Souris
Caractérisation chez la souris de vecteurs synthétiques pour le transfert d’acides nucléiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intramusculaires répétées de vecteurs synthétiques et des prélèvements de sang hebdomadaires, avant euthanasie et autopsie pour doser les vecteurs et évaluer leur toxicité. Le projet vise à mettre au point des vecteurs transportant des fragments d'anticorps, notamment pour la reproduction et une alternative à la contraception hormonale. Le porteur affirme que le passage chez l'animal reste "indispensable" car aucune méthode in vitro ne reproduit l'organisme entier.
Objectifs
Le traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale pourraient potentiellement voir le jour sur la base de la modulation réalisée par des petits fragments d’anticorps communément appelés nanobodies, qui grâce à leur taille inférieure aux anticorps classiques peuvent pénétrer plus facilement au sein des tissus ciblés. Afin de permettre leur délivrance, nous souhaitons évaluer l’utilisation de vecteurs synthétiques facilitant l’adressage des « gènes » codant pour ces nanobodies et induisant leur production par le tissu ciblé. Dans ce contexte, nous cherchons à améliorer le ciblage de la thérapie à l’aide de vecteurs synthétiques. En effet, les acides nucléiques ne traversant pas spontanément les membranes biologiques, l’objectif de notre projet est d’inventer et d’optimiser de nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour faciliter l’entrée des gènes dans les cellules. C’est pourquoi, nous voulons injecter nos vecteurs synthétiques chez la souris adulte pour observer la réponse globale de l’animal. L’analyse des résultats, des différents prélèvements des sites d’injections, du sang, ou de différents d’organes permettra d’ajuster la composition des vecteurs que nous développons et de trouver le meilleur vecteur pour les thérapies futures. Le projet proposé ici a pour objet (1) de déterminer les meilleures voies d’administration de ces fragments d’anticorps, d’étudier leur comportement in vivo, (2) d’optimiser leur séquences et formulation pour leur utilisation in vivo ; et (3) de confirmer leurs effets fonctionnels sur la reproduction.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité des composés étudiés. De plus, l’efficacité des vecteurs synthétiques administrés dans différents organes sera caractérisée. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques de reproduction chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention et de traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale, chez l'homme et/ou les animaux.
Procédures
Selon la procédure, les animaux subiront soit : - Procédure 1 : Des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min et sera répétée 7 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Des prélèvements sanguins sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. - Procédure 2 : Des injections intramusculaires (dans les deux muscles tibiaux) des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min sera répétée 1 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Cinq prélèvements sanguins sont prévus sur animal vigile sur toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés ont été anticipés avant la mise en œuvre du projet. Les vecteurs synthétiques testés possèdent des caractéristiques très précises et un degré de pureté élevé. Des études préliminaires de toxicologie et de biodistribution réglementaires ont déjà démontré la parfaite innocuité et absence de mortalité de ces nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour le transport intracellulaire de gènes thérapeutiques. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une formation de nodules au site d’injection… Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection (intra-musculaire) du vecteur. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang.
Devenir
A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
De manière systématique, les vecteurs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des « gènes thérapeutiques » dans des cellules en culture. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteur a été récemment validée et est actuellement en phase de développement clinique chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Un premier tri in vitro a été réalisé afin de ne sélectionner que les vecteurs ayant démontré la meilleure efficacité de transfection. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 10 animaux par groupe au maximum ont été prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats des études préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins, et des traitements antalgiques sont prévus en cas d’apparition de signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine. Les observations permettront d'effectuer une estimation de la douleur générée et, le cas échéant, de mettre en place des moyens adaptés pour la soulager de façon appropriée, efficacement et sans interférence avec le protocole (grâce à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées à ce projet). Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de sang).
Choix des espèces
Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents vecteurs seront utilisés.
Identification de nouveaux acteurs de l’identité de cellules souches germinales testiculaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
2480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie pour génotypage, certaines étant des donneuses tuées en période néonatale pour prélever des spermatogonies, d'autres recevant une transplantation de ces cellules par chirurgie du testicule. Le porteur indique une douleur liée à la chirurgie de transplantation via le rete testis et des points limites déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucune approche alternative ne permet d'étudier le maintien de la spermatogenèse sur plusieurs mois.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle de l'homéostasie des cellules souches germinales, à l'origine de la spermatogenèse à partir de la puberté et pendant toute la vie de l'individu. Cela devrait permettre d'identifier des gènes impliqués dans les infertilités masculines d'origine encore non identifiée; et de proposer de nouveaux marqueurs de diagnostic voire de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans 30% des cas les infertilités masculines restent de cause inconnue. L'analyse du rôle de différents gènes grâce à la transplantation de cellules souches pour l'étude de leur capacité à recoloniser les tubes séminifières ainsi que pour l'étude de leur capacité à donner sur le long terme de nouvelles vagues de spermatogenèse devrait nous permettre d'identifier de nouvelles causes des infertilités masculines et ainsi de proposer de nouvelle pistes de diagnostiques voire thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux subiront une biopsie pour le génotypage (procédure 1). Des animaux serviront de donneurs de spermatogonies souches suite à leur mise à mort en période néonatale. D'autres animaux seront utilisés pour la réalisation des transplantations de spermatogonies souches et l'analyse de leur capacite de recolonisation testiculaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances que vont subir les animaux sont les douleurs et contraintes associées à la chirurgie pour la transplantation des spermatogonies via le rete testis. Il est à noter que ce modèle, selon la littérature, ne devrait pas engendrer de phénotypes dommageables systémiques conduisant à une atteinte majeure de la santé de l'individu.
Devenir
Suite à la procédure de génotypage, certains animaux seront utilisés pour le maintien des colonies. Les animaux de génotype sans intérêt pour le projet seront mis à mort. D'autres animaux serviront de donneurs de spermatogonies souches suite à leur mise à mort. Enfin d'autres animaux receveurs seront utilisés pour la réalisation des transplantations. Ces animaux transplantés seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour la récupération de tissus pour l'analyse phénotypique de recolonisation des tubes séminifères et restauration de la spermatogenèse à partir des spermatogonies transplantées.
Remplacement
Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes des interactions cellulaires intra et inter-organes pouvant contrôler le développement et le maintien de la spermatogenèse sur le long terme (plusieurs semaines/mois).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Nous utiliserons 20 animaux par type de spermatogonies réimplantées afin d’obtenir des résultats statistiquement valides pour les différences entre les différents groupes.
