Souris
Caractérisation des atteintes cérébrales au décours de l’insuffisance rénale aiguë chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit l'ablation d'un rein et le clampage des vaisseaux de l'autre pour provoquer une insuffisance rénale aiguë, puis des mesures de fonction rénale et d'imagerie sous anesthésies répétées. Le porteur reconnaît une douleur, une hypothermie, un risque d'arrêt cardiorespiratoire et une altération de l'état général, avant un prélèvement terminal du sang, des reins et du cerveau. Il affirme que la circulation entre le rein et le cerveau ne peut être reproduite par des organoïdes et justifie ainsi le recours à la souris.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë correspond à une chute brutale mais réversible de la fonction du rein. Plus de la moitié des patients en réanimation font un ou plusieurs épisodes d'insuffisance rénale aigue. Les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë sévère présentent fréquemment des atteintes neurologiques, à type de confusion au premier plan. Cependant, les raisons de ces atteintes cérébrales ne sont pas connues. L’hypothèse la plus répandue est celle d'une altération de la barrière existant entre le sang et le cerveau (barrière hémato-encéphalique), suivie d’une augmentation de l'inflammation cérébrale. L'objectif du projet est de comprendre pourquoi et comment une insuffisance rénale aiguë induit ces troubles neurologiques, en utilisant la souris comme modèle.
Bénéfices attendus
La meilleure compréhension des atteintes cérébrales au cours de l'insuffisance rénale aiguë permettra de développer des stratégies de prévention de ces atteintes cérébrales chez les patients.
Procédures
(1) Tous les animaux du projet seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste à ôter le rein droit et à poser un clamp autour des vaisseaux du rein gauche sous anesthésie générale et une prise en charge analgésiques pré et post-opératoire. Cette chirurgie dure entre 20 et 30 minutes. (2) Tous les animaux seront sourmis à la mesure de la fonction rénale qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intraveineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie ne dure que 2 minutes. (3) Les animaux seront impliqués soit dans i) une injection intraveineuse unique d'une solution (une minute sous anesthésie gazeuse), ou ii) 3 administrations par jour par voie orale d’un médicament (quelques secondes sur animal vigile), ou iii) 1 injection intra-veineuse d’un marqueur isotopique suivie d’une imagerie (2 sessions à 24h d'intervalle, 30-60 minutes sous anesthésie gazeuse). (4) Enfin, tous les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin terminale sous anesthésie et analgésie suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvement et analyses.
Impact sur les animaux
La chirurgie et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : - hypothermie et douleur provoquées par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose du clamp vasculaire (ouverture des plans cutanés et musculaires, sutures); - risque de détresse respiratoire et d'arrêt cardio-respiratoire lors de la chirurgie; - altération de l'état général : perte de poids, déshydratation; - stress induit par des manipulations quotidiennes. Les tests neurocomportementaux et l'administration du médicament par avoie orale induisent également un stress dû à la manipulation par l'expérimentateur et aux tests eux-mêmes.
Devenir
Les 300 animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever le sang, les reins et le cerveau pour analyse.
Remplacement
Notre projet porte sur la caractérisation des conséquences d'une maladie du rein sur le cerveau. Notre hypothèse est que l'altération des fonctions cognitives observées chez les patients souffrant d'une insuffisance rénale aigue est due à la libération par le rein de molécules toxiques. Ces dernières vont abîmer la barrière hémato-encéphalique, ce qui va permettre leur passage dans le cerveau et provoquer ainsi des dommages. Notre projet nécessite donc l'existence d'une circulation sanguine entre le rein et le cerveau, qu'il est actuellement impossible de reproduire en utilisant des organoïdes ou autres modèles en 3D. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles, nous devons réaliser des évaluations neuro-comportementales des animaux, qui ne sont pas non plus modélisable in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est de 300. Nos expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité des atteintes rénales dans notre modèle. Dans le cas de l'ischémie-reperfusion, des lots de 10 animaux sont nécessaires pour mettre en évidence les différences observables entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. L'imagerie nucléaire cérébrale nous permettra d'évaluer la cinétique de l'atteinte de la barrière hémato-encéphalique après insuffisance rénale aiguë de façon répétée dans le temps chez les mêmes animaux, et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour comparer les groupes d'animaux.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux) et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Des points limites ont été définis. Les animaux sont observés quotidiennement et pésés régulièrement. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car nous maitrisons le modèle d'ischémie et les méthodes d'anlyse dans cette espèce, avec lequel nous travaillons depuis des années. De plus, nous avons reproduit chez la souris de nombreux aspects de la maladie rénale observés chez l'être humain, ce qui confirme sa pertinence. Tous les animaux sont des mâles C57Bl/6JRj fournis par un éleveur agréé. Ils sont livrés à l'âge de 7 semaines. Une période d'acclimatation de 2-3 semaines est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9-10 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu graisseux qui peut gêner l'interruption de la circulation au niveau des vaisseaux rénaux.
Développement d’un traitement pour la déficience en acide lipase lysosomale par thérapie génique avec des virus adéno associés (AAV)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la déficience en lipase acide lysosomale, elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans la veine caudale et des prélèvements sanguins répétés, avant que leur foie, leur rate et leur intestin soient prélevés. Le porteur teste vingt-quatre vecteurs de thérapie génique puis les plus prometteurs, en vue d'un "traitement curatif" présenté au conditionnel. Il affirme que l'effet et l'innocuité de la stratégie ne peuvent être vérifiés que sur un animal vivant.
Objectifs
Dans le cadre du développement d’une thérapie génique pour la déficience en acide lipase lysosomale, le projet consiste à tester l’addition d'un gène médicament encodant la protéine manquante chez les patients : l'acide lipase lysosomale (LAL) en utilisant des vecteurs viraux. Plusieurs types de vecteurs et différentes constructions du gène médicament sont disponibles, il s’agit donc dans un premier temps de sélectionner la meilleure combinaison entre vecteur viral et gène médicament. Puis la meilleure construction sera évaluée a différentes doses et temps sur notre modèle de souris afin d’aboutir à la sélection d’un « médicament » efficace.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi montrer au terme du projet une efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique ce qui permetrait d’initier un développement clinique de ce produit et d'offrir un traitement curatif aux malades.
Procédures
Les animaux subiront une injection dans la veine caudale (animaux vigiles) et des prélèvements de sang (animaux anesthésiés) au niveau du sinus retro-orbitale.
Impact sur les animaux
Dans les procédures expérimentaux : les injections dans la veine caudale et des prélèvements de sang régulièrement pourront entrainer une perte des poids, des plaies au le site de prélèvement ou d'injection. Ces paramètres seront suivie toutes les semaines et pris en compte afin de diminuer la souffrance des animaux.
Devenir
Les souris de la procédure expérimentale 1 seront utilisées dans les procédures 2, 3, 4 et 5. Les souris des procédures 2, 3, 4 et 5 seront euthanasiées afin de récupérer différents organes: foie, rate, intestin pour étudier la correction de l'accumulation de lipides dans nos souris traitées par rapport à des souris saines et malades non traités ai et donc s'assurer de l'effet thérapeutique de notre stratégie et de son inocuité.
Remplacement
Nous développons une stratégie curative de la déficience en LAL par thérapie génique. Bien que cette stratégie ait été testés in vitro sur des cellules de foie et de peau de patient, cela ne permet pas d’étudier la distribution de nos vecteurs ni leur effet thérapeutique sur tous les organes ou encore de confirmer leurs innocuités. Pour cela, nous devons avoir recours à l’utilisation d’animaux sur un modèle de souris représentatif de la déficience en LAL. De plus, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étranger à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le gène de l’enzyme LAL jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux malade à élever et à utiliser, nous allons procéder par étape : sélection des meilleurs vecteurs AAV-LAL in vivo sur souris saines (24 vecteurs), puis études de ces vecteurs sur souris LAL -/- (15 vecteurs) et enfin étude de la dose thérapeutique à injecter pour aboutir à la sélection du meilleur AAV-LAL « médicament » capable de réduire l’accumulation de lipides. Afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser, un premier criblage des vecteurs a été réalisé in vitro.
Raffinement
Afin de raffiner nos procédures, nous avons mis en place un suivi adapté des souris LAL -/- (pesés des animaux, au besoin aliment placé au sol et maintien du lien social) et des points limites les plus précoces possibles afin de soulager ou supprimer toutes souffrances. De plus, les procédures expérimentales potentiellement douloureuses (prélèvement sanguin) seront effectuées sous anesthésie gazeuse (Isoflurane)
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle de souris LAL -/- car ce modèle reproduit les symptômes induit par de la déficience en LAL humaine : accumulation de lipide dans le foie et permet d’étudier l’effet corrective de notre approche de thérapie génique. De plus, seul des modèles de souris LAL déficient sont disponible et ont été décrit dans la littératures jusqu’à présent. Aussi, la souris est facile à manipuler, à nourrir et à se procurer. L’injection de l’AAV dans la veine caudale de souris est parfaitement maitrisée au sein de Généthon et l’étude de l’effet thérapeutique est bien décrit dans la littérature dans les souris. Afin d’étudier la correction de la maladie, les animaux seront injectées à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte. Pour la procédure expérimentale P4, les souris seront injectées à 8 semaines. L’étude sur les souris saines durera 1 mois tandis que l’efficacité du traitement sur les souris LAL-/- nécessitera un suivie de 12 semaines pour les procédures 2-3 et de 8 mois pour la procédure 4.
