Souris
Efficacité pharmacologique et suivi en imagerie de nanoparticules capables d’emmener des molécules thérapeutiques dans le cerveau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trépanées au-dessus du cortex pour y sceller une fenêtre de verre, puis maintenues sous anesthésie jusqu'à trois heures pendant l'imagerie, 336 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de procédure par surdosage d'anesthésique. L'objectif est de suivre le passage, du sang vers le cerveau, de nanoparticules chargées d'une molécule thérapeutique, que le porteur décrit comme un "cheval de Troie" leurrant un transport naturel. Il revendique une "quasi-innocuité" de ses composés et annonce qu'un score de sévérité sévère constitue le point limite déclenchant la mise à mort immédiate.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Dans ce projet nous allons attacher à la surface de nanoparticules (100 nm de diamètre) nos vecteurs et les remplir d'une molécule thérapeutique. Ces nanoparticules leurrent se système de transport comme un cheval de Troie pour pénétrer dans le cerveau suite à leur délivrance dans le sang. L’objectif de ce projet et de quantifier l’efficacité de l’agent thérapeutique embarqué et de suivre en imagerie le passage des nanoparticules, du sang au cerveau avec différents types de contrôles. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Le succès de ces travaux et nos dernières études ont démontré la quasi-innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie.
Bénéfices attendus
Grâce au profil pharmacologique et à l’optimisation de nos composés, nous pourrons envisager de meilleurs effets pharmacologiques /thérapeutiques notamment par la capacité de délivrer une large quantité d’agents encapsulés dans nos nanoparticules. Les correcteurs transitoires d’ADN (dont les ARN messagers et interférents) sont de plus en plus reconnus comme ayant un potentiel révolutionnaire thérapeutique, notamment par leur capacité à moduler transitoirement l’expression génique, ouvrant la porte au traitement de nombreuses pathologies. Ces entités thérapeutiques peuvent présenter de multiples effets définis par leur design (activation/répression, correction de la transcription de l’ADN en ARN messagers, etc.). Ainsi les limites des applications et des cibles de ces molécules thérapeutiques vont bien au-delà des approches classiques (petites molécules, anticorps, protéines, peptides, etc…). En théorie, ces thérapies pourraient être développés pour toute pathologie et même personnalisables pour chaque patient pour restaurer les fonctions déficientes. C’est particulièrement le cas pour toute pathologie présentant une composante génétique identifiée (maladie génétiques type myopathie de Duchenne, cancers, pathologies neurodégénératives, etc…). Bien qu’ils présentent une excellente sélectivité d’action, grâce à leur appariement précis sur une cible donnée, ils souffrent d’un handicap majeur pour permettre leur développement et leur essor dans l’arsenal thérapeutique : en tant que macromolécules chargées, leurs propriétés physicochimiques, leur stabilité et leur taille ne leur permettent pas de traverser les barrières biologiques à des doses acceptables. En outre, bien qu’ils présentent spontanément une affinité préférentielle pour les organes d’excrétion, avec notamment une accumulation au foie, ils ne se distribuent que très peu dans autres les tissus.
Procédures
Dans la procédure 1 un les animaux subiront une injection dans la queue en contention (durée < 1 min) puis seront stabuler jusqu’à 14 jours post injection avant mise à mort par un surdosage d’un mélange d’anesthésique/analgésique (15min entre l’injection et la mise à mort). Dans la procédure 2 qui se déroule entièrement sous anesthésie générale gazeuse induite en boite (2 min) puis maintenue au masque tout au long de la procédure (jusqu’à 3 heures incluant la session d’imagerie). Ensuite les animaux reçoivent des analgésiques systémiques et locaux (2 min) avant de subir la chirurgie d’implantation d’une chambre optique. Cette fenêtre osseuse est ménagée dans le crâne au-dessus du cortex avec un trépan (10 min) puis une lame de verre est déposée au-dessus puis scellée avec un ciment orthopédique (10min). L’animal est ensuite installé sous le microscope (10min). La procédure d’imagerie commence par une injection caudale d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min). S’en suit l’acquisition en imagerie du réseau vasculaire cérébral (10 min). Les nanoparticules sont ensuite injectées de la même manière (1 min) et s’en suit l’acquisition en imagerie durant 2h30 avant la mise à mort de l’animal par surdosage d’un mélange d’analgésique/anesthésique. Dans la procédure 3, les animaux reçoivent la veille en contention soit une injection IV caudale de VEGF A soit d’une NP chargée avec un ARNm Cre (1 min). Le lendemain il subissent la même chirurgie d’implantation, session d’imagerie et protocole de mise à mort que ceux décrits ci-dessus (durée totale 3H).
Impact sur les animaux
Nos conjugués reconnaissent une cible fortement exprimée au niveau des vaisseaux sanguin du cerveau, et sont relativement bien tolérés. Cependant, toute nouvelle entité peut présenter des effets indésirables malgré des évaluations préalables. Pour limiter la douleur et la souffrance, un suivi quotidien est mis en place, avec évaluation comportementale et attribution d’un score de sévérité (non présent, modéré, sévère) pour les procédures éveillées. L’apparition d’un score sévère constitue le point limite et déclenche immédiatement la mise à mort des animaux. Ces mesures garantissent la protection des animaux tout en préservant la fiabilité des résultats expérimentaux. Les points limites liés à l’administration des composés sont : tout signe de toxicité. Pendant les 24h décisives ces points concernent les constantes vitales ainsi que le comportement des animaux. Pour les procédures chirurgicales et la session d’imagerie sous anesthésie générale, les points limites qui seront observés concernent : les constantes vitales au cours de l’anesthésie et les potentiels dommages que pourrait subir le cerveau pendant la chirurgie. Pour les sessions d’imagerie, une partie des études sont classées sans réveil (toutes les sauf « rupture de BHE et NP-ARNm Cre » où les animaux reçoivent une injection la veille : classe modérée). Tous les gestes suivants jusqu’à la mise à mort sont réalisés sous anesthésie générale. L’autre procédure (efficacité pharmacologique), de classe modérée, comprend une injection en contention, une période de stabulation puis une injection terminale avant récupération des tissus/sang pour post analyses. De fait, les seuls stress rencontrés seront des administrations en contention et l’induction des anesthésies (le projet inclura des anesthésiques et analgésiques). Quasiment aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, en termes de toxicité (données antérieures et élimination rapide). Les volumes d’administration sont en accord avec la littérature. L’administration de ces NP peut potentiellement engendrer un léger impact transitoire sur les constantes sanguines (environ 1h post-administration sans conséquences pour le bien-être des animaux) selon nos données antérieures. Il est à noter que nous avons une grande connaissance de l’innocuité de nos composés (toxicité, risques immunogènes) ainsi qu’une maitrise de leur pureté (>97% selon nos standards) et des taux d’endotoxines comparables à une étude clinique humaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure
Remplacement
Toutes études de mesures pharmacologique ou d’imagerie en temps réel, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécanistiques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de variants génétiquement modifiés ; la souris est l'espèce idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le développement de nos vecteurs ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. L'utilisation de rongeurs impose la prise en compte de la règle des 3R, la conformité vis à vis des et du cahier des charges. A noter que la présélection des vecteurs, des NP et des agents thérapeutiques embarqués passent par une phase de criblage in silico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont testés in vitro sur lignées cellulaires avant de passer aux phases in vivo (souches sauvages et génétiquement modifiées) et d’envisager dans d’autre projet un passage au primate non-humain en fin d’étude préclinique. Ce faisant nous respectons scrupuleusement tous les outils à disposition pour sélectionner nos composés avant d’envisager une étude chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs (N.S. one-way anova). Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous nous basons sur notre historique de résultats, notamment au niveau de la reproductibilité inter-individuelle, et d’un plan d’expérience aboutissant à un n=4 pour la première procédure dans chaque groupe et un n=6 pour les procédures d’imagerie 2 et 3.
Raffinement
Pour la procédure d’efficacité pharmacologique, les administrations en contention (très rapides
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé (physiologie connue et proche de l’homme). Il facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la pharmacologie (diminution des quantités administrées). On l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes sans trop de contraintes de stabulation. La souris est également idéale lorsqu’il s’agit de mette en place l’élevage d’une lignée. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés y ont été développés et sont disponibles, dont ceux inclus dans ce projet. Enfin l'utilisation de souris est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler différentes formes de notre récepteur d’intérêt « forme sauvage mais aussi génétiquement modifiée sous sa forme humanisée). Enfin les animaux inclus seront des mâles et femelles à un stade de développement adulte.
Essai thérapeutique de réversion de lésions hépatiques dans un modèle murin d’une maladie vasculaire héréditaire.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
40 souris vont être utilisées, toutes tuées en fin de procédure pour récupérer leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une modification génétique qui fragilise leurs vaisseaux et provoque des lésions du foie, elles reçoivent jusqu'à huit injections en sept jours sur animal éveillé, sous immobilisation de trente secondes, avec un risque d'hématome et d'infection. Le porteur retient dix souris par groupe et quatre groupes, et indique qu'aucun traitement n'existe aujourd'hui pour cette maladie héréditaire. La piste thérapeutique annoncée n'existera que si l'inhibiteur testé améliore effectivement les lésions hépatiques.
