Souris
Utilisation de l’IRM dans l’étude de l’efficacité d’un traitement expérimental dans un modèle de cancer colorectal implanté chez la souris au niveau du colon 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation chirurgicale d'une tumeur colorectale sur le côlon sous anesthésie, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des injections répétées de traitement, avant prélèvement des tumeurs. Le porteur indique une douleur post-chirurgicale et une gêne liée à la croissance tumorale, sans présenter les points limites comme systématiquement atteints. Le projet vise à proposer à l'industrie pharmaceutique un service de suivi tumoral par IRM, le porteur invoquant la nécessité d'observer la tumeur dans "l'organisme entier".
Objectifs
Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Il vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour étudier l'efficacité de nouveaux composés en cancérologie sur des souris porteuses de cancer. L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée chez le patient. Il est attendu de l'IRM qu'elle permette à terme d'améliorer et d'optimiser les études en cancérologie sur animaux, en travaillant avec des modèles de cancers implantés directement dans l'organe d'origine du cancer pour mimer au plus proche ce qu'il se passe chez le patient. Ce projet porte sur le suivi par IRM d'un modèle de cancer colorectal implanté directement au niveau du colon chez la souris. Ce modèle de cancer présente un intérêt fort pour évaluer l’efficacité thérapeutique de potentiels traitements anticancéreux, mais ne peut pas être étudié avec des techniques de suivi de volumes tumoraux classiques : mesures à la main quand les tumeurs sont implantées directement sous la peau. En effet, après l'implantation de la tumeur directement au niveau du colon, il est impossible de mesurer et de suivre l’évolution de la tumeur celle-ci se développant au niveau de l’organe et donc d’observer l’effet d’un traitement. Ce projet vise donc à créer une expertise en oncologie centrée sur l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour la recherche biomédicale. Cette collaboration permettra d’offrir à l’industrie pharmaceutique le service requis pour l’évaluation in vivo chez l’animal de l’efficacité des molécules anticancéreuses développées avant leurs tests en phases cliniques chez le patient.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de mettre en place un protocole de suivi tumoral capable d'étudier l’efficacité de potentiels traitements anticancéreux dans des modèles implantés directement dans l'organe, qui sont non mesurables avec les techniques classiques. Ceci permettra de simplifier l’utilisation de ces modèles de cancer qui miment la pathologie chez les patients et donc d’ouvrir potentiellement l’accès à de nouveaux traitements pour ces types de cancer. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive (l'IRM), technique dont la précision permettra à terme de réduire et raffiner nos études utilisant des animaux.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur : implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs au niveau de la couche extérieure du colon, 20 minutes maximum. Dans le second établissement utilisateur : anesthésie fixe durant l’IRM maximum 30 minutes - traitement par voie intrapéritonéale 30 secondes 10 injections pour les animaux traités au composé expérimental et 2 pour les contrôles et ceux traités - traitement par voie intraveineuse 30 secondes durant 6 séances
Impact sur les animaux
Potentielle perte de poids, une douleur sur plusieurs heures liée à l'implantation par chirurgie de tumeurs par ouverture de la cavité abdominale au niveau du côlon, contrôlée par de l'analgésie et réalisée sous anesthésie gazeuse. Une gêne dûe à une croissance de tumeurs au niveau du colon, du stress dû aux contentions pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite aux injections à la seringue en intrapéritonéal pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite à l'injection à la seringue à la queue en intraveineuse pour l'agent de contraste et un stress dûe à l'anesthésie gazeuse pour l'IRM.
Devenir
Suite à la procédure, les animaux seront mis à mort deux semaines après début du traitement pour les prélèvements de tumeurs fraîches.
Remplacement
Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.
Réduction
Le projet sera fait sur le nombre d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement avec le test approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie) à l’efficacité du traitement tout en ayant une bonne prise tumorale. 32 souris seront utilisées et réparties en quatre groupes de 8 souris. Pour cette étude d’efficacité de nouvelles molécules sur un modèle de cancer colorectal complexe de part son implantation directement au niveau de l'organe, un effectif de 8 souris par groupe sera utilisé afin de pouvoir être capable d'observer une efficacité d'inhibition du volume tumoral de 25% du composé si cela vient à se passer. Pour chaque groupe, les volumes de tumeurs prélevées à la fin de la procédure seront analysées afin de confirmer les données obtenues par IRM et limiter les anomalies d’analyses pour des études futures utilisant l’IRM. Le recours à l’imagerie pour le suivi tumoral évite l’ouverture ou la mise à mort de l’animal pour visualisation direct de la tumeur, et donc une diminution du nombre d’animaux expérimentés.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas d'amaigrissement. Des prélèvements de tumeurs en point final seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Concernant l’acte de chirurgie, les animaux seront traités avec un antidouleur avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse moins invasif et pour un réveil moins difficile. Le personnel est formé à la chirurgie quant à la mise en place du modèle et notre partenaire quant à la réalisation de l’IRM et l’administration des traitements. Afin d’éviter des transports réguliers tous les deux jours minimum des souris, les animaux seront transportés une fois avoir récupérés de la chirurgie pour une période d’acclimatation.
Choix des espèces
La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Les souris seront âgées de 6 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.