AMENDEMENT : Identification du rôle d’une hormone dans l’absorption de nutriments chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
826 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du sans réveil au modéré. Modèles génétiques de l'hémochromatose, elles reçoivent des injections et des prélèvements sanguins répétés, certaines subissant une chirurgie abdominale sous anesthésie. Le porteur cherche à comprendre le rôle d'une hormone intestinale dans l'absorption du fer et à tester des composés mimant cette hormone, en renvoyant les retombées thérapeutiques au long terme. Il justifie l'usage de la souris par le fait qu'elle constitue le "modèle pathologique" de la maladie.
Objectifs
L’hémochromatose est une maladie de surcharge en fer fréquente. La surcharge induit une défaillance des organes vitaux au cours du vieillissement. Cette surcharge en fer est notamment due à une hyper absorption du fer par le duodénum (partie supérieure de l’intestin). Cependant il existe très peu de traitement, la diminution du fer par des médicaments et/ou les saignées sont les principales lignes de traitement. Ces traitements ne visent pas à réduire l’absorption du fer (intestin) mais seulement à diminuer le contenu en fer de l’organisme. L’hormone du fer est produite majoritairement par le foie et est le stabilisateur du taux de fer dans l’organisme. Une production de l’hormone du fer a été décrite également au niveau intestinal. Le premier objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette hormone produite par l’intestin dans la régulation de l’absorption du fer. En parallèle, de nouveaux outils thérapeutiques mimant l’hormone du fer ont été développés. Ces outils thérapeutiques pourraient diminuer l’absorption du fer. Le deuxième objectif de ce projet est donc de montrer l’efficacité de ces nouveaux outils thérapeutiques dans des modèles murins de surcharge en fer (hémochromatose).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont, à court terme, la découverte du nouveau rôle de l'hormone intestinale dans l'absorption du fer et à plus long terme au développement de nouveaux outils thérapeutiques pour diminuer l'absorption du fer dans l'hémochromatose.
Procédures
Sur animaux vigiles : -Contention pour injection en intrapéritonéal (15 secondes par souris (contention + injection)) -Contention pour injection en sous cutanée (15 secondes par souris (contention + injection)) - Prélèvement sanguin (30secondes). Sur animaux anesthésiés -Chirurgie abdominale ( 5 minutes par souris) -Tonte de l’abdomen (30 secondes par souris). -Prélèvement sanguin (30 secondes par souris)
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress lors de l’anesthésie, de la contention, des injections et du gavage.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.
Remplacement
Nous utilisons un modèle murin car c'est le modèle murin pathologique de l'hémochromatose. Nous avons besoin de l'utilisation de l'animal pour que l'effet thérapeutique des lactocoques soit relevant.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et vivent en groupes sociaux. Le milieu est enrichi. Les animaux seront quotidiennement surveillés. De plus, toutes les procédures se font avec des anesthésiques et des analgésiques si nécessaire. Dans chaque procédure, des grilles de points limites ont été établie et que des mesures seront prises en fonction de ces évaluations.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle murin car nous utilisons des souris transgéniques, modèles de la pathologie étudiée. Les souris seront âgées de 3-4 semaines juqu'à 7-8semaines car ce modèle de souris présente une surcharge en fer dès 2 mois. Un autre lot de souris sera utilisé à l'âge de 8-10 semaines. AMENDEMENT : La lignée murine Hbb th1/th1 représente un autre modèle de surcharge en fer qui est secondaire. L'utilisation de ce modèle murin permet d'élargir les domaines d'application de ces probiotiques.
Effet d’une immunothérapie cellulaire sur des modèles murins de différentes tumeurs humaines (cancer du sang, cancer des poumons, du foie et du sein).
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie pendant quatre mois au plus, et une prise de sang chaque semaine à la joue : 675 souris dépourvues de système immunitaire et irradiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. La déclaration en compte 600 en souffrance modérée et 75 en souffrance sévère. Greffées de cellules cancéreuses humaines par la veine de la queue ou, sous chirurgie, dans la rate, elles reçoivent ensuite des lymphocytes T dits "non conventionnels", issus de donneurs sains, dont l'équipe veut faire un traitement "universel" contre leucémies, lymphomes et cancers du poumon, du sein et du foie. Le porteur choisit la souris pour son comportement "bien connu et proche de l'humain", qui rendrait la douleur facile à évaluer, et prévoit chez ces souris irradiées et greffées infections, diarrhée, paralysie ou insuffisance respiratoire.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, a bouleversé la façon dont nous luttons contre le cancer et d’autres maladies. Contrairement aux traitements traditionnels, tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie, qui ciblent directement les cellules cancéreuses, l’immunothérapie tire parti du système immunitaire du patient (système de défense de l’organisme contre les infections) pour combattre la maladie. Dans notre projet, nous nous concentrons sur plusieurs types de cancers hématologiques (leucémie et lymphome) et de cancers « solides », notamment les cancers du poumon, du sein et du foie. Notre objectif est de trouver une nouvelle approche qui pourrait être utilisée pour traiter ces cancers de manière plus efficace. L’une de nos stratégies consiste à utiliser des cellules du système immunitaire appelées lymphocytes T. Ces cellules sont des gardiens du système immunitaire qui patrouillent dans notre corps pour détecter et éliminer les menaces, y compris les cellules cancéreuses. Cependant, il existe deux types de lymphocytes T : les lymphocytes « conventionnels » et les lymphocytes T « non conventionnels ». Les lymphocytes T « conventionnels » sont des guerriers spécialisés qui sont parfois difficiles à obtenir chez les patients, en particulier s’ils ont déjà reçu des traitements agressifs. De plus, ils peuvent causer des effets secondaires indésirables, comme la destruction de cellules saines de notre corps. Nous explorons donc une approche novatrice en utilisant des lymphocytes T « non conventionnels ». Ces cellules proviennent de donneurs en bonne santé et pourraient être utilisées pour stimuler le système immunitaire du patient afin de lutter contre les cellules cancéreuses. Ce serait une sorte de traitement universel, efficace pour différents types de cancers, indépendamment du patient. Notre travail vise à rendre ces thérapies plus accessibles, moins coûteuses et à réduire les effets secondaires, tout en offrant un nouvel espoir à ceux qui luttent contre le cancer du poumon, du sein, du foie et d’autres types de cancer.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à démontrer la possibilité d’utiliser une autre population de cellules du système immunitaire permettant de traiter les patients atteints de cancer. Cette nouvelle stratégie thérapeutique éviterait les problématiques actuellement rencontrées avec des traitements similaires. La validation de nos hypothèses dans un modèle animal servira de base au développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer les taux de guérison de pathologies cancéreuses graves.
Procédures
Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » applicable à différents cancers (cancer du sang, du poumon, du sein, du foie). Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules cancéreuses soit par voie intraveineuse (veine de la queue, durée moins d’une minute sur souris éveillée) soit par injection dans la rate (par chirurgie sous anesthésie et analgésie, durée 15 minutes) dans des souris dépourvues de système immunitaire et préalablement irradiées (cela permet d’augmenter la greffe des cellules cancéreuses et leur multiplication). Après l’établissement de la tumeur (en quelques jours), notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie sous anesthésie générale (durée de la session : 15 min) 24h après le début l'injection du traitement puis deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 4 mois maximum. Afin de compléter l’étude sur l’utilisation de cette population de cellules particulière en thérapie des cancers, nous serons également amenés à traiter un lot de souris avec la molécule connue pour activer nos cellules d’intérêt thérapeutique (administration par injection dans l’abdomen ou dans la veine de la queue au maximum tous les 2 jours, sans anesthésie ; durée de l’injection moins d’une minute). Nous testerons aussi la nécessité d’une 2e voire d’une 3e injection de nos cellules « médicament » pour éradiquer la tumeur. Nous évaluerons également la capacité de nos cellules à rester dans l’organisme et à prévenir une rechute en administrant une seconde dose de cellules tumorales. Chaque semaine, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevées au niveau de la veine de la joue sur souris éveillée) sera effectuée pour suivre la présence des cellules thérapeutiques (durée du prélèvement: 30 s; sur une période de 4 mois maximum).
Impact sur les animaux
Dans les différents modèles de cancer utilisés dans ce projet, l’étape d’irradiation rend la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et induire une perte de poids. Le développement des tumeurs peut lui aussi entraîner des nuisances telles que la douleur, une paralysie, une perte de poids, ou une insuffisance respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires). L’injection intraveineuse de cellules tumorales peut également causer du stress et de la douleur au moment de l’injection. En revanche, l’imagerie, bien que non invasive peut provoquer du stress lié à la manipulation. Pour cette procédure, les souris sont préalablement anesthésiées avec de l’isoflurane. L’anesthésie gazeuse peut perturber la régulation de la température corporelle des souris, et la répétition fréquente de ces anesthésies (deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude et à 24h d'intervalle au moment du début du traitement) peut avoir un impact sur leur bien-être. Les prélèvements de sang à la mandibule (réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure) peuvent provoquer une légère douleur temporaire et du stress. Comme leur nom l’indique, ces prélèvements peuvent entraîner un saignement mineur au site de ponction, généralement contrôlé en appliquant un légère pression. La chirurgie nécessaire à l’injection des cellules cancéreuses au niveau de la rate implique l’ouverture de la paroi abdominale. Cela peut entraîner des douleurs post opératoires, des problèmes de cicatrisation de la plaie chirurgicale et des effets secondaires tels qu’une infection, une hypothermie, une réaction inflammatoire locale et une altération temporaire du comportement alimentaire.
Devenir
Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes liés au système immunitaire, ainsi que ceux associés à notre population thérapeutique d’intérêt (comme le poumon et les muqueuses intestinales), seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.
