Souris

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Une maladie rénale chronique est induite par un régime enrichi en adénine pendant quatre semaines, suivie de six semaines d'administration de probiotiques dans la joue puis par gavage, avec incisions répétées du bout de la queue, test de tolérance au glucose et passage en cage métabolique. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage, tout en indiquant n'avoir observé aucun comportement anormal lors de protocoles similaires. Il affirme qu'aucun modèle mathématique ou cellulaire ne peut répondre à la question et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

La maladie rénale chronique touche 3 millions de français(es). Elle se caractérise par une diminution du fonctionnement des reins et par l’accumulation de déchets, les toxines urémiques, que le rein ne peut plus éliminer. Actuellement, la seule option thérapeutique pour diminuer ces toxines est la dialyse (solution thérapeutique lourde, invasive et réservée aux patients au stade terminal de la maladie). Récemment, le microbiote intestinal a emergé comme un acteur majeur de la production de ces toxines. Ainsi, l’utilisation de probiotiques dans le cadre de la maladie rénale chronique est une stratégie attractive visant à restaurer l’équilibre du microbiote, diminuer les toxines et donc améliorer l’état de santé. Pour rappel, les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui excercent un effet positif sur l’organisme qui les ingère. L’objectif de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de 6 probiotiques, sélectionnés selon des critères spécifiques, regroupés en 3 combinaisons différentes chez des souris ayant une maladie rénale chronique. Les paramètres étudiés seront : la production de toxines, la fonction rénale, le métabolisme du glucose et l’équilibre du microbiote intestinal.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’identifier un ou plusieurs probiotiques capables de diminuer la production des toxines à l’origine de la progression et des complications associées à la maladie rénale chronique. A moyen terme, ces probiotiques pourront être utilisés dans un essai clinique et ainsi, à plus long terme, être proposés comme solutions thérapeutiques aux patients souffrant d’une maladie rénale chronique. Comme mentionné précédemment, aucune solution n’est disponible pour ces patients.

Procédures

Grâce à une nourriture riche en adénine, la maladie rénale chronique sera induite de manière douce. 48 animaux recevront ce régime pendant 4 semaines (pause dans le régime tous les wek-ends, remise des croquettes contrôles). Les 8 autres souris recevront une alimentation normale pendant ces 4 semaines. Les fécès seront collectées avant le traitement aux probiotiques. Les 56 souris seront placées dans des cages individuelles propres pour collecter leurs fécès pendant 30 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé avant le traitement aux probiotiques et après 3 semaines de traitement pour mesurer l’urée (mesure le degré de fonction rénale). Une incision (- de 1mm) sera réalisée au scalpel sur souris vigiles à l’extrêmité de la queue et 15µL de sang seront recueillies avec un capillaire (propre et stérile). La durée du prélèvement sera inférieure à 1 minute/souris. Les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) dans le creux de la joue pendant les 3 premières semaines (5 jours/7). L’administration se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Pendant les 3 semaines suivantes, les 56 souris recevront les probiotiques (ou la solution contrôle) par gavage dans l’estomac (6 jours/7). Le gavage se fera sur animal vigile et durera, contention comprise, 30 secondes/animal. Les 56 souris subiront un test de tolérance au glucose. Les souris seront mises à jeun le matin à 8h pour 6 heures pour mesurer la glycémie à jeun. Une incision (- de 1 mm) sera réalisée au scalpel à l’extrêmité de la queue et une goutte de sang sera deposée sur la bandelette de l’appareil mesurant la concentration de glucose. Ensuite, une injection de glucose sera réalisée dans l’abdomen puis la glycémie sera mesurée en recueillant au bout de la queue une goutte de sang à différents temps après l’injection (15, 30, 45, 60 et 90 minutes). Au cours de la dernière semaine, les 56 souris seront déplacées pour 24 heures, 2 par 2, dans des cages métaboliques pour collecter leur urine et leur fécès. A l’issue de la procédure, les 56 souris seront profondément anesthésiées par une injection dans l’abdomen (une fois 15 secondes contention comprise/animal) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 secondes). Les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement sanguin (2 secondes).