Raffinement
Le raffinement reposera sur la surveillance quotidienne des animaux effectuée par du personnel qualifié (expérimentateurs et personnel animalier). De plus, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum) dans des cages de tailles conformes à la législation en fonction du nombre et du poids des souris, avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages. Des mesures spécifiques seront mises en place pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales. Un traitement préventif analgésique sous-cutané sera réalisé au moment de la chirurgie. Il y aura une surveillance accrue, soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur. Un suivi post opératoire individuel des animaux inclus dans la procédure chirurgicale sera matérialisé par le renseignement d’une fiche de suivi. Il n’est pas attendu d’effets dommageables durables. Des effets dommageables à court terme et/ou accidentels peuvent résulter de la laparotomie abdominale. Les contrôles prévus prendront place pendant l’intervention chirurgicale, au réveil de l’animal le même jour, le lendemain de l’intervention et le jour suivant. Des points limites gradés précis et adaptés ont été défini pouvant conduire à l'arrêt de l'expérimentation. Ainsi, des difficultés opératoires (hémorragies, temps d’intervention trop long) ou post-opératoires majeures (réveil retardé, saignements, suintements ou ouverture de la plaie, altérations de l’état général : posture de l’animal, mobilité spontanée, entretien du pelage) conduiront systématiquement à l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Notre étude reposera sur la technique de transplantation de cellules germinales souches. Nous utiliserons des lignées de souris transgéniques avec des gènes traceurs afin de suivre les cellules germinales transplantées. En parallèle, nous utiliserons une lignée bien définie permettant d'obtenir des souris stériles receveuses pour le transfert de cellules germinales souches. Les femelles et les mâles héterozygotes de la lignée receveuse seront utilisées pour l'entretien de la colonie et sacrifiées à 4 mois; Les femelles qui ne seront pas utilisées ou de génotype sans intérêt pour le projet seront sacrifiées après génotypages soit à 30 jours postnatal. Les mâles receveurs seront utilisés pour la transplantation des cellules germinales souches à 1 mois. Pour les mâles du génotype d'intérêt, pour analyser les capacités de régénération de la spermatogenèse, les souris transplantées seront mis à mort après 1 semaine, 2 semaines, 4 semaines, 8 semaines, 3 mois ou 6 mois. Les souris mâles "traceurs" seront mis à mort à 6 jours après la naissance pour la récupération des spermatogonies souches par tri cellulaire.
Travaux pratiques de formation aux gestes techniques de base chez la souris et le rat dans le cadre de la formation règlementaire à l’expérimentation animale
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 360
360 souris et 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une injection sous-cutanée sur animal vigile, puis des prélèvements de sang sous anesthésie générale sans réveil, avant mise à mort, pour entraîner des stagiaires aux gestes de base de l'expérimentation animale. Le porteur indique que les gestes sont pratiqués par des novices sous supervision, après entraînement sur animaux factices. Il justifie ces travaux pratiques par l'obligation réglementaire de formation "indispensable" à la certification des stagiaires.
Objectifs
Les réglementations française et européenne imposent l’obligation légale de formation de tout applicateur de procédures sur animaux vivants utilisés à des fins scientifiques. L’objectif général de ce projet est de répondre à la nécessité de formation en campus universitaire et de recherche. Cette formation concerne : (i) les étudiants en formation initiale notamment pour leur stage en laboratoire (première et deuxième années de master dans le domaine biomédical) ; (ii) les personnels universitaires et des établissements publics de recherche, en formation continue. Plus précisément, les procédures prévues dans le projet visent à répondre à la demande des autorités nationales de certification de la formation d’inclure dans la partie pratique de la formation la réalisation par les stagiaires de protocoles de base (injections, anesthésie, mise à mort) sur animal vivant.
Bénéfices attendus
À l’issue de leur formation validée, les stagiaires obtiendront une attestation de formation à l’expérimentation animale niveau applicateur, indispensable à leur formation de master et/ou leur projet professionnel. Ils auront eu une expérience concrète de la manipulation et de la contention des Rongeurs (souris et rats) ainsi que de gestes de bases à pratiquer sur animaux vigiles ou anesthésiés, dans le respect des normes éthiques et réglementaires de l'expérimentation animale.
Procédures
Chaque animal sera soumis à 2 interventions, l’une sur animal vigile, l’autre sur animal anesthésié sans réveil. La première intervention, sur animal vigile, est limitée à l’injection sous-cutanée (20 secondes), donc à une douleur légère, et à la manipulation, la contention et l’observation de l’animal associées à l’injection, d’une durée totale de 20 minutes. La seconde intervention consiste en la réalisation des prélèvements sanguins pratiqués sous anesthésie générale profonde, d’une durée maximale de 20 minutes, suivie de la mise à mort sans réveil, donc sans effet douloureux.
Impact sur les animaux
La manipulation par des novices peut être une source additionnelle de stress ou de douleur légère pour les animaux. Cet effet possible est limité par un entrainement préalable des stagiaires sur animaux factices (rat et souris) et par une démonstration faite par un enseignant immédiatement avant la réalisation des gestes sur animal vivant par les stagiaires. De plus, chaque geste pratiqué par un stagiaire est effectué sous la surveillance directe et continue d’un encadrant. Les autres interventions sur les animaux sont menées intégralement sous anesthésie générale sans réveil avant la mise à mort terminale, également sous surveillance d’un encadrant. L’absence de douleur est assurée par le monitorage de la profondeur de l’anesthésie.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux sont mis à mort. La formation approuvée par les autorités nationales de certification de la formation à l’expérimentation animale inclut, durant la session pratique, l’apprentissage des méthodes de mise à mort et la vérification d’absence de signes vitaux, sachant que ces gestes feront sûrement partie des missions de nos stagiaires dans leur futur laboratoire/animalerie
Remplacement
La formation à l'expérimentation animale sur rongeurs et lagomorphes, approuvée par les autorités nationales de certification de la formation à l’expérimentation animale, prévoit 7,5h d’enseignements pratiques, conformément à la réglementation. Sur ces 7,5 h, seules 4 h concernent la manipulation d’animaux vivants. Les stagiaires sont préparés aux séances avec des animaux vivants grâce à des mises en situation sans animaux et des séances sur animaux factices. Il reste néanmoins nécessaire, en fin de formation, de placer les stagiaires en situation réelle et de les former à l’abord de l’animal vivant. Il s'agit d'une exigence ministérielle pour agréer la formation. Cela permet ainsi de garantir la qualité des gestes qui seront appliqués ultérieurement par les stagiaires dans le cadre de leurs activités scientifiques impliquant des animaux. La manipulation d’un rat et d’une souris étant différente, il est nécessaire de former les stagiaires aux particularités de chacune de ces deux espèces.
Réduction
Nous réduisons le nombre d’animaux par séances de travaux pratiques à 1 animal pour 3 stagiaires en veillant à limiter les contraintes et le stress sur les animaux et donc limiter l’atteinte à leur bien-être. Nous réduisons aussi le nombre d’animaux en nous procurant dans la mesure du possible des animaux de réforme (non utilisables pour de la recherche) auprès des fournisseurs.
