Souris
Mécanismes moléculaires impliqués dans les dysfonctions cognitives et les troubles des comportements sociaux liés au stress chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une chirurgie cérébrale, des stress répétés quotidiens pendant dix jours, un isolement social et des restrictions alimentaires, avec pour effets déclarés anxiété, anhédonie et perte de poids. Le projet cherche à identifier des mécanismes moléculaires des troubles cognitifs et sociaux liés au stress. Le porteur affirme que les effets du stress "se produisent à l'échelle de l'organisme" et qu'aucun modèle informatique des comportements complexes n'existe.
Objectifs
Les déficits cognitifs et sociaux sont observés dans l’ensemble des pathologies psychiatriques et altèrent fortement la vie des patients. Le stress est un facteur de risque important favorisant l’apparition des maladies mentales et joue un rôle clé dans le déclin cognitif et social. L’objectif de ce projet est d’identifier certains mécanismes moléculaires impliqués dans ce phénomène. Plus précisément, nous allons inactiver chez la souris des gènes implaqués dans la réponse au stress dans des circuits cérébraux spécifiques afin de protéger des effets délétères du stress ou alors de mimer l’effet du stress.
Bénéfices attendus
Les troubles sociaux et cognitifs sont au cœur de nombreuses maladies neuropsychiatriques et altèrent gravement la vie quotidienne des patients. Dans certains cas, comme dans la schizophrénie, la sévérité des symptômes cognitifs a été corrélée au pronostic du patient. Malheureusement, alors que les traitements actuels, comme les antipsychotiques ou les antidépresseurs, peuvent atténuer certains des troubles émotionnels, les symptômes sociaux et cognitifs restent peu sensibles aux interventions pharmacologiques. Il est donc de la plus haute importance de déterminer les mécanismes biologiques qui sous-tendent ces deux ensembles de symptômes. Récemment, les circuits que nous proposons d’étudier ont fait l'objet d'une attention croissante de la part de la communauté scientifique avec plusieurs études d'imagerie cérébrale indiquant des anomalies chez les patients atteints de maladies psychiatriques. Ainsi ce projet permettra de lier de façon causale ces anomalies aux déficits comportementaux associés au stress permettant d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
Certaines souris seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil (durée de la procédure : environ 45 minutes par souris) avec injections d’anesthésiques et d’analgésiques en préopératoire et traitements anti-inflammatoires/analgésiques en post-opératoire pendant 1 à 3 jours. Des souris subiront des stress répétés (durée 5 min quotidiennes pendant 10 jours). Toutes les souris réaliseront ensuite des tâches comportementales pour une durée maximum de 4 semaines (avec un test maximum par jour d'une durée de 10 min à 1h). Certains tests nécessiteront une diminution de la prise de nourriture pendant 3 semaines. Les souris ayant subi des stress répétés seront hébergées individuellement jusqu'à la fin des expériences. A la fin des tests comportementaux, toutes les souris seront soumises à une procédure chirurgicale sans réveil avec analgésie suivie d'une anesthésie profonde (durée 20 minutes).
Impact sur les animaux
La chirurgie peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires sont possibles, ainsi qu'une inflammation locale au niveau du site chirurgical. Le protocole de stress peut entraîner une augmentation de l’anxiété, une prise de poids, une anhédonie et un retrait social chez un sous-groupe d’individus. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer une perte du poids (5-10 pour cent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Les tests cognitifs nécessitent une restriction alimentaire pouvant entraîner une sensation de faim.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié et le cerveau collecté pour analyse histologique de l'injection virale ou analyse anatomique.
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, les effets du stress se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements causés par le stress sur des circuits neuronaux intacts. Il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques récentes pour l’étude de la fonction des gènes et des circuits cérébraux dans le cerveau (transgénèse conditionnelle, transduction virale, chemo/optogénétique, électrophysiologie in vivo).
Réduction
Le nombre total d’animaux estimé est de 5610. Un nombre important d’animaux est nécessaire car pour plusieurs tests cognitifs, une seule tâche doit être effectuée par cohorte du fait de l’interférence entre différents tests. Nous avons cependant réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à une analyse prédictive du nombre d’animaux en réalisant un calcul de puissance. Nos travaux passés nous indiquent aussi que ces études comportementales nécessitent entre 10 et 15 souris par groupe expérimental pour atteindre une puissance statistique satisfaisante. Lorsque cela sera possible, un même groupe d’animaux sera utilisé dans plusieurs tests comportementaux. Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des valeurs fiables et robustes. Pour les études anatomiques et de biochimie, nous utiliserons les animaux testés en comportement afin de réduire au maximum le nombre de cohortes. Enfin, les modèles nécessitant des injections virales afin d’affiner l’inactivation d’un gène dans une structure donnée ne seront pas nécessairement testés dans toutes les tâches. Effectivement, si un mutant donné ne montre de différence de comportement que dans la tâche de mémoire de travail, seule cette tâche cognitive sera testée chez un mutant restreint par injection virale, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et handling puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée (voire quotidienne en post-opératoire ou lors des restrictions alimentaires pour les tâches cognitives). Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement l’euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire leur stress. Pour les procédures chirurgicales, les souris sont injectées avec un analgésique suivi par un mélange anesthésique. Les souris sont surveillées étroitement. Des points limites adaptés ont été définis pour toutes les procédures.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie et des comportements humains. Les circuits étudiés dans ce projet sont particulièrement bien conservés chez la souris tant d’un point de vue anatomique que fonctionnel. Dans nos études, les souris sont utilisées afin de tirer profit des techniques de transgénèse (système Cre/LoxP, transgénèse induite par des virus). En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude des réseaux de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Tous les comportements et les chirurgies seront réalisées sur des animaux adultes (entre 8 et 20 semaines).
Méthode de génotypage invasif pour l’élevage de modèles de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 000 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souriceau de trois à six jours subit une biopsie de la queue sur animal vigile pour déterminer son génotype, geste pouvant provoquer douleur et saignement. Les souris ne portant pas le génotype recherché sont réparties entre la formation, le don comme animaux de compagnie et la mise à mort, tandis que les autres alimentent les projets de recherche et les accouplements. Ce projet d'élevage produit et trie ces lignées génétiquement modifiées à très grande échelle pour la recherche en neurosciences.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire des souris génétiquement modifiées et de caractériser leurs génomes de manière précoce avec la collecte d’échantillons d’ADN (biopsie de queue). Dans le cadre des projets de recherche de l’Institut, différents modèles de souris génétiquement modifiées sont utilisés pour les études en neurosciences. Plus particulièrement, les animaux jeunes sont utilisés pour des études sur le développement du cerveau. C’est pourquoi une identification et un génotypage précoce est requis.
Bénéfices attendus
Les recherches menées à l’institut grâce à l’utilisation d’animaux utilisés à des fins scientifiques ont des applications médicales multiples dans le cadre des maladies neurologiques et psychiatriques telles que les troubles neurodéveloppementaux, l’épilepsie, les mouvements anormaux, les maladies neurodégénératives, la dépression et l’addiction. Par ailleurs, la méthode utilisée pour l’identification et la caractérisation du génome permet de sélectionner les animaux d’intérêts et ainsi constituer des groupes expérimentaux stables de manière précoce.
Procédures
Une intervention d’une biopsie de queue est réalisée sur souris vigiles à l’âge de 3 à 6 post-natal. Cet acte technique dure moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible.
Devenir
L’ensemble des animaux qui ne sont pas euthanasiés à l’issus de ce projet rentreront en utilisation continue pour d’autres projets autorisés. Les souris ne portant pas le génotype d’intérêt seront pour une première partie utilisées dans le cadre de formation tutorat, pour une seconde partie utilisées en animaux de compagnie et pour une troisième partie euthanasiés. Les animaux portant le génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche de l’Institut ou pour le renouvellement des accouplements.
Remplacement
Une partie des projets du centre de recherche sont réalisés in vitro (biochimie et biologie cellulaire), nous utilisons des lignées cellulaires et des cellules souches embryonnaires afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le Système Nerveux Central (SNC) et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement du cerveau qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Le génotypage précoce des souriceaux permet de conserver uniquement les animaux avec le génotypage d’intérêt et de constituer des lots expérimentaux avant le sevrage des animaux, pour l’utilisation future dans des projets autorisés de l’Institut. Dans le cadre de formation/tutorat, nous utilisons une partie des animaux qui ne sont pas utilisés dans les projets de recherche. Compte-tenu de la nature du projet, aucun test statistique n’est utilisé. Le nombre d’animaux total a été calculé sur la base des productions des années antérieures. Le projet requiert l’utilisation de 180 000 animaux sur une période de 5 ans.