Remplacement
Pour tester l’efficacité de nos différentes thérapies, nous avons d’abord réalisé de nombreuses expériences en laboratoire (in vitro). Ces expériences nous ont permis de valider certaines réponses des cellules aux traitements, en utilisant différentes techniques dont des modèles en trois dimensions appelés sphéroïdes. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de notre nouvelle approche thérapeutique sans utiliser un modèle animal entier vivant.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant deux fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple). Les imageries seront réalisées sous anesthésie. Lors de cette mesure de bioluminescence, nous effectuerons un suivi clinique des souris et établirons un score selon des critères de poids, d’apparence des poils, de mobilité, de comportement ainsi que de rythme respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) et des observations post-opératoires telles que l’état de la plaie et les déplacements de la souris après l’opération (pour la tumeur du foie, nécessitant une chirurgie).La chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées et ayant reçu au préalable l’administration d’anti-douleur, administration qui sera poursuivie dans les jours qui suivent.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles murins de cancers du sang, du poumon, du sein ou encore du foie sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.
Etude du répresseur transcriptionnel REST dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'injection virale d'une heure, puis toutes passent des tests de mémoire, dont un test d'orientation spatiale en milieu aquatique que le porteur reconnaît stressant pour la souris. L'objectif est d'étudier le rôle du répresseur REST dans un modèle génétique de la maladie d'Alzheimer, les bénéfices pour les patients restant renvoyés à de futures cibles pharmacologiques. Sur le remplacement, il affirme que l'évaluation de la mémoire par des tests comportementaux ne peut se faire sans animal vivant.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est une neuropathologie qui implique l'altération de nombreux mécanismes moléculaires. Malgré les progrès récents, la caractérisation physiopathologique de cette maladie reste incomplète, ce qui entrave le développement de traitements efficaces. Comprendre comment l’expression des gènes qui jouent un rôle dans la formation et la rétention des souvenirs est dérégulée dans le contexte de la maladie d’Alzheimer constitue une approche prometteuse et peut contribuer à l'identification de cibles pharmacologiques potentielles.
Bénéfices attendus
Ce projet examinera et comparera systématiquement les mécanismes comportementaux, cellulaires et moléculaires des troubles cognitifs associés à la pathologie Alzheimer. De plus, ce projet complètera les connaissances actuelles sur les troubles cognitifs dans le cerveau pathologique. Outre sa contribution à la résolution des problèmes économiques et sociaux associés aux troubles cognitifs survenant au cours du vieillissement, ce projet fournira des informations importantes sur le rôle des régulateurs de l'expression de gènes dans les fonctions cognitives. Ce point est très important au vu du nombre croissant de publications sur le dysfonctionnement de la mémoire dans le vieillissement normal et pathologique. Nous sommes convaincus que les résultats de ce projet seront exploités par une large communauté de neuroscientifiques, de pharmacologues et d'industries pharmaceutiques intéressés par les aspects développementaux du cerveau et de ses troubles. En outre, l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le déficit de mémoire lié à l'âge, fournira de nouvelles perspectives dans la compréhension du déficit cognitif lié à la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux auront une chirurgie de 60 minutes maximum au cours de laquelle ils recevront une injection d’un petit virus non toxique et non pathogène permettant de transférer du matériel génétique dans le génome de l’hôte. On évaluera ensuite leur mémoire par un test d’exploration d’objets (Familiarisation : 10 minutes ; Apprentissage : 10 minutes ; Test : 10 minutes) ainsi que lors d’un test d'orientation spatiale (Familiarisation : 5 minutes ; Apprentissage : 20 minutes ; Test : 1 minute). Les animaux qui n’auront pas de chirurgie seront exposés à un environnement enrichi sur une durée de 10 jours avant d’évaluer leur mémoire. L’environnement enrichi consiste à placer les animaux dans une grande cage contenant des roues d'activités, des labyrinthes, un abri dans lequel les souris peuvent se cacher et de l’eau et de la nourriture à volonté.
Impact sur les animaux
Une opération chirurgicale, ne durant pas plus de 30 minutes au maximum, sera effectuée sur certaines souris, ce qui pourrait vraisemblablement entraîner une sensation de douleur. Une sensation douloureuse pourrait également apparaitre au moment du réveil de l’animal et pour une durée de plusieurs heures. Un état de stress peut survenir chez les animaux suite au test d'orientation spatiale (Familiarisation : 5 minutes ; Apprentissage : 20 minutes ; Test : 1 minute ; total : 26 minutes). En effet, le milieu aquatique peut être perçu comme stressant pour la souris.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux (soit 480 au total) sera mis à mort pour poursuivre les investigations cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Dans ce projet nous proposons d'évaluer la mémoire des souris au travers de tests comportementaux. Ainsi, l'utilisation d'un modèle vivant (in vivo) ne peut être remplacé par des modèles in vitro ou in sillico.
Réduction
Pour réduire le nombre d'utilisation d'animaux, la mémoire de chaque souris sera évaluée dans les deux tests comportementaux proposés dans ce projet. De plus, un même prélèvement de tissus cérébral permettra de réaliser plusieurs analyses biochimiques et moléculaires. Enfin, des tests statistiques permettront de déterminer le nombre approprié d’animaux dans les protocoles proposés.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés dans des cages présentant un enrichissement (papier, maisonnette). Les signes de douleur ou de stress (prostration, mobilité altérée, poil terne, blessures apparentes, perte de poids > 20% par rapport au poids initial ) qui peuvent survenir à la suite des chirurgies seront évalués lors des inspections journalières des animaux et conduiront le cas échéant à la mise à mort immédiate des animaux en souffrance. L'inspection quotidienne des animaux se fera au travers d'une grille d'évaluation du bien-être basée sur les signes de l'animal évoqués plus haut. Le score final obtenu montrera le degré de souffrance de l'animal. En expérimentation, les animaux seront manipulés quotidiennement pendant les 3 jours qui précédent toute procédure, et ceci dans la pièce où se déroulera les tests comportementaux. Cette démarche permet de réduire le stress lié à la manipulation et d’habituer l’animal à l’expérimentateur et aux pièces expérimentales. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés lors de la chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé dans cette étude est un modèle génétiquement modifié permettant de reproduire les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Ces souris développent des dépôts de plaques amyloïdes similaires à ceux observés chez les patients Alzheimer. De plus, ces souris développent des déficits de la mémoire et d'autres déficits cognitifs progressifs, similaires à ceux observés chez les patients Alzheimer. Dans ce projet, nous utiliserons cette lignée génétiquement modifiée et leur contrôle. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles âgées de 3 mois (avant l'apparition des symptômes de la maladie) et de 10 mois (présence des symptômes de la maladie et des troubles cognitifs).
Mise au point et caractérisation d’un modèle animal d’infection par la microsporidie Enterocytozoon bieneusi
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par gavage avec des selles humaines porteuses de la microsporidie E. bieneusi, une partie recevant en plus un immunosuppresseur par injections répétées et des ponctions sanguines rétro-orbitales jusqu'à six fois en six semaines. Le porteur décrit des diarrhées, des douleurs abdominales et une perte de poids pouvant atteindre le point limite de 20 %, au-delà duquel les souris sont mises à mort. Il affirme que le parasite n'est pas cultivable in vitro et juge l'animal vivant "indispensable", tout en reconnaissant que plusieurs bénéfices cliniques avancés restent à démontrer.
Objectifs
Les microsporidies constituent un vaste ensemble d’eucaryotes intracellulaires pouvant infecter de nombreux hôtes. Chez l’Homme, les espèces les plus fréquemment isolées sont responsables de diarrhées profuses, particulièrement graves chez les immunodéprimés car sans traitement elles évoluent vers la chronicité et peuvent aboutir au décès du patient. Enterocytozoon bieneusi est l’espèce isolée dans plus de 90% des cas. De nombreuses interrogations concernant cette espèce sont encore sans réponse, notamment au sujet (i) de la physiopathologie concernant par ex. la dose infectieuse, les sites de persistance chez l’hôte, les cellules recrutées au site d’infection, la réponse immunitaire, (ii) de la thérapeutique concernant les molécules efficaces (le seul traitement dont l’efficacité a été démontrée, la fumagilline, n’est plus commercialisé depuis 2019), la durée de traitement, ... Les travaux expérimentaux sur cette espèce sont difficiles car elle n’est pas cultivable in vitro et les modèles animaux sont réduits. En effet, seuls les essais sur singes immunodéprimés ou sur cochons gnotobiotiques ont permis l’établissement d’une infection, tandis que des infections uniquement transitoires ont pu être obtenues chez des souris immunodéprimées et des rats athymiques ou chimiquement immunodéprimés. Au sein de l’espèce E. bieneusi, de nombreux génotypes existent, dont la plupart possède des spécificités d’hôtes. Les rongeurs étant naturellement infectés par certains de ces génotypes, nous émettons l’hypothèse que les échecs précédemment décrits dans la littérature concernant l’établissement d’un modèle souris sont liés à l’utilisation de génotypes non adaptés à cet animal. Du fait de nos travaux, nous possédons une très large collection de selles positives pour E. bieneusi de différents génotypes. Les objectifs du projet sont de mettre au point et de caractériser un modèle de souris infectées par E. bieneusi afin de répondre aux interrogations énoncées plus haut. Pour cela, des souris seront infectées par voie orale avec des selles humaines positives pour E. bieneusi. Nous disposons de données préliminaires démontrant le succès de notre protocole d’infection.