Objectifs
Nous travaillons sur une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies et des problèmes de déformation entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteintes du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous avons des modèles de souris de cette pathologie qui sont des animaux génétiquement modifiés. Ces animaux ont été caractérisés pour leurs défauts vasculaires dans le foie qui reproduisent bien certains aspects de la maladie. Nos analyses ont identifié une cible thérapeutique potentielle. Objectif : Etudier l’effet d’un inhibiteur de cette cible sur les manifestations de la maladie dans le foie (lésions hépatiques) de notre modèle animal.
Bénéfices attendus
Il y a actuellement aucun traitement pour la maladie que nous étudions. Si les lésions hépatiques sont améliorés par l’inhibiteur de notre cible, une piste thérapeutique pour traiter les patients sera alors identifiée.
Procédures
Des injections sur animaux éveillés sont effectuées sur l’ensemble des animaux. Les injections sont au nombre de 8 maximum par souris sur une période de 7 jours et d’une durée inférieure à 30 secondes chacune.
Impact sur les animaux
Les injections sur animaux vigiles induisent une douleur passagère (quelques minutes maximum), un risque d’infection et d’hématome, ainsi qu’un stress suite à l’immobilisation (maximum 30 secondes). Une légère perte de poids ou une diminution d’activité sont possibles à la suite de l’invalidation du gène étudié.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient mis à mort, afin de récupérer les organes.
Remplacement
Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules composant les vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un organe à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent aux malformations vasculaires hépatiques, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel statistique, ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires permettant de faire les tests statistiques nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique. Dix souris par groupe seront nécessaires. Le nombre de groupes est de quatre. Le projet nécessite donc 40 animaux.
Raffinement
Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. Pendant toute l’expérience, une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal (voir annexe). En cas de signe de douleur, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques semblables aux mutations portées par les patients atteints de cette maladie. Elles constituent donc le meilleur modèle de la pathologie pour mieux comprendre les mécanismes de développement de cette pathologie et mieux développer des traitements. Les symptômes de cette maladie apparaissent à l’adolescence, nous allons étudier les phénotypes vasculaires à l’âge jeune adulte uniquement.
Rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
9 156 souris vont être utilisées sur cinq ans, chacune recevant par gavage une suspension bactérienne en trois minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur précisant que les animaux ne peuvent être "ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés" puisque l'objectif est de prélever l'estomac ou l'intestin. Il attend de l'infection gastrique aucune souffrance et de l'infection intestinale un inconfort léger épisodique, sur la foi de son expérience et de celle de ses collègues. Le même résumé annonce 9 156 souris au titre du "cas pessimiste" où chaque souche mutante et chaque temps d'observation feraient l'objet d'expériences indépendantes.
Objectifs
Le répertoire des récepteurs de l’immunité innée inclus des protéines capables de reconnaître virtuellement tous les différents composants de la paroi bactérienne. Cette détection de ces composants de paroi permet à l’hôte et aux bactéries d’établir une symbiose bénéfique aux deux partenaires. Cet équilibre est rompu dans le contexte d’une bactérie pathogène. De nombreux pathogènes ont développé des stratégies d’échappement à l’hôte en modifiant ou masquant leur surface au système immunitaire inné. Nous avons fait dans le passé la preuve de principe en étudiant certains mécanismes de modification de certains composants de la paroi bactérienne qui permettent au pathogène d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire inné de l’hôte. Néanmoins, il reste encore à découvrir beaucoup de nouveaux mécanismes de régulation de la paroi bactérienne permettant à des pathogènes d’échapper à la surveillance de l’hôte. Nous étudions ces mécanismes dans deux pathogènes du tractus gastrointestinal : responsable de pathologies gastriques sévères comme le cancer de l’estomac, et responsable de gastroentérites et souvent associé à des maladies chroniques inflammatoires de l’intestin. Ainsi, nous étudierons la capacité de souches mutantes pour des gènes impliqués dans la modification et/ou régulation de la paroi bactérienne à coloniser leur niche naturelle (estomac et intestin). Grâce à ces nouvelles connaissances, nous espérons pourvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces fonctions importantes pour la survie de ces deux pathogènes dans leur niche.
Bénéfices attendus
La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de l’homme. De plus, il existe un grand nombre de lignées murines mutantes, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité, permettant par la suite, en fonction des résultats obtenus sous ce projet, des études mécanistiques approfondies de la réponse immunitaire de la souris face à l’infection de l’estomac par l’une des bactéries étudiéesi. Ces nouvelles connaissances permettraient d’améliorer les stratégies vaccinales contre cette bactérie qui pour l’instant ne sont pas efficaces. De plus, le fait de se focaliser sur des mutants du métabolisme de la paroi chez cette bactérie nous pourrons identifier des cibles prometteuses pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre cette bactérie. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transférables à l’homme.
Procédures
L’administration des suspensions bactériennes par gavage sur animal vigile est très rapide (3 min par individu).
Impact sur les animaux
Le gavage entraine un inconfort et une douleur légère de courte durée. Suivant la littérature, l’infection de l’intestin par les souches pathogènes de l’une des 2 bactéries étudiées peut entrainer épisodiquement un inconfort léger de la souris avec de la diarrhée. Néanmoins, nous n’avons jamais observé avec nos souches de d’inconfort ou de diarrhée. Par contre, l’infection de l’estomac par l’autre bactérie étudiée n’entraine aucune souffrance pour la souris suivant notre expérience et celle de nos collègues nationaux et internationaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, pour toutes les procédures, l’objectif final est de prélever certains organes pour l’observation de la colonisation bactérienne de l’estomac ou de l’intestin. Ces prélèvements d’organes vitaux sont, par définition, réalisés sur animaux morts.
Remplacement
Pour ce projet, aucun système alternatif au modèle animal n’est possible pour répondre à la question scientifique du rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence. Des systèmes cellulaires ou d’organoïdes ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire. De plus, avec ces systèmes in vitro, il y a absence complète de l’environnement complexe de : 1) l’estomac notamment l’acidité produite par les cellules pariétales qui ont un impact très fort sur la survie de l’une des 2 bactéries étudiée ; 2) de l’intestin, notamment, la production d’acides biliaires ou la compétition avec la flore commensale qui impactent fortement la capacité de l’autre bactérie étudiée à coloniser cette niche. Ainsi, le comportement de mutants dans des systèmes cellulaires ne reproduit pas le stress rencontrer dans le tractus gastrointestinal.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utiles à ce projet a été débattue avec les biostatisticiens. Nous utiliserons ici 9156 souris sur une période de 5 ans dans le cas pessimiste où chaque souche mutante et chaque temps d’observation ferait l’objet d’expériences indépendantes. Lorsqu’une expérience permettra l’observation de plusieurs mutants en même temps, ou de plusieurs temps avec une même souche mutante, un seul groupe contrôle sera produit.
Raffinement
Durant les deux semaines précédant toute expérimentation, les expérimentateurs rendront visite aux souris pour les habituer aux manipulations avant toute procédure expérimentale. Pendant le protocole, les expérimentateurs rendront visite tous les jours aux souris lors des deux premières semaines d’infection. Après les 15 premiers jours, si aucun signe visible de détresse est observé, les visites se feront deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. En cas de diarrhée, nous mettrons du gel hydrique dans les cages à dispositions des souris. En cas
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans la continuité des précédents projets menés au laboratoire. C’est le modèle pour lequel nous avons le plus d’outils moléculaires pour étudier la réponse de l’hôte à l’infection. De plus, nous avons à notre disposition des modèles murins génétiquement modifiés, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité qui permettrons une suite en cas de résultats intéressants avec certains des mutants à tester. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront âgées de 5 ou 6 semaines. Cet âge défini est basé sur nos précédents projets internes et externes qui ont fait appel au modèle murin.
Etude de la capacité régénérative de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées chaque jour pendant deux semaines, puis recevant une injection destinée à provoquer une lésion de l'intestin, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées en fin de protocole pour analyse des tissus. Les dommages intestinaux entraînent diarrhées, inflammation, douleurs, déshydratation et perte de poids pendant cinq jours au plus, et le porteur signale qu'un mauvais positionnement de la sonde de gavage peut provoquer une détresse respiratoire imposant une mise à mort immédiate. L'objectif est d'observer la capacité de régénération de l'intestin chez des souris porteuses d'une hypercalcémie d'origine génétique, et de voir si une molécule en développement l'améliore. Ni la substance qui provoque la lésion ni celle administrée par voie orale ne sont nommées, et aucun seuil de mise à mort n'est chiffré pour un projet classé sévère.