Impact sur les animaux

Cette prodécure expérimentale devrait entraîner des nuisances modérées. La nourriture riche en adénine induit une diminution de la prise alimentaire et donc un léger ralentissement de la croissance pondérale pendant les 4 semaines d’induction de la maladie rénale chronique. La petite incision au bout de la queue pour récupérer du sang et mesurer l’urée peut générer du stress chez l’animal. Une contention quotidienne est nécessaire pendant 6 semaines pour réaliser l’administration des probiotiques dans le creux de la joue ou par gavage. Cette contention peut générer un stress chez l’animal le temps de la manipulation (moins d’une minute). La répétition des gavages pendant 3 semaines à raison de 6 jours sur 7 peut générer une irritation de l’œsophage et donc un inconfort pour les animaux. Pour le test de tolérance au glucose, l’incision du bout de la queue, le prélèvement d’une goutte de sang à 6 reprises et l’injection de glucose dans l’abdomen peuvent générer un stress et une légère douleur chez les animaux. Le changement d’environnement lors du passage en cages métaboliques peut générer un léger stress. Il est important de noter qu’au cours de protocoles similaires, il n’a pas été observé de comportements anormaux traduisant un stress, une souffrance, une douleur ou une anxiété des animaux.

Devenir

Les 56 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans la production des toxines et dans le développement de la maladie rénale chronique sont multifactoriels et le résultat de la communication entre plusieurs organes (intestins, reins, foie,…). Des modèles mathématiques ou de la culture cellulaire ne permettraient pas de répondre à la question scientifique. Une étude clinique chez l’homme n’est pas envisageable à ce stade car il est impossible d’étudier en profondeur la fonction intestinale, la fonction rénale et le métabolisme de façon non invasive. L’étude de l’impact des probiotiques sur la production des toxines et sur l’évolution de la fonction rénale ne peut donc se faire, à ce jour, sans l’aide d’un modèle animal.

Réduction

Les probiotiques utilisés ici n’ont jamais été testés dans le cadre de la maladie rénale chronique. Les dispositions nécessaires ont été prises pour éviter le double emploi de la procédure. Le nombre de souris par groupe a été calculé à l’aide d’un logiciel et sur la base des données obtenues dans de précédents procotoles utilisant des souris atteintes de maladie rénale chronique. Afin d’obtenir une différence significative entre les groupes expérimentaux un effectif de 12 animaux par groupe est nécessaire. Pour le groupe contrôle (pas de maladie rénale chronique), un effectif de 8 animaux est suffisant pour une obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre maximum d’animaux utilisés dans cette procédure sera de 56. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger suite à l’obtention des premiers résultats et pourront également être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.

