et des métastases sera suivi par des mesures régulières ainsi leur développement ne devrait pas créer de contraintes particulières chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements, des études préliminaires ont montré une perte de poids, nécrose de la tumeur, inflammation ; Aucune autre nuisance ni effet indésirable n’est prévisible.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.
Remplacement
Comme évoqué précédemment, il est essentiel de démontrer l’efficacité de cette nouvelle thérapie cellulaire, notamment dans le cadre de l’utilisation d’anticorps en traitement du cancer. Cette preuve a déjà été obtenue en laboratoire (in vitro), mais elle doit maintenant être confirmée dans des modèles précliniques chez la souris, qui reproduisent des tumeurs solides proches de celles observées chez la femme. Ces modèles sont les seuls qui permettent d’évaluer à la fois l’efficacité de la thérapie sur la croissance des tumeurs, de valider cette nouvelle façon d’utiliser les anticorps, et de mieux comprendre les mécanismes de la réponse immunitaire contre le cancer. À ce stade du projet, il n’est plus possible de remplacer les modèles animaux par des modèles in vitro, car ces derniers ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre les cellules tueuses et les cellules tumorales. Les modèles précliniques sont encore peu développés dans le domaine des immunothérapies, en particulier pour ces cellules tueuses, qui sont rares et difficiles à étudier. Même si des premiers tests ont déjà été réalisés sans utiliser d’animaux, une étape chez l’animal reste indispensable pour valider la thérapie avant d’envisager des essais chez l’être humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera au maximum de 2160 souris sur 4 ans. Ce nombre a été déterminé afin de permettre une évaluation complète de notre thérapie, à la fois sur son efficacité contre les tumeurs et sur les mécanismes biologiques impliqués.Le projet a été conçu pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chaque étape expérimentale ne sera réalisée que si les résultats de l’étape précédente sont concluants, et des études pilotes seront mises en place avant les expériences principales.Le nombre d’animaux par groupe a été défini à l’aide de modèles mathématiques et d’outils statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire.Par ailleurs, notre expérience dans les modèles de cancer, notamment du cancer de l’ovaire, ainsi que notre expertise dans l’utilisation des cellules tueuses et dans les techniques expérimentales, nous permettent d’optimiser les protocoles et de limiter les pertes, contribuant ainsi à réduire encore le nombre d’animaux nécessaires. De plus grâce à notre maîtrise et à notre connaissance des gestes de greffe ou d’administration en sous- cutané et en intrapéritonéale, nous éviterons les artefacts et les pertes liées à l’expérimentateur.
Raffinement
Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Les différentes molécules seront utilisées en administration locale en une seule administration dans un composé permettant leur diffusion dans le temps, permettant d’éviter tout effet secondaire et d’éviter des administrations répétées. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée.
Choix des espèces
Dans un premier temps nous utiliserons une espèce murine immunodéficiente dans notre étude. Cette dernière est la plus relevante pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence les effets de nos molécules sur le long terme. Ces souris, au contraire des autre lignées immunodéficientes, sont totalement immunodéficientes donc ne possèdent aucune cellule immunitaire ce qui nous permettra d’étudier l’efficacité seule de notre thérapie cellulaire. Dans un second temps l’étude portera sur des modèles murins immunocompétents afin d’étudier l’effet de notre thérapie sur des modèles plus complexes contenant tout le micro-environnement tumoral. L’âge des animaux utilisés dans cette étude est de 7 à 8 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité, et âge le plus approprié pour atteindre l’objectif scientifique de l’étude. En effet, le cancer de l’ovaire est une pathologie qui touche majoritairement des femmes adultes, avec un âge médian au diagnostic d’environ 63 ans. L’utilisation d’animaux à un stade adulte permet ainsi de se rapprocher au mieux des conditions physiopathologique observées chez les patients.