Objectifs
Le maintien de l’équilibre du calcium dans l’organisme repose sur une régulation hormonale finement contrôlée principalement par le calcitriol, la forme active de la vitamine D. Une augmentation anormale des niveaux de calcitriol dans le sang peut conduire à des pathologies rares, chez l’enfant comme chez l’adulte, caractérisées par une accumulation excessive de calcium et de calcitriol dans l’organisme, communément nommée hypercalcémie liée à des excès de vitamine D. L’une des causes génétiques identifiées dans ces hypercalcémies est la perte de fonction du gène qui code une enzyme indispensable à la dégradation du calcitriol. En l’absence de cette dégradation, le calcitriol s’accumule, induisant une absorption excessive du calcium. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que les souris génétiquement modifiées permettant l’inactivation sélective de cette enzyme, reproduisent fidèlement le phénotype des patients comportant une hypercalcémie marquée. Nous avons identifié que ces souris présentent également des anomalies au niveau des cellules souches intestinales, essentielles au renouvellement régulier du tissu. En cas de lésion intestinale sévère, ces cellules entrent dans un programme de régénération qui va permettre de réparer le tissu. Pour étudier les mécanismes de réparation tissulaire dans un contexte pathologique lié à des excès de calcitriol et de calcium, nous utiliserons une substance permettant d’induire une lésion transitoire dans l’intestin, afin d’observer la capacité de régénération du tissu chez ces souris. En parallèle, une partie des souris seront injectée préalablement avec une molécule thérapeutique qui améliore grandement la pathologie, actuellement en cours de développement, pour déterminer si le processus de régénération de l’intestin est amélioré grâce à cette molécule.
Bénéfices attendus
Ces études permettront d’étudier le potentiel des cellules souches intestinales dans un contexte d’hypercalcémie liée à des excès de vitamine D, et de comprendre des activités encore peu connues de la vitamine D. De plus, à terme, ce projet pourrait contribuer à l'identification d'un potentiel traitement pour les maladies liées à des excès de calcitriol.
Procédures
Pendant deux semaines, les animaux recevront chaque jour une petite quantité d’une substance, administrée par la bouche. Cette substance a pour but d’améliorer l’hypercalcémie liée à des excès de vitamine D. Ces administrations sont courtes et généralement bien supportées par les animaux. À l’issue de ces 2 semaines, une injection sera réalisée afin d’induire une liaison intestinale. Sur l’ensemble du projet, 480 souris seront nécessaires. Toutes les manipulations seront effectuées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect du bien-être animal. Si, malgré ces précautions, un animal présentait des complications ou des signes de souffrance (ce qui reste exceptionnel), il serait immédiatement retiré de l’étude et pris en charge de manière appropriée afin d’éviter toute souffrance inutile.
Impact sur les animaux
L’induction des dommages intestinaux peuvent conduire à des diarrhées, de l’inflammation des douleurs, une déshydratation et une perte de poids de l’animal. Ce traitement durera un maximum de 5 jours. Les injections peuvent exceptionnellement causer des infections au niveau du site d’injection. L’administration par la bouche peut rarement conduire à une irritation. Le gavage peut amener à des erreurs de manipulation due à un mauvais positionnement de la sonde qui peut mener à une détresse respiratoire nécessitant une euthanasie immédiate. Les différentes administrations de traitement pourront éventuellement générer un stress chez l'animal ainsi qu'une douleur au niveau du site d'administration. Ces gestes sont effectués par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses de l'expression des gènes et des protéines).
Remplacement
Pour étudier comment l’intestin se répare dans certaines maladies liées à un excès de vitamine D et de calcium, il est nécessaire d’observer l’ensemble de l’organisme. En effet, plusieurs organes (comme les reins, le système immunitaire ou les os) interagissent entre eux et influencent ce processus. Ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites de manière fiable en laboratoire à partir de cellules isolées. L’utilisation d’un animal vivant est donc indispensable pour comprendre ces mécanismes dans des conditions proches de la réalité. La souris est un modèle de référence en recherche, car son fonctionnement biologique et la structure de son intestin sont très proches de ceux de l’être humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les méthodes employées sont bien maîtrisées par l’équipe, ce qui permet de mener des expériences de qualité sans multiplier les animaux. Chaque souris sera utilisée pour plusieurs analyses, afin d’éviter toute utilisation inutile. Les résultats étant comparables chez les mâles et les femelles, les données pourront être regroupées. Les groupes seront toutefois composés à parts égales de mâles et de femelles afin de garantir un bon équilibre. Ainsi, seuls les animaux indispensables à la validité scientifique de l’étude seront inclus.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, dans des cages adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Elles seront surveillées régulièrement, notamment par l’observation de leur comportement et le suivi de leur poids. Si un animal présente des signes de déshydratation ou de malaise, des soins adaptés seront immédiatement mis en place. Les manipulations (administration des traitements) seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec des techniques conçues pour réduire au maximum l’inconfort et le stress. Si un animal montre des signes clairs de souffrance, il sera retiré de l’étude et pris en charge sans délai afin d’éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
La régulation du calcium et de la vitamine D fait intervenir plusieurs organes et différents types de cellules. De même, la réparation de l’intestin est un mécanisme complexe qui ne peut pas être étudié correctement avec des cellules isolées. La souris est particulièrement adaptée à ce type de recherche, car elle réagit aux traitements de manière comparable à l’être humain. Elle permet également l’utilisation de techniques génétiques avancées, indispensables pour comprendre le rôle de certains gènes. L’étude porte sur des animaux adultes. Les souris recevront un traitement à partir de l’âge de 8 semaines, puis une injection unique à 10 semaines afin de déclencher un phénomène contrôlé de régénération intestinale, qui sera ensuite analysé.
Cibler la néovascularisation cornéenne : développement d’un traitement innovant à base de de peptidomimétiques topiques (modèle murin).
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1 180 souris albinos vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une chirurgie de quinze minutes provoque sur un œil une néovascularisation de la cornée, dont le porteur indique qu'elle peut aller d'une vision floue à une perte totale de la vision pendant quatorze jours au plus, puis des collyres sont instillés deux fois par jour et l'œil est imagé sous anesthésie générale pendant quarante-cinq minutes. Des tests de cinq minutes doivent évaluer la douleur et l'inconfort oculaires, sans que le porteur précise lesquels, et l'objectif est de mettre au point un traitement en collyre qui éviterait aux malades les injections dans la cornée. Il affirme qu'aucun modèle ex vivo, in vitro ou in silico ne reproduit la formation de ces vaisseaux, et conclut que l'expérimentation animale est "indispensable" et le modèle rongeur "la seule approche scientifiquement valable".
Objectifs
La néovascularisation pathologique de la cornée est une affection grave causée par le développement anormal de vaisseaux sanguins dans la cornée, et présentant un risque important de perte rapide et irréversible de la vision. Malgré les progrès réalisés, qui ont permis le développement de thérapies, les options pour traiter la néovascularisation cornéenne restent limitées. L'administration topique de médicaments existants, dont la pénétration cornéenne est limitée, n'est efficace qu'à des doses qui risquent d'endommager la structure cornéenne. Il est donc important de développer des traitements topiques efficaces afin de traiter convenablement la néovascularisation cornéenne. Dans ce projet, notre objectif est de développer un agent administré par voie topique et capable d’inhiber le développement de vaisseaux sanguins dans la cornée (néovascularisation cornéenne pathologique), sans recourir à des procédures invasives ni induire d’effets indésirables sur la structure cornéenne. Nous évaluerons l’efficacité de plusieurs composés à l’aide de deux modèles murins de néovascularisation cornéenne qui reproduisent fidèlement les manifestations cliniques observées chez l’homme. Nous suivrons l’évolution de la néovascularisation cornéenne chez des souris sur plusieurs jours après instillation des différents composés. Une analyse détaillée de la cornée sera effectuée afin d’identifier et de confirmer l’effet des molécules testées, grâce à plusieurs tests d’imagerie. L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules administrées directement par voie topique, ainsi que d’analyser la réponse inflammatoire associée à la néovascularisation cornéenne.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de développer une série de molécules anti-angiogénique pour une administration topique visant à traiter la néovascularisation cornéenne pathologique, une affection grave causée par le développement de néovaisseaux dans la cornée et présentant un risque important de perte rapide et irréversible de la vision. En effet, la néovascularisation cornéenne est la deuxième cause de perte de vision, touchant plus de 1,4 millions de personnes chaque année dans le monde. Nos résultats contribueront à la recherche fondamentale et pourront être adaptés à des ligands peptidiques ciblant d'autres domaines thérapeutiques. Nous souhaiterions améliorer le traitement de la néovascularisation cornéenne pathologique en évitant les injections dans le stroma cornéen ou l'espace sous-conjonctival. Cela constituera un avantage décisif pour la santé et une amélioration du confort des patients, avec une meilleure acceptabilité du traitement et moins d'effets secondaires.