Raffinement

L’utilisation du régime riche en adénine évite le récours à la méthode chirurgicale classique (2 interventions). Le régime sera interrompu tous les week-ends afin de limiter la perte de poids. Cette pause permet aux animaux de reprendre le poids perdu tout en ne nuisant pas au développement de la maladie. Les probiotiques seront donnés par gavage seulement pendant la seconde moitié du traitement (3 semaines/6) afin de réduire le stress et les irritations qui pourraient être liés aux gavages. Au cours des 3 premières semaines les administrations se feront dans le creux de la joue. Parmi les probiotiques testés certains sont anaérobies (ils ne doivent pas rentrer en contact avec l’air ambiant) et il a été démontré que l’administration de ces probiotiques par gavages donnaient de meilleurs résultats que l’administration dans le creux de la joue. Par conséquent, la phase de gavages ne peut pas totalement être éliminée du protocole au risque de diminuer fortement ses chances de réussite. Le volume des probiotiques administrés a été réduit au minimum. Les souris seront placées 2 par 2 dans les cages métaboliques pour limiter le stress dû à l’isolement et au changement d’environnement. Une période de 15 minutes d’habituation à ce nouvel environnement aura été réalisée un ou deux jours en amont afin de limiter encore d’avantage le stress des animaux. La concentration de la solution de glucose a été calculée de manière à limiter le volume injecté. Une seule incision au bout de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée en début de test pour recueillir la goutte de sang nécessaire à chaque mesure. Les animaux seront maintenus dans leur cage d’origine pour limiter le stress. La glycémie sera surveillée jusqu’à son retour à la valeur basale. Les animaux seront surveillés 3 fois/semaine pendant le régime adénine puis tous les jours par la personne qui réalisera les administrations de probiotiques. Les animaux seront pesés 2 fois/semaine. Les souris seront profondément anesthésiées pour permettre le prélèvement terminal de sang. Les gestes techniques : incisions du bout de la queue, administrations intra-buccales, gavages et injection seront réalisés par une personne expérimentée afin de limiter le stress de l’animal. Des points limites précis, prédictifs et précoces seront définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant. Lors de nos précédents protocoles de ce type aucun mal-être, douleur ou souffrance n’a été observé.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste un bon modèle pour étudier la maladie rénale chronique et les effets bénéfiques pouvant découler de la supplémentation en probiotiques. Cette espèce possède une physiologie proche de celle de l’homme et permet de reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients (accumulation des toxines, modifications du microbiote, modification du métabolisme). Des souris âgées de 8 semaines seront utilisées. A cet âge là, le régime riche en adénine est bien toléré par les animaux et on observe le développement d’une maladie rénale chronique modérée.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Chaque animal subit une chirurgie de section cutanée du réseau lymphatique associée à un curage ganglionnaire sous anesthésie générale, précédée d'un gavage au tamoxifène cinq jours de suite, pour mettre au point un modèle de lymphœdème secondaire. Seules des femelles sont utilisées, le modèle reproduisant le lymphœdème du bras après cancer du sein, et les souris sont tuées en fin de projet pour prélever les tissus. Le porteur affirme qu'il n'existe à ce jour ni organoïde ni explant conservant l'intégrité des vaisseaux lymphatiques et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème peut être soit primaire ou syndrome de Milroy, qui est une maladie génétique due à une mutation du gène codant pour le récepteur VEFGR3 , soit secondaire, généralement la conséquence d’un curage ganglionnaire chez les patients atteints d’un cancer (prostate, sein, mélanome). Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Pour ce projet, nous allons débuter la mise au point d’un nouveau modèle murin de lymphoedème secondaire induit pas une section cutanée du réseau lymphatique associé à un curage ganglionnaire axillaire et brachial chez les souris transgéniques ou le système lymphatique peut être visualisé grâce à l'expression spécifique d'une proteine fluorescente dans les cellules lymphatiques. Ceci va nous permettre de déterminer quelles sont les conséquences du lymphœdème sur l'ensemble du réseau lymphatique dermal et sous-cutané.

Bénéfices attendus

Nous pourrons établir l'architecture du systeme lymphatique et son organisation avec les différents compartiments du tissu dermal dans un contexte sain et pathologique. A ce jour, seuls les vaisseaux superficiels c'est à dire les capillaires lymphatiques pres du derme sont analysés. Or, un large reseau de vaisseaux pré-collecteurs sous le derme est affecté. Nous espérons pas ce projet déterminer de nouveaux marqueurs des cellules endothéliales lymphatiques nous permettant de transposer nos connaissances sur la pathologie humaine du lymphoedeme, et de mieux comprendre cette pathologie.

Procédures

les animaux subissent une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale. La durée de la procédure est de 20 min approximativement par animal. Les souris seront traitées par gavage oral avec 100ul solution de tamoxifene à 10mg/ml dissous dans de l'huile durant 5 jours consécutifs à l'age adulte (1mg/jour). cette procedure dure moins de 30 sec.