Raffinement
Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont stabulés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température et de l’hygrométrie, un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau . Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. La manipulation et les prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un transfert d’odeurs est réalisé sur les gants de l’opérateur pour minimiser le risque de rejets des nouveaux- nés par la mère ou de cannibalisme . Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.
Choix des espèces
Les équipes de recherche du centre travaillent sur le modèle souris. Par conséquent, la plateforme animalerie produit les souris génétiquement modifiées et collecte des échantillons d’ADN (biopsie de queue) de manière précoce dans le but de caractériser le génome. Pour les besoins des activités de recherche, une identification et un génotypage précoce sont requis. Les deux interventions sont réalisées à l’âge de 3 à 6 jours post natal.
Le TWEAK soluble, un nouveau biomarqueur de la neuro-inflammation au cours de la sclérose en plaques ?
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection, provoquant une paralysie partielle, une perte de poids et des troubles du comportement, avec mise à mort dès un score clinique élevé maintenu deux jours. Le projet cherche à valider une protéine sanguine comme biomarqueur de suivi de la sclérose en plaques. Le porteur revendique un modèle "crucial et indispensable" tout en décrivant les modèles in vitro et la cohorte humaine qu'il utilise en parallèle.
Objectifs
L'objectif global de notre étude est de déterminer si la protéine TWEAK du sang peut être utilisée comme indicateur par les médecins pour le suivi des patients atteints de sclérose en plaques (SEP). À cette fin, nous devons d'abord déterminer quelle est la fourchette normale des valeurs de TWEAK dans le sang et quels sont les facteurs qui influencent son dosage (par exemple, les variations de la protéine au cours de la journée, la production d'anticorps contre TWEAK, etc.). Dans un deuxième temps, nous regarderons s’il y a une relation entre la quantité de cette protéine dans le sang et l'inflammation qui se produit dans le cerveau, et si/comment TWEAK pénètre dans le cerveau à partir du sang. Enfin, nous étudierons les avantages potentiels de la production d'anticorps dirigés contre TWEAK par certains patients et déterminerons s’ils les protègent de certains effets de la maladie. De plus, les symptômes gastro-intestinaux sont fréquents dans la SEP. Un de nos objectifs est aussi de déterminer si pendant la SEP chez la souris, des troubles des fonctions du tube digestif apparaissent en lien avec le système nerveux et TWEAK.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'existe pas d'outils non invasifs et fiables pour le suivi des patients atteints de SEP. Nous proposons cet outil de biomarqueur sanguin pour le suivi neuroinflammatoire de ces patients. L'utilisation du modèle murin d'EAE est cruciale et indispensable en ce sens. Actuellement, nous ne sommes pas en mesure de suivre les patients de manière rigoureuse et quantitative. Nous nous fions aux IRM utilisant un rehaussement à base de gadolinium pour indiquer la charge de la maladie. Cependant, nous ne sommes pas conscients des problèmes à long terme des agents de contraste utilisés durant l'IRM, et elles restent inaccessibles et coûteuses pour la plupart des patients, notamment ceux qui vivent loin des hôpitaux ou centres d’IRM. Enfin, en plus des IRM, les neurologues dépendent des symptômes cliniques du patient pour évaluer et réévaluer le succès des thérapies de modification de la maladie. Ces symptômes restent qualitatifs et des études ont montré qu'ils n'ont aucune corrélation avec ce qui se passe au niveau du SNC. Par conséquent, l'avantage de notre étude est de mettre au point un outil capable de mesurer la neuroinflammation et la progression de la maladie de manière quantitative, non invasive, peu coûteuse et accessible. De plus, l’étude exploratoire concernant les effets gastro-intestinaux de TWEAK pendant l'EAE nous permettra de comprendre les effets de cette cytokine sur un symptôme très courant chez les patients SEP et impactent la qualité de vie. Cette étude pourra fournir des informations precieuses pour comprendre les interactions entre l'axe cerveau-intestin médié par l'interaction du système immunitaire avec les deux qui sont sous-jacents à ces symptomes. En fin, toutes nos études peuvent aider à identifier de nouvelles cibles therapeutiques pour la neuroinflammation et les symptomes gastro-intestinaux chez les patients atteints de SEP, tout en contribuant à une meilleure comprehension des interactions entre ces differents systems durant la santé et la maladie.
Procédures
Parmi les 240 animaux, 150 seront induits en EAE. Ces animaux subiront deux injections pour induire l'EAE. Parmi ces 150, 30 recevront une injection de TWEAK murin recombinant une fois, et nous prevoyons de prélever du sang sur 30 autres animaux à trois reprises sur une période de 24h sous anesthésie gazeuse. Ces deux protocoles, seront réalisés par un manipulateur expérimenté.
Impact sur les animaux
Nos animaux modéliseront la SEP et on observera donc une diminution de la mobilité. Le modèle EAE est bien établi et constitue le modèle de SEP le plus utilisé avec plus de 15 000 publications depuis sa découverte . Le pic de sévérité de l'EAE se manifeste entre 21 et 23 jours après l'induction de la maladie, où on peut observer une paralysie partielle, ainsi qu’une diminution du poids corporel et de la consommation de nourriture et à des troubles du comportement. Ces effets indésirables peuvent persister tout au long de la période de la maladie. Une récupération partielle peut être observée à partir de 20 jours environ.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 21 à 23 jours après l'induction à l'EAE. Cependant, si les souris atteintes d'EAE présentent des manifestations cliniques graves, mesurées par un score clinique égal ou supérieur à 4 pendant deux jours consécutifs, elles seront mises à mort avant cette periode pour éviter une souffrance plus longue.
Remplacement
Notre équipe est engagée dans la réduction de l'utilisation des modèles animaux autant que possible, tout en garantissant que nos travaux de recherche soient pertinents et fiables. Nous avons déjà mis en place des modèles in vitro pour réduire au maximum le nombre d’animaux qui serviront au progres scientifiques dans notre projet, mais dans le cadre de notre étude, le modèle murin d'EAE est le mieux adapté à notre objectif. Notre exploration combine des modèles in vitro, des modèles de souris et des travaux cliniques. Nous allons donc réduire notre dépendance à l'égard de l'extrapolation de données provenant d'animaux en utilisant des lignées cellulaires qui imitent l'organisme humain au niveau cellulaire. Par exemple, nous n'utiliserons pas le modèle murin pour déterminer comment, au niveau transcriptomique et moléculaire, TWEAK module l'inflammation. Nous utiliserons plutôt des lignées cellulaires immortalisées humaines d'intérêt, telles que des lignées cellulaires permettant d’établir un modèle de barrière hémato-encéphalique, de macrophages, etc. Pourtant il est à l’heure actuelle impossible de retracer l'origine et le devenir de la molécule TWEAK dans un système in vitro suffisamment abouti pour reproduire la complexité des interactions moléculaires, cellulaires, et multisystemiques dans l’organisme. En d'autres termes, il n'existe pas de cadre complet utilisant par exemple des organoïdes qui imiteraient le métabolisme d'une cytokine in vitro pour examiner sa cinétique à partir du cerveau, du foie, des reins, des poumons et d'autres organes pertinents. De plus, nos études d'IRM seront directement effectuées sur notre cohorte humaine, allégeant ainsi la charge d'utilisation de souris supplémentaires. Nous allons également directement incuber les cellules humaines avec les sérums de patients SEP au lieu d’injecter des souris avec
Réduction
Nous prenons au sérieux notre engagement à minimiser l'utilisation d'animaux et à respecter les principes des 3R dans nos recherches. Nous nous limitons donc réellement aux expériences et protocoles indispensables, évitant les répétitions inutiles et utilisant des méthodes alternatives lorsqu'elles sont disponibles. Comme on peut le constater dans la section 4.2, le nombre d'animaux que nous prévoyons d'utiliser est adéquat et rigoureux : il n'implique pas un trop grand nombre d'animaux (et donc un gaspillage), tout en conservant sa force statistique. Nous avons déterminé le nombre minimal et nécessaire d’animaux à n = 240 (90 témoins et 150 EAE). Il est important de noter que nous utilisons les mêmes animaux pour réaliser diverses expériences plutôt que d'en utiliser davantage. Nous pensons que le partage des animaux et du matériel biologique est nécessaire pour réduire le nombre d'animaux requis. Ainsi, lorsque cela est possible, nous prélèverons tous les organes dont nous avons besoin sur les mêmes animaux que ceux utilisés pour d'autres protocoles. Il convient de noter que nous n'utiliserons que des femelles, car l'inoculation de l'EAE chez elles a un taux de réussite plus élevé que chez leurs homologues masculins, ce qui contribue une fois de plus à réduire le nombre d'animaux. De plus, nous utilisons des tissus cérébraux de souris EAE conservés d’études précédentes pour effectuer les mises au point techniques préliminaires.