Procédures
Les chirurgies seront effectuées une seule fois par animal sous anesthésie générale et injection d’analgésique, à raison de 15 minutes par animal. L’instillation sera effectuée deux fois par jour, par animal, sur différentes durées chez des souris naïves et dans des modèles de néovascularisation cornéenne. L’instillation sera effectuée sur animal vigile, à raison d’une seule minute par animal. Les tests de comportement, qui permettront d’évaluer la douleur et l’inconfort oculaires, seront effectués chez les souris naïves et les modèles de néovascularisation cornéenne instillées avec les composés, à raison de cinq minutes par animal. Les examens d’imagerie in vivo, qui permettront de prendre des images de la cornée et de suivre l’évolution de la néovascularisation cornéenne, seront effectués chez les souris naïves et les modèles de néovascularisation cornéenne instillées avec les composés, à raison de quarante-cinq minutes par animal. Ils seront effectués sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent provoquer un stress transitoire. Les procédures d’imagerie, qui nécessitent une anesthésie générale, présentent un faible risque d’irritation de la surface oculaire. L’induction d’une néovascularisation cornéenne entraînera une diminution de la qualité visuelle, pouvant aller d’une vision floue à une perte totale de la vision. Cette atteinte unilatérale sera toutefois limitée à un seul œil tout en restant limité dans le temps maximum 14 jours, l’œil controlatéral restant intact. Les procédures sur la cornée sont susceptibles de provoquer des douleurs.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem étant nécessaires, les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront euthanasiés de manière règlementée en fin de procédure. En effet, les techniques fonctionnelles et d’imagerie utilisées sur l’animal vivant ne permettent actuellement qu’une analyse incomplète et partielle des mécanismes impliqués dans la néovascularisation cornéenne et doivent donc être complété par des analyses post-mortem.
Remplacement
L’induction et l’analyse de la néovascularisation cornéenne, ainsi que de la réponse inflammatoire associée, nécessitent l’utilisation d’un organisme entier. À ce jour, aucun modèle ex vivo ou in vitro ne permet de reproduire de manière fiable la formation de néovaisseaux cornéens ni d’en étudier les mécanismes. Par ailleurs, ce projet vise à évaluer les propriétés anti angiogéniques de composés synthétiques développés par nos collaborateurs, ce qui requiert des études in vivo pour examiner à la fois leur toxicité et leur efficacité. L’expérimentation animale est donc indispensable. Une revue de la littérature confirme également l’absence de modèle in silico pertinent pour répondre à ces problématiques. Afin de comprendre précisément les effets anti angiogéniques sur la néovascularisation cornéenne et l’inflammation associée, l’utilisation d’un modèle rongeur demeure la seule approche scientifiquement valable.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1180 animaux dans ce projet d’une durée de 5 ans. L’estimation du nombre d’animaux à inclure dans les procédures s’appuie sur des études antérieures de l’équipe utilisant des approches expérimentales comparables et des tests statistiques de puissance. Ces analyses nous permettent de réduire et d’estimer le nombre d’animaux par lot ou conditions expérimentales nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes en tenant compte de la variabilité inter-individus. Lors de l’analyse de nos résultats, nous effectuerons un premier test statistique permettant de tester la distribution de nos échantillons suivi de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement (maison en carton, bâton en bois à ronger, pas de coton car induit des inflammations du segment antérieur de l'œil), avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure du bien-être animal pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22 degrés Celsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour puis 12h nuit. Un système d’étiquetage associé à des pastilles visuelles indiquant les actes expérimentaux permettra d’assurer un suivi rigoureux du bien-être des animaux. Pour éviter toute souffrance les procédures expérimentales se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire pour les actes qui le nécessitent. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et, en l’absence de rétablissement selon le temps défini pour respecter le bien-être animal, l’animal sera euthanasié pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L’utilisation des souris est ici justifiée par la similitude de leur système visuel (caractéristiques anatomiques, cellulaires, et génétiques fondamentales) avec celui de l’homme. Dans ce projet, les souris albinos ont été spécialement choisies à cause de l’hypopigmentation des structures de leurs yeux, permettant une meilleure visualisation et étude de la néovascularisation cornéenne. Dans ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, afin d’éviter les effets liés au vieillissement pouvant fausser les analyses.
Recherche préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques contre l’endométriose dans un model murin
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Pour cribler des composés candidats contre l'endométriose, 2 500 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. La maladie est provoquée par une injection de fragments utérins dans l'abdomen, précédée et suivie de vingt-huit injections d'œstrogènes sur huit semaines, et les composés sont administrés par gavage ou en sous-cutané jusqu'à deux fois par jour pendant huit semaines. Le porteur attend une douleur persistante modérée ou sévère et une perte de poids de 15 à 20 % la première semaine, et classe pour cette raison le projet en sévère. La mise à mort se fait par dislocation cervicale, précédée ou non d'une exsanguination, ou par élévation progressive de CO2.
Objectifs
L’endométriose représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroître. Il s’agit d’une maladie gynécologique chronique et complexe, caractérisée par la présence de tissu endométrial ectopique, responsable de douleurs pelviennes, de troubles de la fertilité et d’une altération significative de la qualité de vie. Malgré sa forte prévalence et son impact socio-économique, les options thérapeutiques actuelles restent limitées et essentiellement symptomatiques. Ce projet vise à tester des composés thérapeutiques dans un modèle expérimental d’endométriose, modèle pertinent et transposable, reproduisant des caractéristiques clés de la pathologie humaine, dans l’objectif d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de l’endométriose.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patientes atteintes d’endométriose.
Procédures
1) l’injection d’estrogènes en intrapéritonéale une fois par jour pendant 7 jours pour les animaux donneurs et tous les deux jours pendant 8 semaines pour les receveuses (28 injections de 0.25 ml en moins de 10 sec) 2) Une injection intrapéritonéale de fragment utérins (une seule fois 0.5ml en moins de 10sec) 3) Afin de relier l’efficacité des composés à leurs taux sériques, une pharmacocinétique pourra être effectuée une fois par étude. Ainsi, au maximum 3 prélèvements de maximum 30 μL de sang par souris (veine saphène médiale veine submandibulaire en moins de 30 secondes) seront réalisés pendant la même journée ou étalés sur 2 journées. Le volume total de ces prélèvements n’excédera pas 10% du volume sanguin des souris et les prélèvements seront effectués sur animaux vigiles. 4) Les composés et leurs solvants seront administrés soit par gavage (maximum deux fois par jour) ou injection sous cutanée (maximum deux fois par jour) pendant 8 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, sur animal vigile. 5) En fin d'étude ou le cas échéant pour des raisons éthiques, les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’isoflurane, par dislocation cervicale précédée ou non d’une exsanguination (sans ouverture de l’abdomen) ou alors mis à mort par augmentation progressive de CO2.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous nous attendons à observer une douleur persistante modérée ou sévère transitoire, et des pertes de poids transitoires, c’est pourquoi il sera classé en sévère. Nous nous attendons à observer une perte de poids transitoire chez les animaux du fait de l’inflammation générée, environ 15 à 20%, au début de l’induction de la maladie (pendant la première semaine), avec ensuite une reprise de poids. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. Les injections intrapéritonéales et les prélèvements sanguins au niveau de la veine induisent une douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie ou lors de l’administration par gavage ou lors des injections intrapéritonéales.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour prelevement d'organes
Remplacement
Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle alternatif in vitro, y compris les nouveaux modèles d’organoïdes, n’est disponible pour étudier les mécanismes inflammatoires complexes intervenant dans la physiopathologie de l’endométriose. Recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez la femme.
Réduction
Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique.
Raffinement
Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des animaux. Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets adaptés à l’espèce avec une mise en place de matériel permettant la nidification (coton, etc..). Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs.
Choix des espèces
L'utilisation de souris est basée sur une littérature abondante décrivant les différents modèles d’endométriose chez l’animal, cette dernière étant très proche de celle observée chez la femme. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés d’intérêt sur des organes matures.
Plasticité neuroanatomique du système opioïde en conditions neuropathiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Testées cinq jours de suite, opérées en dix minutes, puis testées tous les trois jours pendant deux semaines et une fois par semaine pendant dix semaines, 420 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. À quatre, huit et douze semaines après la chirurgie, elles sont séparées de leurs congénères cinq heures, testées deux jours de suite, puis séparées quinze heures. La douleur induite persiste au moins six mois dans l'un des deux protocoles, et le porteur indique que les analgésiques ne peuvent pas être administrés puisque les mécanismes de sa chronicité sont l'objet même de l'étude. Vient enfin la chirurgie terminale, sous anesthésie profonde, que le résumé justifie en quatre mots, "mise à mort pour prélèvement".
Objectifs
La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitements actuels y compris les opiacés, tels que la morphine, ciblant le récepteur opioïde mu. Elle s’accompagne également de comorbidités de type anxio-dépressif plus fréquentes chez les femmes. Le système opioïde est un acteur clé de la modulation du seuil de sensibilité et de l’humeur. Il est composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa) activés par la libération de neuropeptides opioïdes endogènes. La compréhension des changements affectant ce système en condition neuropathique est donc essentielle pour appréhender son rôle dans le développement de la douleur mais aussi dans l’apparition des comorbidités émotionnelles. Elle est également cruciale pour identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos résultats antérieurs ont montré que les récepteurs opioïdes mu et delta peuvent s’associer et que leur interaction est associée avec une diminution de la douleur en condition neuropathique. Notre objectif est donc de cartographier les changements intervenant dans leur distribution dans le cerveau. Un modèle de douleur neuropathique dans lequel le seuil de sensibilité mécanique revient progressivement au niveau initial et un modèle dans lequel il reste faible de façon durable seront comparés pour déterminer si la plasticité observée est strictement associée au développement de la douleur ou si elle est également prédictive de la capacité de récupération. L'objectif global du projet est une compréhension fine des altérations du système opioïde qui interviennent en condition neuropathique afin de déterminer l’intérêt thérapeutique de cibler les récepteurs opioïdes mu et delta associés.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier les changements induits par la condition neuropathique et de déterminer leur implication dans le développement de la douleur. Elle permettra aussi de déterminer les potentielles différences liées au sexe, au caractère réversible ou pas de l’hypersensibilité mécanique et au développement ou non des comorbidités de type anxio-dépressif. Au final, cette étude améliorera notre compréhension de la plasticité du système opioïde et, plus particulièrement, du rôle et de l’intérêt thérapeutique de cibler les récepteurs opioïdes mu et delta associés.