Impact sur les animaux

Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine apres chirurgie et puis 3 fois par semaine pendant le reste de l'expérimentation . Ce suivi post-opératoire aura pour but de détecter une mauvaise cicatrisation, ou le moindre signe de douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), la capacité de s'alimenter, de boire, et de se déplacer.

Devenir

Les souris serons mis à mort à la fin du projet afin de prélever les tissus et organes pour des expérimentations en histologie.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de système 3D, d'organoïdes ou d'explants permettant de garder l'intégrité et la fonctionnalité des vaisseaux lymphatiques et vasculaires. Nous souhaitons apres cette étude transposer nos hypotheses sur l'étude de biopsies de patients ayant subi une lipodermatectomie du à un lymphoedeme secondaire trop important.

Réduction

Seules les souris femelles seront analysées dans cette étude car la chirurgie du lymphoedeme secondaire mime le lymphoedeme secondaire apres un cancer du sein chez la femme. Il existe une variabilité du au modele de chirurgie donc nos lots seront de 8 animaux pour chaque objectif. Les quantifications seront faites à partir de l'analyse des images 3D. Les tests statistiques dépendront des parametres analysés sur chaque image.

Raffinement

Les animaux seront 5 par cage avec l'ajout de tunnels et de cachettes. L'utilisation d'anesthésique et d'analgésiques sera réalisée pour limiter la douleur de l'animal avant et apres opération pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être pour les animaux.. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance: dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessus, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine puis 3 fois par semaine pendant le reste de l’expérimentation. Ce suivi aura pour but de détecter la douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), détecter la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer selon une grille de lecture par score. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, l'animal sera anesthésié par anesthésie chimique et apres perte de conscience, les animaux seront euthanasiés. Une observation quotidienne sera réalisée pendant la durée du projet. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas changer le comportement des animaux et leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à l’âge adulte.

Choix des espèces

L'étude des souris génétiquement modifiés est largement répandue et partagée dans la communaute scientifique internationale ce qui est un avantage en termes de transmission et de validité de nos résultats et permet une analyse integrée sur plusieurs tissus. Le stade de developpement est adulte. les animaux seront au stade adulte entre 8-10 semaines afin de mimer les conditions de la pathologie humaine.

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour prélèvement d'organes et les animaux d'élevage gardés vivants pour maintenir la lignée. Génétiquement modifiées, elles portent une mutation qui provoque un déficit immunitaire et une inflammation pulmonaire, et subissent deux prélèvements de tissus sur animal vigile pour génotypage. Le porteur indique que les souris atteignant les points limites sont mises à mort. Il affirme que l'étude des coopérations cellulaires dans un "organisme entier" impose un modèle in vivo et retient la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions lymphocytaires ce qui conduit à induire un déficit immunitaire chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris transgénique ainsi que son génotypage.

Bénéfices attendus

Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Deux prélèvements tissulaires seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.

Impact sur les animaux

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.

Réduction

Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.

4 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines rendues aveugles par un modèle de rétinite pigmentaire, elles reçoivent une injection intraoculaire d'un vecteur viral, subissent des examens répétés de l'œil sous anesthésie et une biopsie de la queue pour génotypage, avant prélèvement des yeux. Le porteur indique que l'injection peut provoquer de petites hémorragies oculaires et que l'anesthésie comporte un faible risque de défaillance cardio-respiratoire. Il affirme qu'il "n'existe pas de méthodes substitutives in vitro" et retient la souris pour la ressemblance de sa rétine avec celle de l'humain.