Imagerie multimodale de carcinome hépato-cellulaire (CHC) dans des modèles murins syngéniques et xénogéniques
- Recherche appliquée
- Cancers
1 000 souris subissent une chirurgie abdominale de trente minutes pour l'injection de cellules cancéreuses dans le lobe hépatique gauche, une partie après douze semaines d'injections intrapéritonéales bi-hebdomadaires destinées à installer une cirrhose. 1 030 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une IRM une à deux fois par semaine sous anesthésie et des séances d'imagerie nucléaire pouvant durer deux heures. Le porteur écrit que les procédures d'imagerie "présentent la seule nuisance d'injecter le radiotraceur dans une veine de la souris", et décrit par ailleurs des péritonites, des lésions cutanées et un stress chronique possibles après les administrations répétées dans l'abdomen. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Le carcinome hépato-cellulaire est la cancer du foie le plus courant et représente le 6ème cancer en termes d’incidence mondiale et le 3ème cancer en termes de mortalité. Son pronostic est donc des plus sombres. De plus, les experts estiment que son indicence devrait doubler d’ici à 2050. Il représente donc un enjeu mondial de santé publique. Le diagnostic du carcinome hépato-cellulaire revêt un caractère primordial dans la prise en charge précoce du patient. Or, les outils actuels ne sont pas assez performants car soient trop invasifs soit pas assez spécifiques ou soient pas assez sensibles. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer différentes molécules associées à un atome radioactif (= radiotraceurs) en imagerie nucléaire pour améliorer le diagnostic. De plus, ces radiotraceurs peuvent aussi donner des informations essentielles aux médecins pour mieux prendre en charge le patient. Les modèles animaux sont primordiaux pour la réalisation de ce projet et doivent refléter au plus près les carcinomes hépato-cellulaire rencontrés en clinique humaine qui se développent généralement dans des contextes de foies cirrhotiques. Sur les modèles murins mis en place, plusieurs molécules ciblant les cellules du cancer du foie seront évaluées et comparées lors d’expérimentations en imagerie nucléaire.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier de nouveaux radiotraceurs pour imager les lésions cancéreuses dans le but d’améliorer la prise en charge des patients. Ces radiotraceurs ont pour but de combler un manque dans le diagnositc actuel de cette pathologie et d’apporter des informations supplémentaires sur les lésions hépatiques dans un but pronostique. Enfin, cette étude permettra d’étudier le potentiel de ces radiotraceurs dans le cadre d’une radiothérapie interne vectorisée.
Procédures
Prélèvements sanguins (1 min/souris) sur souris anesthésiées et en présence d'antalgique (1030 souris). Greffe de cellules cancéreuses dans le foie (30 min/souris) : souris anesthésiées + analgésiées. Chrirugie abdominale en condition d’aséptie. Injection des cellules tumorales dans le lobe hépatique gauche. Sutures des deux plans (1000 souris). Induction chimique d’une cirrhose (15 min/souris) : injection intrapéritonéale bi-hebdomadaire pendant 12 semaines maximum. Imagerie par raisonnance magnétique (IRM) (15 min/souris) : souris anesthésiées et après application d’un gel de protection oculaire. Imagerie 1 à 2 fois par semaine (1030 souris). Imagerie nucléaire (entre 10 et 120 minutes/souris) : injection du radiotraceur dans la veine de la queue sur animal vigil puis imagerie sur souris anesthésiées et après application d’un gel de protection oculaire (800 souris).
Impact sur les animaux
Les procédures visant à imager les animaux présentent la seule nuisance d'injecter le radiotraceur dans une veine de la souris. Des nuisances plus importantes sont envisagées lors de l’induction et de l’installation des cirrhoses hépatiques et lors de la chirurgie mise en place pour la greffe des cellules du cancer du foie dans un lobe hépatique. Le développement des tumeurs peut également engendrer des nuisances. La douleur liée à la chirurgie sera gérée par un traitement analgésique préventif et post-opératoire adapté. L’administration répétée dans l'abdomen de la souris peut engendrer des complications (stress chronique, lésions cutanées, péritonites). L’évolution de la cirrhose peut éventuellement induire des douleurs. Pour toutes ces nuisances et effets indésirables, l’état général sera contrôlé quotidiennement selon une grille de score permettant d’évaluer les différents pallier de douleur. L’administration d’analgésique sera en accord avec les palliers de douleur.