Raffinement
Nous sommes conscients que des souris en bonne santé sont essentielles pour mener une science de qualité, et nous nous engageons à prendre en compte le bien-être de nos animaux dans toutes les étapes de notre recherche. Nos protocoles d'induction de l'EAE se font par immunisation avec un peptide et l'administration d'une toxine (en sous-cutanée). Nous effectuerons des visites quotidiennes aux souris et les pèserons quotidiennement pour nous assurer qu'elles sont correctement nourries et nous surveillerons leur comportement et leur état général en nous basant sur la grille d’évaluation des symptômes cliniques de l'EAE dont le score va de 0 à 5. (0 : Aucune modification, 1 : queue molle, 2 : queue molle et faiblesse des pattes arrière, 3 : queue molle et souvent paralysie complète des pattes arrière, 4 : queue molle, paralysie complète de la patte arrière et partielle de la patte avant, 5 : la souris se roule spontanément dans la cage et la mise à mort et recommandée). Ainsi dès le score 2, nous surveillerons la prise hydrique et alimentaire et nous mettrons en place une analgésie, qui sera ajustée en fonction du score. Si les animaux n’arrivent pas atteindre la nourriture et l’eau du fait des troubles moteurs, nous mettrons la nourriture et l’eau à même le plancher de la cage. L’euthanasie est envisagée à partir d'un score 4 observé deux jours consécutifs. Le microenvironnement des souris sera enrichi de dômes en plexiglas ou en carton. Les souris auront accès à de la nourriture et de l'eau fraîches en permanence. Les conditions de logement pour les souris seront optimisées ; les cages seront aménagées pour permettre aux souris d'exercer leur comportement naturel et leur offrir des environnements enrichissants. Les stimuli de l'environnement extérieur seront réduits au minimum pour éviter de stresser les souris, et on maintiendra le nombre d’animaux par cage à 5.
Choix des espèces
Le modèle EAE a permis la publication de plus de 15000 articles et a servi de point de départ au développement de différentes thérapies pour la SEP. Il existe plusieurs modèles expérimentaux de la SEP mais qui ne reproduisent pas tous les symptômes physiques ou les mécanismes physiopathologiquees de la SEP. Le modèle EAE MOG est pertinent pour étudier la SEP sur son versant inflammatoire. Les souris EAE ont des voies immunitaires et de signalisation similaires à celles des humains et sont plus facilement manipulables que d'autres animaux tels que les primates. Puisque nous nous intéressons à l'évolution clinique et l’aspect inflammatoire de la maladie, le modèle murin EAE est le plus pertient. Des souris âgées de huit à douze semaines seront utilisées pour l'induction de l'EAE. Ce stade de development est couramment utilisé dans de nombreuses études. À ce stade, les souris sont considérées comme étant à l'âge adulte et leur système immunitaire est développé, les rendant plus susceptibles à l'EAE. De plus, c'est à ce moment-là que la prévalence de l'EAE est maximale (i.e., plus prévisible), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilises. À mesure que les souris vieillissent, leur réponse immunitaire peut varier, ce qui rend l'induction de la maladie plus variable. D’autre part, il est préférable d'éviter d'utiliser des souris plus jeunes car leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé, et elles ont également une myéline plus immature. Ces facteurs peuvent entraîner une variation importante dans la susceptibilité de l'animal à développer la maladie.
Validation préclinique de séquences d’IRM multiparamétriquesur un modèle murin de sarcome des tissus mous EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
22 souris vont être utilisées, dont 20 tuées à l'issue et 2 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Partiellement immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau puis deux examens d'IRM, avant que la tumeur ne soit prélevée après mise à mort. Le projet vise à valider des séquences d'IRM pour évaluer les tumeurs sans biopsie. Le porteur justifie la mise à mort par le risque infectieux lié au statut immunodéprimé et affirme que la mesure du flux sanguin est "impossible" sur cultures cellulaires.
Objectifs
Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.
Procédures
Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.
Impact sur les animaux
Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.
Devenir
Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.
Remplacement
Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.
Réduction
L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.
Raffinement
Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.
Evaluation préclinique d’une immunothérapie innovante dans la Maladie d’Alzheimer et autres pathologies liées à la protéine Tau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
2 286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent des modèles de la maladie d'Alzheimer ou un système immunitaire déficient, et subissent une biopsie sur souriceau vigile, jusqu'à 59 injections dans l'abdomen, des prélèvements sanguins répétés et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le projet vise à évaluer une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires liées à la protéine Tau. Le porteur affirme que ces interactions ne peuvent être reproduites en culture cellulaire et juge le modèle animal "totalement indispensable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.
Bénéfices attendus
La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (inférieur à 1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 3 semaines à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 59 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile toutes les semaines durant 3 semaines puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections. La biopsie (
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Le projet impliquera un total de 2286 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.
Travaux pratiques de physiologie : Etude de la respiration chez la souris mâle ou femelle
- Enseignement supérieur
100 souris vont être utilisées, gardées en vie pour être réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque souris respire de l'air enrichi en dioxyde de carbone puis de l'azote, avant de recevoir une injection d'une molécule du système sympathique, pour un travail pratique d'étudiants sur la respiration. Le porteur décrit un objectif de formation aux métiers de l'expérimentation animale et affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet cet apprentissage. Il indique que la contention et l'injection provoquent stress et douleur.
Objectifs
Dans le cadre du programme pédagogique national de notre formation, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé". En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". C’est dans le cadre de ces enseignements que ces travaux pratiques (TP) ont lieu. Ainsi, cette séance de TP chez la souris est destinée à des étudiants, dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. D’autre part, cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces TP sont de plusieurs ordres: 1) d'un point de vue physiologique: mettre en évidence les régulations principales de la fonction respiratoire (dioxyde de carbone, oxygène, système nerveux sympathique) et évaluer le mode d'action d'une molécule de référence du système nerveux sympathique; 2) d'un point de vue expérimental chez l'animal: préhension de la souris, mettre en application les points clefs de surveillance d'un animal anesthésié vus lors du précédant TP (Anesthésie chez le rat), réaliser une injection intrapéritonéale (IP) chez la souris anesthésiée, appliquer des éléments de raffinement lors des procédures (lampe chauffante, gel lubrifiant et hydratatnt oculaire), apprendre à observer les réactions de l'animal d'un point de vue respiratoire suite aux différents tests pour savoir identifier les points limites, savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre aux étudiants de notre formation à réaliser des expérimentations in vivo de physiologie et pharmacologie. En effet, ce diplôme est réglementé au niveau national et le contenu des enseignements est défini selon un programme pédagogique national. Dans le cadre de ce programme, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé". En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants sont les suivants : 1) Apprentissage de la manipulation de la souris anesthésiée : préhension, injection IP, suivi d'anesthésie, mesure de la ventilation pulmonaire; 2) Apprentissage du déroulé d’une étude en physiologie in vivo : recueil de données et traçabilité, analyse et interprétation des résultats; 3) Mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale (mise en évidence de la règle de bien-être animal au cours du TP) et des réflexes à surveiller pour une bonne anesthésie (vus dans le précédent TP anesthésie chez le rat). L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect du bien-être animal dans ce protocole; 4) Réflexion sur les points limites à appliquer pour stopper certaines étapes de la procédure au besoin pour chaque animal. Enfin, ce TP participe à la bonne formation de nos étudiants dans le domaine de l'expérimentation animale et favorise donc à mettre sur le marché du travail des personnes avec des compétences solides dans ce domaine.
Procédures
Chaque souris recevra une injection intrapéritonéale (IP) d'un mélange anesthésique / analgésique, puis elle recevra sous anesthésie, 1 à 3 IP pour prolonger l'anesthésie/ analgésie : le site d'injection IP sera alterné à chaque fois. La profondeur de l'anesthésie sera évaluée pendant toute la durée de celle-ci en vérifiant la fréquence respiratoire et les réflexes cutanés (pincement des pattes postérieures et de la queue). Sous anesthésie, chaque souris respirera pendant 1 min de l'air enrichi en dioxyde de carbone, suivi de 20 min de récupération, puis elle respirera de l'azote gazeux pendant 5-10s, suivi de 20 min de récupération et enfin elle recevra une IP pour injecter la molécule de référence du système nerveux sympathique.