Objectifs

La rétinite pigmentaire (RP), forme la plus commune des dégénérescences rétiniennes congénitales, se développe en deux étapes successives. Au début de la maladie, les patients perdent uniquement leur capacité à voir en condition scotopique. Cette incapacité liée à la dégénérescence des photorécepteurs à bâtonnet, représente un handicap mineur puisque dans un environnement normal et bien éclairé, ces patients conservent leur vision, leur permettant une vie quasi normale. Cependant, la maladie progresse par la perte de fonction et la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Cette perte secondaire des cônes qui entraîne une perte de la vision centrale et une quasi-cécité chez les patients atteints de RP. Trouver des stratégies pour redonner la vision à des personnes l’ayant perdu est un enjeu crucial afin de permettre aux personnes touchées de rester autonome. Notre stratégie consistera à exprimer des protéines photosensibles dans des cellules de rétines aveugles de manière à les rendre sensibles à la lumière. Afin de trouver la stratégie thérapeutique la plus efficace possible, il nous faut comprendre comment les différents neurones qui forment le réseau rétinien travaillent ensemble pour traiter l’information visuelle. Dans la première partie, nous tenterons de comprendre le rôle des différents types cellulaires dans le traitement de l’information visuelle. Dans un second temps, nous tenterons de redonner la vision à un modèle de s souris aveugles ( modèle murin de la rétinite pigmentaire). Grâce aux progrès de la recherche en génétique, il est possible d’utiliser un vecteur viral pour introduire l’expression d’un gène d’intérêt dans une cellule cible. L’œil présente des caractéristiques favorables pour le transfert de gènes par des virus adéno-associés (AAV). Le virus adéno-associé est un virus non pathogène et non immunogène et permet un transfert de gène efficace dans les cellules in vivo Les animaux seront injectés par voie intraoculaire à l’âge adulte (8 semaines).

Bénéfices attendus

Ce projet conduira : - à l'identification de cibles thérapeutiques prometteuses pour les maladies dégénératives de la rétine, - les résultats de cette étude permettront d'approfondir les connaissances sur le rôle général des types cellulaires dans le codage de l’information dans la rétine. - cette étude pourra permettre le développement d’une nouvelle classe de thérapies géniques pour proposer des traitements aux personnes souffrant des maladies héréditaires de la rétine.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection intraoculaire de la thérapeutique à évaluer effectuée sous anesthésie générale et locale (5 à 10 min). Par la suite, les animaux seront amenés à effectuer un examen de l’œil répétés, une fois par quinzaine (6 fois maximum par animal) sous anesthésie gazeuse (2 min). Enfin, les animaux seront euthanasiés selon deux méthodes réglementaires en fonction des prélèvements et analyses à réaliser.

Impact sur les animaux

L'injection intra-oculaire peut provoquer des lésions temporaires comme de petites hémorragies oculaires ; Ces dernières se résorbent rapidement, en général dans les 24 heures qui suivent l’injection. Au cours des anesthésies, un faible risque de défaillance cardio-respiratoire est à prévoir. Pour la caractérisation génétique de l'animal, nous devrons faire une biopsie de la queue. Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les yeux des animaux et effectuer les analyses histologiques nécessaires à notre étude.

Remplacement

Nous étudions dans ce projet l’efficacité de l’expression de protéines sensibles à la lumière (optogénétiques) dans les cellules cibles de la rétine. L’induction ne peut être effectuée qu'in vivo puisque le circuit de la rétine doit être intact avant l’expression de la protéine optogénétique. Il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro. De plus de nombreuses barrières biologiques qui constituent de véritables obstacles pour les vecteurs de transfert de gène n’existent pas dans les modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est basé l’expérience du laboratoire dans des expérimentations similaires. Il sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Des outils statistiques adaptés seront utilisés pour l’analyse de nos résultats. Au total, 4000 animaux sont nécessaires à cette étude sur une période de 5 ans.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Ils bénéficieront d’une anesthésie générale fixe ou gazeuse selon le type d’expérimentation. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire - les souris seront placées sur un tapis chauffant lors des injections intraoculaires pour éviter une hypothermie pouvant être induite par l’anesthésie . - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation - Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Nous avons sélectionné le modèle murin car la structure de sa rétine de la souris est semblable à celle de l’Homme. Nous utilisons dans cette étude : - Un modèle murin de rétinite pigmentaire - Des modèles murins transgéniques permettant une expression spécifiques de protéines dans des types cellulaires. -Les injections sont effectuées à l’âge de 8 semaines, âge auquel le circuit de la rétine des souris est mature.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par photothrombose du cortex, des tests sensori-moteurs de la graine, de la ficelle et du cylindre, puis une chirurgie d'isolement du nerf vague avec pose d'électrodes, avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique une plaie au crâne et un affaiblissement musculaire partiel le plus souvent réversible, et présente la lésion comme ciblée et de très petit volume. Il affirme que ce mécanisme physiologique "hautement intégré" ne peut être reproduit in vitro ou in silico.