Bénéfices attendus
Comme développé dans le paragraphe 5.5.1, bien que responsable de plus de 90% des cas de microsporidiose intestinale, de nombreuses interrogations concernant E. bieneusi sont sans réponse, en grande partie du fait de la difficulté à travailler sur ce pathogène non cultivable et sans modèle animal. Les résultats issus de ce projet permettront de répondre à certaines de ces interrogations. En effet, ce projet devrait permettre de faire progresser les connaissances scientifiques fondamentales sur cette espèce en apportant des données sur les points suivants: dose infectieuse, barrière d’espèce, site de multiplication et de dormance chez l’hôte infecté, réponse immunitaire et identification de protéines immunogènes. Ce projet devrait également permettre de faire progresser la prise en charge des microsporidioses humaines en démontrant l’efficacité ou l’inefficacité des molécules actuellement utilisées, notamment le nitazoxanide dont l’indication a été donnée du fait de son efficacité sur d’autres parasitoses, sans preuve scientifique. Si seule la fumagilline démontre son efficacité, cela permettra d’obtenir des arguments forts pour la reprise de production du médicament par l’industrie pharmaceutique. La fumagilline étant responsable d’une thrombopénie, le patient doit être hospitalisé pendant toute la durée du traitement, soit 15 jours. Cette durée a été validée historiquement chez le patient infecté par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Il est suspecté qu’une telle durée de traitement pourrait être réduite avec une efficacité équivalente, réduisant ainsi les durées d’hospitalisation et donc les frais de santé. Ce projet pourrait permettre de valider ou non la réduction de la durée de traitement. L’intérêt du screening dans les selles d’un patient pour valider l’efficacité d’un tel traitement n’est pas non plus démontré mais pourra être évalué dans ce projet chez la souris (par exemple si recherche sur selles négative au bout de 7 jours, alors le traitement pourrait être arrêté, si résultat positif on pourrait conseiller de poursuivre le traitement jusqu’à 15 jours), et ainsi apporter des arguments pour proposer une étude chez l’Homme (type protocole de recherche clinique).
Procédures
-gavage avec le pathogène (ou un liquide neutre pour les groupes contrôle) sur animal vigile, 1 seule fois pour tous les animaux: 592 souris, soit quelques secondes par souris -ponction sanguine au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie générale, les ponctions seront répétées 6 fois en 6 semaines : 12 animaux, ponction d'une durée inférieure à 10 secondes -injection molécule immunosuppressive (dexaméthasone) sur animal vigile, en intra-péritonéal, à raison de 6 injections en 6 jours: 288 animaux, soit quelques secondes par souris -gavage par des molécules à visée thérapeutique (ou un liquide neutre pour les groupes contrôle), une fois par jour pendant 14 jours : 192 souris, soit quelques secondes par souris
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les souris sont ceux associés à une infection intestinale (extrapolation sur la base des symptômes observés chez les humains) : douleurs abdominales, ballonnements, diarrhées aqueuses, perte de poids. Ces douleurs pourraient se traduire chez l’animal par la prostration, le hérissement du poil, des expressions faciales (gonflement du museau et des joues, oreilles et vibrisses vers l'arrière, plis visibles autour des yeux). Chez l’Homme immunocompétent, ces symptômes durent entre 3 et 4 semaines ; chez l’immunodéprimé, ils persisteront jusqu’à rétablissement de l’immunité ou prise d’un traitement spécifique anti-microsporidien. Concernant les effets indésirables associés au traitement spécifique : - une diminution du nombre de plaquettes est décrite chez l’Homme lors de la prise de fumagilline. D’après le résumé des caractéristiques du produit, la dose que nous utiliserons sur la durée prévue n’est pas associée à la survenue d’effets indésirables graves. Ainsi des saignements pourraient avoir lieu (par exemple en cas de blessures). - le nitazoxanide est associé à une toxicité hépatique. Cela pourrait se traduire par un ictère (coloration jaune des muqueuses), visible au niveau oculaire. - concernant la molécule test, il n’y a pas de données chez l’animal.
Devenir
Les souris seront toutes sacrifiées à la fin du projet pour récupérer les tissus et le sang, en vue d’analyses complémentaires.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle in vitro permettant le développement d’E. bieneusi. Il y a peu de publications à ce sujet probablement car beaucoup de tentatives se sont soldées par des échecs. Il semble que le cycle de multiplication ait déjà pu être initié in vitro mais que rapidement celui-ci avorte. L’utilisation d’animaux vivants apparait indispensable pour étudier à l’échelle globale d’un individu l’impact d’une infection par E. bieneusi et permettre d’identifier des sites de multiplication et de dormance dans un organisme infecté, ainsi que de caractériser sa réponse immunitaire. L’efficacité du traitement et la durée d’excrétion des parasites sous traitement ne peuvent également être validés qu’à l’échelle d’un individu.
Réduction
Nous utiliserons les souris sur-numéraires issues de reproductions de souris (reproductions visant à l’obtention de génotypes spécifiques au sein du laboratoire). Cela permettra donc de ne pas sacrifier ces animaux par ailleurs en bonne santé alors qu’ils pourraient être utiles pour d’autres recherches. Le nombre d'animaux utilisés pour cette manipulation a été réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les expérimentations seront couplées afin de permettre de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Par exemple, les souris infectées pour tester la charge infectieuse limite seront aussi utilisées pour évaluer l’item sur l’efficacité de la thérapeutique. Les révisions d’articles (reviewing) se durcissant, il est maintenant nécessaire de réaliser les expérimentations sur mâles et femelles, raison qui nous contraint à augmenter le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon les standards prévus par la règlementation, en groupes sociaux (compte tenu du fait que les souris sont des animaux grégaires), dans un environnement adapté et enrichi. Les animaux auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Afin d'éviter les comportements agressifs, les animaux d'une même cage seront tous du même sexe, ne seront jamais plus de 6 et un enrichissement sera proposé avec des maisons en plastique. Les animaux étant nés dans notre animalerie, les groupes par cage seront les mêmes que ceux constitués lors du sevrage. Une période d’acclimatation sera réalisée avant le début de la procédure (une semaine). Les animaux d’une même cage auront subi la même infection. Nous utiliserons un système de score de manière à limiter au maximum la souffrance et à définir des points limites. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer tout changement de comportement et/ou de motricité et perte de poids. Si des signes de douleur sont observés, une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Si un animal remplit des critères préalablement définis associés à une souffrance, ainsi qu’une perte de poids supérieure à 20% (points limites), le responsable du projet décidera de la mise à mort.
Choix des espèces
Le fond génétique des souris a été choisi car le laboratoire pratique, dans le cadre d’autres expérimentations, des reproductions sur le même fond génétique pour l’obtention de génotypes spécifiques, et certaines souris issues de ces reproductions ne sont pas conservées. Différents âges d’infection seront utilisés, entre 7 et 18 semaines, afin de mimer la situation en vie réelle (jeunes enfants rarement atteints, population adulte) et s’affranchir de l’effet « âge ».
Elevage de lignées de souris (animaux génétiquement altérés : AGA) immunodéprimées ou exprimant une cécité précoce, en condition exempt de pathogènes spécifiques et opportunistes
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
15 600 souris génétiquement modifiées vont être élevées, immunodéprimées ou frappées d'une cécité précoce, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur décrit lui-même des lignées au phénotype "dommageable", avec dégénérescence rétinienne sévère et susceptibilité accrue aux infections, destinées à des protocoles sur la cryptosporidiose et la tuberculose. Une partie des souris part vers d'autres protocoles ou renouvelle les reproducteurs, le reste étant tué en surnombre ou en fin de "carrière" de reproduction. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Ce projet consiste à élever différentes lignées de souris, génétiquement modifiées/altérées (= AGA : animaux génétiquement altérés), dont le phénotype est dommageable pour l’animal élevé au sein de la a plateforme expérimentale et qui serviront pour des protocoles réalisés également au sein de la plateforme expérimentale. Les souris sont élevées pour répondre aux besoins scientifiques des chercheurs de l'unité de recherche qui étudient (i) à mieux comprendre les mécanismes protecteurs ou pathologiques mis en jeu lors de la cryptosporidiose et la tuberculose et à (ii) plus particulièrement dans le cadre de la cryptosporidiose, à évaluer l’effet d’immunostimulants et de molécules anti-parasitaires dans des modèles murins expérimentaux sensibles à ces agents pathogènes telles que les souris immunodéprimées par délétions génétiques de gènes de l’immunité.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l'obtention de souris génétiquement altérée pour l'expérimentation correspondant aux besoins des projets correspondants. Comme précisé plus haut cryptosporidiose est une maladie zoonotique qui a une forte incidence dans les élevages de ruminants et qui est encore mal contrôlée par la chimiothérapie ou un vaccin. La compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la protection est donc déterminante pour pouvoir indentifier des stratégies d’immunostimulation du système immunitaire notamment des jeunes individus afin de les rendre plus résistants ou plus résilients à l’infection. La compréhension des mécansimes immunitaires est donc essentielle pour la mise en place de stratégies efficaces. La recherche de nouveaux antiparasitaires plus efficaces que le produit possédant une autorisation de mise sur le marché (antiparasitaires) est une priorité de recherche et il convient d’évaluer les antiparasitaires sur les modèles sensibles à l’infection (souriceaux, veaux, agneaux, chevreaux, souris immunodéficiente : individus immunodéprimés). Les bénéfices attendus sont donc à la fois forts pour l’élevage de ruminants et l’humain qui sont tous deux infectés par le même parasite sur lequel nous travaillons. La contamination se fait par contact direct (animal-animal ; animal-humain ; humain-humain) ou indirect via l’environnement (eau de boisson insuffisamment traitée ou de piscine, aliment souillés…). Le contrôle de la maladie chez les animaux d’élevage bénéficie donc directement à l’environnement et à l’humain. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections mycobactériennes est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Dans le cadre de la tuberculose, nous pourront ainsi définir les signes précoces de la maladie en analyse leur comportement grâce à la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur. Cette lignée permettra aussi de caractériser le rôle des gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés.