Raffinement
En amont des procédures proprement dites, le bien-être des animaux et l’absence de stress ou douleur sont assurés lors de l’accueil et de l’hébergement des animaux par : – un hébergement en groupes sociaux stables dans un environnement calme avec un enrichissement adapté à l’espèce. – une période d’acclimatation de 6-8 jours dans la zone de stabulation avant les TP. – une durée des TP limitée à 2h. Durant la procédure proprement dite, la limitation de la douleur, de la souffrance et du mal-être est assurée par : – un entrainement préalable des stagiaires sur animaux factices. – un taux d’encadrement des stagiaires important (1 formateur pour 5 stagiaires et 2 animaux) : chaque manipulation par un stagiaire est supervisée par une personne compétente. – une démonstration par l’encadrant compétent avant toute manipulation par le stagiaire. – des consignes de calme systématique (niveau sonore faible) garantissant un déroulement optimal du TP et de l’anesthésie des animaux. – un seul acte réalisé sur animal vigile : injection sous-cutanée de liquide physiologique au niveau de la nuque (peu douloureux et sans conséquence délétère). – la réalisation des autres actes sous anesthésie analgésique générale sans réveil avec monitorage consciencieux. – le maintien de la température corporelle des animaux à 37°C (valeur physiologique) durant l’anesthésie grâce à un coussin chauffant adapté. – des volumes injectés faibles avec un matériel adapté (taille des aiguilles). – un volume de sang prélevé faible (
Choix des espèces
En France, la souris et le rat sont les animaux les plus fréquemment utilisés à des fins scientifiques (respectivement près de 61 % et 8,7 % des utilisations) (Direction générale de la recherche et de l’innovation - Statistiques nationales, 2021), c’est pourquoi la formation pratique s’appuie sur ces deux espèces. Les stagiaires travailleront sur des animaux adultes (stade le plus couramment utilisé, posologie adaptée, prélèvement de sang plus "facile")
Etude sur modèle murin du rôle des cosmétiques capillaires contenant du glycolate ou du glyoxylate dans l’apparition de la néphropathie oxalique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système urogénital
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une crème lissante capillaire contenant du glycolate est appliquée sur leur pelage pendant 24 heures, avec port d'une collerette et gavage, pour vérifier si ces cosmétiques provoquent une insuffisance rénale par précipitation de cristaux. Le porteur indique un risque d'insuffisance rénale sévère, objet même de l'étude, avant mise à mort pour analyse des tissus. Il affirme que l'usage d'un "organisme vivant dans son ensemble" est "indispensable" pour tester l'effet cutané sur les reins.
Objectifs
L'insuffisance rénale aigue est une situation grave dans laquelle la fonction rénale est altérée et met en jeu le pronostic vital des patients. De nombreuses causes peuvent être retrouvées, parmi lesquelles des maladies rénales causées par la précipitation de cristaux: les néphropathies cristallines. Parmi ces maladies, les néphropathies dites oxaliques sont des maladies sévères avec un pronostic de récupération très sombre. Ces maladies ont comme déterminant commun la précipitation intra-rénale de cristaux d'oxalate de calcium. Elles peuvent être dûes à des maladies génétiques monogéniques (hyperoxalurie primaire) ou encore à des intoxications par de l'éthylène glycol. Très récemment, une équipe israélienne a rapporté la survenue de néphropathie oxalique chez des jeunes femmes dont le seul déterminant commun était l'application de crème lissante sur les cheveux à répétition. Hors, ces préparations contiennent de fortes doses de glycolate, le précurseur naturel de l'oxalate (le glycolate est transformé dans le foie en oxalate et libéré sous cette forme). Toutefois, les auteurs de cette étude n'ont pas pu apporter de preuve expérimentale de la toxicité de ce cosmétique, qui reste utilisé par de nombreuses personnes. Cete série de patiente concernait 26 patientes jeunes atteintes d'insuffisance rénale sévère, dont peu ont récupéré une fonction rénale normale. Récemment un cas similaire a été observé en France, la crême lissante utilisée a pu être récupérée. L'objectif de ce travail est de déterminer si les crèmes lissantes contenant du glycolate (notamment celle utilisée par la patiente française) sont effectivement responsables de la survenue de néphropathie oxalique dans un modèle murin. Si cela devait se confirmer, une alerte de pharmacovigilance sera lancée et le retrait d'un certain nombre de ces produits sera probablement envisagé.
Bénéfices attendus
Démonstration expérimentale du lien direct entre l'application de crème lissante capillaire et la survenue d'une insuffisance rénale aigue cristalline permettant de documenter le risque associé à cette pratique. Si cela devait se confirmer, une alerte de pharmacovigilance sera lancée et le retrait d'un certain nombre de ces produits sera probablement envisagé.
Procédures
La procédure consistera simplement à appliquer des crèmes lissantes le plus rapidement possible sur l'animal afin de ne pas induire de stress (2 minutes maximum). La souris sera exposée 24h à ce produit. Le prélèvement de "spots urinaires" le soir de l'application de la crème, et le lendemain de l'application de la crème (J1) Le spot urinaire: Il s'agit d'une miction spontanée de la souris. Un léger massage abdominal est appliqué pour favoriser la miction cette sera de courte durée 30 secondes environ . le gavage à l'aide d'une sonde appropriée pour souris ce geste sera court d'environ 30 secondes . La méthode d'euthanasie réglementaire sera éffectuée à la suite du prélèvement sanguin toujours sous anesthésie .
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet les animaux seront exposés à différentes crèmes qui seront appliquées sur le pelage sur animal vigile .Afin d'éviter toute digestion par léchage les animaux seront isolés durant une courte durée et disposent d'une collerette qui pourrait être source d'un stress de courte durée 30 minutes .Certains animaux receverons également un traitement par gavage impliquant une contention et l'introduction d'une sonde gastrique qui peut être source de stress et d'une sensation désagréable pour l' animal mais de courte durée (30 secondes ).Enfin il y a un risque de survenue d'une insuffisance rénale sévère consécutive à l'exposition aux crèmes ceci fait l'objet de cette étude .
Devenir
Euthanasie à la fin de la procédure pour procéder à l'analyse histologique et moléculaire des différents tissus.Tous les animaux de la procédure .
Remplacement
L'utilisation d'un organisme vivant dans son ensemble est ici indispensable, car il faut déposer le toxique supposé sur la peau pour tester son effet sur les reins .Ceci ne peut etre réalisé que sur des modèles animaux en l'état actuel des choses. Les modèles murins sont particulièrement appropriés pour le développement de modèles de néphropathie oxalique. Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou des organoïdes.
Réduction
Des lots d'animaux suffisamment grands sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences de la toxicité entre les groupes d'animaux. Les tests statistiques adéquats seront ensuite utilisés pour comparer les 6 groupes entre eux.Au total pour ce projet 120 souris.
Raffinement
Le bien être animal est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose ,des dômes seront ajouté dans les cages afin que les animaux puissent se cacher et grignoter celui-ci pour confectionner un nid. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés avec une acclimatation de 8 jours avant la procédure. Le personnel est formé spécifiquement dans le domaine avec une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur.l'exposition aux disfférentes crèmes sont de courte durée l'anesthésie et l'analgésie seront pratiquées pour le prélèvement sanguin terminal ,les points limites seront respectés pendant la durée du protocole .