Evaluation préclinique de substances d’essai
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 4200
Cochons d'Inde : 420
Lapins : 60
Chiens : 120
Furets : 60
Cochons : 60
8 520 animaux non-humains de sept espèces, souris, rats, cobayes, lapins, furets, cochons et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer la pharmacocinétique et la toxicité de candidats médicaments. Ils reçoivent des substances par de multiples voies, jusqu'à 91 jours de suite, et subissent des prélèvements répétés de sang, de liquide céphalo-rachidien ou d'urine. Environ 4 200 sont tués, notamment après prélèvement terminal ou administration de substances toxiques, les autres étant réutilisés selon un score qui les envoie à la mort au-delà d'un seuil, et 60 chiens rendus à l'élevage. Le porteur affirme que ces modèles animaux "ne peuvent pas être remplacés" par des méthodes alternatives.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la pharmacocinétique, la bio-distribution ou la toxicité de candidat médicaments. Les résultats de ces études sont indispensables pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments et pour la réalisation des autres études précliniques dans de bonnes conditions. En maitrisant la pharmacocinétique, il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas d’effet sur l’animal.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique et de toxicité permettent de cibler les doses du candidat médicament appliquées dans les études de pharmacologie préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations de substance par diverses voies (intrapéritonéale, per os, souscutanée, intraveineuse, intramusculaire, intraplantaire, intranasale, intratrachéale, intradermique, transdermique ou transmucosale, intrathécale, injection dans le genou ou la cheville), de manière unique ou répétée à diverses fréquences (1 à 3 fois par jour, pendant 1 à 91 jours), à l'état vigile ou sous anesthésie générale (de manière systématique pour les voies intradermique, intrathécale et injection dans le genou ou la cheville, et à l'appréciation du responsable de projet pour les autres voies). En routine, les administrations sont réalisées sur des groupes de 5 mâles et/ou 5 femelles pour les rongeurs et de 3 mâles et/ou 3 femelles pour les non-rongeurs. A l'administration de substance peuvent s'ajouter des prélèvements de fluides physiologiques, tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien ou l'urine, de manière unique ou répétée à diverses fréquences. Ces prélèvements sont réalisés sur animal vigile ou anesthésié au gaz isoflurane. Chez le rongeur, un maximum de 7 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 1 ou 2 les jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines. Par exemple, chez un rat de 300g, un volume de 200 µL de sang pourrait être prélevé à la veine sublinguale à chaque point-temps. Dans ce cas, une réhydratation de l’animal (injection sous-cutanée de sérum physiologique, à volume égal à celui prélevé) est prévue pendant les premiers jours de l’étude, tant que la fréquence de prélèvement est supérieure ou égale à 1 tous les 24 heures. Chez le non-rongeur, un maximum de 8 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 2 les quatre jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines. Par exemple, chez un chien de 10 kg, un volume d’au moins 5 mL pourrait être prélevé à la veine jugulaire à chaque point-temps. De manière générale, le volume total prélevé chez un animal est proportionnel à sa volémie totale et par conséquent, à son poids corporel.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Une procédure spécifique est toutefois présente dans ce dossier pour prendre en compte ce cas rare ou lorsque les prélèvements vivo sont importants
Devenir
Pour les 6 procédures décrites dasn ce projet, tous les animaux, de toute espèce, soumis à un prélèvement terminal et/ou ayant reçu une substance toxique (atteinte des points limites) ou dont les effets à long terme sont inconnus, sont mis à mort. Les animaux gardés en vie, et potentiellement réutilisés, sont ceux issus de groupe contrôle ou ayant reçu une substance dont les effets à long terme sont connus, et n'ayant pas subi de procédure de catégorie "sévère". La réutilisation des animaux (souris, rats, cobayes, lapins, furets, cochons et chiens) est soumise à l’approbation du vétérinaire. Un suivi de la réutilisation est mis en place au sein de l’entreprise, et un score est établi afin d’empêcher une réutilisation excessive, notamment dans des procédures de sévérité modérée. Dans le cas des rongeurs, les scores de réutilisation (procédure légère: 1 point, procédure modérée: 4 points) s’incrémentent pour chaque procédure appliquée à l’animal. La réutilisation est possible tant que le score cumulé est inférieur à 8. Au-delà, les animaux sont euthanasiés. Dans le cas des non-rongeurs, l’état des animaux est évalué à chaque fin d’étude.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, voir section 3.4.13.). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, en mettant à disposition des animaux, de l’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, des tapis chauffants, des lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
La distribution d'une substance ou ses effets sur la biologie clinique chez l'animal de laboratoire sont prédictifs de ce qui peut se produire en clinique. Par ailleurs, l'innocuité d'une substance ainsi que sa cinétique doivent être évaluées chez une espèce rongeur et une espèce non-rongeur. Le choix de l'espèce sera fonction de la substance testée et dépendra des tests préliminaires de pharmacocinétique ou d'innocuité. Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période néonatale jusqu'à l'âge adulte. Lapins, furets, chiens et cochons adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Mise au point d’un environnement de phénotypage intégré et étude du profil comportemental des souris au sein d’un groupe
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
416 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 288 réutilisées ensuite pour des mises au point et 128, génétiquement modifiées, tuées pour prélèvement. Elles reçoivent sous anesthésie gazeuse une puce d'identification sous-cutanée, et les souris d'une lignée trisomique subissent en plus une biopsie d'oreille pour génotypage. Le projet vise à mettre au point une cage où les souris réalisent des tests d'apprentissage, de mémoire et de motivation sociale sans manipulation, présentée par le porteur comme un "raffinement". Il affirme que la compréhension des maladies génétiques associées aux retards mentaux "requiert l'étude d'un organisme vivant dans son intégrité".
Objectifs
Ce projet vise en premier lieu à mettre au point un environnement enrichi pour l'étude du comportement des souris. Cet environnement permet de suivre les animaux en continu pendant de longues périodes (plusieurs jours) grâce à un système de suivi individuel. Les animaux sont en groupe dans cet environnement qui est constitué d’un environnement de vie et de modules de tests. Les modules de test sont accessibles grâce à une porte qui ne laisse passer qu'un seul animal à la fois, l'identifiant lors de son passage. Dans un premier temps, nous souhaitons développer deux tests individuels: un test d’apprentissage et de mémoire et un test de motivation sociale. Nous relierons les scores mesurés dans les tests individuels avec les comportements mesurés dans la partie sociale de la cage (exploration, interactions sociales). L'autre intérêt de cette approche est la non manipulation des animaux tout au long de l'expérience: les animaux sont moins stressés et leur rythme circadien est respecté. En effet, les tests se font de manière volontaire lorsque les animaux veulent les réaliser. In fine, ce projet a pour but de privilégier des études comportementales dans un environnement plus éthologique. Il s'inscrit dans une démarche de raffinement. Une fois l’environnement mis au point et testé, nous réaliserons une étude afin de comprendre l’influence de la taille du groupe sur les profils comportementaux de chaque individu du groupe. Pour cela, nous réaliserons des expériences en modifiant la taille du groupe des animaux (4, 6 et 8 animaux dans l’environnement). Cette étude permettra de mieux comprendre les dynamiques de groupe et leurs effets sur la construction des profils comportementaux. Nous validerons cette approche sur un modèle murin présentant une déficience intellectuelle.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mettre en place un environnement de caractérisation comportementale de souris modèles de maladies neuropsychiatriques. Cet environnement enrichi permettra d’évaluer les capacités sociales et cognitives des animaux sans intervention de l’expérimentateur dans un contexte social plus éthologique. Cela réduira le stress des animaux et donc les données obtenues seront plus robustes. Nous validerons les conditions optimales de cet environnement identifiées au cours du projet dans un modèle animal de trisomie. Cette caractérisation permettra de vérifier que les défauts cognitifs identifiés en conditions de test standard dans des études précédentes restent visibles dans notre nouvel environnement. Cette étude constitue donc aussi une base pour des investigations ultérieures concernant la recherche de voies d’amélioration pour les patients. Ces conditions pourront ensuite être généralisées à des modèles d’autres maladies neuropsychiatriques.
Procédures
Les animaux subissent uniquement l'insertion en sous-cutanée d'une puce d'identification par radio-fréquence à l'âge de 6 semaines. Les animaux de la lignée Dp16(1)Yey seront génotypés au sevrage par biopsie d’oreille. Le prélèvement nécessite une contention de 15 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux nouvellement inclus dans le projet subiront l’insertion sous-cutanée de la puce RFID (opération de 2 minutes par animal, sous anesthésie gazeuse). Une légère douleur très ponctuelle lors de cette injection sera contrôlée par l’utilisation d’un analgésique local (la lidocaïne). Les animaux de la lignée Dp16(1)Yey seront génotypés au sevrage par biopsie d’oreille. Le prélèvement nécessite une contention de 15 secondes.
Devenir
288 animaux de type sauvage seront réutilisés pour s les mises au point de tests comportementaux non invasifs. Ils n’auront pas subi de stress significatif. Les 128 animaux de la procédure 2 seront mis à mort, étant génétiquement modifiés, ils ne pourront pas être réutilisés.
Remplacement
La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des retards mentaux requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus cognitifs et moteurs. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Les échantillons proposés permettront de vérifier si le test de mise au point donne les résultats attendus.