Procédures
Un premier groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis 1 fois par semaine durant les 10 semaines suivantes. Le comportement de l’animal est également évalué 4, 8 et 12 semaines post-chirurgie sur une séquence de 4 jours comprenant une séparation des congénères pendant 5 heures le premier jour, un test de 5 minutes le 2ème jour, un test de 10 minutes le 3ème jour et une séparation des congénères de 15h le 4ème jour. Un deuxième groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis ensuite 1 fois par semaine. Au bout de 4 ou 8 semaines, une injection de 10 secondes sera pratiquée sur animal vigile suivie 1 heure plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes suivie 4 ou 8 semaines plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un quatrième groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis 1 fois par semaine durant les 10 semaines suivantes. Au bout de 4 ou 8 semaines, il subira une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un cinquième groupe de souris adultes vigiles recevra 1 injection de 10 secondes suivie 1 heure plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes .
Impact sur les animaux
Les deux modèles de douleur utilisés entraînent une douleur modérée qui perdure pendant au moins 6 mois dans l’un des modèles tandis que dans l’autre modèle les animaux récupèrent spontanément au bout de 3 mois. L’identification des mécanismes responsables du caractère chronique de la douleur représente le sujet de l’étude ; Par conséquent, les analgésiques ne peuvent être utiliser pour soulager la douleur. Par ailleurs, la chirurgie induit une inflammation et, potentiellement, une perte de poids transitoire.
Devenir
mise à mort pour prélèvement
Remplacement
Les changements au niveau cérébral induits dans les modèles de douleur ne peuvent être évalués que sur organisme entier et vivant. Le système opioïde exerce un rôle neuromodulateur similaire chez l‘homme et la souris qui constitue dès lors un bon modèle pour en étudier les altérations dans des modèles de douleur reproduisant les signes cliniques observés chez l'homme.
Réduction
Une veille de la littérature sera effectuée durant toute la durée du projet afin de s'assurer du caractère original des expériences proposées et d'intégrer toute nouvelle donnée qui permettrait de réduire le nombre de paramètres à tester. Des expériences pilote sur des groupes d'animaux de taille réduite seront menées pour toute mise au point de protocole. Le nombre d'animaux est déterminé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement robustes.
Raffinement
Les conditions d'hébergement (enrichissement, groupes sociaux, transfert de cage avec utilisation de tubes) et de manipulation (habituation à l’expérimentateur et aux pièces d’expérimentation) des animaux sont optimisées pour respecter leur besoin d'interaction sociale et réduire le stress des animaux. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie générale et de façon à minimiser les effets négatifs sur l’animal (tapis chauffant, gel oculaire). Des points limites sont établis pour chaque procédure pour prévenir toute souffrance inutile. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.
Choix des espèces
L'espèce animale a été choisie car (1) ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et (2) cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. l'étude sera réalisée sur des souris agées de 6 semaines ou plus.
Utilisation d’un modèle murin sensible aux souches virales émergentes et ré-émergentes transmises par les moucherons culicoïdes.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Choisies pour leur sensibilité accrue aux agents pathogènes, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont saignées à la joue, à la queue ou au sinus rétro-orbitaire, et le résumé présente ces prélèvements comme les seules procédures prévues, tout en annonçant par ailleurs des souris vaccinées puis inoculées avec des virus transmis par les moucherons culicoïdes. Toutes sont tuées au dernier jour expérimental, pour mesurer la quantité de virus et d'anticorps dans leurs organes et leur sang. Le porteur revendique un "immense avantage" à recourir à ces souris, celui de réduire l'utilisation de moutons, de bovins, de chèvres et d'équidés, et fixe l'effectif de 300 souris sur cinq ans d'après la moyenne des années précédentes.
Objectifs
Les nombreuses émergences et ré-émergences de virus transmis par les culicoides (moucherons) ces dernières années, touchant les animaux (maladie hémorragique épizootique, fièvre catarrhale ovine, …) ont été responsables d’une forte mortalité chez les ruminants et responsables de fortes pertes économiques. Dans le but de limiter les conséquences de ces émergences, la caractérisation des nouvelles souches virales circulantes et la vaccination des animaux est le meilleur moyen de protéger les animaux et de limiter la diffusion de ces maladies. De ce fait, il est nécessaire de bénéficier d’un modèle rongeur adapté pour tester des approches prophylactiques efficaces. De par leur sensibilité accrue à de nombreux agents pathogènes, les souris sensibles constituent un modèle de choix pour des études préalables à des essais sur l’espèce naturellement ciblée par ces agents pathogènes (mammifères de taille importante). Le but de ce projet est de caractériser la virulence de souche virale et d’évaluer la capacité des souris à produire des anticorps dirigés contre les virus d’intérêt. Un total de 300 souris pour 5 ans sera utilisé (ce qui correspond au nombre moyen d’animaux utilisés ces dernières années durant les différents projets).
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes d’infection de multiples virus émergents et ré-émergents. Ils pourraient permettre également le développement et la mise au point de nouveaux vaccins.
Procédures
Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles pratiqués à la joue (veine submandibulaire), ou à la queue ou en dernier recours au sinus rétro-orbitaire, après pose d’un collyre anesthésiant par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement ne dure que quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlées tous les jours.
Impact sur les animaux
Une surveillance quotidienne de tous les animaux vaccinés et / ou infectés sera réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée sera effectuée avant chaque inoculation de virus, puis quotidiennement. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance sera augmentée à deux observations quotidiennes, y compris les week-ends. L’adjuvant utilisé a fait l’objet de tests toxicologiques qui ont conclu à la non-toxicité et à la tolérance favorable.
Devenir
Les souris seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes et de sang, pour l’analyse de la quantité de virus et d’anticorps dans ces différents prélèvements.
Remplacement
Le modèle des souris s’avère particulièrement pertinent pour l’étude des virus et présente l’immense avantage de réduire l’utilisation de grands animaux (ovins, bovins, caprins, équidés…).
Réduction
Six souris par groupe permet d’avoir des résultats solides et statistiquement fiables. En moyenne, 2 souches virales et 2 essais d’efficacité de nouvelles molécules étant testées par année, 60 souris / an seront utilisées (soit 300 souris au maximum sur 5 ans).
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton ...). Elles sont abreuvées et nourries ad libitum. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée est effectuée avant chaque inoculation d’une souche virale (infectieuse), puis une pesée quotidienne est ensuite effectuée. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance est augmentée à deux observations quotidiennes. Le score clinique de chaque souris est établi quotidiennement et permet de poursuivre ou non la procédure pour chaque souris. Un collyre anesthésiant sera appliqué pour les prélèvements de sang au niveau du sinus rétro-orbitaire. Les prélèvements sont effectués par du personnel expérimenté et formé et ne dure que quelques secondes par souris.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour les virus, de par sa grande sensibilité à l’infection virale. Elle développe généralement des signes cliniques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris utilisées seront âgées de 10 semaines minimum afin de disposer d’animaux adultes présentant un système immunitaire mature et permettant la réalisation des prélèvements dans de bonnes conditions expérimentales.
Etude du contrôle astrocytaire des fonctions et dysfonctions cérébrales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 400 souris vont être utilisées, chacune subissant une injection intracérébrale de trente minutes et, pour certaines, trois injections supplémentaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'accès au cerveau passe par une incision de la peau et une perforation du crâne, suivies d'une douleur et d'une gêne post-opératoires pendant les premiers jours, d'une perte de poids transitoire et d'un risque d'infection de la suture. Toutes sont tuées environ vingt jours après le début des expériences, pour prélever leur cerveau. Le porteur annonce des retombées "majeures" sur la compréhension du rôle des astrocytes et de nouvelles pistes pour des pathologies neurologiques ou psychiatriques, sans que le projet comporte lui-même d'essai thérapeutique.