Choix des espèces
L'utilisation d'un organisme vivant dans son ensemble est ici indispensable, car il faut déposer le toxique supposé sur la peau pour tester son effet sur les reins. Ceci ne peut être réalisé que sur des modèles animaux en l'état actuel des choses. La souris est un modèle de petite taille ,d'hébergement et pour lequel nous disposons de toutes les techniques d'analyses des résultas. Les souris seront utilisées à l'âge de 8 à 9 seamines correspondant au moment le plus propice à la précipitation de cristaux dans l'arbre urinaire.
Evaluation comportementale des effets de nouvelles entités pharmacologiques dans trois modèles de mémoire chez le rongeur: le test du labyrinthe de Barnes, le test du labyrinthe en Y et le test de reconnaissance de nouvel objet
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1440
6 240 rongeurs, 4 800 souris et 1 440 rats, vont être utilisés, et la déclaration en compte 3 520 en souffrance légère et 2 720 en souffrance modérée. Selon les groupes, ils passent sous candidats médicaments un labyrinthe de Barnes, un labyrinthe en Y, dont une version impose huit jours de restriction alimentaire, ou un test de reconnaissance d'objet nouveau, et l'un des protocoles les expose à une lumière et un bruit forts pour les pousser à chercher un refuge. Les souris des lignées présentées comme reproduisant la trisomie 21 et le syndrome de l'X fragile passent les trois tests. Ces molécules viennent du centre de recherche du porteur, qui les trie selon leur effet sur la mémoire et renvoie les retombées pour les patients à "plus long terme", où le projet "pourrait permettre" de fournir des données qu'il dit "indispensables". Les souris de ces lignées et les rongeurs traités par des composés qui risqueraient d'interférer avec d'autres expériences sont tués, et les témoins pourront être réutilisés dans d'autres projets, 960 souris et 360 rats selon la déclaration.
Objectifs
Il existe de multiples formes de mémoire chez l’humain, avec notamment la mémoire déclarative (ou explicite, que l’on peut verbaliser), qui est perturbée dans de nombreuses pathologies telles que la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, l’autisme, ou encore des maladies génétiques telles que la trisomie 21, le syndrome de l’X Fragile… Afin de chercher des pistes thérapeutiques à ces pathologies, il est nécessaire de passer par des tests chez l’animal, et donc de pouvoir évaluer leur mémoire déclarative de manière objective, car ils ne peuvent pas la verbaliser. Différents types de tests comportementaux ont été mis au point dans ce but, en utilisant des stratégies distinctes. Un première stratégie vise à approcher la mémoire déclarative humaine chez l’animal en mettant en jeu un sous-type de cette forme de mémoire, la reconnaissance/familiarité, qui peut être évaluée chez le rongeur. Le test le plus utilisé est celui de reconnaissance de nouvel objet, que nous utiliserons dans ce projet. Une seconde stratégie utilisée pour évaluer la mémoire chez l’animal repose sur un parallèle existant entre mémoire déclarative humaine et mémoire spatiale animale, qui reposent toutes les deux sur les mêmes structures cérébrales et qui partagent des mécanismes. Divers dispositifs ont été validés dans la littérature afin d’étudier cette mémoire spatiale chez la souris et le rat, et nous en utiliserons deux dans ce projet : le labyrinthe de Barnes et le labyrinthe en Y. Grâce à ces trois tests comportementaux évaluant des types de mémoire différents, nous avons pour objectif de tester l’effet sur la mémoire de nouveaux candidats médicaments développées dans notre centre de recherche (dont la majorité ont pour cible des récepteurs du système nerveux central). C’est pourquoi nous travaillerons tout d’abord sur des animaux standards dans un contexte physiologique afin de tester l’effet sur la mémoire des composés en conditions basales. Nous prévoyons aussi d’utiliser des modèles murins de pathologies génétiques (Trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile) afin d’étudier l’effet bénéfique potentiel de nos composés pour réduire les déficits cognitifs présents dans ces modèles.
Bénéfices attendus
A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouveaux candidats médicaments, ce projet permettra de caractériser leur effet sur différents types de mémoire (reconnaissance d’objet, reconnaissance spatiale, mémoire à court ou long terme). En travaillant tout d’abord chez des animaux standard en condition physiologique, on pourra ainsi sélectionner des candidats médicaments présentant des effets promnésiques (c'est à dire favorisant la mémoire) intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits de mémoire (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Ou à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire. D’autre part, ce projet inclus deux modèles murins de maladies génétiques (trisomie 21 et syndrome de l’X Fragile), qui permettront de tester l’effet de nos nouveaux candidats médicaments sur les déficits cognitifs présents dans ces pathologies. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique chez l’humain, ce projet pourrait permettre de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments pour traiter des déficits de mémoire dans différentes pathologies.
Procédures
Ce projet comporte 3 protocoles différents et indépendants. Dans le cas d’utilisation de souris et de rats standards, des groupes distincts seront soumis à ces 3 protocoles. En revanche, dans le cas de l’utilisation des 2 modèles souris de la trisomie 21 et du syndrome de l’X Fragile, les mêmes souris seront soumises aux 3 protocoles car ces souris sont disponibles en quantités limitées. Le premier protocole est le test du labyrinthe de Barnes. Ce protocole sera déoulera sur plusieurs jours (une à deux semaines), et pour chaque journée chaque animal ne sera testé dans le labyrinthe qu'une à trois fois pour une durée de 3 minutes maximum chacune. Le second protocole est le test du labyrinthe en Y, qui pourra se décliner en 3 versions différentes. La première version se fera en un seul essai de 8 minutes; la seconde version impliquera une restricton alimentaire légère (pour motiver la recherche de récompenses alimentaires) et se déroulera sur 8 jours avec au maximum 3 essais par jour de quelques minutes; la troisième version aura lieu sur 1 à 2 jours avec 2 essais de 5 min séparés de 1h à 24h. Le troisième protocole de ce projet est le test de reconnaissance de nouvel objet. Ce test a lieu sur 2 jours, avec trois phases de 5 à 10 minutes chacune au sein du dispositif et séparées de 4-5h à 24h. Pour chacun des 3 protocoles de ce projet, des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant l’entraînement, avant le test de mémoire…) selon l’effet recherché.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, dans le cadre d'un protocole spécifique, les rongeurs pourront être soumis à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d'un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. Enfin, toutes nos procédures impliquent une manipulation des animaux pour les introduire dans les différents dispositifs, ce qui est source de stress, mais qui sera atténué par une habituation préalable et par le transport dès que possible via des tunnels ou sur le bras de l'expérimentateur pour éviter le soulèvement par la queue.