Raffinement
L'étude elle-même s'incrit dans une logique de raffinement : les animaux restent en groupe et font des tests comportementaux individuels de manière volontaire. L'expérimentateur n'interviendra pas dans l'environnement, sauf en cas de problème, ou pour recharger en eau ou en nourriture. Le stress lié à la manipulation est donc réduit au maximum. Un des buts de ce projet est de proposer une alternative plus éthologique pour l’étude du comportement animal. Par ailleurs, une telle approche permettra de collecter des données en continu sur chaque animal, ce qui nous permettra de fournir une caractérisation la plus exhaustive possible des traits comportementaux. La pose de puce RFID se fait sous anesthésie gazeuse et analgésie locale (opération de 2 minutes par animal). Une surveillance de la cicatrisation est réalisée et, si un suintement est observé, un antispetique local (dermidine) et/ou pommade cicatrisante (vétramil) est/seront appliqué(s). L’apparence des animaux (état du pelage qui doit rester brillant et propre, perte de poids visible par saillie des hanches) sera surveillée quotidiennement, sans interférer avec l’expérience qui se déroule en autonomie..
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. Comme le laboratoire utilise ces modèles, nous mettons au point les tests comportementaux pour les explorer. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 7 semaines. Nous avons choisi ce stade car le cerveau y est totalement mature. Nous n'étudions pas dans ce projet le développement du cerveau mais l'influence du groupe sur le fonctionnement de celui-ci une fois mature, c'est à dire à l'âge adulte.
Mécanismes de transport de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) à travers les barrières du système nerveux central – applications thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 418 dans des procédures classées sévères et 254 opérées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent des injections de protéines puis un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine dans une artère cérébrale, suivi d'IRM et de tests de récupération fonctionnelle non précisés, avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer perte de poids, douleurs post-opératoires et déficits fonctionnels, les souris perdant plus de 15 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information et retient la souris comme modèle d'AVC.
Objectifs
Le système nerveux central (SNC) compte plusieurs barrières qui ont pour rôle le maintien de l’homéostasie cérébrale, notamment en régulant le transport de molécules entrant ou sortant du SNC, ce qui peut constituer un obstacle à l’administration d’agents thérapeutiques. L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques Les expériences menées in vitro et in vivo suggèrent que le tPA vasculaire peut traverser les barrières du SNC et se retrouver dans le compartiment cérébral par un mécanisme actif spécifique d’un récepteur et que ce transport implique une seule partie du tPA (appelée « domaine Finger »). L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes de transport du tPA à travers les barrières du SNC par des approches in vivo sur des souris et de convertir ces découvertes en approches thérapeutiques pour vectoriser le passage d’agents thérapeutiques connus, incapables d’atteindre leur cible par injection intraveineuse. Ces outils seront testés dans un modèle d’AVC ischémique (développé au laboratoire) réalisé sur des souris, afin de proposer une stratégie thérapeutique pour améliorer la prise en charge des patients victimes d’AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées pour permettre le passage de molécules thérapeutiques du compartiment sanguin au compartiment cérébral. Une meilleure compréhension des interactions sang/cerveau permettra d’une part, à évaluer le potentiel thérapeutique de différentes molécules, et d’autre part, une amélioration de la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
1 : Injection intraveineuse de protéines à travers les barrières du système nerveux central (SNC) (20 minutes). Prélèvement liquide cerebro-spinal (LCS), du sang, et du cerveau 10, 30 ou 60 minutes après injection des protéines (20 minutes) 2 : Injection intra-carotidienne de protéines à travers les barrières du SNC (10 minutes). Prélèvement LCS, sang, et cerveau 5 minutes après injection des protéines (20 minutes). 3 : a. Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’accident vasculaire (AVC) sans rtPA (traitement médicamenteux pour un AVC ischémique) Jour 0 (J0) : Induction d’un AVC ischémique par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne (40 minutes) / 20 minutes après injection des protéines (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec test de comportement (5 minutes) Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes) b: Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’AVC avec administration précoce de rtPA J0 : Induction d’un AVC ischémique (40 minutes) / 20 minutes après injection des protéines et du rtPA (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par IRM (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec un test de comportement (5 minutes). Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes) c: Evaluation du potentiel thérapeutique des protéines après un modèle d’AVC avec administration tardive de rtPA (J0) : Induction d’un AVC ischémique (40 minutes) / 4 heures après injection des protéines et du rtPA (20 minutes) J+1 : Evaluation des lésions cérébrales par IRM (15 minutes) J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle avec un test de comportement (5 minutes). Prélèvement LCS, sang et cerveau à J+1 et J+15 (20 minutes). L’ensemble des procédures, hormis les tests comportementaux, sera fait sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les rongeurs seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Dans chaque phase du projet, le minimum de souris a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre de souris pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur chaque modèle.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70%) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Phénotypage des comportements de type anxieux et dépressifs des souris transgéniques pour le récepteur GPR103
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour un récepteur, elles subissent jusqu'à neuf tests comportementaux sur quatre semaines évaluant l'anxiété, la dépression et la sociabilité, certains imposant un isolement nocturne de quelques heures ou une mise à jeun. Le porteur indique que ces tests exposent les souris à des stress légers à modérés pouvant provoquer des réactions d'évitement ou de peur. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut évaluer ces paramètres comportementaux, jugeant "nécessaire" l'étude sur l'animal vigile.
Objectifs
Nous avons montré dans une précédente étude qu'une protéine était impliquée dans la dépression. Dans ce projet, nous voulons confirmer que cette protéine a aussi un impact sur les troubles émotionnels. C’est pourquoi nous testerons des souris transgéniques pour lesquelles le gène de cette protéine a été inactivé dans un large éventail de tests comportementaux. En comparant ces souris transgéniques à des souris contrôles, nous évaluerons les performances émotionnelles, mais aussi de sociabilité, ou l’état de bien-être, d’anxiété et/ou dépressif. Les souris adultes mâles et les femelles seront utilisées pour éventuellement mettre en évidence des effets dépendants du sexe.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans les troubles émotionnels. Il pourrait aussi permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la prévention et le traitement de l’anxiété et/ou de la dépression.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests comportementaux servant à évaluer les performances sociales et émotionnelles. Chaque test dure durant de 3 à 10 minutes par jour répartis sur 1 à 4 jours. 48h au minimum sépareront ces tests. Certaines cohortes d’animaux réaliseront aux maximum 9 tests répartis sur 4 semaines alors que d'autres effectueront 4 tests répartis sur 3 semaines.
Impact sur les animaux
D’après les premières études préliminaires, l’inhibition génétique de la protéine d’intérêt ne semble pas induire de phénotype délétère. Elle pourrait toutefois induire potentiellement des altérations des niveaux d’anxiété et/ou de dépression, ce que nous pourrions mettre en évidence dans cette étude si tel est le cas. Les animaux seront soumis à des sessions de tests comportementaux entre 5 et 10 minutes maximum, avec au moins 48h minimum de repos entre chaque test ou session. Lors de ces tests, les animaux sont soumis à des stress légers à modérés pouvant induire des réactions d’évitement ou de peur. Deux de ces tests nécessiteront d’isoler les animaux pendant quelques heures en phase nocturne et un test nécessitera une mise à jeun.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs.