Objectifs
Le cerveau est composé de milliards de cellules appelées neurones, qui permettent de penser, bouger, ressentir et mémoriser. Mais les neurones ne sont pas seuls : le cerveau contient aussi un autre type de cellules très nombreuses, appelées astrocytes, dont le rôle est longtemps resté sous-estimé. On sait aujourd’hui que les astrocytes ne se contentent pas de « soutenir » les neurones, mais qu’ils participent activement au fonctionnement du cerveau. Ils peuvent influencer l’activité des neurones, la manière dont les messages nerveux circulent, et l’organisation globale des réseaux cérébraux. Lorsque ces cellules ne fonctionnent pas correctement, cela pourrait contribuer à certaines maladies du cerveau. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les astrocytes agissent sur l’activité du cerveau, dans des conditions normales et lorsque ces mécanismes sont perturbés. Plus précisément, nous cherchons à comprendre comment les astrocytes communiquent entre eux, comment ils utilisent certains signaux internes pour fonctionner, et comment ils contribuent à maintenir l’équilibre chimique nécessaire au bon fonctionnement des neurones. En étudiant ces mécanismes dans le cerveau, ce projet vise à établir des liens clairs entre le fonctionnement des astrocytes et l’activité des neurones. À terme, ces travaux permettront de mieux comprendre comment le cerveau fonctionne normalement et pourquoi certains dysfonctionnements peuvent apparaître.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer notre compréhension du rôle des astrocytes dans la régulation des fonctions cérébrales, aussi bien en conditions normales que pathologiques. En identifiant les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les astrocytes influencent l’activité neuronale et les réseaux corticaux, ce travail pourrait contribuer à renouveler en profondeur notre vision du fonctionnement du système nerveux central. Les résultats attendus auront donc des retombées majeures non seulement sur le plan fondamental en enrichissant les connaissances sur les interactions neurogliales, mais aussi sur le plan biomédical, en ouvrant de nouvelles pistes pour la compréhension de pathologies neurologiques ou psychiatriques impliquant un dysfonctionnement des cellules gliales.
Procédures
Injection intracérébrale (1/animal, 30 minutes environ). Des injections complémentaires pourront être réalisées chez certains animaux (3/animal, 1 minute environ).
Impact sur les animaux
La procédure d’injection intracérébrale (environ 30 min) est susceptible d’entraîner plusieurs types de nuisances chez les animaux : 1. Un stress chirurgical associé à l’anesthésie générale et à l’injection intracérébrale pendant les heures suivant l’intervention. 2. Une douleur et une gêne post-opératoire liée à l’incision cutanée et à la perforation du crâne nécessaire à l’injection intracérébrale durant les premiers jours post-opératoires. 3. Une perte de poids transitoire dans les jours suivant l’intervention. 4. Un risque d’infection localisé au niveau de la suture.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études biochimiques ou immunohistochimiques, ou pour réaliser des techniques de patch-clamp et de field recording, d'imagerie calcique ou de réseaux multélectrodes.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions entre neurones et astrocytes dans un contexte fonctionnel intégré, au sein d’un cerveau intact. Or, les modèles alternatifs tels que les cultures cellulaires, les simulations informatiques, ou les organismes plus simples (comme la drosophile ou Caenorhabditis elegans) ne permettent pas de reproduire la complexité du cerveau des mammifères, ni les interactions spécifiques entre neurones et astrocytes dans leur environnement naturel. Il n’est donc pas possible, dans le cadre de ce projet, de remplacer l’expérimentation animale par des approches alternatives tout en conservant la pertinence scientifique des résultats obtenus.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la taille des groupes de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Par ailleurs, chaque souris est utilisée comme son propre contrôle, grâce à une injection bilatérale : l’hémisphère recevant la condition expérimentale est comparé à l’hémisphère opposé injecté avec une condition de référence. Cette approche de comparaison intra-individuelle permet de limiter significativement le nombre d’animaux requis. Ainsi, 10 animaux par groupe sont nécessaires. Enfin, le recours à des vecteurs viraux ciblés permet de réduire le nombre de lignées transgéniques à générer, croiser et maintenir, contribuant ainsi à la réduction globale de l’utilisation d’animaux dans le projet.
Raffinement
Les injections intracorticales seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant toute la durée de l’intervention afin de prévenir l’hypothermie per-opératoire. Après la chirurgie, les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique quotidienne. Une grille d’évaluation standardisée intégrant des critères d’apparence (toilettage, posture, aspect du pelage) et de comportement (locomotion, interactions sociales, prise alimentaire) sera utilisée pour détecter précocement toute altération du bien-être. Cette surveillance permettra d’identifier d’éventuels points limites justifiant une intervention rapide.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il présente une organisation du cerveau proche de celle de l’homme, permettant d’étudier de manière pertinente le fonctionnement des cellules cérébrales dans un contexte comparable. La souris est également l’espèce pour laquelle il existe un large éventail de modèles génétiquement modifiés, indispensables pour étudier de façon ciblée le rôle de certaines cellules et de certains mécanismes biologiques dans le cerveau. Ces outils ne sont pas disponibles, ou de manière très limitée, dans d’autres espèces animales. Enfin, le modèle murin présente également des caractéristiques biologiques permettant une gestion maîtrisée des effectifs, garantissant la disponibilité d’un nombre suffisant d’animaux pour les besoins du projet tout en limitant le recours à un nombre élevé d’animaux reproducteurs. Les expériences sont initiées chez des souris âgées d’environ un mois, car les animaux sont ensuite mis à mort environ 20 jours plus tard, à un âge où les circuits cérébraux sont fonctionnellement matures.
Effet de préparations pro-pré-post-biotiques sur la physiologie de l’hôte dans un modèle rongeur
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 1440
Gavées chaque jour pendant vingt-huit jours, isolées dans une cage vide jusqu'à quinze minutes pour le recueil des fèces deux fois par semaine, et saignées une fois par semaine, 1 440 souris et 1 440 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués en fin de protocole pour analyse des tissus. Le porteur affirme qu'aucune nuisance liée aux substances n'est attendue parce qu'elles sont "connues pour leur sécurité d'emploi chez l'homme et l'animal", alors que le projet existe précisément parce que leurs mécanismes d'action "restent largement peu décrits". Il indique par ailleurs qu'un calcul de puissance formel ne peut pas être établi de façon robuste pour ces analyses, et retient un effectif de 2 880 rongeurs jugé adéquat.
Objectifs
L’utilisation de micro-organismes ou leurs dérivés (les « probiotiques » ou assimilés), ou d’autres interventions thérapeutiques visant le microbiote intestinal (certaines fibres, les « prébiotiques ») ont déjà démontré leur intérêt dans diverses aires thérapeutiques, en prévention ou en complément des traitements de référence. Pourtant, les mécanismes biologiques actionnés par ces substances (pré, post et probiotiques) restent largement peu décrits, notamment en raison de leur complexité en termes de composition, mais aussi d’interactions avec l’hôte et son microbiote. La recherche d’une meilleure compréhension de ces modes d’action se justifie car elle permet de mieux communiquer sur la pertinence scientifique de ces solutions de santé, mais également de renforcer leur sécurité. Dans cet objectif, si le recours à des modèles in vitro est possible dans certains cas, il n’existe pas à ce jour de modèle non animal capable de récapituler la complexité du système digestif, qui comprend l’hôte, son microbiote, les substances issues de l’alimentation, et met en jeu des interactions entre ces acteurs et le reste de l’organisme – système digestif, système gastro-intestinal, système nerveux, système immunitaire… L’utilisation de modèles animaux pour aborder l’aspect mécanistique est alors un complément indispensable à l’obtention des données cliniques. Outre la description des mécanismes, les modèles animaux sont idéaux pour développer, améliorer, comprendre les solutions existantes ou en développer de nouvelles. L’objectif du projet est donc de caractériser l’effet de préparations pré/post/probiotiques existantes ou en cours de développement sur la physiologie de l’hôte, notamment sa physiologie digestive, chez l’animal sain, et en en mesurant les conséquences sur des paramètres cliniques (courbe de poids, dosages sanguins) ou microscopiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer et de comparer l’efficacité de préparations pré/post/probiotiques dans un contexte physiologique, à travers des mesures de marqueurs biochimiques, d'inflammation, ... et de décrire leurs mécanismes d’action notamment sur la physiologie intestinale. Finalement, les données obtenues permettront de développer les solutions thérapeutiques les plus efficaces et les plus sûres, sur la base de critères scientifiques objectifs.
Procédures
Sur animaux vigiles : -administration des substance évaluées par gavage, quotidiennement, pendant 28 jours maximum. -prélèvements de fèces, deux fois par semaine maximum, pendant 6 semaines maximum. Les animaux seront isolés dans une cage vide jusqu’à l’émission, avec une durée maximale de 15 minutes. -prélèvements sanguins, une fois par semaine maximum, pendant 6 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, aucune nuisance liée aux substances administrées n’est attendue, car ces substances sont connues pour leur sécurité d’emploi chez l’homme et l’animal. Les administrations, l’isolement transitoire pour les prélèvements fécaux ainsi que les prélèvements sanguins et les contentions associées à ces gestes peuvent être une source de stress pour l’animal.
Devenir
Une partie du projet se base sur des mesures effectuées sur les tissus prélevés post-mortem. L'mise à mort en fin de protocole est donc nécessaire.