Devenir
Les animaux traités avec des composés pharmacologiques qui risqueraient d’interagir avec d’autres expérimentations dans le but d’une réutilisation seront mis à mort, tout comme les souris modèles de pathologies génétiques qui ne peuvent pas être réutilisées dans d'autres projets. Cependant, les animaux contrôles standards pourront être réutilisés dans d’autre projets selon les objectifs de recherche. La décision sera prise par le responsable projet (ou par une personne compétente désignée par lui) ou par le vétérinaire.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux avant toute administration à l’homme. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés e, groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, en particulier pour les trois tests utilisés dans ce projet. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine, avec même des tests mnésiques réalisés chez la souris qui peuvent être transposés de manière très fidèle chez l’humain. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitive et d’attention fonctionnelles.
Evaluation du rôle des intégrines β1 et β3 plaquettaires dans les saignements inflammatoires (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent selon les groupes une inflammation cutanée, pulmonaire ou cérébrale, ce dernier modèle incluant une chirurgie du cou pour provoquer un AVC, avec prélèvements de sang, injections et pose de cathéter à la queue. Le porteur indique une détresse respiratoire possible et des difficultés motrices et alimentaires liées à l'AVC, les animaux étant mis à mort sous anesthésie pour quantifier les saignements. Il affirme que le rôle des intégrines plaquettaires ne peut être étudié sans le métabolisme entier de la souris.
Objectifs
L’arrêt des saignements implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, adhèrent, s’activent et agrègent pour former le clou plaquettaire qui limite le saignement. Il a été mis en évidence que les plaquettes jouent un rôle particulièrement important également dans l’arrêt des saignements en conditions inflammatoires. En effet, l’inflammation induit un recrutement des neutrophiles qui traversent la paroi vasculaire entrainant la formation de brèches vasculaires. Les plaquettes jouent alors leur rôle et colmatent les brèches. Cependant, les mécanismes impliquant les plaquettes dans ce processus restent encore peu compris à ce jour. Ce projet vise donc à évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes impliquant les plaquettes dans l’arrêt des saignements inflammatoires, ce qui à terme pourrait conduire à une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Pour l’inflammation cutanée, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections intradermiques et rétro-orbitales et à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h). Pour l’inflammation pulmonaire, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h) et à une inoculation intranasale. Pour l’inflammation cérébrale, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections rétro-orbitales, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h), à une chirurgie au niveau du cou qui permettra d’induire un AVC (maximum 30min) et à une imagerie IRM (maximum 1h).
Impact sur les animaux
Un effet indésirable attendu est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. De plus, une inflammation locale sera observée. Dans le modèle pulmonaire, on pourra observer une surcharge de liquide dans les poumons conduisant à une détresse respiratoire légère à modérée. Pour le modèle d’AVC, on s’attend à des douleurs suite à la chirurgie, à des difficultés motrices et pour s’alimenter dues aux manifestations de l’AVC.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux encore anesthésiés sont mis à mort afin de prélever et quantifier les saignements dans les tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales), il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par d’autres méthodes du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal sous anesthésie • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de tétracaïne sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux effectués sur la souris démontrant le rôle primordial des plaquettes dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Afin de pouvoir comparer nos résultats avec ceux publiés, il est nécessaire de réaliser ce modèle dans la même espèce animale. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Mise en place d’un nouveau traitement dans le gliome pédiatrique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont greffées dans le tronc cérébral sous anesthésie, puis un traitement anticancéreux est injecté par voie intrapéritonéale ou intracrânienne, avant prélèvement des tumeurs. Le projet compare deux voies d'administration d'une combinaison de médicaments contre le gliome du tronc cérébral, un cancer pédiatrique incurable. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.
Objectifs
Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral (DIPG), un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de DIPG. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Ici, le projet vise à comparer deux voies d’administration afin de déterminer si la voie d’administration intracrânienne de notre thérapie est la plus adaptée pour un usage chez les patients. La combinaison de drogues utilisée sera celle validée il y a deux ans dans ce même modèle murin. Elle sera injectée soit par voie intrapéritonéale, soit par voie intracrânienne. Des analyses moléculaires et histologiques seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des drogues et de chaque voie d’injection sur les cellules cancéreuses et l’expression de leurs gènes dans un contexte in vivo.
Bénéfices attendus
Démontrer que la combinaison bloque la formation de la tumeur chez la souris qu’elle soit injectée par voie intrapéritonéale ou par voie intracrânienne. Ces données serviront de base à l’élaboration de stratégie thérapeutique chez les enfants atteints d’un gliome pédiatrique. Elles permettront aussi d’envisager l’utilisation de ce modèle pour tester de nouvelles combinaisons de drogue par voie intracrânienne, si cette dernière donne satisfaction.
Procédures
Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine pendant 3 semaines, 20 minutes). Injection intrapéritonéale ou intracrânienne sous anesthésie d’une solution chimique (2 fois par semaine pendant 3 semaines, 5 minutes ).
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certains groupes de souris, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux par voie intrapéritonéal et intracrânienne afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à la combinaison et selon le mode d’administration. La plupart des manipulations sur les animaux seront réalisés sous anesthésie générale. Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure. Cependant, comme les souris sont manipulées sous anesthésie, une large partie de ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.
Devenir
Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments stromaux et tumoraux en action in vivo chez la souris.
Réduction
En termes de test statistique et d’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50 pourcent de différence inter-lots avec 50 pourcent d’écart type intra-lots est de 15.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.
Étude du rôle des macrophages dans le développement du cancer buccal.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1008 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 541 d'entre elles étant réutilisées et les autres tuées. Elles reçoivent une biopsie de la queue à la naissance, un cancérigène dans l'eau de boisson pendant deux à quatre mois qui provoque des tumeurs de la langue, et un gavage, les tumeurs entraînant des difficultés d'alimentation et une perte de poids. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort pour prélever les organes et que les parents reproducteurs sont euthanasiés après six mois. Il affirme que seules des souris génétiquement modifiées permettent d'étudier le rôle des macrophages dans ce cancer.
Objectifs
Le carcinome à cellules squameuses oral (OSCC) est le cancer de la langue le plus courant, touchant principalement les fumeurs, les personnes alcooliques ou porteuses d’un papillomavirus. Malgré sa prévalence, il reste peu étudié en comparaison avec d’autres cancers. Les macrophages sont connus pour s'infiltrer dans divers types de tissus cancéreux, contribuant à la progression tumorale en favorisant l'angiogenèse, la métastase ou le développement d'un environnement immunosuppresseur. A l’inverse, certains sous-types de macrophages vont avoir un rôle antitumoral, notamment aux prémices du développement tumoral. La diversité et les fonctions spécifiques de sous-populations de macrophages lors du développement de l’OSCC sont encore peu claires. En effet, l'hétérogénéité des macrophages et le rôle des différentes populations dans la promotion de la croissance tumorale font encore l'objet de controverses. De plus, la plupart de cette caractérisation reste très superficielle car réalisée chez l'homme. A travers l’utilisation de modèles animaux permettant de supprimer spécifiquement et localement les macrophages de la langue, nous proposons d’étudier leur rôle au cours du développement tumoral de l’OSCC.