Remplacement
Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les différents paramètres comportementaux sur l’animal vigile. En effet la plupart des tests comportementaux réalisés dans le cadre d'un criblage comportemental impliquent une réponse motrice et mais également intégrée de l’animal. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats fiables et robustes tenant compte de la variabilité interindividuelle, des animaux génétiquement modifiés et du sexe. Un maximum de test est réalisé sur un même groupe d'animaux tant que cela n'entrave pas la fiabilité des résultats expérimentaux et le bien-être animal.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées groupées. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience. De l'enrichissement (carrés de coton pour favoriser la nidation, barreaux de bois à ronger et tunnel) est systématiquement disposé dans toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux entreront en procédure doucement après habituation à l'expérimentateur et à la manipulation. Des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de signe de mal- être (prostration, apathie, réactions anormales), des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut.
Choix des espèces
Nous ne pouvons pas utiliser un autre modèle que la souris car les souris sont génétiquement modifiées pour la protéine d'intérêt. Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte (âge au moins 8 semaines) avec un système nerveux ayant atteint sa pleine maturité fonctionnelle.
Création de lignées murines transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
18 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, au service de la création de lignées génétiquement modifiées. Les femelles reçoivent des injections hormonales et une microchirurgie de transfert d'embryons sous anesthésie, avec des douleurs post-opératoires possibles, et les souriceaux subissent une biopsie de génotypage. Les mâles isolés sont tués à un an, les femelles donneuses tuées pour prélever les embryons et les receveuses tuées en fin de procédure, seuls les souriceaux jugés d'intérêt étant gardés pour fonder les lignées. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de remplacer ces animaux et que la production de nouveaux modèles "impose" le recours à des souris donneuses et receveuses.
Objectifs
Les équipes des instituts de recherche utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées sous une forme similiaire chez des patients humains, à évaluer des stratégies thérapeutiques adaptées en conséquence. Ce projet a pour objectif la génération de tels modèles murins transgéniques sur site obtenus par 2 approches différentes de modification du génome.
Bénéfices attendus
Les lignées génétiquement modifiées créées sont des modèles de choix pour la communauté scientifique. En effet, ce sont des modèles pour la recherche fondamentale, mais aussi des modèles de pathologies humaines servant à mieux comprendre les processus de développement de ces maladies et voire même à tester des molécules/médicaments afin de valider (ou invalider) des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
-hébergement en situation d'isolement de 1 à 2 semaines maximum - Stimulation hormonale : 2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 30 secondes) réalisées à 48h d'intervalle - Microchirurgie sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 30 min) nécessitant 2 injections, une en IP et une en sous-cutanée - Biposei de tissu pour génotypage (moins d'1 minute)
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement. L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons par micro-chirurgie. Un stress peut aussi apparaitre en raison de la contention des animaux lors des stimulations hormonales ou pour l'anesthésie/analgésie des femelles pseudo-gestantes. A propos des animaux dits "fondateurs" obtenus après réimplantation des embryons modifiés, ceux-ci peuvent potentiellement avoir un phénotype dommageable. .
Devenir
Les mâles isolés sont mis à mort à l'âge d'un an pour éviter que leur vieillissement n'impacte leur qualité de reproduction, les femelles donneuses d'embryons sont mises à mort pour permettre la récolte des embryons post-mortem et les femelles pseudo-gestantes réimplantées sont mises à mort en fin de procédure ne pouvant pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons. Sont conservés uniquement les souriceaux issus des réimplantations confirmés comme d'intérêts pour assurer la création des nouvelles lignées, les autres souriceaux obtenus sont mis à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l'utilisation de ces animaux, la génération de nouveaux modèles murins transgéniques impose l'utilisation d'animaux donneurs/receveur d'embryons.
Réduction
La création de nouvelles lignées transgéniques sera limitée aux lignées qui ne sont pas disponibles, que ce soit sous forme respirante, d'embryons congelés, ou de semence congelée. Une seule série de production - réimplantation sera effectuée dans un premier temps par projet. La deuxième et éventuellement troisième série ne sera programmée qu'en cas d'absence d'un fondateur d'intérêt. L'estimation des nombres maximums d'animaux à utiliser dans ce projet a été faite en se basant sur la litterature scientifique. En moyenne, 50 animaux seront nécessaires pour l'établissement d'une nouvelle lignée.
Raffinement
La chirurgie de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton.
Choix des espèces
Pas d’autres possibilités que l’utilisation de souris pour la production de lignées de souris génétiquement modifiées. Les mâles reproducteurs utilisés pour la production des embryons ainsi que les femelles receveuses et les males vasectomisés, sont d'âge adulte (2 à 12 mois) Les femelles donneuses d'embryons utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.
Evaluation de la toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées, au prélèvement d'organes ou de sang terminal, au point limite ou en fin d'étude, 7 925 souris vont être utilisées pour mesurer la toxicité de composés d'immunothérapie anticancéreuse et de leurs solutions de mise en suspension, sur 75 études au plus en cinq ans. La déclaration en compte 575 en souffrance modérée et 7 350 en souffrance sévère. Immunodéprimées ou non, greffées ou non de cellules tumorales sous la peau ou dans la veine, avec des risques cités de nécrose de la tumeur ou de paralysie, elles peuvent recevoir le composé jusqu'à une fois par jour pendant quatre semaines et subir des microprélèvements de sang à la queue, des prises de sang derrière l'œil sous anesthésie et un prélèvement terminal derrière l'œil ou dans le cœur. Pour cette étude de toxicité, le porteur invoque l'efficacité du composé, qui dépendrait de "son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme", et conclut qu'il est "nécessaire d'utiliser des animaux".