Impact sur les animaux
La contention et la manipulation des souris entrainent du stress, l'injection en intrapéritonéal pour induire l'anesthésie et l'analgésie engendre une légère douleur au site d’injection. Aucune douleur pour les autres injections intrapéritonéales n'est prévue, car elles seront faites sous anesthésie/analgésie.
Devenir
Toutes les souris seront gardées en vie à la fin du TP, car la procédure globale a été conçue de façon à ce que les animaux aient récupéré leur respiration basale après leur réveil. Elles pourront alors être réutilisées dans le cadre de procédures hors champ au sein de notre établissement. Cette réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux au moment de la réutilisation et donc de l'avis du vétérinaire référent.
Remplacement
Dans le cadre de la formation de nos étudiants, le programme pédagogique national prévoit dans la compétence "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé", que les étudiants apprennent à "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP aura lieu. Ce TP doit permettre d’une part d’évaluer in vivo les effets de variations de la composition en gaz de l'air inspiré et d'une molécule de référence du sytème adrénergique sur la respiration et d’autre part l’apprentissage par nos étudiants de la surveillance d'un animal anesthésié et de l'administration par voie intrapéritonéale (IP) chez un animal anesthésié. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants tant sur le plan technique (manipulation de l’animal anesthésié, administration de substance chez l’animal anesthésié…) que sur le plan physiologique/pharmacologique (observation des effets induits par l'air modifié ou par la substance étudiée, pratique des méthodes d'évaluation des effets). Enfin pour favoriser l'apprentissage des étudiants et éviter d'intégrer des animaux d'entraînement, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, placement du capteur de pression, pose des masques, injection IP) leur seront présentées avant le début du TP. L'enseignant mimera les gestes à faire avant chaque étape de la procédure sur une des 4 souris de chaque TP. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections IP en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge).
Réduction
Les étudiants, répartis en trinôme ou quadrinôme, travailleront avec une souris par trinôme ou quadrinôme. Cette répartition permettra aux étudiants de surveiller l'animal aisément tout en réalisant les enregistrements et les analyses des tracés de la respiration et l'injection de la molécule. Ce fonctionnement lors de ce TP permettra d'utiliser un nombre réduit d’animaux tout en garantissant un apprentissage de qualité des étudiants. Chaque année, 4 groupes de 14 étudiants au maximum réaliseront ce TP. A chaque séance de TP un enseignant encadrera 1 groupe d’étudiants. Comme les gestes à réaliser sont relativement simples, leurs démonstrations seront réalisées au début du TP grâce à des vidéos et seront mimées lors du TP sur les animaux des étudiants, évitant ainsi l'utilisation d'un animal de démonstration. De même au cours du TP, les étudiants pourront s'entraîner à réaliser les injections IP en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge). Ainsi, pour chaque groupe de 14 étudiants maximum, 4 souris seront donc nécessaires. Soit un total de 4x4 = 16 souris par an et 4 souris supplémentaires seront prévues par an afin de remplacer éventuellement une souris ne pouvant pas entrer dans le protocole pour cause de santé, soit 100 souris sur 5 ans pour 280 étudiants au maximum. Chaque année, ce nombre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'étudiants par groupe est inférieur à 14 étudiants.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe socialement harmonieux en présence de deux éléments d’enrichissement (papier absorbant et une petite maison ou tunnel soit en polycarbonate soit en carton). Les souris seront anesthésiées et analgésiées tout au long du TP. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée avant de commencer le protocole, mais également tout au long du TP, par les étudiants et l'enseignant. Tout signe de réflexe de l’animal induira l’administration immédiate d’une demi-dose supplémentaire d’anesthésique/analgésique (un quart de dose à la dernière étape de la procédure). Pendant la durée du TP, les animaux seront placés sous une lampe afin d’éviter toute hypothermie et un gel lubrifiant et hydratant oculaire sera déposé afin d'éviter la dessication de leurs yeux. L'enregistrement des paramètres de respiration se fera grâce à un capteur de pression situé à la surface de la cage thoracique et maintenu en place grâce à une ceinture velcro. Ce dispositif est donc non invasif. Les points limites spécifiques du projet seront appliqués : tout animal présentant des signes de stress ou de maladie (tels que poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids telle qu'attendue à l'âge de ces animaux) ne sera pas inclus dans le TP et sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référent; les procédures de variations de la qualité de l'air inspiré en dioxyde de carbone ou en oxygène ou l'injection d'adrénaline par voie intrapéritonéale se feront sous le strict contrôle de l'enseignant et les temps d'application choisis courts permettront la récupération d'une respiration basale en 1 à moins de 10 min pour l'animal. Par ailleurs préalablement au TP, les animaux auront été manipulés régulièrement, afin de diminuer leur stress lors de l’injection intrapéritonéale destinée à l'anesthésie/analgésie et une récompense (de type vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt, billes de céréales, pop corn, gâteau sec…) leur sera donnée afin d'augmenter leur familiarité. De plus, toujours pour diminuer le stress des souris, leur répartition dans leur cage d’hébergement sera conservée à l’issue du TP et une nouvelle récompense leur sera donnée après leur réveil. Enfin, le fait que les étudiants aient déjà vu les procédures en image ou en démonstration améliore leur travail sur les animaux et garantit une meilleure réussite des différentes procédures et donc de l'ensemble de ce TP.
Choix des espèces
La souris est bien connue des points de vue physiologique et pharmacologique et c'est aussi l'une des espèces les plus utilisées en recherche et pharmacologie. De plus, sa taille permet une surveillance aisée de l’animal entier anesthésié et un enregistrement facilité des paramètres basiques de la respiration/ventilation pour des étudiants. Les souris devront peser entre 30 et 45g. Ce poids est adapté à la taille des capteurs et des ceintures que nous avons à disposition et qui permettent d’enregistrer les paramètres de respiration.
Développement des nouvelles techniques d’imagerie et photostimulation multi-photonique pour l’étude des circuits neuronaux dans les rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une injection de vecteur viral sous anesthésie, 900 subissent une craniotomie avec pose d'une barre de tête et d'une fenêtre crânienne, et une partie est observée éveillée sous contention, pour mettre au point de nouveaux microscopes d'étude des circuits visuels. Le porteur indique que les implants peuvent causer douleur, stress et perte de poids pendant un à trois jours. Il affirme que ces circuits ne sont pas observables in vitro et juge l'usage de l'animal "scientifiquement indispensable".
Objectifs
Ce projet vise à mettre au point des nouvelles technologies d’optique permettant de contrôler avec plus de précision les neurones impliqués dans la vision. L’objectif est de comprendre comment les circuits neuronaux de la vision sont organisés et comment ils traitent les signaux sensoriels pour produire le comportement. Nous concevons et construisons de nouveaux microscopes utilisant des techniques d’optique pour mise en forme de la lumière. Jusqu’à présent, les études n’ont pu être réalisées qu’en surface dans les tissus, ou dans des échantillons transparents. Ces nouveaux microscopes constituent des outils sans précédent pour l’étude en profondeur des circuits visuels. En effet, les nouvelles méthodes d’optique développées permettront d’activer des neurones spécifiques avec la lumière et de décrire l’architecture des connexions neuronales dans une même région du cerveau ou entre deux régions différentes afin de comprendre les dynamiques de la perception sensorielle. Ce travail sera mené essentiellement dans des circuits du cortex cérébral.
Bénéfices attendus
Le projet permettra : 1. Le développement de nouvelles technologies d’optique pour la manipulation et l’enregistrement de l’activité neuronale dans le cerveau. Les nouvelles techniques optiques permettront l’étude des circuits neuronaux avec la lumière de façon plus précise par rapport aux méthodes utilisées jusqu’à présent. 2. Les nouvelles techniques optiques permettront de contrôler l’activité des neurones dans des régions du cerveau en profondeur. 3. Cette étude nous permettra de comprendre les mécanismes de perception sensorielle et la structure des circuits neuronaux impliqués, afin de cibler au mieux les thérapies géniques pour la restauration sensorielle en cas de pathologie (par exemple visuelle).