Devenir
Pour toutes les procédures les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
L’imagerie nucléaire s’intéresse à la pharmacocinétique d’un radiotraceur dans un organisme complexe. Il s’agit d’étudier le comportement de molécules radiomarquées une fois injectées dans un organisme. Cela met en jeu tous les organes et de ce fait, ne peut pas être remplacée par des modèles in silico ou in vitro. De plus, les pathologies telles que les carcinome hépato-cellulaire impliquent des processus physiologiques complexes mettant en jeu de nombreuses intéractions entre les différentes cellules de l’organisme.
Réduction
Les radiotraceurs seront d’abord testés in vitro avant d’être injectés chez la souris. Une même souris pourra recevoir plusieurs radiotraceurs permettant ainsi de réduire le nombre de souris nécessaire. Cela sera possible seulement pour les radiotraceurs qui porteront un atome dont la demi-vie radioactive est très courte comme le fluor-18 (110 min ou le gallium-68 (68 min). En revanche, pour les atomes radioactifs à demi-vie plus longue comme le cuivre-64 (12.7h) ou le zirconium-89 (78h), ce multiple emploi ne pourra pas être effectué. Pour chaque étude, le nombre d’animaux utilisés sera réduit à un minimum acceptable pour obtenir des informations robustes et statistiquement pertinentes. Les statistiques seront réalisées sur un logiciel dédié selon un T-test non paramétriques pour les analyses intergroupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par 3 ou 5 avec des frisottis pour pouvoir faire un nid, avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine. Lors de la chirurgie, les souris seront anesthésiées et se verront administrer des antalgiques avant et après l'acte chirurgical. L'ensemble de la chirurgie se déroule sur tapis chauffant et dans des conditions d'asepsie (champs, gants, manchettes, instruments et seringues stériles). Pendant la chirurgie, l'hydratation des souris est maintenue par l'injection de sérum physiologique tiédi à 37°C. Les souris feront l’objet d’une surveillance accrue dans les 24h après la chirurgie. Cette surveillance sera relâchée si la récupération est complète. D’autre part, les animaux seront pesés régulièrement et un suivi quotidien de leur état général sera mis en place selon une grille de score comportant 4 palliers (0 : absence de douleur, 3 : douleur sévère). L’évaluation quotidienne permettra d’ajuster le traitement analgésique. Suite aux greffes et induction de cirrhose, l’imagerie par IRM permettra de bien contrôler l’état du foie et la progression tumorale. Lors de l'étape de greffe des cellules tumorales, les souris sont préalablement analgésiées 30min avant l’intervention.
Choix des espèces
Les dispositifs d’imagerie dont nous disposons dans le laboratoire sont seulement adaptés aux souris ce qui restreint notre choix aux souris. Enfin, des modèles similaires sont rapportés dans la littérature scientifique, des protocoles éprouvés et publiés pourront servir de base pour la mise en place de nos modèles. Les souris seront utilisées à partir de 7 semaines après leur naissance, lorsque les souris ont atteint l’âge adulte, le carcinome hépato-cellulaire ne touchant que les adultes. Pour les souris saines greffées, le suivi de la pathologie par IRM se fera sur 6 semaines maximum après la greffe. Pour les souris cirrhotiques greffées, le protocole nécessite 12 semaines d’injection bi-hebdomadaire de TAA avant la greffe des cellules tumorales. Après cette greffe, le suivi de la pathologie par IRM se fera sur 6 semaines maximum.