Procédures
Les souris seront élevées de façon conventionnelle (identification, surveillance quotidienne, mise en reproduction, change des cages) dans l’attente d’être intégrées dans nos protocoles de recherche
Impact sur les animaux
Certaines lignées présentent certains degrés d’immunosupression par altération d’une cytokine, de son récepteur ou de cellules immunitaires. On peut donc s’attendre à une susceptibilité accrue aux infections (agents pathogènes intracellulaires par exemple). Pour les souris C3H, Elles sont homozygotes pour l'allèle donné et présentent une dégénérescence rétinienne sévère précoce.
Devenir
Tous les animaux produits sont en majorité utilisés pour des protocoles expérimentaux ou pour renouveller les animaux reproducteurs. Les animaux non utilisés dans des protocoles expérimentaux (sous autorisation éthique validée) seront mis à mort à l’issue d'une "carrière" de reproducteur ou s'ils sont surnumérraires (nombre très réduits d'animaux).
Remplacement
Pour étudier les réponses immunitaires de l’hôte ou des stratégies d’immunostimulation qui ciblent le système immunitaire, il n’est pas possible d’utiliser de système in vitro ou des méthodes alternatives suffisament élaborées pour reproduire un environnement tissulaire complexe tel que l’intestin (pour étudier la cryptosporidiose) ou le poumon (pour étudier la tuberculose). Cas de la cryptosporidiose : Pour étudier, l’effet de molécules anti-parasitaires (anti Cryptosporidium), il est possible dans un premier temps de faire un criblage de molécules in vitro sur des lignées de cellules épithéliales intestinales. La phase in vivo intervient pour avoir un environnement cellulaire plus complexe impossible à reproduire in vitro ou lorque l’on doit évaluer l’efficacité de métabolisation d’une molécule ou sa biodisponibilité dans l’organisme. La culture partielle des parasites est possible sur des lignées de cellules épithéliales intestinales et toutes les interactions que nous pouvons étudier dans cet environnement sont toujours réalisées en amont des expérimentations in vivo. Par exemple, si on veut étudier l’effet d’une cytokine sur les cellules épithéliales, on peut commencer à l’évaluer in vitro comme tous les essais d’antiparasitaires qui sont sélectionnés in vitro. La phase in vivo intervient pour avoir un environnement cellulaire plus complexe impossible à reproduire in vitro ou lorque l’on doit évaluer l’efficacité de métabolisation d’une molécule ou sa biodisponibilité dans l’organisme. Cas de la tuberculose : A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum, mais en nombre suffisant afin d’éviter toute risque de perte d’une lignée. Le nombre est défini en fonction de la prolificité de la lignée et de l’expérience acquise dans l'élevage de ses lignées. Le maintien de ces derniers en statut SOPF (Specific and Opportunistic Pathogen Free) permet également de diminuer le nombre de reproducteurs nécessaires. Comme indiqué précédemment, la reproduction en plus grand nombre des animaux est fonction de la demande des chercheurs et des projets pour lesquels les protocoles et le nombre d’animaux ont été validés par le comité d’éthique local et le ministère. Pour le maintien des lignées (conservation d'un "noyau") : A raison de 10 animaux par lignée (mâles et femelles confondus) et par génération, avec un renouvellement trimestriel, nous estimons le nombre à (10x4) x 5ans, soit 200 animaux par lignée gardé en vie. Donc 1600 animaux pour les 8 lignées sur les 5 ans. En se basant sur la formule de calcul de probabilité : F= (P/PP)/R, nous comptons 5,55 femelles qui’il faut mettre en reproduction pour obtenir 10 petits par génération (5 mâles et 5 femelles), 10 = (10/6)/30%. F = nb de femelles à mettre en accouplement P = nb d'animaux demandé PP = nb de petits par portée R = nb de femelles gestantes sur 1 accouplement (lié au cycle oestrien) = 30% Toutefois, la portée moyenne est de 6 petits par femelle, ce qui ferait si toutes les femelles mettaient bas, 30 petits par génération et par lignée. Mais afin d’éviter les surprises, nous allons compter la totalité des animaux si toutes les femelles mettaient bas. Ce qui nous ferait au final, un nombre théorique de 30 petits par générations x 4 renouvellements annuel x 8 lignées = 960 animaux par an, soit 960 X 5 ans= 4800 animaux juste pour le maintien du "noyau". Ce qui nous fait : 45 (reproducteurs) x 3 (reproductions par an) x 5 ans x 8 lignées = 5400 animaux servant la multiplication des lignées. Puis en suivant le même raisonnement que le maintien de lignée si toutes les femelles mettaient bas, 30 (femelles mis en repro) x 6 (petits par portée) x 3 (fois par) x 5 ans x 8 lignées = 21600 animaux. Autre paramètre, toutes les lignées ne sont pas utilisées en même temps, ainsi pour se projeter par rapport à notre expérience des années précédentes, nous estimons une multiplication de la moitié des lignées annuellement, ce qui ferait 21600/2 = 10800 animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en conditions particulière de type exempt de pathogènes spécifiques et opportunistes. Le change est effectué dans des conditions d'hygiènes strictes. Un suivi sanitaire trimestriel est mis en place afin de surveiller leur statut sanitaire et des modes opératoires sont rédigés, validés, respectés et révisés régulièrement pour permettre de maintenir ce statut. Leur milieu de vie est enrichi et diversifié afin que les animaux puissent exprimer un comportement normal, propre à l’espèce. Parmi les différents types d’enrichissement utilisés, citons : la maison igloo. Ces enrichissements sont adaptés en fonction des lignées, de l'âge des animaux… en fonction de l'évaluation faite par les zootechniciens. Les cages sont pourvues au minimum de 2 enrichissements différents. D’autres enrichissements pourront être testés / utilisés au fil du temps, pour améliorer / diversifier l’environnement des animaux et leurs possibilités d'activité..., en fonction des propositions des fournisseurs en particulier. Les lignées sont identifiées par poinçon à l’oreille ; l’échantillon prélevé à cette occasion sert pour le génotypage des animaux d’intérêt, à garder pour le maintien et le suivi de la lignée. Concernant plus particulièrement les souris, modèle de la tuberculose, nous gardons un environnement enrichi unique sans diversification pour ne pas perturber les animaux à l’apparition du phénotype dommageable = leur cécité.
Choix des espèces
Le modèle murin est très largement utilisé par toute la communauté internationale travaillant sur la cryptosporidiose. L’infection mime bien celle que nous observons chez l’humain et les ruminants (même site d’infection : ileum), même suceptibilité liée au statut immunitaire, même souche parasitaire capable d’infecter l’humain, la souris et les ruminants). Le modèle murin permet l’utilisation de nombreux animaux trangéniques, leur génétique bien définie permet d’avoir des réponses homogènes. Leur reproduction rapide permet l’obtention régulière d’animaux, leur cycle court de reproduction permet des mises-bas synchronisées très utiles pour les expériences sur les nouveau-nés. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. Le modèle murin permet une manipulation en animalerie de confinement de niveau 3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce : kits, anticorps. Les animaux seront utilisés pour la reproduction : il y aura donc les deux sexes à l’âge adulte, des femelles gestantes et allaitantes, ainsi que leurs nouveau-nés qui suivront leur croissance jusqu’au sevrage puis jusqu’à leur maturité pour ensuite être mis en accouplement. à leur tour. Pour les projets en lien avec la cryptosporidiose, les animaux âgés entre 3 et 7 jours en début d’expérimentation seront fournis (encore accompagnés de leur mère) ainsi que des souris adultes de sexe indéterminé généralement âgés de 8 à 20 semaines. Pour les projets en lien avec la tuberculose, les souris adultes seront âgées de 6 semaines. Il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus, nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.les souris adultes seront âgées de 6 semaines. Il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus, nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.
Développement d’une immunothérapie combinatoire dans les cancers pulmonaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des tumeurs pulmonaires sous la peau ou en suspension, puis on leur administre de une à quatre injections d'un vaccin et des prélèvements sanguins, pour tester une immunothérapie combinée contre le cancer du poumon. Le porteur décrit une douleur légère, une perte de poids modérée et une gêne à la mobilité liée aux tumeurs sur le flanc. Il affirme que l'effet d'un vaccin combiné à des anticorps ne peut être vérifié que sur un "organisme vivant entier".
Objectifs
L'objectif du projet est de développer et d'optimiser un vaccin thérapeutique contre le cancer du poumon puis de le combiner avec les immunothérapies anti-PD-1 existantes dans les cancers pulmonaires.
Bénéfices attendus
Le vaccin thérapeutique seul a demontré un effet bénefique, in vitro et in vivo, sur certains lymphocytes en les activant. La combinaison que nous proposons est d'ajouter des anticorps de type anti points de blcage immunitaire qui viseront à maintenir l'état d'activation des de ces lymphocytes, specifiquement induits par le vaccin, plus longtemps. Cette combinaison thérapeutique dévrait demontrer un bénéfice anti-tumoral et à terme pourrait améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
En fonction de la procédure expérimentale appliquée, les souris seront soumises à des greffes de lignées cellulaires en suspension: durée 5 minutes, sous anesthésie locale ou des greffes sous-cutanées de tumeurs solides: durée 10 minutes sous anesthésie locale et générale - Chaque souris sera greffée qu'une seule fois durant toute la procédure expérimentale - Selon les porcédures, les animaux auront entre 1 et 4 injections de vaccin, sous aensthésie locale, durée 3 minutes. Certains animaux pourront avoir 1 prélèvement sanguin par semaine durant 3 semaines: durée 3 minutes, sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Les animaux qui seront utilisés subiront des injections (dont des greffes de tumeurs sous la peau), ainsi que des prélèvements de sang. Parmi les nuisances possibles : stress léger et douleur légère et transitoire lors des administrations et des prélèvements, perte de poids modérée posible, gêne légère à la mobilité des souris à cause des tumeurs pouvant pousser sur le flanc.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de conduire des analyses post-mortem sur les tumeurs et les rates.