Bénéfices attendus
Les cancers de la tête et du cou sont le sixième type de cancer le plus courant. Ils regroupent plusieurs types de cancers qui se développent souvent dans les cellules squameuses tapissant les surfaces muqueuses de la cavité buccale, du pharynx, du larynx ou de la cavité nasale. Toutefois, le cancer de la bouche est le type le plus fréquent des cancers de la tête et du cou, avec environ 377 700 nouveaux cas et 177 700 nouveaux décès signalés chaque année dans le monde. L’OSCC est le cancer de la bouche le plus courant, représentant 90% de tous les cancers buccaux et se trouvant le plus souvent sur la langue. Malgré les traitements disponibles tels que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, les taux de mortalité et de morbidité restent élevés, avec un taux de survie à 5 ans et après traitement de moins de 50%. De plus, selon l'Observatoire mondial du cancer, l'incidence de l’OSCC devrait augmenter d’au moins 40% d'ici 2040, ce qui en fait une préoccupation majeure de santé actuelle et future. Ce projet va nous permettre de comprendre la dynamique des macrophages dans un cancer encore trop peu étudié, tant chez l'homme que chez la souris. L'utilisation d'un modèle unique va donc nous permettre d'aller plus loin dans la compréhension du rôle des macrophages dans le développement de la maladie, ainsi que des mécanismes moléculaires impliqués, que ce soit au stade précoce ou tardif du développement. À terme, ces données pourraient donc ouvrir la voie à de nouvelles voies thérapeutiques en particulier celles impliquant l’immunomodulation.
Procédures
1008 souris se verront prélever un morceau de queue 7 à 10 jours après leur naissance. 314 souris seront soumises à un traitement avec une molécule cancérigène ajouté à l'eau de boisson pendant des périodes allant de 2 à 4 mois maximum. 84 souris seront traitées avec une molécule cancérigène ajouté à l'eau de boisson pendant 4 mois et seront traitées avec une molécule qui permet à notre modèle murin de fonctionner, à travers un gavage de moins de 10 secondes par voie orale 2 fois à 7 jours d'intervalle.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé. - L'induction de l'OSCC se fait par la prise d'une molécule cancérigène diluée dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 4 mois. Au fur et à mesure de son développement, ce cancer provoque des lésions sur la langue, entraînant finalement l'apparition de tumeurs. Ces lésions et tumeurs induisent des difficultés d'alimentation, entraînant une perte de poids à la fin du protocole. - L'administration d'une molécule par voie orale à l'aide d'une seringue avec embout flexible), permettant à notre modèle murin peut entraîner un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration, qui dure environ 10 secondes.
Devenir
Après 6 mois d'accouplement, les parents sont euthanasiés. Les bébés sont utilisés pour (i) remplacer les parents, (ii) être utilisés dans ce projet ou être utilisé dans de futures projets. À la fin des procédures, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes.
Remplacement
Les données de la littérature ont montré que chaque type de macrophage exprime un profil d’expression de gènes unique lui permettant de réaliser des fonctions propres à ce sous-type. Ce profil d'expression de gènes est induit par un ensemble de signaux fournis par son microenvironnement direct. Nous anticipons que le développement de la tumeur fournira un nouvel environnement et donc de nouveaux signaux instructifs permettant la différenciation de nouveaux sous-types de macrophages. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre le macrophage et le microenvironnement de la tumeur. Ces interactions sont basées sur le recrutement de cellules circulantes, la présence de macrophages linguaux différenciés avant l’apparition de la tumeur, dont on ne sait pas reproduire le profil in vitro, et un profil évolutif des cellules tumorales au cours du temps qui possèdent également leur propre profil. De plus, les macrophages pourraient également impliqués dans le recrutement ou la communication avec d’autres cellules immunitaires circulantes, dont on ne pourra pas connaître la nature exacte si les expériences in vivo ne sont pas effectuées. Enfin, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique, le niveau de risque acceptable et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
De la nourriture en gelée sera ajoutée à chaque cage dès le début du traitement. Des bâtonnets de bois seront également ajoutés pour permettre le limage naturel des dents, qui seront contrôlées de manière hebdomadaire et coupées si nécessaire. Une surveillance renforcée sera mise en place deux fois par jour si les souris perdent plus de 10 % de leur poids initial, présentent une diminution de leur mobilité ou un pelage hirsute. Les souris seront euthanasiées en cas de perte de poids supérieure à 20 %, de comportement sévèrement altéré (vocalisations spontanées, automutilation, immobilité et absence de réaction) ou d'anomalie physique (piloérection, dos arrondi). Le statut de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les conditions d'hébergement des souris respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE : - Les cages utilisées dans les zones ont une surface de 530 cm2. Il est possible d'y héberger 5 souris adultes d'un poids >= à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. - Du coton ou du sizzle pad pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. - Les animaleries bénéficient d'une Température régulée à 21°C, d'une Hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée (250 lux à un mètre du sol). - Les animaleries sont calmes (58Db).
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour répondre de manière irréfutable aux questions posées. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 6 semaines jusqu'à la fin du traitement, puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages lors du développement tumoral à l’âge adulte.
Production liquide d’ascite (produit dérivé)
- Production de routine
- Tests réglementaires
4800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules dans le péritoine, qui provoque une production de liquide d'ascite et un gonflement de l'abdomen surveillé chaque jour, le liquide étant récolté après mise à mort. Ce liquide d'ascite entre dans la fabrication de tests de diagnostic de la toxoplasmose et de la rubéole. Le porteur indique que cette cellule ne peut à ce jour être conservée qu'in vivo et que des essais de substitution sont "en cours d'étude".
Objectifs
La production de ce liquide d'ascite (produit dérivé) entre dans la formulation de tests de diagnostics de maladies infectieuses tel que la recherche de Toxoplasmose et de Rubéole. Il est utilisé dans son entièreté sans purification préalable et amène une stabilité aux tests.
Bénéfices attendus
Cette ascite issue de la multiplication d'une cellule qui est utilisé directement dans nos diluants, sans étape de purification préalable et a un rôle de stabilisant et de ballast. Cela améliore ainsi la spécificité des tests.
Procédures
Selon le protocole chaque souris recevra 1 seule injection de cellules sans injection préalable d'un activateur du système immunitaire. Cette injection dure quelques secondes. L'incubation dure 2 semaines maximum. Durant cette phase de developpement de la cellule, un suivi quotidien est réalisé (à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur afin de d'avoir une objectivité sur l'apparition d'éventuels points limite). La récolte de l'ascite est réalisée stérilement sur les animaux préalablement euthanasiés.
Impact sur les animaux
La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d'ascite. Cela engendre un gonflement de l'abdomen de l'animal. Ce gonflement de l'abdomen fait l'objet d'une surveillance quotidienne et une cotation est réalisée chaque jour afin d'évaluer la douleur engendrée par ce geste.
Devenir
Les animaux dédiés ne sont utilisés que pour ce protocole. A la fin de celui-ci, Le liquide d'ascite est récolté post mortem.