Objectifs
Chaque année, plus de 19 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 10 millions de décès. L'immunothérapie des cancers (immuno-oncologie) est une révolution dans le domaine du traitement des cancers. L'objectif est de réactiver les cellules du système immunitaire pour les conduire à reconnaître et à éliminer les cellules tumorales. Nous développons des composés thérapeutiques visant à stimuler le système immunitaire pour induire un contrôle durable des tumeurs : • des anticorps monoclonaux qui vont « marquer » les cellules cancéreuses et permettre aux cellules immunitaires de les reconnaître pour les détruire. • des anticorps multispécifiques capable de se lier, à la fois, aux cellules immunitaires et aux cellules tumorales. Ce co-engagement induit une forte activation des cellules immunitaires et la destruction des cellules cancéreuses. • des conjugués anticorps-médicaments capables d'amener des toxines dans les cellules cancéreuses en utilisant des anticorps comme support. L’objectif de ce projet consiste à évaluer/détecter une éventuelle toxicité de composés à visée thérapeutique et de solutions de resuspension chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur. Il pourra également permettre d’identifier les cellules immunitaires ou les substances impliquées dans celle-ci.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès dans le monde en 2020. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Le projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques agissant sur la cible d'intérêt, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation (1 fois) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 4 semaines, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 4 semaines, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (prélèvement d’un volume inférieur ou égal à 20 µL dans la limite de 25% du volume total de sang sur une période de 28 jours, 30 s) ; Administration de la solution de resuspension du composé thérapeutique (maximum 1 fois/jour pendant 4 semaines, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire, d’un volume inférieur à 7.5% du volume sanguin total avec un temps de récupération de 1 semaine minimum ou inférieur à 10% du volume sanguin total avec un temps de récupération de 2 semaine minimum (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire, d’un volume maximal de 800 µL (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque, d’un volume maximal de 1 mL, sous analgésie (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée ou en intraveineuse. Stress et douleur légère lors de l’administration du composé thérapeutique, de la molécule déplétante/neutralisante ou de la solution de resuspension du composé en intra-péritonéal, sous-cutané, per os ou intraveineux. Inconfort lors de la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de tonte du flanc, pesée et mesure de tumeur. Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse et difficulté de mobilité/engourdissement au réveil. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d’effets indésirables liés au composé thérapeutique : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir une évaluation, statistiquement interprétable, de l’éventuelle toxicité d’un composé thérapeutique et 5 souris maximum par groupe pour celle d’une solution de resuspension, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et des signes cliniques observés. Ces études sont menées avec des analyses statistiques basées sur les tests ANOVA, Mann Whitney, test T de Student, test de Log-rank et/ou de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Afin de prendre en compte le succès de l’induction tumorale pour les études nécessitant une greffe tumorale sous-cutanée, il est nécessaire d’ajouter 30% d’animaux dans ces dernières, soit 13 souris maximum par groupe. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 75 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permettra de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un prélèvement terminal, sous anesthésie générale pourra également être réalisé. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé et/ou les cellules tumorales greffées en intraveineuse pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et l’activation du système immunitaire. Enfin, le modèle murin est un modèle de choix du fait de l’existence de souris immunodéprimées et de souris génétiquement altérées qui permettent d’évaluer le rôle de nos composés thérapeutiques sur le système immunitaire. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Lésions rénales : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur les lésions rénales chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 750
Pour tester des candidats médicaments contre les lésions des reins, 750 souris et 750 rats, soit 1 500 rongeurs, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour récupérer leurs organes et "de grands volumes de sang". La déclaration en compte 1 000 en souffrance modérée et 500 en souffrance sévère. Sous anesthésie générale de deux heures au plus, les vaisseaux d'un rein ou des deux sont clampés pour y couper la circulation, ou l'uretère gauche est ligaturé pour provoquer une fibrose, puis les composés sont administrés par le nez, la trachée, le muscle, la peau, la bouche ou l'abdomen, au cours d'études de deux mois au plus. Le porteur annonce une douleur modérée d'environ trois jours "compte tenu de l'analgésie prévue", une pesée quotidienne et une réhydratation sous la peau des rongeurs déshydratés, et écrit que les points limites "sont listés en détail dans la procédure", liste que le résumé ne reproduit pas.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de lésions rénales résultant en des états inflammatoires aigus et chroniques du rein : lésions dues à une ischémie/reperfusion rénale ou à une obstruction urétérale unilatérale causant de la fibrose. En général, la lésion rénale initiale est associée à une insuffisance rénale aiguë (déclin rapide et potentiellement réversible de la fonction rénale), tandis que la fibrose tend à se produire dans le cadre de la maladie rénale chronique. La maladie rénale chronique peut par ailleurs résulter d’une non résolution d’insuffisance aiguë. Chez l’homme, plusieurs agressions initiales peuvent déclencher des lésions rénales. L’objectif de ce projet est de modéliser chez le rongeur deux d’entre elles : l’ischémie-reperfusion (arrêt temporaire du flux sanguin dans un rein ou les deux), et l’obstruction des voies urinaires (uretère). Ces modèles nous permettront de tester des candidats médicaments visant à traiter des patients présentant des lésions rénales. Les lésions d'ischémie reperfusion (IR) rénales sont une cause fréquente d'insuffisance rénale aiguë chez les patients. Aucun traitement spécifique n'est actuellement disponible. Parmi les modèles in vivo existants, le modèle de clampage du pédicule rénal (contenant les vaisseaux sanguins rénaux) chez la souris est couramment décrit dans la littérature et utilisé en raison de l’existence de nombreuses souches de souris transgéniques. Ce clampage temporaire génère une ischémie rénale. Selon l’objectif à atteindre, le clampage peut être réalisé sur un rein (pour mimer une ischémie-reperfusion au cours de la transplantation de l’organe) ou sur les deux reins à la fois (pour mimer une ischémie-reperfusion secondaire à une forte hypotension). Aucun traitement n’existe à ce jour pour la fibrose rénale chez l’homme. Le modèle d'obstruction urétérale unilatérale (UUO) sera utilisé pour modéliser des affections rénales aboutissant à un fibrose rénale. Ce modèle d’obstruction urétérale se caractérise par une dilatation tubulaire, une expansion interstitielle, une perte de masse tubulaire proximale, une hypertrophie, une hydronéphrose, une infiltration de leucocytes, la mort des cellules épithéliales tubulaires et la présence de fibroblastes, qui conduisent tous à une fibrose tubulo-interstitielle progressive.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation mode préventif ou thérapeutique sur les lésions rénales. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces lésions rénales pour laquelle les options sont pour le moment limitées.
Procédures
Les lésions rénales seront induites sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit ischémie reperfusion unilatérale ou bilatérale rénale ou par ligature de l’uretère gauche. Ces trois procédures auront lieu sous anesthésie générale qui durera au maximum deux heures. Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements sur les lésions rénales, des composés chimiques ou biologiques pourront être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’au maximum une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie ou en moins de 5 min sur animal vigile; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’au maximum une heure sinon). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Les études dureront au maximum 2 mois.
Impact sur les animaux
La constitution de groupes lors de la randomisation impliquera un remaniement des groupes sociaux qui pourra générer un stress léger durant moins de 3 jours. Les chirurgies pourront générer une douleur modérée durant 3 jours environ compte tenu de l’analgésie prévue. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille.
Devenir
Après les trois procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
L'étude des mécanismes impliqués ne peut être remplacée par des modèles cellulaires en raison des très nombreux types cellulaires composant le rein et de la complexité des voies de signalisation cellulaire modifiées par l'ischémie reperfusion rénale ou l’obstruction des voies urinaires, à l’origine de fibrose. Ainsi, ce projet ne peut être évalué que dans un modèle in vivo chez l’animal tant pour la compréhension précise de ces phénomènes que pour la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour permettre une analyse statistique fiable des résultats. Dans le cas où des composés auraient besoin d’être testés dans les deux modèles au même moment, les animaux sham seront mis en commun pour ne pas être dédoublés. Sur la base de la littérature, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure est de 10 animaux par groupe. Cependant, les premières études visant à établir les modèles permettront de modifier au besoin ce nombre, s’il est insuffisant, ou au contraire s’il peut être réduit. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 20 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.
Raffinement
Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésique avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermostatée. Une surveillance quotidienne stricte, avec évaluation du réveil et de l’état de santé post-opératoire, permet de détecter rapidement toute complication éventuelle et d’adapter immédiatement la prise en charge, en respect des points limites préétablis, en particulier par un traitement analgésique adapté. Les animaux recevront une analgésie préalable à la chirurgie (buprénorphine au moins 30 minutes avant la chirurgie) et un anesthésique local sera utilisé (SC autour du site d’ouverture chirurgicale au moins 5 minutes avant, et sur le feuillet musculaire avant fermeture de la peau). En cours d’étude, les animaux seront pesés 2 fois par semaine jusqu’à la chirurgie puis tous les jours à partir de la chirurgie. La déshydratation sera évaluée quotidiennement à partir de la chirurgie et les animaux déshydratés seront réhydratés par voie sous cutanée. A partir de la chirurgie, de la nourriture gélifiée sera placée en fond de cage, pendant une semaine Les points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si la litière venait à se souiller plus rapidement que ce qui est constaté habituellement, la fréquence de change des cages sera augmentée.