Etude d’une voie de signalisation régulant les cellules rénales chez la souris (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie pour prélèvement des reins. Chaque souris boit une eau sucrée contenant une molécule qui active ou inactive un gène, subit une surcharge en acide ou en bicarbonate pendant sept jours, des prélèvements sanguins, et jusqu'à cinq jours en cage métabolique, isolée de ses congénères sur une grille de collecte d'urine. L'objet du travail est le rôle d'une protéine dans la régulation de l'équilibre acido-basique du rein, des cultures cellulaires ayant déjà suggéré son implication. Le porteur annonce un effectif maximal de 500 souris tout en indiquant qu'il est certain que le nombre réel sera inférieur, et écrit vouloir "valoriser au maximum les animaux utilisés" en constituant des banques de matériel biologique.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment des cellules rénales, régulent l’équilibre acido-basique de l’organisme. Cet équilibre est essentiel pour le bon fonctionnement des organes et des réactions biochimiques. Les reins jouent un rôle clé en ajustant la quantité d’acide ou de base excrétée dans l’urine, en réponse aux variations de l’alimentation ou du métabolisme. Nous étudierons spécifiquement le rôle d’une protéine en réponse à une surcharge de base. Des résultats préliminaires dans des cellules en culture suggèrent que cette protéine est impliquée dans la réponse des cellules du rein aux bases et plus généralement dans la régulation de l’équilibre acido-basique. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées, dont le gène codant pour cette protéine est inactivé. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent cet équilibre, et pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles acido-basiques qui peuvent survenir dans certaines maladies rénales ou métaboliques. Le projet se déroule dans 2 animaleries distinctes.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet améliorera la compréhension des mécanismes régulant l’acidité du sang, un processus vital pour la santé. D’autre part, ils pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres de l’état acido-basiques visibles chez un nombre important de patients en réanimation, chez des malades sous dialyse ayant une maladie chronique du rein. Ces prises en charge représentent un coût important pour la société en raison des hospitalisations prolongées, des traitements lourds et de la diminution de la qualité de vie des patients. À plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces, permettant de réduire les complications médicales, d’améliorer la qualité de vie des patients et de diminuer les dépenses de santé associées. Ces résultats contribueront également à la recherche fondamentale sur le fonctionnement du rein et et le maintien de l’équilibre des ions dans l’organisme.
Procédures
Nombre total d’animaux : 500 souris (adultes, mâles et femelles). Les souris seront soumises aux interventions suivantes : -> 84 souris vigiles subissent une injection (durée de l’injection quelques secondes) ainsi qu’un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 56 souris vigiles subissent un traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours, un prélèvement de sang (30 secondes) sous anesthésie générale chimique (durée 10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 64 souris transgéniques vigiles subissent l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson (5 ou 10 jours) (EU 2/2 ou EU 1/2) -> 128 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson pour inactiver un gène - injection d’une solution (quelques secondes) suivie d’un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale. - Après une récupération de 10 jours, une surcharge plus longue (7 jours) en bicarbonate est entreprise. Des mesures urinaires en cages métaboliques pendant 5 jours et prise de poids quotidienne sont réalisées. Un prélèvement sanguin (3minutes) sous anesthésie locale est ensuite réalisé à la fin de cette période. -> 168 souris transgéniques vigiles auront l’ensemble des manipulations suivantes : (EU 2/2 ou EU 1/2) - administration d’une molécule dans l’eau de boisson ou par lors d’une injection (quelques secondes) pour activer un gène. - une surcharge en acide ou bicarbonate (7 jours) sera entreprise. Toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale chimique (10 minutes). (EU 2/2 ou EU 1/2)
Impact sur les animaux
Le stress est modéré lors des prélèvements sanguins, atténué par l’utilisation d’anesthésiques locaux (collyre) ou lors d’une anesthésie générale. L’inconfort est transitoire après des prélèvements sanguins, avec surveillance post-opératoire pour détecter tout signe de souffrance (prostration, perte de poids importante). La perte de poids lors de l’habituation aux cages métaboliques est temporaire et limitée. De plus, les souris sont isolées de leurs congénères dans ces cages et placées sur une grille permettant la collecte quotidienne d’urine. La molécule permettant l’inactivation du gène ou la stimulation d’un autre gène est mélangée à une eau légèrement sucrée pour que les souris la boivent sans difficulté. La pesée des souris pour le suivi de leur poids ou avant une anesthésie n’induira qu’un stress minime. Une anesthésie générale est réalisée par du personnel expérimenté, la douleur générée est modérée au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de chaque procédure. Un prélèvement des tissus rénaux pour plusieurs types d’analyses est effectué pour l’ensemble des animaux de chaque procédure. Aucune réutilisation, adoption ou remplacement n’est possible, car les prélèvements nécessitent la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus (rein) et sanguins sont nécessaires pour analyser l’impact des traitements sur l’équilibre acido-basique et l’implication de la protéine que nous étudions.