Objectifs

Les lésions cérébrales résultant d'un accident vasculaire cérébral (AVC) sont la principale cause de handicap neurologique acquis. En dehors de la rééducation physiothérapeutique, il n'existe pas de traitement efficace et standardisé pour amplifier la restitution des circuits neuronaux détruits par la lésion. L'identification de nouvelles stratégies de "neuroréparation" efficaces et cliniquement crédibles constitue un défi majeur. Une solution émergente est la stimulation du nerf vague (SNV). De manière surprenante, l'envoi d'impulsions électriques indolores à travers ce nerf crânien améliore la récupération fonctionnelle des patients sans provoquer d'effets secondaires majeurs. Cependant, le mécanisme par lequel cette méthode améliore la neuroplasticité n'est pas connu. La SNV est donc utilisée de manière empirique, sans standardisation. Pour mieux appréhender son potentiel thérapeutique, il est essentiel de comprendre comment la SNV, appliquée pendant la période critique de la récupération suivant l'AVC, peut améliorer la plasticité cérébrale. Sur la base des concepts récents de plasticité post-AVC, nous suggérons que la SNV normalise l'activité corticale de la région péri-lésionnelle, en périphérie du tissu nécrosé suite à l’AVC. Cette correction permettrait ainsi d'optimiser la plasticité cérébrale afin de reconstruire des réseaux neuronaux fonctionnels, nécessaire au réapprentissage du geste perdu. Nos précédents travaux mettent en évidence un défaut d'activité lié à l'équilibre entre l'excitation et l'inhibition. Ainsi, notre premier objectif sera de caractériser les modulations de l’activité corticale en réponse à un traitement par stimulation du nerf vague aigu chez la souris ischémiée anesthésiée. Ensuite, notre second objectif consistera à tester l'effet de la SNV sur les potentiels évoqués somato-sensoriels (PES) déclenché par une stimulation tactile de la patte avant de la souris. Ces travaux s’inscrivent dans une volonté de caractériser les mécanismes d’action de la SNV afin de raffiner les protocoles actuellement pratiqués en clinique, et dans l’espoir d’en faire la prochaine génération de traitement de réadaptation post-AVC.

Bénéfices attendus

Même si les premiers essais cliniques ont rapporté des résultats encourageants, cette nouvelle thérapie assez surprenante, ne se développera pas sans une compréhension convaincante de son mécanisme d’action de base. Nos hypothèses découlent de plusieurs années de recherche dans le domaine de l’AVC et nos données préliminaires suggèrent que nous sommes sur la bonne voie. Si nos hypothèses sont correctes, le résultat de ce travail viendra guider la pratique clinique. Comprendre dans quelle mesure un traitement de SNV, améliorant la récupération post-AVC chez la plupart des sujets selon la littérature, peut corriger l’activité corticale péri-lésionnelle est essentiel pour comprendre pourquoi ce traitement échoue ou fonctionne chez un patient donné. De plus, l’étude de la coïncidence temporelle entre la SNV et un stimulus tactile sur la correction de l’activité cérébrale permettra notamment de guider sur la temporalité du traitement au cours des séances de réhabilitation, dont le déroulement reste encore très empirique. Nous pensons que notre équipe peut apporter des avancées significatives pour développer cette thérapie.