Remplacement
L’étude de l’effet thérapeutique d’un vaccin peptidique en combinaison avec les inhibiteurs de checkpoints immunitaires relève d’une grande complexité où les modéles in vitro seuls n’apporteraient que des réponses partielles et ne permettraient pas de vérifier nos hypothèses. Un des effets majeurs attendus est le recrutement et l’activation prolongée des cellules immunitaires au sein des tumeurs pulmonaires. L'utilisation d'un organisme vivant entier est donc incontournable.
Réduction
Afin de calculer le nombre d’animaux minimum pour répondre à nos hypothèses,, un logiciel de statistique a été utilisé. Les calculs de puissance ont pris en compte la réalisation d'expériences uniques, l'effet attendu, et le taux de prise de greffe. Les résultats seront étudiés par analyse de variance à une voie. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses de vaccins seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. Des procédures pourront être annulées en cas d'hypothèse non vérifiée.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux. Chaque cage contiendra en plus de l’eau et de la nourriture, des éléments d’enrichissements : Une maison par cage ou 2 tunnels en cartons, avec du sizzlenest pour leur nid. Le comportement social des souris sera suivi, en observant des comportements tels que le grooming, leurs mouvements dans la cage ou encore le temps de toilettage des souris. Des examens cliniques seront faits quotidiennement par l'équipe de recherche. En cas de perte de poids, un aliment plus riche, plus appétent et plus facile à consommer sera donné. Toutes les interventions lors des procédures seront faites avec anesthésie locale ou générale (ou en combinaison). Des antalgiques seront utilisés.Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour tester des vaccins sur animaux à système immunitaire normal (greffes de tumeurs murines) ou déficient (greffes de tumeurs humaines). Les souris seront greffées jeune adultes (6 semaines) et seront traitées à 8-9 semaines. Ce choix d’âge est justifié par une réponse immunitaire robuste et une prise de greffe plus efficace.
Etude des protéines β-caténine et fascine 1 dans la progression tumorale des cancers du foie mutés pour la β-caténine
- Recherche fondamentale
- Oncologie
950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On greffe des cellules de cancer du foie à 770 d'entre elles par chirurgie et à 180 par voie sous-cutanée, avec suivi par imagerie et traitements par injection ou gavage, pour étudier deux protéines impliquées dans les cancers du foie de l'enfant et de l'adulte. Le porteur décrit une douleur liée aux greffes chirurgicales, des dysfonctionnements du foie et le développement de micro-métastases. Il affirme que la culture de cellules ne représente pas la maladie et qu'un "modèle physiologique complet" reste nécessaire.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont d’étudier dans le modèle de la souris les rôles de deux protéines d’intérêt dans le développement des cancers du foie chez l’enfant et chez l’adulte. Nous nous intéressons également au microenvironnement tumoral qui permet l’interaction des systèmes physiologiques avec la tumeur et qui peut être modifié par les cellules cancéreuses. L’immunothérapie est actuellement utilisée pour traiter de nombreux cancers et son principal intérêt est d’activer le système immunitaire pour combattre les cellules cancéreuses. Cependant certains cancers du foie adultes sont résistants à l’immunothérapie et sont caractérisés par une absence de cellules immunitaires au sein de la tumeur. Or des résultats préliminaires montrent que certaines protéines conduisent à un défaut de communication entre cellules tumorales et cellules immunitaires pouvant expliquer cette résistance à l’immunothérapie. Ainsi un des objectifs de ce projet est d’étudier l’impact de l’inhibition d’une de ces protéines en réponse à l’immunothérapie dans les cancers du foie chez l’adulte. Le deuxième objectif concerne une autre protéine et consiste à évaluer l’efficacité d’un de ses inhibiteurs dans le traitement des cancers du foie chez l’enfant. Des résultats préliminaires montrent un effet de cette molécule sur la prolifération, la mort cellulaire ainsi que l’invasion et la migration cellulaires. Pour confirmer l’ensemble des résultats différents types d’implantation de cellules tumorales dans la souris seront effectués et comprennent des expériences pilotes ceci afin d’utiliser un nombre minimum d’animaux.
Bénéfices attendus
Nous aspirons à une meilleure compréhension des cancers du foie et des processus tumorigéniques et métastatiques dans l’optique que ces résultats servent à améliorer les traitements actuels et à développer de futures thérapies cliniques.
Procédures
Une partie des animaux vont subir une greffe orthotopique de cellules tumorale, cette greffe nécessite une procédure chirurgicale de moins de 10min, le nombre d'animaux concernés est de 770. Le reste des animaux eux seront greffés par voie sous-cutanée, intervention de moins de 5 min qui concernera 180 animaux. La croissance tumorale sera suivie par imagerie chez l’ensemble des animaux (950), intervention qui durera environ 15 minutes. Certains animaux recevront des traitements soit par injection intrapéritonéale (240) soit par gavage (240), chacune de ces interventions n’excédant pas une minute.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux, 2/ une douleur durant et après les injections orthotopiques, 3/ une mineur infection pour les injections orthotopiques, 4/ un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant les injections orthotopiques, 5/ un stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boîte à induction lors des imageries) et de réveil, 6/ les traitements peuvent également induire une perte de poids et 7/ des dysfonctionnements hépatiques et le développement de micro-métastases.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent les rôles importants de nos 2 protéines d’intérêt dans les cancers du foie. Toutefois la culture de cellules in vitro est loin d’être un modèle représentatif, le microenvironnement tumoral permettant l’interaction des systèmes physiologiques avec la tumeur manque et nous éloigne de résultats pouvant directement être bénéfiques en clinique chez l’homme. Afin de confirmer nos premières observations in vitro nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal
Réduction
Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. La croissance tumorale sera suivie tout au long de l’expérience ce qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes.
Raffinement
Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). La croissance tumorale sera suivie très précisément ce qui nous permettra d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide.
Choix des espèces
Nous utiliserons deux modèles d'animaux, un qui permettra d’étudier l’infiltration immunitaire dans nos tumeurs et un qui permettra d'étudier la greffe de cellules humaines. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.
La matrice extracellulaire comme cible pour le traitement de cancers – EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules tumorales du sein ou des voies aérodigestives, on leur inflige jusqu'à dix injections dans la tumeur et une irradiation de 2 à 10 Gy, sous anesthésies répétées à l'isoflurane pour lequel le porteur reconnaît une aversion des souris. Il décrit une possible nécrose ou ulcération de la tumeur et une insuffisance respiratoire liée aux métastases. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'ensemble des mécanismes tumoraux, pour tester des peptides combinés à la radiothérapie.
Objectifs
Le cancer, dont les cancers du sein et des voies aérodigestives supérieures (VADS), reste un problème majeur de santé publique. La radiothérapie est actuellement appliquée dans plus de 70% des traitements contre le cancer et fait partie de l’arsenal antitumoral incontournable. Cependant, la radiothérapie possède comme effets secondaires l’augmentation de l’immunosuppression du microenvironnement tumoral, en activant notamment un composant du tissu tumoral ce qui favorise la récidive des tumeurs. Ce composant, une protéine fortement exprimée dans la matrice extracellulaire spécifique des tumeurs, joue un rôle primordial dans la genèse d’un microenvironnement tumoral aux effets immunosuppresseurs promouvant ainsi la progression et la malignité des tumeurs. Cibler les mécanismes par lesquels ce composant agit sur les tumeurs permettrait de réduire à la fois la croissance tumorale et l’apparition de métastases. Notre laboratoire a récemment découvert des petites molécules (peptides MPs) capables d’affecter cette nouvelle cible thérapeutique et ainsi d’inhiber la croissance de cellules tumorales in vitro. Cette étude s’attachera à déterminer la capacité de ces peptides MPs, seuls ou combinés à des traitements de radiothérapie, à inhiber le développement de tumeurs mammaires et des VADS et la formation de métastases dans des modèles expérimentaux murins. Elle s’attachera également à analyser in vivo l’effet anti-tumoral de ces peptides suite à l’inactivation de molécules impliquées dans le phénotype des cellules cancéreuses ou dans la mort cellulaire. L’impact de ces peptides, combinés à la radiothérapie, sur le microenvironnement tumoral et notamment sur les activités immunosuppressives de ce composant du tissu tumoral, une nouvelle cible thérapeutique, sera également étudié aux niveaux cellulaire et moléculaire. Cibler l’aspect immunosuppresseur de cette nouvelle cible thérapeutique devrait permettre d’améliorer la rémission des tumeurs induite par la radiothérapie. Cette étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des traitements associés avec la rémission des tumeurs et aidera à en contourner les effets indésirables pour une future application dans des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de démontrer, grâce à des modèles d’expérimentation in vivo, la capacité de ces peptides MPs à contrecarrer l'effet immunosuppresseur du tissu tumoral, en partie induit par des traitements anticancéreux tels que la radiothérapie, dans différents modèles de cancer. Le but in fine est de déterminer si ces peptides, dont nous avons montré in vitro leur capacité d’inhiber la prolifération de cellules cancéreuses, pourraient être utilisés en santé humaine en complément de tels traitements anti-cancéreux pour cibler l’aspect immunosuppresseur de molécules du microenvironnement tumoral et ainsi conduire à une régression plus efficace des tumeurs.