Procédures
1-L’injection d’un vecteur viral sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur tous les animaux (1320 souris) et sous conditions stériles. 2-Une craniotomie sera réalisée sur une partie des animaux (900 souris) sous anesthésie profonde ; une barre de tête et une fenêtre seront posées. Durée : 1h. 3-Une partie des animaux observés en microscopie multi-photonique sera sous anesthésie profonde (600 souris) (durée : 1-6h). 4-Une partie des animaux observés en microscopie multi-photonique sera vigile (300 souris) (durée : 1-2h). Les expériences avec animaux vigiles seront précédées d’une habituation de l’animal à l’environnement afin de minimiser le stress de l’animal (durée : quotidiennement de quelques minutes à 1 heure, habituation progressive de plusieurs jours). 5- Un prélèvement caudal sera réalisé sur tous les animaux (1320 souris maximum) pour déterminer le profil génétique (durée : 5 minutes). L’analgésie est toujours utilisée avec l’anesthésie lors des chirurgies. Une euthanasie par une méthode réglementaire est nécessaire en fin de procédure pour les prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants chroniques, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’une journée à 3 jours après l’opération. Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur. L’adaptation de l’animal à l’environnement expérimental et au microscope d’enregistrement est accompagnée au début d’une détresse de l’animal, qui va diminuer avec l’habituation en quelques jours. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet pour prélever le cerveau et vérifier les données obtenues en microscopie multi- photonique.
Remplacement
Une partie des expériences avec les nouvelles protéines sensibles à la lumière et les indicateurs d’activité neuronale seront faites d’abord dans des modèles cellulaires in vitro, pour identifier les plus efficaces avec les systèmes optiques développés. Des simulations par ordinateur, préalables aux expériences, sont utilisées pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des protéines sensibles à la lumière…). À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux activés par la stimulation sensorielle ne sont pas observables in vitro. L’utilisation de l’animal est donc scientifiquement indispensable à notre étude.
Réduction
L’utilisation d’animaux avec implants permanents nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience. Cela nous permettra de travailler sur un plus petit nombre d’échantillons sur lesquels nous répéterons les stimulations avec la lumière. Grâce à des schèmes et formules mathématiques développés dans notre laboratoire, capables de définir préalablement des profils de stimulations avec la lumière (nombre de cellules et séquences de stimulation), nous pouvons réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention des données requises pour notre étude. Les schèmes de stimulation nous permettent aussi de réduire la durée des expérimentations. Pour chacune des mesures à réaliser, nous utiliserons des tests statistiques pour l’interprétation des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Au total, et sur 5 ans, nous utiliserons 1320 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5 congénères dans des cages ventilées. Ils seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant expérimentation. Une signalétique particulière sera utilisée pour les animaux en expérimentation. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis pour chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation. L’utilisation d’une grille d’évaluation permettra de définir les points limites pour chaque acte expérimental, afin d’éviter toute souffrance de l'animal et permettre l’euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge. Les animaux observés éveillés seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.
Choix des espèces
Notre modèle animal est la souris adulte car ce modèle, très utilisé par les laboratoires de recherche, permet d’étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques proches de l’Homme. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études sous microscope avec haute précision. Le modèle souris permet aussi de disposer d’animaux ayant des particularités génétiques pertinentes pour notre étude. Nous utiliserons des souris âgées entre 28 jours et 1 an avec circuits neuronaux matures.
Rôle de l’habenula latérale dans l’intégration des signaux olfactifs sociaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
775 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, et la déclaration en compte 20 sans réveil, 100 en souffrance légère et 655 en souffrance modérée. Selon les groupes, elles subissent une chirurgie du cerveau de 30 minutes pour y injecter des virus, des analogues ou des antagonistes, des frottis vaginaux répétés pour les femelles, des recueils d'urine en leur massant le ventre, sept jours d'isolement avant des tests olfactifs d'évitement et de préférence sexuelle, et pour certaines huit injections dans l'abdomen, ou une injection d'endotoxine qui mime une infection pour que leur urine porte l'odeur d'un congénère malade. Les bénéfices annoncés, à moyen terme, relèvent de la connaissance : montrer qu'une région du cerveau, l'habenula latérale, relaie les odeurs sociales, et que deux hormones de la reproduction agissent dès la transmission de ces odeurs. Le porteur juge "impératif d'utiliser un animal entier", tout en écrivant que s'appuyer sur des "données fortes de la littérature" lui permettra de limiter le nombre de tests.
Objectifs
Chez la plupart des animaux, les signaux chimiques olfactifs sont cruciaux pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont intégrées via les neurones sensoriels du système olfactif et sont ensuite codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Récemment, l'habenula latérale (LHb), une région cérébrale épithalamique qui participe à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions habénulaires chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs, provoquent une diminution de la réactivité sexuelle (lordose) et un évitement des contacts sexuels. En outre, l'Hb reçoit les projections neuronales exprimant des hormones contrôlant la reproduction : la gonadolibérine (GnRH) et la kisspeptine (KP)). Il a été montré que l’LHb exprime les récepteurs de ces deux hormones. Cependant, le rôle de LHb comme centre de traitement olfactif régulant les comportements sociaux ainsi que la modulation de la fonction de l'Hb par les hormones GnRH et KP restent peu compris à ce jour. Nos résultats préliminaires montrent que LHb est activée par des stimuli olfactifs contenus dans l’urine de congénères malades. Ces mêmes stimuli olfactifs provoquent aussi l’évitement du congénère malade par la souris saine. Par conséquent, ce projet a pour objectif de : (i) caractériser le rôle de la LHb dans le traitement des odeurs sociales lié à l'évitement des congénères malades et à l'attirance sexuelle ; (ii) déterminer le rôle de la GnRH et de la KP dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par LHb.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus avec ce projet seront de deux ordres à moyen terme : (i) la mise en évidence que l’LHb relaie des informations externes, telles que les odeurs sociales, permettant une régulation fine des comportements sociaux adaptatifs ; (ii) que les hormones KP et GnRH ne sont pas seulement des régulateurs clés de l'axe de reproduction hypothalamo-hypophyso-ovarien mais qu’ils peuvent aussi agir en amont dès la transmission des stimuli olfactifs.
Procédures
Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 30 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectué par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevé entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Pour les urines de souris mimiquant un état infectieux aigüe, une seule injection de l'endotoxine en intrapéritonéale (IP) sera effectuée et l'urine sera prélevée qu'une seule fois par animal. Chaque souris injectée avec l'inhibiteur de l'excitation neuronale, recevra au total 4 injections de l'activateur de l'inhibition en IP (1 fois/semaine) et 4 injections du tampon contrôle en IP (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections IP ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l'injection des virus, analogues et antagonistes peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines est possible. Il s’agira d’un stress aigu de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'endotoxine pourront développer des effets secondaires transitoires tels que fatigue, réduction de l'appétit et diminution de l'intérêt social. Ces effets, qui peuvent être observées 2 à 3 h après l'injection de l'endotoxine, disparaissent rapidement et n’entraînent pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'activateur d'inhibition pourront développer des effets secondaires transitoires tels qu'une diminution de la locomotion et de l'anxiété. L'injection intrapérotonéale peut parfois générer une douleurs et hématome au point d'injection. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests olfactifs pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.
Devenir
Tous les animaux seront tous euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine qui seront euthanasiés par le personnel animalier.
Remplacement
A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité́ de neurones de résidants dans plusieurs structures qui sont à la fois olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulations interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères. Néanmoins nos expériences s’appuient sur des données fortes de la littérature ce qui nous permettra de limiter le nombre de tests et d’acquérir des résultats pertinents.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. La taille de nos échantillons a été calculée grâce à un logiciel spécialisé. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaire, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. La significavité des résultats sera évaluée grace à des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe sociaux en présence d’enrichissements (abri cartonné complémenté de matériel de nidification)] avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies avec une première sédation analgésique suivie d’une anesthésie gazeuse. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflamatoire non stéroidien permettant une couverture analgésique de 24h. L’administration sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoire si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra une dose de molécule contrant les effets de l'analgésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation en se conformanat aux points limites post-opératoires connus chez cette espèce.
Choix des espèces
Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. En outre, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelles (génération d'animaux mutants par exemple) qui ne sont pas ou peu possibles sur d'autres espèces. Les animaux mâles ou femelles seront des adultes qui seront âgés de 8 semaines au début des expériences.
Révéler la neuroanatomie des fibres de la matière blanche chez la souris.
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
107 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une intervention neurochirurgicale sous anesthésie de 30 à 45 minutes, avec un risque de douleur, d'infection et de perte de poids, pour cartographier l'organisation des fibres de matière blanche du cerveau. Les retombées annoncées pour l'humain, une meilleure compréhension du cerveau normal et pathologique, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que seuls les modèles mammifères conviennent et conclut que le recours à la souris est "nécessaire".