Remplacement
Ce projet nécessite l'utilisation d'animaux car il est actuellement impossible de reproduire la complexité des interactions cellulaires dans le rein, ni la réponse systémique à une surcharge alcaline et à la perturbation de l’état acido-basique.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 500. Ce nombre maximal a été calculé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives entre les groupes expérimentaux. Cet effectif permet également de comparer les effets chez les mâles et les femelles. Néanmoins, il est certain que le nombre réel d'animaux utilisé sera inférieur à ce nombre maximal. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions biologiques sur ces mêmes modèles et en réalisant une étude statistique de nos résultats.
Raffinement
Les 500 souris seront pesées au moment de leur arrivée à l’animalerie. Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Pour minimiser leur stress, les souris sont progressivement adaptées aux cages métaboliques pour limiter la perte de poids (pesée quotidienne). Un enrichissement de l’environnement dans ces cages limite l’inconfort des souris. Une anesthésie chimique locale est réalisée pour certains prélèvements sanguins. D’autres prélèvements sont réalisés sous anesthésie chimique générale. Une analgésie adaptée sera systématiquement mise en œuvre pour les procédures susceptibles d’entraîner de la douleur ou de l’inconfort. Des collectes d’urine non invasives seront réalisées chez un maximum de 268 souris afin de limiter le recours aux cages métaboliques, qui peuvent être source de stress pour les animaux. Selon la nature des prélèvements sanguins réalisés, une anesthésie locale ou une anesthésie générale sera utilisée. Lorsque certains traitements sont administrés dans l’eau de boisson, un agent sucrant pourra être ajouté afin d’améliorer l’acceptabilité de l’eau traitée et de maintenir une consommation normale. Lorsque les objectifs scientifiques le permettent, la perfusion des tissus sera réalisée après la mort de l’animal plutôt que sous anesthésie terminale avant le décès, afin de réduire les interventions pratiquées sur l’animal vivant.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier le fonctionnement du rein. Cette espèce possède un fonctionnement du rein proche de celui de l'Homme et permet d'étudier cette fonction par les mêmes techniques, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. De plus, ce projet inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris et permettant l’inactivation d’un gène. Cette inactivation sera déclenchée à deux âges différents car l’efficacité de cette méthode peut varier selon le stade de développement de la souris. Tester deux périodes permettra de déterminer les conditions les plus adaptées pour obtenir une inactivation efficace du gène dans les cellules rénales étudiées. Nous explorerons la fonction rénale chez des souris âgées minimum de 11-12 semaines pour lesquelles le rein est complètement développé.
Etude de la formation des cellules impliquées dans la réponse immunitaire médiée par les anticorps
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, seule façon selon le porteur d'identifier les fibroblastes associés aux cellules B. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, adultes et nouveau-nés. Chacune subit des injections tous les trois jours pendant trois semaines, trois gavages, une injection sous-cutanée dans la patte arrière sous anesthésie et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Les souriceaux sont séparés de leur mère pendant dix minutes au maximum pour être injectés et génotypés par biopsie de tissu. Toutes sont tuées en fin de projet pour l'analyse post-mortem de leurs ganglions lymphatiques.