Choix des espèces
Ces modèles sont décrits dans la littérature chez le rat et la souris. Les mâles seront privilégiés car leur utilisation est bien décrite dans la littérature. La souris sera privilégiée lorsque l’utilisation de souches génétiquement modifiées est nécessaire. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Etude de la transmission du virus Langat par la tique Ixodes ricinus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Langat, subissent une petite incision de la queue chaque jour pendant quinze jours et sont exposées à des piqûres de tiques pendant plusieurs jours, pour étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tiques. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, poil ébouriffé et paralysie des membres postérieurs, et affirme que les piqûres de tiques sont "indolores". Il conclut qu'il est "très difficile voire impossible" de reproduire cette transmission vectorielle in vitro.
Objectifs
Le virus de l’encéphalite à tique (TBEV) est présent dans les glandes salivaires de la tique avant d’être transmis par la salive de la tique lors du gorgement sur un hôte vertébré. Les tiques vectrices appartiennent à différentes espèces : Ixodes ricinus à l'ouest (sous-type européen) et Ixodes persulcatus (sous-types sibérien et extrême-oriental) Les humains sont des hôtes accidentels qui jouent un rôle insignifiant dans l'épidémiologie de la maladie. L'infection par le sous-type de l'Extrême-Orient peut être plus grave, 20 à 40 % des patients développant une maladie neurologique sévère avec un taux de létalité de 20 à 40 % pour ceux qui progressent. L'étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques revêt plusieurs intérêts importants : 1. Prévention et sensibilisation : Comprendre la vitesse de transmission du virus TBE permet de sensibiliser les populations vivant dans des zones à risque et de leur fournir des informations précises sur les mesures de prévention. 2. Détection précoce : En comprenant combien de temps il faut pour que le TBEV soit transmis, les professionnels de la santé peuvent être mieux informés pour diagnostiquer rapidement les cas d'encéphalite à tique chez les personnes mordues par une tique infectée. 3. Développement de vaccins : L'étude de la vitesse de transmission du virus TBE peut aider à orienter la recherche et le développement de vaccins efficaces. 4. Évaluation des risques : L'analyse de la vitesse de transmission du virus TBE par les tiques peut aider à évaluer les risques associés à certaines régions géographiques ou à certaines espèces de tiques. Cela permet aux autorités sanitaires de mettre en place des mesures de surveillance et de prévention ciblées pour réduire la propagation de la maladie. 5. En résumé, étudier la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentiel pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques.
Bénéfices attendus
Le risque d'infection par le virus de l'encéphalite à tiques (TBEV) après une morsure de tique reste largement inconnu. L’étude de la vitesse de transmission du virus de l'encéphalite à tique par les tiques est essentielle pour la prévention, le diagnostic précoce, le développement de vaccins et l'évaluation des risques. Ces informations sont essentielles pour lutter contre l'encéphalite à tique et minimiser son impact sur la santé publique.
Procédures
Le virus sera injecté une fois en début de procédure. La durée de l’injection est de quelques secondes. Des prélèvements seront réalisés tous les jours à la queue après une petite incision pendant 15 jours consécutifs. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement final sera réalisé par voie rétro-mandibulaire juste avant la mise à mort (30 secondes). Les souris seront exposées à des piqûres de tiques pendant 4-5 j pour les larves et les nymphes et environ 7 jours pour les adultes. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux infectés peuvent présenter selon la dose de virus des symptômes qui peuvent consister en une perte de poids, un malaise se traduisant par un poil ébouriffé et une perte de vivacité, une atteinte neurologique se manifestant par une paralysie des membres postérieurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par un virus.
Remplacement
La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.
Réduction
Nous envisageons lors de la première procédure de travailler sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer la dose de virus adaptée à notre expérience soit un sous-total (par expérimentation) de 108 individus répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser de 20 à 24 individus par groupe. Dans le cadre de la troisième expérience, nous utiliserons 10 souris par groupe, soit un effectif total de 20 souris par expérience, ce qui nécessitera d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. En prenant en compte un effet cage, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs pour effets forts à très forts.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Plusieurs points limites ont été définis. Lorsque le premier point limite sera atteint, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement important ou bien si leur mobilité diminue. Les animaux seront mis à mort lorsque les points limites terminaux seront atteints. Des igloos en carton ou du coton seront mis à disposition dans chaque cage, afin que les animaux soient dans une ambiance confortable.
Choix des espèces
Nous souhaitons posséder un modèle simple d’infection de tiques sur des souris. Il est nécessaire qu’il s’agisse d’un modèle proche de la réalité de la transmission par des vecteurs. L’utilisation de membranes de gorgement n’est pas satisfaisant car elle ne mime que très partiellement la transmission naturelle. Les souris sont des animaux déjà retrouvés infectés dans la nature par le virus de l’encéphalite à tique. Les souris seront des mâles et femelles âgés de 4 à 7 semaines car il a été montré à travers la littérature que les jeunes souris développaient une meilleure allure de la courbe de l’infection, à savoir, plus lente et progressive permettant ainsi de pouvoir avoir le temps d’apposer nos tiques et qu’elles se mettent en gorgement avant le pic de virémie. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 15jours.
Evaluation in vivo et ex vivo de l’intérêt de nouveaux agents pharmacologiques pléiotropes dans le traitement curatif de la maladie d’Alzheimer chez la souris 5xFAD mâle et femelle.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 720 dans des procédures classées légères et 168 modérées. Certaines lignées reproduisant la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des traitements par voie orale et intranasale, une puce implantée sous anesthésie et des tests de mémoire nommés (alternance spontanée, reconnaissance d'objet et de localisation), avant une perfusion intracardiaque terminale, pour tester de nouveaux composés. Le porteur affirme que les agents utilisés "ne sont pas connus pour induire des nuisances" aux doses prévues. Il conclut que l'évaluation de la mémoire ne peut se faire que sur "un organisme capable d'effectuer une tâche cognitive", excluant tout modèle in vitro ou in silico.