Objectifs
L'objectif global de notre projet est de faire progresser nos connaissances anatomiques sur la manière dont le cerveau est connecté. Pour ce faire, nous étudierons l'organisation de la matière blanche (qui contient les voies qui relient les différentes régions du cerveau) dans le cerveau de la souris. Les techniques non invasives actuellement disponibles pour étudier ces voies sont incapables de révéler de manière fiable l'organisation des structures complexes telles que les faisceaux de fibres et manquent de la précision par rapport à la neuroanatomie de référence. Par conséquent, nous visons à améliorer la précision avec laquelle nous pouvons étudier l'anatomie de ces voies en utilisant une approche multimodale avancée. En fin de compte, les connaissances et la méthodologie développées dans ce projet serviront de d'étape clé pour une approche similaire appliquée à d'autres espèces, y compris le cerveau humain, et contribueront à une meilleure compréhension de l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau humain, qu'elle soit normale ou pathologique. A termes, notre étude conduira également au développement des modèles informatiques et algorithmes prédictifs qui permet d'éventuellement remplacer certaines études impliquant les animaux.
Bénéfices attendus
La matière blanche du cerveau est impliquée dans un certain nombre de maladies humaines. Une meilleure compréhension de son organisation structurelle et fonctionnelle dans des conditions normales est nécessaire pour identifier et comprendre les différences qui peuvent survenir dans des conditions "anormales" ou pathologiques. En améliorant la précision de nos connaissances sur la neuroanatomie de la matière blanche du cerveau, notre projet permettra de mieux comprendre l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau. En outre, les méthodes et approches techniques que nous innoverons dans notre projet d'étude du cerveau de la souris contribueront au développement d'une nouvelle approche qui permettra une étude fiable de la neuroanatomie de la matière blanche dans le cerveau humain.
Procédures
Les animaux subiront une seule intervention neurochirurgicale sous anesthésie d'une durée de 30 à 45 minutes, qui n'aura lieu qu'une seule fois dans la vie de la souris.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent une brève intervention chirurgicale sous anesthésie. Cet acte comporte un faible risque de douleur, d'infection, d'inconfort et de perte de poids.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Comme nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur les cerveaux humains, un modèle mammifère est préférable en raison de la plus grande similitude de l'organisation des structures neuronales. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possible. A notre connaissance, seuls les modèles mammifères, et plus particulièrement la souris (grâce à sa petite taille permettant la visualisation de son cerveau entier lors des approches de microscopie à lumière), répondent à l'ensemble de ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre projet car des procédures invasives sur le tissu vivant soient nécessaires pour effectuer le marquage par vecteurs viraux. Cela empêche l'utilisation des tissus port mortem humains. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Le projet vise à contribuer à la validation et au développement d'outils de prédiction et de modèles cérébraux in silico. Il contribuera au développement d'une ressource réutilisable à la disposition de la communauté scientifique qui pourra à terme réduire et même remplacer les études sur les animaux. De par sa nature même, il contribuera directement aux objectifs de réduction prévus par les principes des 3Rs et la législation européenne. Le succès de notre projet repose sur des aspects techniques : la capacité de cibler des zones cérébrales de faible volume et nécessitant une grande précision, la capacité de réaliser un marquage intense des neurones nécessitant une optimisation de notre approche expérimentale. Plusieurs facteurs sont susceptibles d'influencer les résultats obtenus. Pour ces raisons, il est très difficile d'estimer a priori le nombre d'animaux nécessaires. Cependant, nous sommes et resterons très attentifs à l'objectif de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. C'est pourquoi nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale qui nous permettra d'analyser nos données au fur et à mesure (c'est-à-dire des expériences réalisées sur de petits lots de 2 à 5 animaux). Cela nous permettra de modifier notre stratégie expérimentale et d'arrêter les expériences dès que le résultat obtenu sera satisfaisant. Comme notre stratégie expérimentale dépend de ces facteurs techniques, nous ne sommes pas en mesure de proposer des tests statistiques pour estimer la taille de l'échantillon nécessaire.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal pendant la période précédent l'intervention chirurgicale conformément aux critères généraux. iii) Intervention immédiate et appropriée (si nécessaire) - les mesures conservatrices doivent être privilégiées. iv) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire le risque de douleur ou de souffrance v) Lors de la chirurgie : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation des produits anti-douleurs adaptés. Respect des principes d’hygiène et d'asepsie. Surveillance continue, application d'une procédure de "nursing" si nécessaire. vi) Formation appropriée et actualisée des expérimentateurs aux techniques chirurgicales pertinentes. vi) Adaptation des conditions d'hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Etant donné que nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur le cerveau humain, un modèle mammifère est préférable puisque l'organisation des structures neuronales est grandement similaire. Bien que nos recherches initiales utilisent des animaux sains, nous avons l'intention d'effectuer des recherches semblables sur des modèles de pathologie humaine. À ce jour, la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible de modifier le génome de manière routinière et constitue donc le modèle idéal pour nos recherches. La petite taille du cerveau de la souris permet de l'adapter à la fois à l'appareil d'IRM et au microscope optique, qui sont tous deux des dispositifs essentiels à notre étude. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (âgés de 4 à 6 semaines), premièrement car les circuits neuronaux concernés sont stables à cet âge par rapport à des souris plus jeunes, mais aussi car il sera plus facile de nettoyer le cerveau pour l'imagerie. En effet, ce processus d'élimination des lipides du cerveau de la souris devient techniquement plus difficile chez les adultes plus âgés. Il s'agit d'une étape cruciale pour préparer le cerveau à la visualisation de structures spécifiques et, par conséquent, un jeune adulte est l'âge optimal pour faciliter une procédure réussie. Le choix de la souris est également motivé par nos données antérieures et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà développés, qui garantissent le succès de notre étude.
Etude de l’effet de peptides dérivés de l’endogline sur l’hémostase et sur l’angiogenèse chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines portent une maladie du saignement, avec hémorragies et malformations des vaisseaux, et subissent une coupure de la queue pour mesurer le temps de saignement, une ponction cardiaque ou la pose puis le retrait chirurgical d'implants aux flancs, pour tester des peptides contre une maladie génétique rare. Le porteur indique que des tests sur plaquettes humaines et une optimisation par ordinateur ont précédé ces expériences. Il présente la mise au point d'un traitement local comme "essentielle", les patients n'ayant aujourd'hui aucune solution sans risque.
Objectifs
Ce projet porte sur l’étude de peptides (séquence d’acides aminés), dérivés d’une protéine des vaisseaux sanguins. L’absence de cette protéine entraîne chez l’homme une maladie génétique rare, responsable de malformations des vaisseaux sanguins et de saignements de nez spontanés et récurrents. Au cours des 15 dernières années, plusieurs traitements ont été proposés mais aucun n’a été totalement efficace, entraînant soit des risques de formation de caillots dans le sang, soit une résistance ou une rechute de la maladie. Développer une nouvelle solution thérapeutique visant l’hémostase (le mécanisme permettant d’arrêter un saignement), et notamment les plaquettes serait essentiel pour traiter la maladie. Dans ce contexte, nous avons récemment démontré qu’un peptide dérivé de cette protéine est capable d’agir sur les plaquettes sanguines et de les agréger, permettant l’arrêt du saignement. Lors d’une étude préliminaire, nous avons montré que ce peptide est également efficace sur un modèle de souris mimant cette maladie, faisant de ce peptide une potentielle cible thérapeutique. Nous cherchons à optimiser ce peptide et avons identifié trois variants de sa séquence semblant améliorer son efficacité. Le but de ce projet est donc de tester sur différents modèles de souris l’efficacité des variants sur le temps de saignement, l’effet sur l’agrégation plaquettaire et l’effet sur la formation des vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait permettre de proposer une nouvelle solution thérapeutique au traitement d’une maladie génétique rare. En effet, à terme, le but est de développer un traitement local, qui non seulement arrêterait le saignement mais apporterait également un effet préventif. Les patients n’ayant à l’heure actuelle pas de traitement sans risque de complication, de résistance ou de rechute, le développement de nouvelles thérapeutiques améliorerait leur prise en charge.
Procédures
Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis une coupure de l’extrémité de la queue, sous anesthésie (10 min). Après un mois de repos, de nouveau une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis un prélèvement sanguin au niveau du cœur, sous anesthésie générale (30 secondes /souris). Ou : Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris) puis, sous anesthésie gazeuse, une injection d’implant gélifié au niveau des flancs (2 fois 15 secondes /souris). Une à deux semaines plus tard, une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), puis sous anesthésie gazeuse, une incision de la peau au niveau des flancs pour récupération des implants (2 fois 1min/souris).
Impact sur les animaux
Les souris modèles de pathologies du saignement peuvent présenter des nuisances dues à leur phénotype : hémorragies en cas de blessures, saignements de nez, malformation des vaisseaux sanguins. Les manipulations peuvent entraîner un stress à l’animal après réveil, avec un risque de reprise de saignement dans les jours suivants. Elles peuvent également entraîner un stress et une légère douleur au moment de l’anesthésie et de la prémédication (contention, piqure). Les implants gélifiés peuvent entraîner une légère gêne.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie générale afin d’effectuer des prélèvements et réaliser des études ex vivo.