Procédures
Un groupe d’animaux subira une injection unique (1 minute) en sous-cutané dans l’un de leurs flancs effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum. Une partie de ces animaux sera soumis à un régime alimentaire puis subira une injection péri-tumorale (30 secondes) effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes, suivis de 4 traitements d’imagerie in vivo chacun d’une durée de 5 minutes et chacun effectué sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes maximum. Une autre partie recevra en une semaine 3 traitements à la doxycycline dans leur eau de boisson. Un second groupe d’animaux subira une injection unique (1 minute) en sous-cutané au niveau de la nuque effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum puis sur une période de 3 semaines 10 injections péri-tumorales (30 secondes chacune) et chacune effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum. Une partie de ces animaux subira également une seule irradiation aux doses de 2 ou 10 Gy (durée de 5 minutes maximum) effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes maximum. Un troisième groupe d’animaux subira une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 20 minutes maximum puis 10 injections péri-tumorales (30 secondes chacune) à raison d’une injection tous les 2 jours pendant 3 semaines et chacune effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes maximum. Une partie de ces animaux subira également une seule irradiation aux doses de 2 ou 10 Gy (durée de 5 minutes maximum) effectuée sous anesthésie générale d’une durée de 15 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à développer des carcinomes des voies aéro-digestives supérieures (VADS) ou des tumeurs mammaires suite à la greffe de cellules cancéreuses dans les glandes mammaires, la nuque ou le flanc des animaux. Les effets indésirables que nous pourrions observer chez ces animaux ayant développé des tumeurs sont : gêne, légère douleur, infection ou inflammation aux sites d’injection de cellules tumorales et de molécules à potentiel anti-cancéreux, nécrose ou ulcération tumorale, perte de poids, limitation à s’alimenter ou à se déplacer due au développement de tumeur, insuffisance respiratoire due à l’apparition de métastases. Les souris montrent une aversion à l’isoflurane gazeux et même si chaque anesthésie ne durera au maximum que 15 minutes, certains animaux subiront plusieurs anesthésies sur une période de 3 semaines. L’irradiation peut induire des érythèmes cutanés et des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement. Bien que non attendus, il n’est pas exclu que les molécules (peptides) à potentiel anti-cancéreux étudiés dans ce projet puissent avoir des effets secondaires indésirables sur l’animal. Cette étude apportera des éclaircissements sur ce point.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des différentes procédures pour une caractérisation in vitro des tissus tumoraux, métastatiques et divers autres tissus d’intérêt. Ces caractérisations viendront en complément des résultats obtenus in vivo.
Remplacement
Le modèle animal est nécessaire car il n'existe actuellement pas de modèle in vitro capable de reproduire dans sa globalité l’ensemble des mécanismes impliqués dans la croissance tumorale et le développement de métastases, comme l'environnement tumoral, la réaction du système immunitaire, les mécanismes physiologiques impliqués et l'impact sur la survie de l'animal, entre autres exemples. Le modèle animal nous permettra également d’obtenir des échantillons issus de tumeurs traitées ou non par des agents anti-cancéreux qui seront utilisés pour la validation de données obtenues in vitro. Le projet sera complété au maximum par des études effectuées en parallèle sur des cultures cellulaires.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir atteindre les objectifs du projet et réaliser une analyse statistique pertinente a été déterminé grâce à l’utilisation d’un outil de calcul spécifique et grâce à des données de la littérature.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 4-6 souris par cage dans des cages avec une surface supérieure à la surface réglementaire minimale, enrichies de bâtons à ronger pour favoriser leur activité et agrémentées de frisures de papier, tunnel en polycarbonate, dômes et rouleaux de coton pour leur permettre de se cacher. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement 15 jours avant de démarrer les procédures expérimentales et habitués quotidiennement à leur manipulation par les expérimentateurs une semaine avant pour réduire leur stress. Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l’expérience en cours. L’anesthésie sera systématiquement utilisée à chaque étape des protocoles expérimentaux pour réduire le stress et la douleur et, si nécessaire, l’animal recevra également des analgésiques pré- et post-opératoires. Les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter tout risque d’hypothermie et un gel ophtalmique sera utilisé pour protéger leurs yeux. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel formé. Leur état général (poids, alimentation, apparence, comportement) sera évalué quotidiennement durant les 3 premiers jours de l’expérimentation puis au minimum 3 fois par semaine afin de détecter au plus tôt tout signe de stress ou de souffrance. Plusieurs points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de déclin de l’état général, une surveillance quotidienne de l’animal sera mise en place. Si un animal présentait des symptômes de douleur, un analgésique lui sera administré.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin car celui-ci est développé depuis de nombreuses années dans notre laboratoire et possède de multiples avantages : nombreuses lignées génétiquement modifiées disponibles et modèle animal déjà validé dans le laboratoire. De plus, la souris récapitule de manière très similaire à l’homme l'ensemble des mécanismes moléculaires et des paramètres impliqués dans le développement tumoral : microenvironnement, réaction du système immunitaire, dissémination des métastases, mécanismes physiologiques impliqués et/ou associés, impact sur la survie. Une littérature abondante dans notre domaine est également un argument complémentaire en faveur du choix de cette espèce. Les souris seront utilisées adultes à partir de 8 semaines d'âge minimum, ceci afin de mimer la pathologie chez l’être humain adulte. L’utilisation de souris plus jeunes n’est pas pertinente car les mécanismes physiologiques impliqués seraient potentiellement différents, le jeune individu étant encore en cours de développement.
Évaluation de nanoparticules de polymère magnétiques dans un modèle de souris immunodéprimées portant des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales mammaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
374 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante un dispositif hormonal, on leur greffe des cellules de tumeur mammaire, puis on leur injecte des nanoparticules magnétiques activées par un champ magnétique, avec suivi par imagerie, pour tester une délivrance ciblée de médicaments anticancéreux. Le porteur décrit des risques de nécrose de la tumeur, de perte de poids et de douleur aux points d'injection. Il affirme qu'aucun modèle sans animaux ne recrée la tumeur et son environnement et présente la souris comme le modèle de première ligne.
Objectifs
Malgré les avancées notables dans la prévention, le dépistage et la prise en charge du cancer du sein, celui-ci reste un problème de santé publique majeur en raison de ses taux alarmants d’incidence et de mortalité prématurée dans le monde. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène. Les cancers mammaires les plus agressifs et les plus résistants aux traitements conventionnels sont appelés triples négatifs. C’est pourquoi développer des nouvelles thérapies capables de cibler spécifiquement ce type de cancer est plus que nécessaire. A ce titre, des anticorps conjugués à des médicaments (ADC) ont été récemment développés et mis sur le marché. Cependant, la production d'ADC est très complexe, longue et surtout coûteuse. Il est donc nécessaire de développer une alternative aux ADCs offrant une nouvelle voie pour le traitement du cancer. Notre projet s’inscrit dans cette logique. Notre objectif est de proposer un nouveau concept de ciblage des tumeurs mammaires en utilisant des nanoparticules magnétiques de polymères emprisonnant des médicaments. La délivrance de ces derniers se fera grâce aux propriétés d’échauffement local des nanoparticules magnétiques sous champ magnétique alternatif (AMF), permettant un contrôle spatio-temporel du relargage du médicament ainsi encapsulés dans le polymère. Ce projet s'effectuera dans deux EU differentes.
Bénéfices attendus
Le projet présente plusieurs bénéfices pour la santé humaine. En effet, ces nanomatériaux, rapides et moins coûteux à synthétiser, présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps conjugués à des médicaments développés récemment. Ils sont faciles et rapides à synthétiser, très peu couteux, présentent une bonne biocompatibilité, sont capables de traverser la membrane cellulaire en absence de toutes réponse immunogène. Cette approche permet de délivrer de façon spatio-temporelle des médicaments anti-cancéreux grâce à ses propriétés de ciblage et de délivrance contrôlée. Ainsi, notre approche transforme potentiellement des agents thérapeutiques non spécifiques avec des effets secondaires prononcés en un système thérapeutique ciblé utile pour la médecine de précision.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Pose chirurgicale d’un pellet contenant des hormones en sous-cutanée sous anesthésie et analgésie (1x/animal, 5-10 minutes) ii) Injections unique orthotopiques dans la glande mammaire de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine (2 minutes/animal) iv) Injection intraveineuse ou intra-tumorale des nanoparticules sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Imagerie sur animal anesthésié (1x/vie, 30 min) vi) Application d’un champ magnétique alternatif sur animal vigile (4x/vie, 30min-1heure) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : i) le risque infectieux et la sensation de douleur, conséquence potentiel de la pose d’implants d’œstrogènes nécessaire au développement préalable des glandes mammaires avant de pouvoir greffer les cellules cancéreuses. ii) le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. iii) le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la tumeur suite aux injections des nanomatériaux par voie intraveineuse ou intra-tumorale. iv) les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) v) le stress potentiel pour les animaux lors du transport des animaux sur un autre site en vue de l’imagerie.
Devenir
A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=374) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.
Remplacement
Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cellules en culture cellulaire ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.