Remplacement
La cellule permettant la production de cette ascite est à ce jour conservée in vivo uniquement et il n'y a pas à ce jour d'alternative fiable utilisable en routine pour remplacer cette cellule en l'état, car une perte de viabilité de la cellule très importante est constatée lors des cycles congélation/décongélation. Cela empêche donc la conservation de la cellule en in vitro. Cependant des essais de faisabilité du retrait ou de la substitution de cette ascite sont en cours d’étude.
Réduction
La quantité d'animaux nécessaire est déterminée sur la base de prévisions de fabrication des tests utilisant l'ascite. Afin de réduire l'utilisation de cette ascite, la totalité des cas d'emplois à été répertorié. Chaque cas d'emploi a été analysé afin d'identifier la possibilité d'un retrait ou de substitution de l'utilisation de cette ascite. La réduction de certains cas d'emploi est déjà acquise (arrêt produits et arrêt d'un cas d'emploi). Pour les autres références la faisabilité est en cours d'analyse en travaillant prioritairement sur les plus gros consommateurs de liquide d'ascite. Le développement des nouvelles références se fait systématiquement sans usage de liquide ascite. Développement en cours d'un lignée cellulaire stabilisée congelée afin d'essayer de substituer le mode de conservation in vivo actuel.
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, cependant, le protocole ne nécessite pas d'amorce intrapéritonéale (pas d'injection de pristane) et cela fait diminuer considérablement la sévérité du protocole. De plus, les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. La mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet au technicien d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer. Les animaux sont en hébergés en cages équipées d'enrichissement de type "maison".
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé du fait de l'origines des cellules à multiplier Pour cette application, nous utilisons des animaux matures âgées à minima de 8semaines.
Etude des mécanismes de l’atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un prélèvement de queue, des injections intraveineuses, deux chirurgies sous anesthésie et des séjours en cage métabolique, une atteinte rénale leur étant induite pour en étudier les mécanismes avant prélèvement des reins. Le porteur affirme que "seule l'expérimentation animale" permet d'étudier ces maladies rénales rares dans un organisme vivant. Les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort après le seul génotypage.
Objectifs
Les maladies rénales rares et sévères sont à mauvais pronostic et sont associées à des risques élevés d'insuffisance rénale terminale. Ces maladies représentent 11% des causes d'insuffisance rénale terminale en France. Ces maladies sont des maladies complexes et seule l'expérimentation animale, résumant l'ensemble des interactions cellulaires au sein du rein, dans un organisme vivant, permettra d'étudier les mécanismes impliqués dans la destruction rénale au cours de ses maladies. Nous avons identifié une protéine potentiellement impliquée dans ces maladies et nous allons tester le rôle de cette protéine chez des souris où cette protéine aura été inactivée et chez qui nous aurons induit les maladies rénales que nous étudions. Nous réaliserons des prélèvements d'urine pour évaluer la fonction des reins et les animaux serons mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les reins et analyser les lésions.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la physiopathologie des maladies rénales rares et sévères. Ce projet permettra d'établir si le mécanisme identifié pourrait faire l'objet d'un ciblage pharmacologique à visée thérapeutique.
Procédures
Baguage à l'oreille et prélèvement d'un morceau de queue de 1 mm sur animal vigile (1 fois 2 min), injection intra veineuses sous anesthésie générale (1 à 3 selon la procédure, 5 minutes), chirurgies sous anesthésie générale (2 chirurgies pour une procédure, 20 minutes). recueil d'urine en cage métabolique (3 à 7 selon les procédures, 8H)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, stress lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleur post-opératoire. Effet lié aux modèles: insuffisance rénale pouvant induire une perte de poids modérée ou une fatigue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Soit ils n'auront pas un génotype d'intérêt et sont mis à mort sans expérimentation autre que le génotypage, soit ils sont d'intérêt et sont mis à mort pour prélèvement des tissus.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères incluant les cultures cellulaires (in vitro). Les cibles identifiées sont d'abord testés sur des cellules en culture. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales comme les interactions entre les glomérules et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous avons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un logiciel dédié. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les cages sont enrichies en coton et bâton de bois. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, les modèles utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Stade de développemnt: de la naissance à l'age adulte car nous avons un élevage. Seuls les animaux adultes agés de 2 à 6 mois sont utilisés pour les modèles expérimentaux. Les pathologies étudiées touchent essentiellement les adultes donc nous réaliserons les modèles expérimentaux chez des souris adultes.
Archivage de lignées murines par cryoconservation de sperme ou d’embryons
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
35 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des stimulations hormonales par injection, des microchirurgies de transfert d'embryons sous anesthésie et des biopsies pour génotypage, pour archiver des lignées génétiquement modifiées par congélation de sperme et d'embryons. Le porteur indique que les mâles reproducteurs et donneurs de sperme, les femelles donneuses d'ovocytes et les femelles ayant subi le transfert d'embryons sont toutes mises à mort, comme les animaux nés des transferts et utilisés pour le contrôle qualité. Il affirme que la congélation des semences est "la seule méthode possible" pour sauvegarder ces lignées murines.
Objectifs
Les équipes de recherches utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations de stockage et de congélation en azote liquide des lignées génétiques impliquées vise à garantir la disponibilité de ces lignées à l'état cryoconservé permettant au besoin de revivifier la lignée en cas de problème survenu sur la lignée à l'état respirant (perte, dérive génétique, contamination) et de faciliter les échanges de ces lignées entres les différents sites hébergeurs par l'envoi des semences cryoconservées.
Bénéfices attendus
L'archivage et la sauvegarde des lignées par cryoconservation de sperme et/ou d'embryons permet de garantir la disponibilité des lignées murines traitées et de favoriser/simplifier les échanges entre différents sites.
Procédures
-hébergement en situation d'isolement de 1 à 2 semaines maximum - Stimulation hormonale : 2 injections intrapéritonéales (durée inférieure à 30 secondes) réalisées à 48h d'intervalle - Microchirurgie sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 30 min) nécessitant 2 injections, une en IP et une en sous-cutanée - Biopsies de tissu pour génotypage (moins d'1 minute)
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs (utilisés pour la production du sperme ou des embryons) sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement. L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons par micro-chirurgie. Un stress peut aussi apparaitre en raison de la contention des animaux lors des stimulations hormonales ou pour l'anesthésie des femelles pseudo-gestantes. Le prélèvement de tissu pour génotypage peut entrainer une douleur et un stress en lien avec la contention de l'animal.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort. En effet, les mâles reproducteurs sont mis à mort en fin de projet et ceux donneurs de sperme doivent être mis à mort afin de prélever le sperme. Les femelles pseudo-gestantes ayant été sujettes à la chirurgie de transfert d'embryons ne peuvent subir un deuxième transfert d'embryons. Les femelles donneuses sont mises à mort pour permettre la récolte d'ovocytes post-mortem. Les animaux issus des transfert d'embryons (contrôles qualités) ne sont pas conservés.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible, la congélation des semences est la seule méthode possible pour la sauvegarde de lignées murines.