Remplacement
La physiologie du tube digestif, lieu d’action primaire des pré/post/probiotiques, est complexe. Elle implique le tube digestif, lui-même composé de plusieurs types cellulaires, le système immunitaire, le microbiote, et le dialogue biochimique complexe qui s’établit entre ces différentes composantes. Il n’est actuellement pas possible de reconstituer une telle complexité par des modèles non animaux, y compris les plus complexes.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux impliqués est basée sur : -une bonne connaissance du modèle permettant d’ajuster les effectifs au minimum tout en maximisant la qualité et la pertinence des résultats obtenus -une exploitation maximale du matériel biologique et des données cliniques, permettant de limiter le nombre de réitérations -une bonne connaissance des produits testés, de la dose efficace et de leur absence d'effet indésirable, permettant de ne pas requérir de mise au point ou d’ajustement de doses et de durées de traitement. -le regroupement des essais permettant de limiter le nombre de groupes témoins La taille des groupes est justifiée par une approche combinant données de la littérature, expérience acquise avec ce modèle et variabilité attendue des données collectées. Un calcul de puissance formel nécessitant de définir a priori un critère principal, une variance et une taille d’effet attendues, il ne peut être établi de façon pleinement robuste pour ces analyses exploratoires et multidimensionnelles. Le nombre d’animaux retenu vise donc à garantir des résultats interprétables et statistiquement exploitables, tout en limitant les effectifs au nombre adéquat.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes, avec enrichissement (ouate, abri, roue, tube…). Une surveillance individuelle renforcée quotidienne (weekend et jours fériés inclus) sera appliquée pendant la procédure afin d’écarter au plus vite tout animal dont l'état général se dégraderait. Les prélèvements fécaux seront réalisés au maximum deux fois par semaine. Les prélèvements sanguins seront réalisés au maximum une fois par semaine et limités au volume minimal nécessaire aux analyses.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces de référence pour les raisons suivantes : -existence d’outils moléculaires pour l’exploration mécanistique -existence de données préliminaires sur ces modèles concernant les produits évalués Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre 8 et 15 semaines, car le projet concerne des produits visant une utilisation chez l’adulte
Evaluation du bien-être animal d’une nouvelle lignée murine crée par le système Crispr/Cas9.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souriceaux d'une lignée voisine meurent avant le sevrage dans 40 à 50 % des cas, dont environ 60 % dans les quarante-huit heures suivant la naissance, et le porteur n'exclut pas de retrouver les mêmes atteintes dans la lignée qu'il crée ici. 240 souris vont être utilisées dans des procédures classées légères et réduites à des observations non invasives, pour évaluer ce que le porteur appelle le "bien-être animal" de cette lignée obtenue par Crispr/Cas9. Dans cette lignée voisine, les survivants présentent une hypoglycémie, des déséquilibres hormonaux et une activité motrice réduite. Les souris affectées à l'étude comparative sont mises à mort, celles retenues pour l'évaluation restant en vie pour la reproduction.
Objectifs
Cette demande s’inscrit dans le cadre de la création d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées, avec pour objectif principal d’évaluer les conséquences de cette altération génétique sur le bien-être animal, tout en les comparant à celles observées dans des modèles murins existants disponibles au sein de notre équipe. Cette approche comparative est essentielle afin de situer précisément les effets propres à la modification ciblée et d’en apprécier la spécificité. La lignée développée cible une région génomique impliquée dans une maladie humaine rare. À ce titre, ce modèle s’inscrit à l’interface entre recherche fondamentale et recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Nous considérons que ces travaux sont susceptibles d’améliorer notre compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques associés à cette pathologie, en particulier durant la période périnatale. Enfin, cette nouvelle lignée pourrait constituer un modèle préclinique pertinent, complémentaire des modèles existants, permettant d’explorer plus finement le rôle des éléments génétiques impliqués, notamment dans le contexte périnatal. Elle offrirait ainsi un outil original pour étudier l’émergence des phénotypes et, à plus long terme, pour identifier de potentielles cibles thérapeutiques.
Procédures
Cette évaluation est basée sur des observations non invasives.
Impact sur les animaux
La lignée développée ici cible une petite région génomique qui chez un autre modèle de la pathologie que nous étudions est altérée pour deux autres gènes. Cette dernière présente de la mortalité en période périnatale ainsi que des défauts métaboliques. 40 à 50 % des individus mutants décèdent avant le sevrage, dont environ 60 % dans les 48 heures suivant la naissance. Les souriceaux présentent un métabolisme altéré, caractérisé par une hypoglycémie, des déséquilibres hormonaux et une diminution de l’activité motrice spontanée. Les individus survivants apparaissent ensuite globalement normaux, malgré un poids corporel inférieur à celui des témoins. L'objectif étant de déterminer la contribution potentielle de ce gène dans les phénotypes observés il n'est pas exclu d'observer les mêmes altérations pour cette nouvelle lignée.
Devenir
Tous les animaux d'interêt pour l'évaluation du bien-être animal sont gardés en vie pour la reproduction. Tous ceux pour l'édude comparative sont mis à mort.
Remplacement
Nos gènes d’intérêts sont exclusivement retrouvés chez les mammifères placentaires et sont exprimés uniquement dans le cerveau. Ce mode d’expression strictement neuronal, associé à leur apparition tardive au cours de l’évolution des mammifères, restreint considérablement le choix de modèles d’étude biologiquement pertinents. Ainsi, toutes les études publiées à ce jour ont été menées chez la souris, d’autant que ce modèle reproduit certains traits pathologiques caractéristiques de la maladie. Enfin, notre demande porte sur un stade de développement crucial : la naissance. À ce jour, il n’existe aucun modèle alternatif crédible et biologiquement pertinent pour cette étude.
Réduction
Pour étudier les individus sur 2 générations à partir de la G1, nous souhaitons produire 4 mâles fondateurs par génération pour s’affranchir des mutations non voulues et augmenter la diversité génétique. Donc en croisant chaque mâle avec 2 femelles et en raison de 6 naissances par portées nous estimons pouvoir obtenir d'après les rapports Mendélien 12 souris par sexe et par génotype. Il s'agit là d'un chiffre théorique qui nous permettra d'obtenir les 7 animaux minimum par sexe recommandés par le guide européen.En ce qui concerne la génération de la colonie, notre stratégie de croisement permet de limiter le nombre d’animaux produit. Nous attendons à ce que 50 % des souriceaux présentent la délétion pour notre gène d’intérêt contre seulement 25 % avec des croisements classiques.
Raffinement
Ce projet a pour objectif d’évaluer le bien-être des individus générés suite à la création d’une nouvelle lignée. Cette évaluation portera sur les individus issus de deux générations de la mise en place de la colonie. Il s’agit dans un premier temps de faire un suivi non invasif des souris basé sur l’observation pour détecter un éventuel phénotype dommageable. Cette surveillance sera quotidienne. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation. Des points limites précoces seront mis en place. Si les animaux présentent des signes de souffrance alors ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de la pathologie décrits à ce jour ont été réalisés chez la souris. Ce modèle murin est donc devenu la référence incontournable dans notre domaine de recherche, car il permet non seulement d’établir des comparaisons avec les données existantes dans la littérature, mais aussi de réduire le nombre de souris en évitant la répétition d’expériences déjà publiées et donc pouvant être considérées comme inutiles sur le plan éthique. Notre demande porte sur un stade de développement crucial, la naissance, jusqu'à l'âge adulte.
Étude des altérations précoces de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de la trisomie 21
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour prélever leur cerveau, ou tuées faute de pouvoir être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique, 1 085 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un dixième d'entre elles développe une accumulation de liquide dans le cerveau, et toutes sont plus petites et plus légères que les souris sans cette modification. Elles subissent une biopsie de tissu pour génotypage sur animal éveillé, une injection de traceur fluorescent sous anesthésie brève et, pour une partie, un prélèvement sanguin. Le porteur retient la souris parce que son génome est modifiable et que la barrière cérébrale y est complète dès la troisième semaine, et fixe l'examen à un et trois mois, avant l'apparition des signes de vieillissement.
Objectifs
Le syndrome de Down, aussi appelé trisomie 21, est la cause génétique la plus fréquente de déficience intellectuelle. Il est dû à la présence d’un chromosome 21 supplémentaire, en totalité ou en partie. Les personnes porteuses de trisomie 21 présentent également un risque très élevé de développer une maladie d’Alzheimer précoce. Le cerveau est protégé par une barrière naturelle appelée barrière hémato-encéphalique. Cette barrière agit comme un filtre très sélectif : elle contrôle strictement ce qui peut passer du sang vers le cerveau afin de maintenir son bon fonctionnement. Elle est formée par différents types de cellules qui travaillent ensemble au sein d’une structure appelée unité neurovasculaire. Lorsque cette barrière est endommagée, des substances normalement exclues du cerveau peuvent y pénétrer, ce qui peut perturber son fonctionnement. Une altération de cette barrière est observée dans de nombreuses maladies neurologiques, notamment la maladie d’Alzheimer. Des travaux récents suggèrent que la barrière hémato-encéphalique pourrait également être fragilisée chez les personnes atteintes de trisomie 21 et de maladie d’Alzheimer. Cependant, on ne sait pas encore si ces altérations apparaissent très tôt au cours de la vie en raison de la trisomie elle-même, ou si elles sont une conséquence plus tardive des mécanismes liés à la maladie d’Alzheimer. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre ce phénomène en étudiant si la barrière hémato-encéphalique est déjà altérée dès les premières étapes de la vie dans la trisomie 21. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiées reproduisant les principales caractéristiques génétiques de la trisomie 21. Grâce à des méthodes complémentaires bien établies, nous chercherons à déterminer si la barrière protectrice du cerveau laisse passer des molécules anormalement et à identifier les changements affectant les cellules qui assurent son bon fonctionnement.