Remplacement
Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des plaquettes humaines de volontaires sains afin de démontrer l’efficacité du peptide sur la coagulation du sang. L’optimisation de la structure des variants a été réalisée par ordinateur, 3 variants sur les nombreux identifiés ont été sélectionnés pour être testés dans nos différents modèles murins. Ces expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet de notre peptide dans l’optique du développement d’une nouvelle thérapie.
Réduction
Les modèles de souris que nous allons utiliser existent déjà, ces souris nous sont rendues disponibles via des collaborations du responsable du projet. Seul le nombre de souris nécessaire aux procédures nous seront envoyées, permettant d’éviter la création d’un nouveau noyau d’élevage. Les mêmes souris seront utilisées pour le test de temps de saignement et les tests ex vivo d’étude des fonctions plaquettaires, réduisant ainsi le nombre de souris totales utilisées dans l’étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées par cage de 2 à 5 afin d’éviter l’isolement et la surpopulation, en présence d’enrichissement (matériel de nidification, igloos). Elles recevront une alimentation standard et de l’eau à volonté. Les souris issues de modèles de pathologie de saignement feront l’objet d’une surveillance accrue afin de prévenir tout signe de souffrance. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, qui sera contrôlée régulièrement au cours de la procédure. D’autre part, des souris immunodéficientes seront utilisées pour l’injection d’implant gélifié, afin d’éviter le phénomène de rejet.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant de réaliser à la fois des tests d’hémostase in vivo et d’obtenir suffisamment de sang nécessaire aux études ex vivo. Par ailleurs, le modèle souris nous permet d’utiliser des modèles transgéniques mimant les pathologies de saignement faisant l’objet de notre étude. Le stade de développement des souris, de 8 à 12 semaines, a été choisi par analogie avec la littérature pour l’étude des pathologies de saignement.
Etude de la contribution neuroinflammatoire à la spasticité post-traumatique et de sa modulation par Stimulation Transcutanée dans un modèle murin de lésion de moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On implante à chacune une fenêtre vitrée, et 450 subissent une section de la moelle épinière qui paralyse leurs pattes arrière, avant une rééducation et une stimulation électrique dont le porteur veut optimiser les réglages. Il signale une paralysie postérieure, des difficultés à vider la vessie qui imposent des massages abdominaux deux fois par jour, et une douleur résiduelle malgré les antalgiques. Les retombées annoncées pour les patients paralysés sont formulées comme un espoir, appuyé sur l'actualité d'une équipe suisse.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement et d'optimiser les paramètres de stimulation en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Compte tenu de la diversité des paramètres électriques ajustables (fréquence de stimulation, durée et intensité des impulsions, nombre de répétitions quotidienne/hebdomadaire, positionnement des électrodes relativement à la lésion...), une approche rationnelle doit être mise en oeuvre sur modèle murin. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mettre en place et valider le premier modèle souris permettant de tester l’effet de la stimulation électrique transcutanée sur la récupération fonctionnelle après traumatisme de moelle épinière. Il permettra également d’évaluer l’effet anti-spastique de cette stimulation en vue d’application à d’autres pathologies comme la sclérose en plaques, les AVC, les hémorragies, la sclérose amyotrophique… Il permettra notamment de mieux comprendre les effets thérapeutiques en fonction de la fréquence de stimulation utilisée notamment en évaluant le potentiel immunomodulateur de ces différents protocoles et leur impact neurotrophique. Il est ainsi attendu qu’une optimisation rationnelle des traitements proposés aux patients puisse être mise en place sur la base de biomarqueurs circulants choisis pour caractériser à la fois la gravité du traumatisme et sa réponse aux traitements électriques. En clarifiant les actions directes et indirectes des impulsions électriques sur le système nerveux central, ce projet permettra également de clarifier les conditions dans lesquelles l’implantation d’électrodes est requis pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité. La prise en charge des patients humains pourrait devenir à la fois moins invasive et plus efficace.
Procédures
Sur cinq ans, 750 animaux seront implantés avec fenêtre vitrée. 450 de ces souris seront soumises à une transection de moelle épinière thoracique . La paralysie transitoire des membres postérieurs sera prise en charge dans le cadre d’un protocole de rééducation et d’électrothérapie dont nous souhaitons optimiser les paramètres. Tous les animaux recevront des anti-inflammatoires en post-trauma comme en clinique humaine. 87% de ces animaux traumatisés recevront un traitement complémentaire : soit une rééducation fonctionnelle, soit une stimulation électrique transcutanée, soit la combinaison des deux traitements. La durée des expériences sera limitée à 62 jours post-trauma, sauf pour les animaux a forte récupération dont la stabilité sera évaluée sur 360 jours. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les animaux seront soumis à des sessions d’imagerie intravitale ni douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par semaine à raison de 50µl par prélèvement (sans dépasser un volume maximum de 7,5% de la volémie de l'animal de façon hébdomadaire). 20% des animaux seront soumis à une antibiothérapie préalable au traumatisme pour étudier l'impact du microbiote sur les phénomènes étudiés. La majorité des animaux sortiront du projet dans les 62 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. Les animaux ayant le mieux récupérer seront éventuellement gardé pendant 360 jours pour évaluation trimestrielle de la stabilité de leurs performances.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : diahrée post-prise antibiotiques, gêne locomotrice avec paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, stress et/ou douleur résiduelle modérée malgré la prise d’antalgique et anti-inflammatoires.
Devenir
Tous les animaux (750) seront sacrifiés soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. La majorité d'entre eux sera sacrifiée avant le jour 62. Les meilleurs récupérateurs seront conservés pendant un an pour évaluer de façon trimestrielle la stabilité de leurs facultés sensorimotrices.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. A ce jour il n’existe pas de méthodes de remplacement, mais l’actualité récente de la recherche en Suisse démontre l’intérêt de la recherche animale pour aider les patients tétraplégiques à retrouver une certaine utilisation de leurs membres. Notre modèle murin permettra de clarifier les mécanismes d’action du traitement par SET en réduisant au maximum les facteurs de variabilité (conditions traumatiques, gravité des lésions, diversité des genres, âges et conditions de vie des patients). Il permettra également de réaliser une optimisation rationnelle du traitement clinique à partir d’indicateurs difficiles d’accès chez le patient (évolution dynamique du phénotype de cellules inflammatoires).Un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test de Mann Whitney dédié aux petits échantillons. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J62. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 750 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après anesthésie gazeuse légére et injection d'antidouleurs, l'anesthésie est approfondie par injection intrapéritonéale d'anesthésique avant d'être positionnés sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant , et de l'anesthésique local appliqué avant toute incision. Après l'opération, une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton) et un accès non limité à la nourriture et l’eau. Le cycle jour/nuit, la température et l'humidité sont contrôlés. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs et dont le phénotype est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et de son comportement en font un modèle pré clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront des animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaires. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux.
Rôle de la connexine 43 gliale dans le contrôle de la balance énergétique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau, puis un hébergement individuel, des séjours en cage à métabolisme, un jeûne de 24 heures et un régime gras et sucré, pour étudier une protéine des cellules gliales dans l'obésité. Le porteur indique que la chirurgie échoue chez 55 % des souris, dont la région visée n'est pas atteinte, et que l'isolement et le jeûne causent inconfort et anxiété. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet cette étude "sur un animal in toto" et renvoie au long terme les pistes contre l'obésité.
Objectifs
L’obésité et les troubles métaboliques associés constituent un enjeu de santé publique majeur et une préoccupation planétaire. L’obésité est une maladie chronique de la nutrition qui trouve son origine, en partie, dans des dysfonctionnements de plusieurs structures nerveuses. Ces structures cérébrales intègrent les informations liées à nos réserves adipeuses et à l’alimentation. Elles participent au contrôle de l’appétit pour maintenir un poids corporel stable. Malgré une recherche intense dans le domaine, les mécanismes régulant notre appétit restent mal compris et les stratégies pour lutter efficacement et durablement contre l’obésité sont limitées. Ce projet vise à mieux comprendre comment une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régule la prise alimentaire et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Il étudie le rôle dans la régulation de l’appétit et du poids corporel de cellules non-neuronales appelées cellules gliales. Plus spécifiquement, il étudie un acteur cellulaire, la connexine 43 qui contribue à la communication des . La moitié des animaux auront l’expression de la connexine 43 réduite dans la région cérébrale d’intérêt, permettant de tester sa contribution : 1) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun. Par ailleurs, une partie de ce projet testera la contribution de la connexine 43 dans un contexte de régime enrichi en graisses et en sucres. Nous testerons alors la propension des animaux à prendre du poids et développer un diabète de type 2 lorsqu’ils sont nourris avec ce régime hypercalorique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales d’une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régulent la prise alimentaire, le métabolisme et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la communication des cellules gliales dans la propension des animaux à développer une obésité et un pré-diabète lors d’un régime enrichi en graisses et en sucre. Nous étudierons les contrôles fins de la prise alimentaire, évaluerons la prise hydrique, les dépenses énergétiques, la réponse au jeûne ou encore de l’activité locomotrice des animaux. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités, en particulier le diabète de type 2.