Procédures

Nous utilisons un modèle de lésion photothrombotique du cortex (à la surface du cerveau), chez la souris pour simuler un AVC. L'induction de l'ischémie photothrombotique chez les souris se fait par injection d'un colorant, le rose bengal (tous les groupes, n = 78), suivie d’une illumination du crâne avec un laser pour créer une lésion ciblée dans le cortex moteur de la patte avant (Groupes 2, 5 et 6) (Durée d’anesthésie : 50 min). Durant toutes les procédures chirurgicales, les souris sont anesthésiées, leur bien-être et leur réaction à l'analgésie sont attentivement surveillés, et une température constante est maintenue pendant toute la procédure. Les souris témoins sham (Groupe 1 et 3) subiront toute la procédure chirurgicale sans illumination par le laser, et donc sans réaction oxydante du rose bengal. Afin d’évaluer un déficit fonctionnel, l’ischémie photothrombotique est précédée si nécessaire (Groupe 3 à 6) d’un apprentissage aux tests sensori-moteurs de la graine, de la ficelle et du cylindre. La performance à ces tests est évaluée à J7 (Groupes 5-6, n = 24) et /ou J14, J21 et J28 (Groupes 3-4, n = 32) pour mesurer le déficit moteur et la récupération fonctionnelle de la patte avant lésée des souris. Ces tests reposent sur la dextérité, la coordination motrice et de la préférence motrice des animaux, altérées après l’AVC. L’activité cérébrale basale et ses modulations en réponse à la stimulation du nerf vague seront évaluées à la surface et en profondeur du cortex, sous anesthésie, selon deux modalités. D’une part, l’activité corticale évoquée par des stimulations vibro-tactile sera évaluée avec et sans SNV à J14 (Groupes 1-2, n = 22). D’autre part, l’activité spontanée du cortex péri-lésionnelle sera mesurée à J7 (Groupes 5-6, n = 24) et /ou J14 et J28 (Groupes 3-4, n = 32). La chirurgie se compose d’une partie active (Isolation du nerf vague, pose de l’électrode de stimulation et insertion de l’électrode d’enregistrement) (Durée : 2h30), suivi d’une partie où l’expérimentateur n’intervient plus, sous anesthésie plus légère (Durée : 1h30). L'efficacité de la SNV est vérifiée en observant une bradycardie transitoire en réponse à chaque stimulation. À la fin de l'expérience, les souris sont profondément anesthésiées et mises à mort. A cela s'ajoute les animaux nécessaires à l'entraînement chirurgicale d’un nouvel opérateur, à la fois pour l’induction de l’ischémie et l’enregistrement électrophysiologique corticale (n = 30)

Impact sur les animaux

Nuisances : - La microchirurgie au niveau du crâne et la suture de la peau le recouvrant entraînera une plaie sur 1,5 cm, qui sera traitée. - La coagulation locale des vaisseaux du cortex moteur primaire droit (par illumination d'une zone de 1mm carré) induira un déficit partiel de la force musculaire du côté opposé à la lésion, le plus souvent réversible au cours des 3 semaines qui suivent. Cette procédure d'ischémie est peu invasive (pas d'ouverture du crâne), et n'est pas connu pour occasionner une douleur autre que celle liée à la suture de la peau du crâne. La lésion étant très focalisée (microlésion uniquement corticale), elle n'occasionnera d'handicap lourd et pas de perte de poids significative. - La pose de l'électrode autour du nerf vague et la suture de la peau à ce niveau (cou) entraînera une plaie sur 1,5 cm. Les muscles et les organes ne seront pas endommagés. Les glandes salivaires seront préservées. Au total, notre expérience de plusieurs années sur des modèle modéré d'AVC montre que les animaux supportent ces procédures sans complication et sans manifester une douleur ou une détresse que nous ne puissions traiter. - La stimulation du nerf vague, à l'intensité choisie, n'entraîne pas d'inconfort, de douleur ou de perturbation métabolique ou physiologique nuisible. Tout au contraire, il s'agit d'une stimulation employée chez l'animal et chez l'homme pour réduire les symptômes de dépression, pour limiter l'épilepsie ou pour inhiber la douleur. Le retour sur les précédant projets autorisés utilisant ces mêmes procédures ont montré que le seuil des points limites n'a jamais été franchi. Nous sommes donc confiant que le présent projet n'occasionnera pas d'effets inattendus.