Objectifs
Ce projet vise à valider d’un point de vue comportemental et électrophysiologique (preuve de concept préclinique), l’intérêt d’une nouvelle approche pharmacologique de traitement curatif de la maladie d’Alzheimer (MA). Plus précisément, le but du présent projet est de concevoir de nouveaux composés modulant deux cibles différentes d’intérêt dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Afin de contourner la barrière hémato-encéphalique (BHE), d'améliorer l'effet central de ces promédicaments ou/et d'éviter les effets secondaires potentiels liés à leur activation au niveau périphérique, une formulation conçue pour l'administration intranasale (i.n.) sera utilisée pour l'administration des molécules d’intérêt. Dans ce contexte, il s’agira, d’abord de sélectionner parmi les molécules synthétisées et caractérisées in vitro, celles qui présentent la meilleure tolérance in vivo chez la souris C57BL6 mâle (évaluation par une technique d’observation standardisée (screening pharmacologique type Irving) et par mise en œuvre d’un test d’actimétrie). Cette première étape nous permettra de sélectionner deux composés. Nous évaluerons ensuite l'efficacité des promédicaments sélectionnés à contrebalancer les déficits de mémoire de travail (test d’alternance spontanée), ainsi que les déficits de mémoire de reconnaissance (tests de reconnaissance d’objet et de reconnaissance de localisation d’objet). En outre, la capacité de nos composés d’intérêt à annuler les déficits de transmission synaptique et de plasticité hippocampique sera évaluée par une approche électrophysiologique ex vivo. Ces expériences seront menées en tant qu'évaluations finales après administration chronique des composés à partir de l'âge de deux mois jusqu'au moment optimal déterminé dans l'étude longitudinale. Ensuite, la neuropathologie amyloïde, l'intégrité synaptique et les paramètres de neuro-inflammation seront évalués ex vivo à l’issue de la phase d’étude comportementale.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote permettra de valider la preuve de concept de l’intérêt de notre stratégie. Plus précisément, les objectifs du projet visent à découvrir de nouveaux candidats médicamenteux, avec un mécanisme d'action innovant, et susceptibles d'entrer en étude préclinique. Sur la base de l'expérience acquise avec la conception d’un composé innovant et selon des résultats préliminaires extrêmement positifs, la survenue de la découverte d'un nouveau promédicament pléiotrope capable de cibler sélectivement la BuChE centrale et soit bêta2-AR soit 5-HT4R semble raisonnable à court terme.
Procédures
Une partie des animaux sera soumis à des traitements aigus par voie orale et intra nasale. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Un premier lot de souris permettra une évaluation des propriétés toxicologiques après administration. Les modifications comportementales et neurologiques induites par les composés seront évaluées chez la souris par une technique d'observation standardisée à différents temps (30 min, 3 h et 24 h) (durée de 2 minutes par session soit un total de 6 min par souris). Le second lot permettra une mesure de l’activité locomotrice des animaux après administration (durée de 1h par souris). La seconde partie des animaux sera soumis à des traitements chroniques par voie intra nasale (2 injections par semaine) de l’âge de 2 mois à l’âge de 8 mois. Chaque injection nécessite une contention de l’animal et prendra environ 1 minute par souris. Afin de pouvoir être facilement identifiable, les animaux de cette partie auront une puce électronique (1,4 mm x 8 mm) implantée à l’aide d’un système miniaturisé de micro-injecteur stérile sous anesthésie et subiront un prélèvement de poils nécessaire pour leur génotypage (durée de la procédure : 5 minutes). Ces animaux vont effectuer plusieurs tests comportementaux afin de tester notamment leurs performances de mémoire de travail spatiale (5 min par souris x 2 Sessions), mémoire de reconnaissance d’objet (10 min par souris x 2 Sessions), mémoire de reconnaissance de place (10 min par souris x 2 Sessions). La moitié des animaux de cette partie seront perfusés au PBS (solution saline dans un tampon phosphate) par voie intracardiaque afin de récupérer le cerveau (durée de la procédure : 10 minutes).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance sur la souris n’est attendue suite à la réalisation des tâches comportementales (test d’exploration réalisé en situation libre d’une durée de 5 à 10 minutes). Les animaux subiront une nuisance lors des administrations par voie orale ou nasale d’agents pharmacologiques et composés nouveaux. Concernant les agents pharmacologiques utilisés, aucun d’entre eux, aux doses envisagées, n’est connu pour induire des nuisances ou effets indésirables chez la souris. Les effets des molécules de référence utilisées ne sont que transitoires (moins de 24 heures) dans les conditions de notre étude. Une partie des animaux de cette étude subira une nuisance lors de 2 anesthésies générales de courte durée : la première lors de l’implantation de la puce électronique permettant leur identification et la seconde lors de leur mise à mort.
Devenir
La première partie des animaux sera mise à mort après les études comportementales. La seconde partie des animaux sera mise à mort à l’issue de cette étude. Le cerveau de tous les animaux de cette partie sera prélevé pour des exploitations scientifiques (analyses électrophysiologiques ex vivo, quantification de la neuropathologie amyloïde, de l'intégrité synaptique et des paramètres de neuro-inflammation).
Remplacement
Ce projet vise à favoriser le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles d’avoir un intérêt dans le cadre de la prévention et/ou le traitement de pathologies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer. Or la recherche de nouveaux médicaments nécessite scientifiquement l’utilisation d’espèces animales. De plus, l’évaluation des performances de mémoire ne peut être réalisée que sur un organisme capable d’effectuer une tâche cognitive (ici un test de mémoire de travail spatiale). Ainsi, aucun remplacement par des modèles in vitro ou in silico (modèles mathématiques, bio-informatique) ne peut être réalisé.
Réduction
Un total de 888 souris sera nécessaire pour cette étude soient 120 souris 5xFAD (60 femelles et 60 mâles) et 768 souris C57BL/6JRj (24 femelles et 724 mâles). Les tests seront réalisés sur des groupes de n=12 souris. Il s’agit d’un effectif suffisant pour assurer la puissance des analyses statistiques qui seront réalisées, comme l’analyse de la variance entre les groupes (ANOVA). Un groupe contrôle administré par le solvant (formulation différente selon la voie d’administration) sera systématiquement testé. Les autres groupes seront constitués d’individus recevant un même traitement à des doses différentes.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, souffrance et angoisse infligées, les animaux seront maintenus dans des conditions d’hébergement optimales et stables : température, cycle de lumière, hygrométrie. Ils seront surveillés quotidiennement par un personnel qualifié et une attention particulière sera apportée à l’apparence physique externe des animaux, aux variations éventuelles de poids ainsi qu’aux changements de comportements. Les injections intra-nasales et orales seront réalisées exclusivement par un personnel qualifié. Afin de diminuer le stress de nos animaux, un protocole de familiarisation des animaux à l’animalerie et à l’expérimentateur sera mis en place sous la forme de handling dès l’arrivée des animaux au sein de notre animalerie. Afin de réduire la douleur et la détresse de nos animaux nous avons choisi un point limite précoce et compatible avec les objectifs scientifiques de notre recherche. Pour la perfusion, les animaux seront analgésiés et anesthésiés profondément pour éviter toute douleur durant cette procédure.
Choix des espèces
Les souris font partie des espèces animales les plus exploitées en recherche biomédicale du fait de leur facilité de reproduction et de la similarité du système nerveux central qu’elles présentent avec l’Homme. Leur comportement est bien décrit et il est possible d’en mesurer les modifications. Les modèles murins possèdent une bonne faculté d’apprentissage justifiant leur utilisation dans l’étude de la mémoire. Nous souhaitons étudier les effets de l’administration de nouveaux ligands sur des paramètres d’une part, comportementaux (mnésiques) d’autre part, électrophysiologiques (au niveau de l’hippocampe de souris C57BL/6JRj et 5xFAD). Les souris C57Bl/6JRj ont des capacités mnésiques intactes et nous serviront de base de comparaison. Par ailleurs, elles servent de fond génétique à plusieurs souches transgéniques dont les souris 5xFAD, chez lesquelles nous souhaitons étudier la réversion des troubles mnésiques et électrophysiologiques par des composés nouveaux. Des souris adultes (minimum 8 semaines d’âge) seront utilisées dans ce projet, un âge auquel les grandes fonctions physiologiques sont arrivées à maturité.