Bénéfices attendus
Jusqu’à présent, la recherche sur la barrière protectrice du cerveau dans la trisomie 21 s’est surtout intéressée aux périodes tardives de la vie, lorsque les lésions caractéristiques de la maladie d’Alzheimer sont déjà bien installées. En revanche, ce qui se passe très tôt dans la vie, bien avant l’apparition de ces lésions, reste largement méconnu. Cette absence de données rend difficile la compréhension de ce qui déclenche réellement la maladie, par opposition à ce qui en est une conséquence. Dans la trisomie 21, plusieurs facteurs liés à la présence d’un chromosome supplémentaire, comme une inflammation chronique, des perturbations du métabolisme ou des réactions immunitaires anormales, pourraient fragiliser dès le plus jeune âge la barrière qui protège le cerveau. Une telle fragilité précoce pourrait, à long terme, favoriser l’apparition de troubles neurologiques. Malgré l’hypothèse largement admise selon laquelle un dysfonctionnement de cette barrière pourrait jouer un rôle clé dans l’apparition précoce et l’évolution rapide de la maladie d’Alzheimer chez les personnes atteintes de trisomie 21, aucune étude n’a jusqu’à présent examiné de manière approfondie l’état de cette barrière dans des modèles animaux représentatifs de la trisomie 21. Ce projet est donc le premier à s’intéresser à l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dès le début de la vie dans un modèle de souris de la trisomie 21. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc, à court terme, de pouvoir révéler un potentiel problème jusqu’ici insoupçonné dans la circulation sanguine du cerveau et ainsi ouvrir la voie à de nouvelles recherches pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie. A plus long terme, cela pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou de traitement.
Procédures
Pour identifier les souris porteuses de la modification génétique d’intérêt, un très petit prélèvement de tissu sera réalisé pour tous les animaux (une seule fois, d’une durée inférieure à une minute, animal vigile). En cas de problème technique rare, un second prélèvement pourrait être effectué chez ces mêmes animaux, à l’âge adulte et à l’état éveillé, également d’une durée inférieure à une minute et réalisé une seule fois. Une partie des animaux recevra une injection d’une molécule permettant de vérifier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, elle sera effectuée sous anesthésie générale de très courte durée (une seule injection d’une durée inférieure à 1 minute, durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes). Une partie des souris aura également un seul prélèvement sanguin (durée inférieure à cinq minutes, animal vigile).
Impact sur les animaux
La biopsie pour identifier le patrimoine génétique des animaux peut causer une douleur passagère et un petit risque de saignement. Les souris utilisées dans cette étude présentent une modification génétique spécifique et, dans 10 pourcents des cas, une accumulation de liquide dans le cerveau, appelée hydrocéphalie. Ces souris sont aussi plus petites et plus légères que les souris ne présentant pas cette modification génétique. Lors des manipulations nécessaires aux injections et aux prélèvements, les souris peuvent ressentir un stress léger et passager. Une douleur brève peut également être ressentie au moment de la piqûre. Les injections peuvent entraîner un inconfort temporaire et un faible risque de saignement. Dans de rares cas, une irritation ou une atteinte de l’œil peut survenir. Les animaux seront sous anesthésie générale pour l’injection, celle-ci peut entraîner quelques effets secondaires, comme une légère baisse de la température corporelle, une sécheresse des yeux, et dans de très rares cas, des problèmes respiratoires ou cardiaques. Toutefois, cette anesthésie générale sera très courte et présente donc des risques moins importants. Les prélèvements de sang peuvent occasionnellement provoquer un saignement persistant.
Devenir
Une partie des souris utilisées seront euthanasiées afin de prélever puis analyser des cerveaux dans le but de répondre à notre question scientifique. Toutes les autres souris seront euthanasiées car elles ne pourront pas être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Il n'existe malheureusement pas d'alternative à l'utilisation d'animaux pour ces recherches. Pour étudier comment le cerveau est protégé et comprendre quand cette protection devient défaillante, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris. La barrière qui protège le cerveau ne dépend pas d’un seul type de cellule, mais du travail coordonné de plusieurs cellules différentes (cellules des vaisseaux sanguins, cellules de soutien, neurones et cellules immunitaires). Ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites de façon fiable en laboratoire à partir de cellules isolées. L’injection de substances fluorescentes de tailles différentes permet de vérifier si cette barrière joue correctement son rôle de filtre. En observant si ces substances restent dans les vaisseaux sanguins ou si elles passent anormalement dans le tissu cérébral, il est possible de déterminer si la barrière est fragilisée et dans quelle mesure. Après ces injections, l’analyse du cerveau est indispensable pour visualiser précisément où ces substances se sont accumulées et pour étudier les changements affectant les cellules qui composent les vaisseaux du cerveau. Ces observations sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles de la barrière protectrice du cerveau et, à terme, pour améliorer la prévention et le traitement des maladies neurologiques.
Réduction
Sur une période de quatre ans, ce projet utilisera au maximum 1085 souris. Ce nombre a été soigneusement calculé afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Les souris utilisées seront élevées au sein du laboratoire tout au long du projet. L’élevage sera géré de façon raisonnée, avec pour objectif de ne produire que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Tous les paramètres ont été pris en compte, comme la proportion de souris réellement porteuses du gène étudié, la nécessité d’obtenir autant de mâles que de femelles, ou encore les difficultés de reproduction propres à cette lignée. Dans nos lots expérimentaux nous inclurons des souris mâles et femelles, ainsi que des animaux jeunes et adultes, afin de tenir compte des différences naturelles liées à l’âge et au sexe. Nous avons défini qu’il nous faudrait des groupes de 15 à 20 animaux, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables sans multiplier inutilement le nombre de souris. Les résultats que nous obtiendrons seront ensuite analysés avec les tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris seront élevées et hébergées dans des conditions strictement conformes à la réglementation. Les animaux provenant d’un élevage extérieur disposeront d’une semaine d’adaptation après leur arrivée avant d’être utilisés pour la reproduction. Les souris auront accès librement à l’eau et à la nourriture. Elles vivront également dans un environnement adapté à leur bien-être, avec du matériel pour faire un nid, ronger et se cacher. Elles seront observées quotidiennement et, au moindre signe anormal, l’équipe de recherche, la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire seront immédiatement informés afin d’assurer une prise en charge rapide et appropriée. Des mesures préventives seront mises en place pour réduire tout impact des procédures expérimentales sur les animaux. Cela comprend la formation du personnel, la surveillance constante des animaux, et des méthodes pour les habituer à la manipulation avant les expériences. Pour identifier les souris nécessaires à l’étude, un très petit prélèvement est réalisé chez des animaux très jeunes. Ce geste est conçu pour être le moins invasif possible et permettre une cicatrisation rapide. Les souris sont surveillées juste après le prélèvement, puis un peu plus tard, afin de s’assurer de leur bon état. Le choix d’utiliser uniquement des mâles porteurs des modifications génétique d’intérêt comme reproducteurs permet à la fois de faciliter la prise en charge des portées par les mères et de limiter le nombre d’animaux présentant des fragilités liées à leur génétique. Afin de réduire au maximum le stress et toute douleur lors des injections, les souris sont placées sous anesthésie générale de courte durée. Pendant toute la procédure, leur état est étroitement surveillé. Des mesures simples seront mises en place pour assurer le confort des animaux, comme le maintien de leur température corporelle et l’application d’un gel protecteur sur les yeux afin d’éviter leur dessèchement et de limiter les irritations après l’injection. Après l’intervention, les animaux sont surveillés attentivement pendant leur réveil dans un environnement chauffé.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus adapté pour étudier le syndrome de Down et ses effets sur le cerveau. En effet, la souris est un modèle bien connu et largement utilisé pour modéliser les pathologies humaines. Notamment, son génome est parfaitement connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Ainsi un modèle de souris génétiquement modifiées possède une copie supplémentaire d’une grande partie des gènes du chromosome correspondant au chromosome humain 21, et il reproduit plusieurs caractéristiques importantes du syndrome de Down. Cette lignée de souris permet d’étudier très tôt dans la vie l’intégrité et la perméabilité de la barrière qui protège le cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique, ainsi que les modifications des vaisseaux sanguins et l’inflammation dans le cerveau. Chez les souris, cette barrière cérébrale est pleinement développée dès la troisième semaine après la naissance. Les signes liés au vieillissement ou à la maladie d’Alzheimer, comme la perte de certaines protéines et de neurones, ou l’accumulation de molécules toxiques dans le cerveau, n’apparaissent qu’après neuf mois. C’est pourquoi nous étudierons les souris génétiquement modifiées à 1 et 3 mois. Cette approche nous permettra de savoir si les premières altérations de la barrière cérébrale apparaissent avant les autres signes caractéristiques de la maladie, et de déterminer si ces changements vasculaires et au niveau de la barrière peuvent servir de marqueurs précoces du syndrome de Down. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre leur modification génétique très tôt.