Devenir

Les animaux devront être mis à mort puisque leur cerveau et leur nerf vague seront prélevés pour des exploitations histologiques (analyses histopathologique et immunohistochimique).

Remplacement

Ce projet permettra d’analyser un mécanisme physiologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. Les paramètres physiologiques concernés n'existent que dans la situation "in vivo''. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante (78 souris adultes + 30 d’entrainement), en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience. Le nombre d’animaux nécessaire a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et de la littérature en vigueur.

Raffinement

Nous avons développé un modèle de lésion photothrombotique, sans craniotomie, générant une lésion corticale (surface du cerveau), ciblée et de très petit volume (~4 mm3, soit ~0,6% du volume cérébral), de manière à préserver au maximum le bien-être de l’animal. Cet effort de raffinement est compatible avec la proposition d’une procédure de classe modérée. En effet, le déficit fonctionnel occasionné n’est détectable que par des analyses cinématique du mouvement. A l'œil, il est généralement impossible de distinguer le comportement d'une souris ischémiée d'une souris non ischémiée (sham). Par ailleurs, les souris seront systématiquement anesthésiées lors des procédures invasives. Seul du personnel qualifié se chargera de réaliser les expériences, en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Des points limites sont définis au préalable. Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux bi-quotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuellement en vigueur (Directive 2010/63/UE). Pour limiter le stress des animaux, les cages seront isolées dans une pièce dédiée, à l'abri du bruit extérieur. Les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum et ils seront sous surveillance constante après le déclenchement de l’AVC expérimental. Enfin, le bien-être animal sera au cœur de nos préoccupations. Toute angoisse, douleur ou souffrance animale occasionnées pendant le projet sera prise en charge et réduite autant que possible. De l’acquisition de l’animal jusqu’à sa mort, tout sera mis en œuvre dans l’optique de respecter les principes éthiques et de raffiner nos travaux autant que possible.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est le mammifère non-primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé, autant sur le plan cellulaire qu’au niveau de la récupération fonctionnelle. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser l’ischémie cérébrale. De plus, le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux central et la physiologie vasculaire assez similaire à celle de l’Homme en font un très bon modèle pour cette pathologie. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des données aussi pertinentes et exploitables par la communauté scientifique et médicale. Les animaux seront âgés de 8-15 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses humaines puis de lymphocytes modifiés, avec suivi de la croissance tumorale par imagerie sous anesthésie, pour tester des cellules CAR-T contre des tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer détresse respiratoire ou paralysie des membres postérieurs, les souris concernées étant alors mises à mort. Il affirme que les études précliniques sur l'animal sont "incontournables" et que la souris est un "modèle de référence" en cancérologie.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Malgré son efficacité dans le traitement de cancers sanguins comme la leucémie, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Ce projet vise donc à étudier l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient contribuer à améliorer les immunothérapies dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du pancréas et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle et surveillées au réveil.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peuvent occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisance pourront apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 300 mm2 pour les tumeurs sous cutanées), il y a apparition de détresse respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une paralysie des membres arrière est observée (pour la tumeur Raji). Si ces signes sont observés souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle et son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons passer dans un modèle de souris afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les deux jours pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur (ex : analgésiques locaux type Lidocaïne au point d’injection à la queue ; et/ou antalgiques type AINS). De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.