Objectifs
Les anticorps protègent contre des pathogènes mais provoquent aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique les cellules B, productrices d’anticorps, et des fibroblastes qui sont en contact directe avec les cellules B. Dans cette étude nous cherchons à comprendre comment ces fibroblastes se différencient et comment ils participent à la réponse immunitaire. Ce savoir pourrait avoir des implication dans la vaccination contre des infections ou pour le traitement de maladies autoimmunes.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la formation des fibroblastes associés au cellules B et leur implication dans la réponse immune. Ces résultats pourraient avoir des retombées à moyen terme sur une nouvelle application en découvrant des nouveaux médicaments contre des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.
Procédures
Des souris vigiles sont soumises à des injections tous les trois jours (durée < 1 min) pendant 3 semaines. Les souris vigiles sont gavées 3 fois (durée < 1 min). Les souris anesthésiées sont soumises à une injection d’un agent induisant une réponse immunitaire (durée < 1 min). Des prélèvements de sang sont effectués sur animal vigile (durée du prélèvement quelques secondes).
Impact sur les animaux
Pour les injections des souriceaux et leur génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires. Cela peut être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors de la biopsie de tissu. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent être source de stress et de l’anxiété tout comme une douleur légère de courte durée pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Aucune habituation n’est prévue pour les nouveau-nés ou animaux juvéniles. Il n’y pas d’acclimatation nécessaire. L’anesthésie est prévue pour les injections par voie sous-cutanée dans la patte arrière afin de cibler spécifiquement les ganglions poplités et inguinaux. Les sites de prélèvement sous-mandibulaires sont alternés. Le bien-être de l’animal est évalué tous les jours par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement et la locomotion. Les critères sont notés sur une fiche de score. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. Si le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Les souris sont hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour connaitre plus sur le mécanisme de la formation et la fonction des cellules du ganglion lymphatique. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes où se trouvent ces cellules et une souris génétiquement modifié qui permet d’identifier ces cellules. Il n’existe aujourd’hui aucun autre moyen pour les identifier. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature. Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement du système immunitaire impliquant la formation de ces cellules. La souris génétiquement modifiée est justifiée par être le seul moyen d’identifier les fibroblastes associés aux cellules B.
Imagerie de l’encéphalopathie septique et investigation de la perméabilité de l’axe cerveau-poumon dans différents modèles murins de SDRA
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids ou dont le score de douleur dépasse 1,5 sont mises à mort. 498 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour, indique le porteur, ne pas laisser une souffrance méconnue perdurer. Selon les groupes, elles subissent une injection intrapéritonéale de toxine bactérienne, une instillation pulmonaire, une injection intracérébrale ou une chirurgie d'infection digestive, puis des injections quotidiennes pendant sept à dix jours, la pose d'un cathéter et des séances d'imagerie de trente minutes sous anesthésie. Les groupes chirurgicaux peuvent perdre jusqu'à 15 % de leur poids et présenter des difficultés respiratoires. Le choix des lignées suit l'effet recherché, des souris SWISS pour l'inflammation généralisée et l'infection digestive, des C57BL6/J mâles pour l'inflammation pulmonaire, les femelles étant décrites comme protégées de cette inflammation.