Réduction
Le projet impliquera un total de 374 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Une étude pilote sur 20 animaux permettra d’optimiser les conditions expérimentales en validant le modèle murin ayant le meilleur taux de prise de greffe permettant par la suite de réduire la taille des groupes (moins de variabilité). L’étude de biodistribution sera réalisée sur des groupes de 3 souris maximum. Enfin, chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). Enfin, la réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce (l’homme dans le cas présent), et il n’y aura pas de réaction du non-soi, les cellules injectées pourront alors pousser sans être rejetées. Le choix de la souche de souris Nude sera effectué à la suite d’une étude pilote nécessaires pour optimiser les conditions de prise des xénogreffes et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaire au projet. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.
Modélisation de comportements complexes de type autistique chez la souris et impact de l’obésité induite pendant la grossesse en utilisant la vision par ordinateur et des approches d’apprentissage en profondeur
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un tatouage, une amputation du bout de la queue, l'implantation d'une puce sous-cutanée et des injections, une partie des femelles étant soumise à un régime gras pendant la gestation, pour modéliser des comportements de type autistique observés par un système de suivi vidéo. Le porteur signale une mortalité de 20 à 50 % des souriceaux à la naissance qu'il présente comme inhérente à la pathologie modélisée. Il décrit le modèle murin comme "indispensable" pour étudier le comportement social, impossible selon lui à reproduire in vitro.
Objectifs
Le trouble du spectre de l’autisme (TSA) désigne un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par : 1) des déficits de la communication sociale et 2) la présence de comportements répétitifs et des intérêts restreints. L'étiologie des TSA serait déterminée par la combinaison de plusieurs facteurs : génétiques et environnementaux. Parmi ces facteurs environnementaux, l’obésité maternelle représente un facteur de risque important. Le diagnostic des TSA repose essentiellement sur l’observation d’un comportement « anormal » durant les deux premières années de vie et notamment le comportement social. Ce dernier est un comportement très complexe dont l’étude requiert un niveau de détails élevé et l’accès à l’observation de plus de 2 animaux interagissant de manière libre pendant une longue période de temps. Pour étudier ce comportement et répondre à ces critères, nous proposons d’utiliser un système, appelé « Live Mouse Tracker (LMT)» qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de plusieurs congénères (4 souris) et sur plusieurs jours. Dans ce projet, nous souhaiterions modéliser des comportements complexes de type autistique sur 3 modèles de souris portant chacun l’inactivation de gènes impliqués dans des pathologies avec TSA. Ce projet s’articule autour de 3 objectifs : 1) Modélisation et validation de comportements complexes de type autistique chez les 3 modèles murins de TSA cités précédemment aux stades juvénile, adulte et lors du vieillissement. 2) Etudier l’effet d’un traitement à l’ocytocine, administré lors de la première semaine de vie,sur les comportements complexes de type autistique révélés chez les 3 modèles murins étudiés dans l’objectif 1 et à différents âges. En effet, il a été montré dans de précédentes études que l’administration d’ocytocine corrige notamment un comportement autistique dans l'un des 3 modèles de souris à l’âge adulte. 3) Etudier l’impact d’un surpoids gestationnel sur des comportements autistiques sur la descendance des 3 modèles de TSA cités précédemment. En effet, la variabilité des symptômes autistiques pour une même mutation peut être expliquée par la contribution de facteurs environnementaux. Dans ce projet, nous proposons de tester l'hypothèse que le surpoids gestationnel pourrait être un facteur aggravant
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont, d'une part, l'identification de nouveaux comportements complexes associés aux troubles du spectre de l'autisme observés chez des souris en « semi-liberté » sur des modèles génétiques de l’autisme, sur un modèle avec obésité gestationelle (connue pour être un facteur de risque), et sur des modèles combinant les facteurs génétiques et obésité gestationnelle. L'obésité représente un enjeu majeur de santé publique dont l'incidence est en nette augmentation en France depuis 1997 avec des conséquences graves sur la santé cardiovasculaire, métabolique et neurologique. Plus précisément, le taux de surpoids et d'obésité atteint 32% chez les femmes en âge de procréer ou enceintes. Par conséquent, la mesure de l'impact d'un surpoids/obésité gestationnel, est importante car elle peut démasquer ou aggraver l’effet des mutations génétiques. Il est nécessaire de mettre en évidence ces conséquences sur les symptômes de type autistique qui sont de plus en plus fréquents chez les enfants.
Procédures
Les animaux seront soumis au tatouage (quelques secondes), à la caudectomie (quelques secondes) et à l'implantation d'une puce en sous-cutanée. Cette implantation sera réalisée qu'une seule fois sous anesthésies locale et générale et durera environ 5 minutes. Les 4 injections sous-cutanées d'ocytocine pendant la première semaine de vie postnatale seront réalisées sous anesthésie locale et ne dureront que quelques secondes. L'administration d'ocytocine chez la souris sauvage n'entraine aucun effet néfaste. Son administration chez les souris mutantes a un effet bénéfique sur le comportement alimentaire et social. L'exposition des femelles reproductrices à un régime riche en graisses entraine une prise de poids. La durée du régime sera de 6 semaines (gestation + lactation).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les seules expérimentations susceptibles d'induire un effet indésirable seront la caudectomie, les injections sous cutanées, l'implantation des puces et le régime riche en graisses. Par ailleurs, les souris modèles d'autisme peuvent présenter un taux de mortalité à la naissance (20 à 50%) qui est inhérent à la pathologie. Cette mortalité a lieu dans les 2 premiers jours de vie par manque d’activité de succion (manque de nutrition) ou due à des apnées respiratoires sévères. Les animaux qui survivent, ne présentent pas d’anomalies et seront étudiés pour leur comportement social et répétitif avec le LMT.
Devenir
Les animaux seront utilisés pour des analyses immunohistochimiques ou euthanasiés.
Remplacement
Dans ce projet, nous nous intéresserons essentiellement à l'étude du comportement social. Le comportement est un ensemble d'actions réalisés par un être vivant, les modèles in vitro (culture cellulaire par exemple) ne permettant pas d'étudier le comportement, le modèle animal reste donc notre seule alternative. De plus, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite une validation sur des modèles précliniques (modèles animaux). Par conséquent, l'utilisation d'un modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs de notre étude. Il est à noter que l'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisé.
Réduction
Ce projet sera réalisé sur plusieurs étapes successives. Le nombre d'animaux a été calculé à partir d'une base de 20 animaux par groupe, par sexe et par génotype pour les expériences de comportement. Ce nombre a été calculé en se basant sur nos expériences précédentes utilisant des tests comportementaux ainsi que sur la littérature et correspond au nombre de souris utilisées dans ce type de test (LMT). Etant donné que l’utilisation du LMT est une procédure non-invasive, les mêmes souris seront utilisées aux différents âges pour l’étude comportementale. Ces mêmes animaux seront utilisés pour les études immunohistochimiques. De plus, l'utilisation d'animaux dans certaines expérimentations sera conditionnée par les résultats obtenus des premières expérimentations. En effet, si les résultats de ces dernières sont positifs (altérations comportementales), alors nous réaliserons un traitement à l'ocytocine dans une nouvelle cohorte, le nombre de souris utilisé sera alors établi grâce à l'utilisation de tests de puissance statistiques.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification, un accès illimité à l'eau et la nourriture, la présence d'objets (tunnel) et un nombre limité de souris par cage (4 souris par cage). Pour notre étude, il est nécessaire de constituer des groupes de 4 souris de même sexe et même âge par cage pour l'étude comportementale. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur. Les expérimentations induisant une douleur seront toutes réalisées sous anesthésie (locale et générale). Les animaux seront surveillés quotidiennement (poils, posture, activité dans la cage ...) et le poids pris régulièrement. Une grille de score sera mise en place pour la surveillance des animaux. Si un animal montre un score classé comme bénin à modéré, il sera surveillé plusieurs fois par jour et l'administration d’un AINS (anti-inflammatoire non stéroidien) en sous-cutanée et/ou d’un morphinique en sous-cutanée sera envisagée. L'arrêt de la nourriture riche en graisse sera également considéré. Si aucune amélioration n'est observée et que l'état de l'animal se détériore, une mise à mort sera alors réalisée.
Choix des espèces
L'ensemble de la littérature montre que les souris représentent des modèles robustes pour étudier différentes pathologies dont les TSA, cela est souligné et fortement soutenu par la fondation SFARI (Simons Foundation Autism Research Initiative) qui a pour but de mieux comperndre, diagnostiquer et traiter les TSA (www.sfari.org). Les outils génétiques utilisés chez la souris ont permis de générer les mêmes mutations génétiques retrouvées chez l'Homme mimant ainsi un certain nombre de symptômes et motivant la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Par ailleurs, les souris sont des animaux très prolifiques avec des temps de génération courts et des portées de 6 à 8 souriceaux en moyenne, facilitant ainsi l'étude de cohortes de plusieurs animaux du même âge, même sexe et à différents âges (de la naissance à la vieillesse) en moins de 18 mois. Dans ce projet, les animaux seront utilisés à 3 stades de développement différents : 1) Stade juvénile (entre le 35ème (P35) et le 40ème jour post-natal (P40)) : Pour identifier des altérations du comportement à l'adolescence. 2) Stade adulte (3 à 4 mois) : Pour évaluer la progression des altérations comportementales présentes au stade juvénile et/ou l'apparition de nouvelles altérations comportementales chez l'adulte. 3) Stade de vieillissement (>18 mois) : Pour évaluer si les souris âgées présentent un « vieillisement précoce », autrement dit des altérations comportementales similaires à celles observées dans certaines maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer). En effet, les patients atteints de certains syndromes avec des troubles autistiques développent une démence ou un déclin cognitif après 40 ans (syndrome de Down ou le syndrome de Prader-Willi).