Étude et visualisation de la réponse immunitaire au cours de la croissance d’un cancer du sang et durant l’immunothérapie
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
5 734 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans la moelle osseuse ou les ganglions, sont manipulées quotidiennement pour suivre la tumeur et, pour certaines, subissent une chirurgie d'imagerie de 30 minutes avant d'être maintenues sous anesthésie sans réveil, pour étudier l'action des immunothérapies dans les cancers du sang. Le porteur affirme que les souris "rencontrent peu d'effets indésirables" tant que le taux de cellules tumorales est maîtrisé. Il conclut que les tests in vitro "ne permettent pas de récapituler la complexité" des réponses immunitaires observées in vivo.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des traitements cancéreux ainsi que de leurs répercussions sur l’organisme. Pour cela nous tenterons d'identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur (ex. les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T). Nous tenterons d'évaluer leur contribution directe ou indirecte sur l’efficacité de l’immunothérapie. Enfin, nous souhaitons mettre en lumière les limitations de ces thérapies afin d’apporter de nouvelles hypothèses de travail pour l’amélioration des traitements. En résumé, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des immunothérapies dans les cancers du sang, au moyen/long terme, à l’amélioration de la prise en charge des patients en clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers du sang (lymphomes & leucémies) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer de nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet offrira des pistes de travail pour générer des immunothérapies capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles combinaisons thérapeutiques ou de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteints de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
La greffe de la tumeur consistera à une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h mais cette procédure sera sans réveil.
Impact sur les animaux
Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris dans les organes immunitaires tels que la moelle osseuse ou les ganglions lymphatiques. Cet objectif sera atteint par l’injection des cellules. Le bien-être de chacune des souris sera contrôlé fréquemment. Notre connaissance précédente suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables tant que le pourcentage de cellules tumorales circulantes est maitrisé. Leur mobilité semble inchangée, elles ne perdent pas de poids, leur pelage reste soyeux et leur comportement demeure inchangé. L’injection des thérapies que nous proposons d’étudier dans ce projet pourra ne pas causer d’effets indésirables ou avoir un effet à court terme (24-72h) par exemple sur la température corporelle de l’animal liée à l’élimination des cellules tumorales. Des mesures pour soulager l’inconfort des animaux seront mises en place et sont décrites plus loin dans ce protocole.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires 2D ou des organoïdes (Structures 3D mimant les certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieu in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, les expériences de cytométrie et de dosage protéiques ou d’imagerie seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec des statisticiens, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral. Enfin, si nos études de cytométrie ne donnent pas les résultats attendus, les autres expériences ne seront pas réalisées. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet seront réduits.
Raffinement
Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé, prostration, pourcentage de tumeur circulante) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’antalgiques. Par ailleurs, ils seront mis à mort si la souffrance persiste. Pour la pousse de tumeur, le sang des animaux sera prélevé afin d’évaluer le pourcentage de cellules tumorales circulantes. Nous savons qu’un certain niveau de cellules circulantes dans le sang d’une souris immunocompétente peut servir de limite et correspond à une taille limite de masse tumorale dans la moelle osseuse avant impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. Concernant les interventions chirurgicales pour l’imagerie intravitale, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur. L’animal sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. Pour les expériences non terminales, la cage sera supplémentée avec du gel hydrique et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie pour améliorer le confort de l’animal. Une injection d’antalgique sera renouvelée pendant les premières 48h.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Etude par imagerie de l’impact cérébral de maladies hépatiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisses et en sucre pendant 23 semaines, six séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un radiotraceur et des tests comportementaux d'activité motrice, de dépression et d'anxiété, pour étudier par imagerie l'atteinte cérébrale liée à une maladie du foie. Le porteur décrit comme effets attendus une prise de poids et un possible stress au réveil des anesthésies. Il affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour cette approche globale et présente le rongeur comme le "modèle de choix".
Objectifs
La NAFLD (acronyme anglais, non-alcoholic fatty liver disease) regroupe un large spectre de maladies hépatiques chroniques caractérisées par une accumulation excessive de graisses dans le foie (stéatose) sans lien avec l’alcool, et qui touchent environ 25% de la population générale et 80% des personnes en obésité morbide. Dans certains cas, la maladie évolue vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH, acronyme anglais non-alcoholic steatohepatitis), une forme sévère et irréversible avec inflammation. Cette forme agressive de la maladie favorise l’accumulation de fibrose et peut évoluer vers la cirrhose et ses complications, principalement cardiovasculaires. Cette maladie hépatique est désormais reconnue comme un dysfonctionnement multisystémique, c’est-à-dire que le mauvais fonctionnement du foie entraine le mauvais fonctionnement d’autres organes, comme le cerveau. L’encéphalopathie hépatique est la complication la plus fréquemment décrite et des études ont mis en évidence l’impact de l’obésité et d’une mauvaise alimentation sur le fonctionnement cérébral et cognitif. Cependant, les mécanismes cérébraux sous-jacents restent inconnus à ce jour. L’imagerie fonctionnelle offre la possibilité d’explorer in vivo certains des mécanismes élémentaires qui affectent le fonctionnement cérébral tels que le métabolisme cérébral, la densité synaptique ou l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’objectif de ce travail est de mettre en œuvre ces méthodes d’imagerie déjà développées et appliquées dans notre laboratoire, à un modèle rongeur NAFLD/NASH bien caractérisé afin d’identifier les mécanismes physiopathologiques à l’origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans la NAFLD/NASH, et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Cela permettra également d’identifier quelle(s) méthode(s) d’imagerie sera la plus pertinente pour continuer le développement de cette approche chez l’homme. A plus long terme, cela permettra d’envisager l’étude de cette pathologie in vivo chez des patients atteints par ces pathologies avec pour objectif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : -Administration d’un régime alimentaire enrichi en graisses et sucre, pendant 23 semaines. -Réalisation de sessions d’imagerie (6 par animale) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum,) -Injection d’un radiotraceur (1 minute) -Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux ( 5/animale) afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 6 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. -
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : - Accumulation de gras dans le foie (asymptomatique) et prise de poids - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’atteinte multisystémique d’une maladie hépatique. Un modèle animal est indispensable afin d’envisager cette approche globale de la pathologie. Le modèle rongeur NAFLD/NASH est le modèle de choix pour cette approche car déjà largement utilisé pour l’étude de cette maladie avec une atteinte cérébrale mise en évidence par certaines études. Le choix du rongeur est également adapté aux différentes expérimentations envisagées (imagerie et comportement) qui pourront être conduites aisément avec ces animaux.
Réduction
L’utilisation des différentes modalités d’imagerie permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.
Raffinement
Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergés par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue au début de leur séjour et avant de débuter le régime alimentaire HFHSD. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux traités par le régime HFHSD feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids au cours du traitement. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. .
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections hépatiques. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP et IRM ainsi qu’à l’étude comportementale. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).