Réduction
Les nombres d'animaux utilisés sont réduits au maximum et l'estimation a été faite en se basant sur la littérature scientifique et sur la base des années d'expérience dans ces approches. Pour les cryoconservations de sperme, 2 animaux sont nécessaires par lignée. Pour les cryoconservations d'embryons, en moyenne, 45 animaux seront nécessaires par lignée
Raffinement
La procédure chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post et per-opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton.
Choix des espèces
L'archivage des lignées murines déja existantes impose l'utilisation du modèle murin. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses et les males reproducteurs ou donneur de sperme, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubères (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation. Les animaux issus des transferts d'embryons dans le cadre des contrôles qualités effectués seront âgés de 7 à 10j.
Cibler le microbiote des tiques pour perturber leur alimentation/survie et bloquer leur compétence vectorielle vis-à-vis de bactéries (rickettsies)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Lapins : 12
100 souris et 12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des injections, portent une capsule fixée sur le dos et sont infestées par des tiques, les lapins étant utilisés pour produire du sérum, avant mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que l'alimentation des tiques provoque un inconfort modéré et que la pose des capsules a été optimisée pour le limiter. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de la souris à une vaccination anti-microbiote de tique.
Objectifs
L'implication du microbiote (bactéries symbiotique de la tique) de la tique dans la survie des tiques et dans la transmission des agents pathogènes transmis par ces dernières a déjà été signalée pour différentes espèces de tiques. Ces preuves renforcent le fort potentiel du microbiote des tiques en tant que cible pour le développement de stratégies de contrôle. Il est prouvé que la présence de certaines espèces de ces bactéries (symbiotes) favorise l'établissement d’agents pathogènes chez les tiques, alors que la présence d'autres espèces de bactéries a été associée à l'absence d’agents pathogènes chez la tique. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de recherche est de cibler deux types de bactéries symbiotiques pour évaluer les effets de la vaccination de souris par ces bactéries sur la composition du microbiote de la tique, sur l'limentation et la survie de tique et enfin sur l'acquisition d'un agent pathogène par la tique.
Bénéfices attendus
Les tiques transmettent des maladies graves à l'homme et aux animaux. Cependant, la lutte contre les tiques repose uniquement sur les acaricides, qui peuvent contaminer l'environnement et les produits d'origine animale (par exemple, le lait et la viande) consommés par l'homme. En outre, les acaricides peuvent sélectionner des populations de tiques résistantes. Malgré la gravité des maladies transmises par les tiques, la prévention repose uniquement sur l'évitement des piqûres de tiques. Les tiques abritent une communauté de microbes (microbiote) comme les autres animaux. Chez les tiques, le microbiote joue un rôle dans la survie et le développement des tiques ainsi que dans leur capacité à transmettre des agents pathogènes. Ce projet vise à développer une stratégie plus sûre de lutte contre les tiques, basée sur des vaccins anti-microbiote de tique utilisés chez la souris.
Procédures
Souris animaux vigiles : 2 injections et 3 prélèvements. Pose de capsule sur le dos des souris. Infestation avec tiques Lapins = Animaux vigiles : 2 injections et 2 prélèvements.
Impact sur les animaux
Chez les souris, l’alimentation des tiques induit un inconfort modéré. De plus, les souris peuvent simplement se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pas de symptômes attendus suite à l'inoculation des agents pathogènes mais surveillance quotidienne des animaux (souris et lapins).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.
Remplacement
Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec des bactéries non pathogènes afin d'évaluer les effets sur la composition du microbiote de la tique, l'alimentation/survie de la tique et l'acquisition d'une bactérie pathogène (Rickettsia) par la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne afin d'analyser les effets sur le microbiote des tiques et la colonisation des pathogènes. Afin de disposer d'un plus grand volume de sérums pour des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation de souris supplémentaires. Dans le cadre de ce projet nous ne cherchons pas à simplement infecter des tiques par des bactéries, nous avons besoin d’évaluer l’efficacité d’une vaccination chez la souris avec deux bactéries sur le gorgement/survie et capacité à s’infecter des tiques. Il existe des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire des souris suite à une vaccination. La production/cultures des bactéries est par ailleurs réalisée par culture cellulaire in vitro.
Réduction
Chaque souris peut nourrir au maximum 30 tiques. Mais par souris entre 20-25 tiques vont se détacher sans faire un repas complet ou mourir donc nous obtiendrons 5-10 tiques gorgées par souris donc il faut prévoir 5 souris pour groupe pour obtenir 25-50 tiques gorgées par groupe au total, nombre nécessaire à nos analyses. Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir le nombre de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Nous avons comptabilisé le nombre minimal de lapin nécessaire à l’obtention du volume necessaire de serum pour nos futures experimentations in vitro. Pour nos expérimentations futures in vitro, nous avons besoin durant les 5 années du projet d’un volume total de 60ml de sérums de lapins immunisé pour chaque bactérie (deux bactéries) et le même volume pour chaque lapin contrôle (deux contrôles). Nous avons donc estimé avoir besoin de 3 lapins par groupe (environ 20ml de sérum pouvant être récupéré par Lapin) soit un total de 12 lapins sur les 5 ans du projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées par lot de 3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Il n’y a aucune souffrance attendue suite à l’infection par les bactéries lors des immunisations, les infections sont asymptomatiques chez les souris et les lapins. Pas de points limites dans ces conditions. Cependant, après inoculation des agents pathogènes, l’état clinique des animaux (état général) sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de déshydratation ou signes neurologiques (début de paralysie notamment). Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels. Lorsque les souris auront des capsules sur le dos avec des tiques, elles devront être hébergées en cage individuelle, en effet les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Mais ces souris seront hébergées dans les conditions classiques avec l'enrichissement nécessaire à leur bien être en augmentant le nombre de carré de coton et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages d'à côté. Pour les lapins, à leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins seront observés quotidiennement pendant toute l'expérimentation. Comme les lapins sont des animaux très sensibles à la manipulation, ils seront quotidiennement contrôlés et manipulés par les animaliers et l’expérimentateur pour les habituer à leur présence et aux manipulations.
Choix des espèces
Les 3 lignées de souris ont été sélectionnées car elles sont les plus sensibles aux agents pathogènes (bactéries notamment) transmis par les tiques. Lapin blanc de Nouvelle-Zélande car ce sont les animaux les plus appropriés pour obtenir un grand volume de sérum vacciné en une seule expérience et permettra d'obtenir suffisamment d'anticorps spécifiques contre les bacteries à l'étude. De plus ils ne peuvent pas être utilisés pour infecter des souris car ils ne développement pas de bactériemie suffisante. Souris 7-8 semaines. Lapins = 4-5 semaines. Adaptation des animaux durant une semaine avant l'expérimentation. Souris gardées au plus 39 jours (entre 20 et 39 jours selon procédure). Lapins seront gardés au maximum 30 jours. Mise à mort de tous les animaux au maximum à J39.