Objectifs
Le choc septique représente le stade ultime d'une infection aiguë, et est responsable d'environ 11 millions de décès chaque année dans le monde. A ce jour, les infections respiratoires restent la première cause de choc septique. Parmi ces patients, la dysfonction cérébrale aiguë (encéphalopathie) apparaît dans environ 40% des cas et s'associe défavorablement au pronostic. Néanmoins, à ce jour, les facteurs tant prédictifs que pronostics sont encore largement méconnus, et le diagnostic de l'encéphalopathie repose sur des échelles cliniques pouvant être prises en défaut (utilisation de médicaments sédatifs...). Afin de visualiser la neuroinflammation, il est possible d'utiliser l'IRM ou l'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite) après injection de particules dirigées contre des marqueurs d'inflammation. Lors d'une inflammation, la perméabilité des vaisseaux sanguins change par le niveau d'expression d'une molécule appelée PLVAP. Nous souhaitons donc utiliser une approche utilisant des particules ciblant PLVAP afin de mettre en évidence l'inflammation et la perméabilité de l'axe poumon-cerveau dans différents modèles d'infection chez la souris, afin d'offrir une caractérisation non invasive de l'encéphalopathie. Ceci permettrait de valider la possibilité de diagnostiquer et de suivre la survenue d'une encéphalopathie au cours du sepsis par une imagerie non invasive chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La survenue d'une encéphalopathie au cours d'un séjour en réanimation est un évènement pronostic majeur, bien que les éléments diagnostiques soient peu spécifiques et sujets à des facteurs confondants, au premier rang desquels l'utilisation de médicaments sédatifs. L'utilisation d'une technique d'imagerie avec l'observation d'éléments objectifs permettrait de s'affranchir de ces limites, de diagnostiquer plus rapidement l'encéphalopathie et de proposer une prise en charge rapide, permettant probablement de limiter les séquelles ultérieures. Par ailleurs, l'utilisation d'une technique basée sur la reconnaissance de changements vasculaires permettra une meilleure compréhension des phénomènes à l'origine de l'encéphalopathie chez ces patients, et d'offrir ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : induction d'un modèle d'inflammation systémique aiguë par injection intrapéritonéale unique (30 secondes), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire par instillation (2 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation cérébrale par injection intracérébrale unique (30 minutes) et modulation thérapeutique par injection quotidienne pendant 10 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle d'inflammation pulmonaire non infectieuse par instillation unique (30 secondes) et modulation thérapeutique par injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours (30 secondes par injection), induction d'un modèle chirurgical d'infection digestive (10 minutes), pesées quotidiennes (inférieur à 5 minutes), pose d'un cathéter pour l'administration de produit de contraste sous anesthésie (environ 10 minutes), réalisation d'examens d'imagerie sous anesthésie (environ 30 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle de d'inflammation généralisée par injection de toxine bactérienne est susceptible d'occasionner une perte de poids chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience, la perte de poids est attendue inférieure à 10% et de courte durée (3 jours environ). Les modèles par instillation intra-nasale ou injection intracérébrale occasionnent une perte de poids plus modérée. Les modèles chirurgicaux d'infection digestive et par instillation sont susceptibles d'entraîner une perte de poids importante jusqu'à 15%, un inconfort et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours), ainsi que des difficultés respiratoires.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer la spécificité du produit de contraste sur des cultures de cellules de vaisseaux sanguins. Ils ont permis de confirmer la surexpression de PLVAP au cours de l'inflammation, et la possibilité pour notre produit de contraste de se lier à sa cible in vitro. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier le produit de contraste à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles, ainsi que des données de la littérature. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu, le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel PVC ou igloo PVC, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge. La douleur sera évaluée par l'utilisation d'échelles adaptées. Les animaux seront pesés quotidiennement. Les animaux des groupes chirurgicaux bénéficieront de compléments alimentaires humidifiés pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture à volonté. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 15% ; le score moyen l'échelle est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant les imageries ou chirurgies, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une souffrance ne correspondant pas à un point limite recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale et une anesthésie locale.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies septiques. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude de de la réponse au sepsis dans des conditions mimant ce qui est retrouvé chez l'Homme en soins critiques. Dans le modèle d'inflammation systémique, d'inflammation par injection intracérébrale, et d'infection digestive chirurgicale, les animaux utilisés seront des souris SWISS âgées de 8 semaines. Dans le modèle d'infection pulmonaire par instillation intranasale et d'inflammation pulmonaire non infectieuse, les animaux seront des souris C57BL6/J de 8 semaines, mâles car les femelles sont protégées de l'inflammation pulmonaire. Le modèle d'inflammation cérébrale par vascularite fera appel à des souris C57BL6/J de 8 semaines.