Procédures
Pour les procédures impliquant des animaux nourris avec un régime standard, la durée totale du projet est de 5 ou 11 semaines . Pour les procédures impliquant des animaux alimentés avec un régime enrichi en graisses et sucres, la durée totale du projet est de 14 semaines. Toutes les souris ont une intervention chirurgicale de 45 minutes pour l’injection intracérébrale d’un composé qui cible la connexine 43. Les animaux sont ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, soit 4 semaines pour 24 animaux et 10 semaines pour les autres animaux. Après récupération chirurgicale, le poids et prise alimentaire des animaux sont mesurés 2 fois par semaine pendant 10se. Entre la 6 et 7e semaine qui suivent la chirurgie, les souris sont utilisées dans différents test(s) métabolique(s) : - Certains animaux sont hébergés pendant 3 jours dans des cages métaboliques qui mesurent la prise alimentaire en continu et les dépenses énergétiques. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. Ces animaux sont également utilisés dans un protocole de 25h qui mesure la réalimentation consécutive à un jeûne. La moitié des souris est mise à jeun pendant 24h et les autres pendant 21h puis réalimentées pendant 3h. - Pour d’autres animaux, un test de tolérance au glucose (4h), classiquement utilisé pour diagnostiquer un diabète, est utilisé. Une solution de glucose est administrée par voie orale, puis des prélèvements sanguins sont réalisés pour suivre l’évolution de la glycémie (7 prélèvements au cours des 4h). Après le test et selon les résultats obtenus, les animaux seront soumis à un test qui vérifie l’absence d’anxiété, ainsi qu’à un test de préférence alimentaire (plusieurs régimes pour rongeurs proposés pendant 8j). - Certains animaux sont utilisés dans un test de tolérance à l’insuline. Une injection d’insuline est réalisée, puis des prélèvements sanguins sont réalisés de la même façon que pour le test de glucose (7 prélèvements, 4h). -Enfin, des animaux seront utilisés dans deux tests de privation en glucose (par l’administration d’un composé pharmacologique ; durée 4h). Au cours de ce test, des suivis de mesures de la glycémie (7 prélèvements en 4h) seront réalisés, ou des mesures de la prise alimentaire (pendant 4h).
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. Le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale implique une période de récupération post-opératoire qui est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement. Un inconfort et de l'anxiété peuvent résulter de cet isolement. L’hébergement de 3 jours dans les cages métaboliques est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal qui entraîne une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. Le suivi du statut glycémique et le diagnostic d’un diabète requièrent des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. Par ailleurs, la modification du statut glycémique cause un inconfort dû à la contention de l’animal et aux administrations des composés modifiant le statut glycémique. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem.
Devenir
Les animaux éventuellement sortis de l’étude prématurément en raison d’une souffrance non-traitable seront mis à mort. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem. Ces analyses comprennent des étude in situ, des analyses biochimiques de marqueurs métaboliques. Elles permettent également de vérifier l’efficacité de la chirurgie dans la région d’intérêt et de caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Les animaux sortis des procédure pour une prise de poids insuffisante sous régiùe obésogène seront sacrifiés et les tissus prélevés afin d’abonder un tissuthèque interne à l’équipe permettant de réaliser des analyses biochimiques tests et/ou des essais immunohistochimiques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe pas de méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la balance énergétique. En effet il s’agit ici d’étudier le rôle d’une sous population de cellules gliales présente dans une région spécifique du cerveau et de comprendre leur interactions avec les neurones régulant la balance énergétique. Il est capital que ces cellules soient dans l’environnement complexe qui est le leur in vivo et que ne peut pas être reproduit in vitro. De plus l’objectif est ici de voir si la perturbation de la communication gliale modifie le comportement alimentaire, la prise de poids, la régulation glycémique, les dépenses énergétiques… Ces paramètres ne peuvent être abordés que sur un animal in toto et pas in vitro.
Réduction
Le nombre maximal de souris nécessaire à ce projet est de 348. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Le nombre de lots nécessaires dépend du nombre de variables testées, avec dans chaque procédure des animaux contrôle. 1) La moitié des animaux reçoit un composé inerte vis-à-vis de la connexine 43 et les autres animaux reçoivent un composé qui réduit la connexine 43 dans notre région cérébrale d’intérêt. Cela constitue la variable « condition d’expression de la connexine 43 ». Pour 2 procédures, la condition d’expression de la connexine 43 est la seule variable et nécessite 2 lots d’animaux. 2) Une partie des animaux est soumise à une modification du métabolisme (jeûne ou régime enrichi en graisses et en sucres). Le statut nutritionnel constitue une seconde variable et les procédures concernées nécessitent 4 lots d’animaux (avec la condition d’expression de la connexine 43). Pour l’ensemble des procédures, 20 lots sont nécessaires. L’effectif nécessaire par lot dépend des paramètres étudiés. Il prend en compte : 1) La variabilité individuelle des paramètres étudiés permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’études bibliographiques ou au cours de précédents projets. Une procédure nécessite 6 animaux inclus dans les analyses finales, et les autres procédures 8 animaux par lot. 2) L’inclusion ou non des animaux dans les groupes statistiques finales. Dans ce présent projet, deux critères d’exclusion sont relevés : a) l’échec des chirurgies. L’intégralité de la région d’intérêt doit être touchée, cela représente 55% des animaux et b) l’échec, pour induire une obésité chez la souris qui peut aller jusqu’à 30 %. Ainsi, pour l’étude de paramètres nécessitant 8 animaux, nous devons utiliser au maximum 8 souris inclues dans les analyses statistiques et prévoir 8 souris exclues des analyses (et 6 souris résistantes au régime enrichi en graisses), soit au maximum 22 animaux par lot de souris soumises à un régime enrichi. Pour les animaux exposés à un régime standard, 16 animaux par lot maximum sont nécessaires. En prenant en compte les critères d’inclusion et d’exclusion, nous nous assurons que les animaux utilisés seront suffisants pour obtenir des résultats scientifiquement valables qui pourront être utilisés par la communauté scientifique.
Raffinement
Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entrainé. L'état clinique des animaux est suivi quotidiennement et un état anormal fait l’objet d’une quantification par une grille de score, permettant une prise en charge adaptée . Les actes pouvant générer de la douleur sont réalisés sous analgésie et/ou anesthésie. La chirurgie est réalisée sous analgésie pré-opératoire et post-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale. Après la chirurgie, un suivi renforcé est mis en place. Durant les 3 jours qui suivent la chirurgie, les animaux sont placés dans une salle de l'animalerie dédiée pour une surveillance accrue. Pendant cette période, une alimentation adaptée limitant la déshydratation et la perte de poids est disposée en fond de cage et une analgésie est systématiquement administrée. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de glycémie sont réalisés après application d'une crème anesthésiante. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde et sous analgésie quand elle est susceptible de générer de la douleur. Pour étudier le métabolisme des animaux nous avons recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non-invasives, la mesure de plusieurs paramètres métaboliques. Les mesures sont effectuées simultanement sur un même animal pour faciliter les études de corrélation entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests nécessitant une mise à jeun, les animaux seront habitués au retrait de la mangeoire pour réduire l'angoisse causée par l'absence de nourriture. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention avant les différents tests métaboliques pour réduire l'angoisse animale et éviter des fluctuations de la glycémie dues au stress de la manipulation et de la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie jusqu'à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes sont disposées afin de permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères. Par ailleurs, un enrichissemen plus varié est mis en place. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Pour les procédures n’incluant pas l’étude des effets du régime enrichi en graisses, des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. L’anatomie des différentes régions du cerveau est bien connue à cet âge et ce qui nous permet plus aisément de cibler la structure cérébrale. Pour les procédures étudiant l’effet d’un régime enrichi en graisses et en sucre, des souris à partir de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter les régimes enrichis en graisses et en sucres peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale.