Souris
Evaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle murin du Syndrome de l’X Fragile (2023-E-023).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation modélisant le syndrome de l'X fragile, elles reçoivent un composé dans l'eau de boisson pendant huit jours, puis sont tuées pour prélever le cerveau et enregistrer l'activité électrique sur des coupes, afin de tester si ce composé calme l'hyperexcitabilité du cortex. Le porteur indique que ces souris ne montrent pas d'altération du comportement à l'âge utilisé et que le composé n'a pas provoqué d'effet indésirable. Sur le remplacement, il affirme qu'étudier l'activité neuronale dans le cerveau entier est "indispensable" et ne peut se faire sur des cultures cellulaires.
Objectifs
Le syndrome de l’X fragile (SXF) est une maladie génétique qui provoque des problèmes intellectuels et touche environ 10 000 personnes en France. Cela est dû à une mutation dans un gène qui empêche la production d'une protéine essentielle pour le fonctionnement normal des cellules nerveuses dans le cerveau. Ce dysfonctionnement des cellules nerveuses entraîne des problèmes d'excitabilité dans le cerveau, plus particulièrement dans une région appelée cortex. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour cette maladie héréditaire. Les traitements existants ne font que soulager certains symptômes, mais ne guérissent pas la maladie. C'est pourquoi il est très important de rechercher de nouveaux traitements qui pourraient changer le cours de la maladie. Une approche potentielle pour traiter le SXF serait de trouver un traitement qui pourrait réduire cette hyperexcitabilité dans le cerveau. L'objectif de ce projet est de tester l'effet d'un composé administré dans l'eau de boisson sur l'hyperactivité du cortex observée dans un modèle de souris atteintes de SXF. En d'autres termes, nous allons étudier si ce composé peut aider à calmer l'excitabilité excessive dans le cerveau de ces souris pour améliorer leur état.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les dysfonctionnements des cellules neuronales observés dans le SXF, forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire, et notamment les mécanismes responsables de l’hyperexcitabilité au niveau du cortex cérébral, et de tester l'effet d'un candidat médicament sur cette hyperexcitabilité, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter cette pathologie.
Procédures
Administration d'un composé dans l'eau de boisson pendant 8 jours. Euthanasie : Administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie de la souris par inhalation d'un anesthésique (maximum 5 minutes), prélevement du cerveau (2 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris modèles du SXF que nous utilisons ne présente pas d’altération de leur comportement à l’âge utilisé. Le composé étudié n’induit aucun effet indésirable après 8 jours d’administration dans l’eau de boisson.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.
Remplacement
Les expériences in vivo, en utilisant des modèles animaux, permettent d'étudier le fonctionnement des neurones dans leur contexte naturel, c'est-à-dire à l'intérieur du cerveau entier. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour étudier l'activité éléctrique neuronale des différentes régions du cerveau et le bénéfice de certains traitements sur ces modifications d'activité neuronale envisagés dans ce projet. Ces approches expérimentales ne peuvent pas être remplacées par des méthodes substitutives type approche in sillico / in vitro ou culture cellulaire ... L'utilisation du modèle souris nous permet de mimer la physiologie et la pathologie humaine et de corréler les modifications anatomiques et physiologiques observées in vivo à des déficits.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.
Raffinement
Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Une observation des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés). Pendant la période d’administration du composé dans l’eau de boisson (8 jours), un contrôle renforcé selon la fiche de suivi sera réalisé à minima 3 fois, afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits du SXF, un modèle de souris de cette maladie nous permettra d’étudier l’effet d’un traitement sur les dysfonctionnements neuronaux observés dans le SXF. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, de 6 semaines à 15 semaines. En effet, des études préliminaires réalisées par notre client ont montré une efficacité du composé testé sur un autre modèle de souris malades à l’âge adulte.
Etude des caractéristiques pharmacocinétiques des composés d’intérêts administrés par voie intra-veineuse, voie intrapéritonéale ou voie orale en dose unique chez le rat ou chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 780
1 560 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit une administration unique d'un composé par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse, subit jusqu'à deux prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, puis est tué et exsanguiné par perfusion intracardiaque, pour mesurer le devenir des molécules dans l'organisme avant leur passage vers des programmes ciblés. Le porteur décrit un projet "généraliste" en amont, servant de filtre de sélection des molécules, et estime les nuisances faibles hormis une éventuelle toxicité aiguë. Sur le remplacement, il concède que des tests in vitro miment la métabolisation hépatique mais conclut que le modèle animal est "incontournable" pour la pharmacocinétique.
Objectifs
Les propriétés physico-chimiques des composés étudiés leur confèrent des propriétés pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo. Pour étudier l’efficacité pharmacologique des molécules dans un modèle donné ou dans une pathologie précise, il est nécessaire de savoir comment la molécule se comporte une fois administrée à un organisme vivant. C'est-à-dire quelle sera son impact et son devenir dans un organisme dans lequel elle est administrée. Le projet décrit ici a donc pour objectif de détailler des procédures de pharmacocinétiques expérimentales préalables au développement des molécules innovantes dans diverses pathologies. Pour être efficaces, les molécules doivent pouvoir atteindre leur cible, une fois administrées, car les molécules subissent une métabolisation ou une dégradation puis une élimination, la voie d’administration sera donc aussi un facteur essentiel sur la biodisponibilité de la molécule dans l’organisme. Ce projet « généraliste » se place donc en amont de nos programmes de recherches spécifiquement dédiés à une pathologie, il est composé de procédures expérimentales standardisée (voies IP, IV ou PO chez rats et souris) pour les études des caractéristiques PK (pharmaco kinetic en anglais) des molécules qui viendront alimenter les programmes de recherches avals. Ces procédures préalables nécessitent peu d’animaux au regard de l’ambition des programmes menés, ils permettent d’ajouter un filtre supplémentaire dans notre arbre de sélection des nouvelles molécules qui seront destinées aux études d’efficacité chez l’animal. L’ensemble des procédures décrites dans ce projet appliquées à des souris et des rats nécessitera l’emploi de 1560 animaux pour la durée de 5 années que couvre ce projet.
Bénéfices attendus
Ces études préalables aux études d’évaluation de l’efficacité des composés dans les modèles développés dans une pathologie données, permettent de déterminer les conditions optimales d’administration des principes actifs étudiés. Cela peut donc contribuer à obtenir des modèles plus qualitatifs (conditions optimales) et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés (moins de répétitions d’étude).
Procédures
Chaque animal inclus dans les procédures 1 à 4 subira une seule administration, selon les cas elle pourra être réalisée par voie intraveineuse (IV), Intrapéritonéale (IP) ou per-os (gavage intragastrique PO). Les injections IP et IV durent 10 à 15 secondes et peuvent nécessiter l’emploi d’un dispositif de contention lorsque les IV sont faites dans la veine caudale ou au sinus retro-orbitaire. Les administrations PO durent 5 à 10 seconde et sont pratiquées sur un animal maintenu en contention manuelle. • Les procédures 1 et 2 concernent les PK plasmatiques, chaque animal inclus dans ces procédures subira au maximum 2 prélèvements sanguins, ils sont pratiqués sous anesthésie volatile par une ponction au sinus retro-orbitaire faite par un capillaire en verre. Chaque prélèvement dure environ 20 seconde. •Les procédures 3 et 4 concernent les PK plasmatiques et tissulaire, chaque animal inclus dans ces procédures subira un prélèvement sanguin unique (terminal) réalisé sous anesthésie volatile (durée 20 secondes) par une ponction au sinus retro-orbitaire faite par un capillaire en verre. L’anesthésie volatile sera maintenue afin de procéder à l’euthanasie puis à l’exsanguination rapide par une perfusion intracardiaque (durée 30-40 secondes) d’une solution physiologique héparinée.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont produites par les administrations des composés, et sont estimés faibles ou modérées et uniquement produites lors des administrations par voie intraveineuse (au sinus retro-orbitaire) pour lesquelles le recours à l'analgésie est prévue. Les prélèvements sont effectués sous anesthésie et ne produisent pas d'inconfort autre que celui de l'état de l'animal au sortir de son anesthésie. On ne peut pas occulter l’éventualité d’une toxicité aigue post administration du composé étudié mais comme les produits utilisés ne sont administrés qu’une seule fois et qu’ils sont dosés faiblement, , la probabilité d’observation de signes clinique est très minime, mais permettrait les cas échéant de juger de la sévérité de la souffrance et de l’atteinte de points limites qui déclenchent un arrêt anticipé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédures expérimentale. Dans le cas des procédures 1 et 2, bien que nous n'étudions que l'exposition plasmatique, nous mettrons les animaux à mort car il ne peuvent en aucune mesure être employés dans d'autres études ( ils ne sont plus naifs et ont pu stocker des quantités de composés ou de ses métabolites). Dans les cas des procédures 3 et 4, ils sont mis à mort au temps de cinétiques indiqués pour les mesures d'exposition des composés dans les organes clés du métabolisme (foie, reins, etc )
Remplacement
L'objectif principal est d'évaluer la pharmacocinétique de nos molécules suite à une administration per os qui est la voie la plus utilisée dans la Pharmacopée. Cette voie d’administration impose aux molécules un 1er passage entérohépatique lors duquel se déroulent de nombreuses modifications chimiques, même si des tests de stabilité mimant l’action des cytochromes peuvent être appréhendés in vitro, le modèle animal est incontournable pour la réalisation des études de pharmacocinétiques. D’autres voies d’administration systémique (intraveineuse ou intrapéritonéale par exemple) vont renseigner sur les paramètres ADME, elles pourront aussi être utilisées. Ces études seront menées sur animaux sains ou sur des animaux dans un état pathologique induit expérimentalement, en effet la pharamcocinétique des produits peut être modifée dans ces circonstances.
Réduction
Les méthodes analytiques sont performantes, de faibles quantités sont décelables de minière reproductibles, cela permet de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à ces études de pharmacocinétique.
Raffinement
Le point sur lequel l'expérimentateur peut agir concerne le raffinement au moment des administrations et prélèvements au cours desquels on apporte un confort par l'utilisation d'analgésique ou de moyens anesthésiques s'ils est avéré qu'ils n'induisent pas un biais expérimental.
Choix des espèces
Les rats et les souris constituent des modèles reconnus dans la littérature scientifique pour l’étude pharmacocinétique de molécules. Les animaux utilisés seront des animaux jeunes rats adultes à adultes ( 175-200gr minimum) ou des souris adulte de 25-30 gr , il ne sera pratiqué aucune expérience sur des animaux nouveaux-nés.
Modèles précliniques de gliome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de glioblastome sont implantées dans leur cerveau, suivies de résection chirurgicale, d'irradiation, d'imagerie IRM et de tests comportementaux de dépression, d'anxiété, de motricité et de mémoire, pour reproduire la prise en charge des patients et évaluer de nouveaux traitements. Le porteur indique que la tumeur peut entraîner perte d'appétit, posture anormale, isolement, troubles de l'équilibre et de l'orientation, les manipulations répétées ajoutant du stress. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un glioblastome et que l'animal reste le seul moyen de mener ce projet.
Objectifs
Les traitements pour les patients souffrant de glioblastome (GBM) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ)). Lors d'une étude précédente nous avons mis en place un modèle animal qui récapitule la prise en charge du patient ce qui rend la validation de nouvelles approches thérapeutiques très pertinentes. Ce nouveau modèle nous ouvre maintenant de nombreuses perspectives afin d'utiliser ce modèle dans des applications précliniques originales. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin immunocompétent ou immunodéprimé afin d’y implanter des cellules tumorales de souris (modèle syngénique) ou humaines, pour reproduire au mieux les conditions de formation de ces tumeurs chez l’homme. Les animaux sont produits à cet effet dans une structure agréée qui tient compte de l’éthique animale et assure l’élevage et le suivi quotidien des animaux dans les meilleures conditions de bien-être conformément à la législation et la règle des 3R. De notre côté nous veillons à bien définir le projet et sa pertinence comme le stipule la règle des 3R. En effet avant de réaliser les procédures des études de préliminaires seront réalisées afin de remplacer chaque fois que cela est possible le modèle in vivo par des modèles in vitro. A ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable puisqu’aucun modèle suffisamment précis n’est disponible pour étudier le glioblastome et sa réponse aux traitements. L’efficacité d’un nouveau traitement passe nécessairement par ces études in vivo et l’intérêt d’avoir un modèle, à ce jour jamais réalisé, reproductible et mimant toutes les phases d’une radio-chimiothérapie pour l’homme est essentiel pour bien appréhender
Bénéfices attendus
Les glioblastomes sont responsables de nombreux décès, à ce jour une résection de tumeurs avec un traitement adapté permet une survie des patients de 6.9 à 14.6 mois. L’objectif est donc de prolonger ces délais mais aussi et surtout améliorer le confort des patients. A ce jour les traitements pour les patients souffrants (GB) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ). La validation d’un inhibiteur passant la barrière hématoencéphalique et potentialisant la combinaison radio- et chimiothérapie et ceux en diminuant les doses de TMZ ont pour objectif d’améliorer la survie mais aussi le confort de vie des patients..
Procédures
Implantation tumorale 10 minutes. La résection tumorale 15 minutes. L'imagerie IRM 40 min. L'irradiation 2min. La bioluminescnce 2 min. Pour les testx comportementaux les tests de dépression de 4 à 20 min une fois par semaine, les tests de l'anxiété 5 min 1 fois par semaine , les tests de la motricité de 1 à 4 min 1 à 3 fois par semaine et les tests de la mémoire et de l'anxiété 10 min 1 fois par semaine.
Impact sur les animaux
Les souris seront surveillées quant à leur comportement et aux signes indicateurs de croissance tumorale pouvant générer une perte de l’alimentation une posture anormale, un manque de toilettage et un isolement social et seront pesées quotidiennement à partir de l'apparition des premiers signes cliniques. Les tests de comportements vont permetre de déceller des des symptomes tels que une perte de l'équilibre et des troubles de l'orientation mais aussi provooquer du stress suite à de nombreuses manipulations.
Devenir
A la fin de l'étude nous prélevons les cerveaux pour des analyses immuohistologiques
Remplacement
Il est impossible d’évaluer l’effet thérapeutique d'anticorps sur un modèle in vitro ou in silico. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité d'un glioblastome, et seul le modèle animal permet de conduire ce projet. Les souris sont des animaux très adaptés à ce travail avec une littérature validant ce choix.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Pour ces études les tests statistiques non paramétriques seront utilisés en cohérence avec le nombre de groupes analysés et d'animaux. Au total 800 souris maximum seront nécessaires pour cette étude.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux sera instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Pour cela des soins pré-, per- et postopératoires adéquats seront réalisés. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques sont systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle syngénique (souris C57BL/6rJR ) et un modèle immunodéprimé pour les glioblastomes humains. L’utilisation de ces modèles va nous aider à mieux appréhender la croissance tumorale et surtout avoir un modèle animale très proche des procédures effectuées chez les patients. Les cellules utilisées nous permettent de contrôler la croissance tumorale par bioluminescence ou par IRM. Nous utiliserons des souris de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines dans un modèle immunocompétent ou immunodéprimé, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.
Rôle du récepteur nucléaire CAR comme senseur hépatiques des fibres alimentaires dans les maladies métaboliques du foie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour invalider le gène CAR, elles sont soumises trente semaines à un régime gras qui induit obésité et foie gras, avec gavages oraux, tests de tolérance au glucose et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal d'organes, pour étudier le rôle des fibres alimentaires et du microbiote dans les maladies du foie. Le porteur affirme que le régime provoque ces désordres "sans souffrance visible", et signale que le gavage peut stresser les animaux et irriter l'œsophage. Sur le remplacement, il décrit un dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux qu'aucun modèle cellulaire ne reproduirait, et conclut au recours à l'animal "entier".
Objectifs
Le syndrome métabolique affecte actuellement 18% de la population française. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de lipides dans celui-ci puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la 2ème cause de transplantation de foie et aucun médicament contre ces maladies n'a été approuvé. De plus, des études ont démontré que l’augmentation de la température d’hébergement des animaux, associée à un régime gras permettait d’induire le développement d’une maladie du foie plus sévère. Par ailleurs, le microbiote intestinal est impliqué dans le développement de cette maladie en produisant des petites molécules qui circulent entre l’intestin et le foie via la veine porte et qui peuvent favoriser le développement de l’inflammation dans le foie. Les fibres alimentaires (dont l’inuline) peuvent être transformées par le microbiote intestinal et ont des effets bénéfiques sur ces maladies hépatiques. Les effets de l’inuline sont dépendants des petites molécules produites par le microbiote intestinal, cependant ces molécules et les mécanismes en jeu dans le foie sont peu connus. Nos résultats préliminaires démontrent que les fibres alimentaires ont également un impact sur une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor) connue pour être impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact des fibres sur le développement des maladies hépatiques via la production de molécules microbiennes, ainsi que la fonction du récepteur CAR dans cet axe microbiote intestinal-foie. Ainsi, pour cette étude, nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été invalidé et qui seront nourries avec un régime gras induisant une maladie hépatique similaire à celle observée chez l’Homme. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement de la NAFLD mais également dans l’expression du récepteur CAR, donc nos études seront effectuées dans les 2 sexes.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact des fibres alimentaires fermentescibles sur le développement des maladies hépatiques et via la production de molécules microbiennes et leur impact sur le récepteur CAR. L’identification de molécules issues du microbiote intestinal et ayant des effets bénéfiques ou délétères sur le foie permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques hépatiques et aidera potentiellement au développement de futurs agents thérapeutiques issus du microbiote intestinal (pro-, pré- ou post-biotiques) dans ces pathologies.
Procédures
Après les 2 semaines d’acclimatation, les animaux seront placés sous régime Western Diet (WD). Au cours des 30 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests de tolérance orale au glucose (semaine 14 et 28) et 2 tests de mesure de la perméabilité intestinale in vivo qui nécessiteront un gavage oral puis un prélèvement d’un ou 2 gouttes de sang à la queue. Le gavage oral sera réalisé après une contention rapide de l'animal puis un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée. Le geste de contention et de gavage durera moins d'une minute par animal. Les prélèvements sanguins à la queue seront réalisés après application d'un analgésique local sur la queue puis une incision légère de celle-ci sera réalisée. Le geste de prélèvement sanguin durera moins d'une minute par animal et nécessitera un maintien uniquement de la queue. Après 30 semaines de régime, nous procéderons à un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le régime WD induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Lors du test de tolérance orale au glucose et de la mesure de la perméabilité intestinale in vivo, le gavage oral peut provoquer un stress lié à la contention et des irritations de l’œsophage. Le prélèvement sanguin à la queue peut parfois induire un changement comportemental chez les souris mâles qui nécessitera une surveillance accrue des animaux afin d’éviter l’agressivité.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. Différents organes (foie, intestin, …) seront prélevés afin d’approfondir les connaissances sur l’impact des fibres sur le développement des maladies hépatiques via la production de molécules microbiennes, ainsi que la fonction du récepteur CAR dans cet axe microbiote intestinal-foie.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme cardiaque, respiratoire et de la nature de ceux-ci) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris (C57Bl6J) soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition des maladies hépatiques. De plus, nous souhaitons étudier le rôle hépatique du récepteur CAR dans les pathologies hépatiques, ainsi nous utiliserons un modèle murin C57Bl6J déficient pour le récepteur CAR au niveau systémique. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression le récepteur CAR.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et de leur effet vasoconstricteur par imagerie laser doppler dans un modèle murin de rosacée
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 80
600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des inducteurs de rosacée sont injectés de façon répétée pour provoquer une inflammation cutanée, puis les animaux reçoivent des traitements quotidiens par voie orale, cutanée ou injectée, avec imagerie, mesures de l'épaisseur des oreilles et du dos et prélèvement sanguin terminal, pour tester de nouvelles molécules contre cette maladie de peau du visage. Le porteur reconnaît que la rosacée est "sans gravité" mais insiste sur son retentissement psychologique, et décrit une inflammation locale "transitoire" ainsi qu'un possible dessèchement de la peau. Il écarte le remplacement au motif qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la peau comme tissu vivant, alors que le bénéfice reste conditionné à ce qu'une molécule "se révèle efficace".
Objectifs
La rosacée touche 2 à 3 % de la population adulte, majoritairement des personnes âgées de 30 à 60 ans et atteint deux fois plus les femmes que les hommes. La rosacée est une maladie cutanée chronique caractérisée par une atteinte des petits vaisseaux sanguins du visage. Cette maladie de la peau touche essentiellement la partie centrale du visage (front, nez, joues, menton). Elle se manifeste par des rougeurs du visage occasionnelles ou persistantes ; de la couperose (dilatation anormale et permanente de petits vaisseaux sanguins de la peau, visibles à l'œil nu) ; et éventuellement, diverses lésions cutanées comme des papules, des pustules...Bien que sans gravité, la rosacée peut avoir un fort retentissement psychologique en raison de la visibilité des lésions du visage. Il est indispensable de tester ces molécules dans un modèle murin pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la rosacée afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.
Bénéfices attendus
La rosacée est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints de rosacée de guérir de la rosacée et de son érythème, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.
Procédures
Des traitements seront administrés quotidiennement aux animaux par voie orale, topique, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse afin d'évaluer leur efficacité dans le cadre de la rosacée (durée d'intervention
Impact sur les animaux
L'injection répétée des inducteurs de la rosacée induit de l'inflammation locale, mais très transitoire chez l'animal, du fait de l'injection en elle-même et du produit injecté. Il est possible également que les molécules testées par voie topique puissent assécher localement de façon excessive la peau des oreilles. Si tel était le cas, les fréquences de traitement seraient espacées (dans le cas de traitement de 1 à 2 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures car ils ne pourront pas être réutilisés du fait du prélèvement des tissus chez ces derniers.
Remplacement
Nous n'utiliserons le modèle animal de rosacée qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).
Réduction
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA ; seuil de significativité alpha de 5 % dont le critère principal sera l'épaisseur des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Le nombre d’animaux sera de 8 par groupe (groupe d’animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester et le traitement thérapeutique de référence commercialisé). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15 %, une puissance de 70 %, et une différence à souligner de 20 % entre groupes témoins et tests. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du meme animal. Cette approche permet donc de réduire le nombre d’animaux de 50 % au moins comparé à une technique telle que l'histologie qui aurait nécessité le sacrifice des animaux à différents temps.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63/UE). Nous veillerons à ce que chaque cage d'hébergement bénéficie d'un enrichissement adapté (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, l'utilisation de points limites adaptés et établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement sera mise en place ainsi que l'utilisation d'un arbre décisionnel et des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris / rat) sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. Ainsi il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entres ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faible coûts, cycle de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de préciser que les molécules actuellement utilisées en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines, nous permettant ainsi d’avoir un point de comparaison par rapport aux résultats issus de la littérature relative à ce modèle.
Etablissement d’un modèle de défaillance hépatique aigue induit par un stress oxydatif et une inflammation. Evaluation de propriétés de composés actifs dans ce modèle expérimental.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1380
2 760 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 2 400 étant classés en gravité sévère. Après un jeûne nocturne, ils reçoivent trois injections en trois jours, de pyrazole imitant une alcoolisation massive et de lipopolysaccharide, pour provoquer une défaillance hépatique aiguë, puis sont tués pour prélever foie, cerveau et reins. Le porteur indique attendre baisse d'activité, baisse de température et signes de douleur après les injections. Il présente le modèle comme un outil d'évaluation rapide de composés pour un "programme de développement pharmaceutique" et justifie le choix des espèces en une seule phrase.
Objectifs
La cirrhose est une maladie irréversible du foie caractérisée par un état inflammatoire continue de l’organe qui use les cellules, perturbe le fonctionnement des cellules et entraine leur destruction. La défaillance hépatique aigue ou acute-on-chronic liver failure (ACLF) est un syndrome fulminant qui évolue rapidement vers une défaillance de multiples organes et qui survient de manière aiguë, généralement en raison d'événements précipitants de différentes natures, tels qu’un épisode infectieux, une affection virale ou une prise excessive d’alcool ou de médicaments. Lors de phase aigüe d’aggravation, il se produit un emballement de la réaction immunitaire et inflammatoire déterminante pour la survie des patients cirrhotiques dont le foie fragilisé n’est pas armé pour lutter contre cette agression. L’alcool est principalement métabolisé dans le foie, il produit un stress oxydant pour les cellules et les tissus par une forte production de composé toxiques oxydants et une diminution des moyens de défense naturelle antioxydante. L’alcool et certain produit toxique et aussi des médicaments sont pris en charge dans le foie par les mêmes mécanismes de détoxification. Le pyrazole fait partie de ces produits qui sont métabolisés par les mêmes voies que l’alcool, et son utilisation permet de développer des modèles expérimentaux animaux qui miment le phénomène de « binge drinking ou alcoolisation massive rapide » qui est un facteur déclenchant de la défaillance hépatique aigue. En associant chez un animal sain, l’utilisation du pyrazole à l’origine d’un stress oxydatif à celle d’un agent pro-inflammatoire similaire à celui qui est naturellement présent sur les bactéries et qui infecte les patients, nous reproduisons in vivo 2 conditions importantes dans le mécanisme de survenue de la défaillance hépatique. Nous développerons ce modèle chez les rongeurs dans l’optique de disposer d’un modèle d’évaluation rapide des propriétés de composés destinés à poursuivre un programme de développement pharmaceutique dans cette indication de décompensation cirrhotique.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes de défaillance hépatique aigue, notamment chez le patient cirrhotique, il est nécessaire que la prise en charge intervienne le plus précocement pour sauvegarder au maximum la fonction hépatique, ce qui peut se révéler être vital lors d’une récidive. Le stress oxydant est un des mécanismes qui entraine la mort cellulaire, il est donc essentiel de le limiter de manière à préserver le capital hépatocytaire qui subsiste après une défaillance hépatique. L’identification de composés et la mise en place de solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Au cours des procédures décrites dans ce dossier nous procèderons à différents geste ou acte sur les animaux qui peuvent avoir une action négative sur leur comportement, leur confort ou stress, il s’agit de mise à jeun, injections, et prélèvements La mise à jeun « over-night » c’est-à-dire au cours d’une nuit complète, qui est la période d’alimentation normale du rongeur. La privation de nourriture est source de stress. Les stimulations des processus pro-oxydatifs et inflammatoires sont réalisés par une injection intrapéritonéale, ces injections au nombre de 3sont faites au cours de 3 jours successifs : 2 fois le pyrazole et une fois le LPS ou TNFa. Elles durent chacune environ 15 secondes. Ceci concerne les procédures 1 et 2. Au cours des procédures d’évaluation des activités de composés, nous réaliserons en plus une administration dudit composé par une injection par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, cette administration sera unique et durera également une quinzaine de secondes. Ceci sera appliqué au cours des procédures 3 et 4 Un prélèvement sanguin intermédiaire pourra être réalisé sur les rats au cours des procédures 2 et 4 , il sera pratiqué sur des rats anesthésiés à l’isoflurane par une ponction à la veine sub-linguale, l’action est unique et dure 15 à 20 seconde. Les prélèvement sanguin terminaux se feront également sous anesthésie générale et précéderont la mise à mort.
Impact sur les animaux
Lors des procédures décrites dans ce projet, les animaux subiront des injections en intra-péritonéales ou intra-veineuses, à la suite desquelles, on s'attend à constater une diminution de l'activité, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la température corporelle ainsi que des signes de douleurs ou d'inconfort tels que fourrures ébourriffées, larmoiements.
Devenir
L'évaluation histologique, biochimique et transcriptomique des organes tels que le foie, le cerveau et le rein ainsi qu'une évaluation des taux plasmatiques de marqueurs inflammatoires et hépatiques nécessitent la mise à mort des animaux.
Remplacement
Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global».
Réduction
La méthode est majoritairement basée sur l’expérience déjà réalisée et publiée. Dans certaines conditions, à partir de données expérimentales disponibles, la variance des paramètres peut être connue. A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Le test de Welsh permet de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité. Sans cette condition, les effectifs calculés par la méthode de Welsch sont généralement démesurés.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé avec des personnes habilitées, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques afin de raffiner au maximum les procédures. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires, une grille de scoring permettant de quantifier la douleur perçue par l'animal sera établie et des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Compte tenu du fait que la pathologie implique un emballement du système immunitaire et une défaillance multi -organes, il nous est impossible de remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro.
Choix des espèces
Les espèces souris et rats sont décrites dans la littérature comme des espèces en capacité de répondre biologiquement au stimulus par le pyrazole.
Etude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans des modèles murin d’hyperthermie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une hausse de température, elles sont soit contenues et isolées afin d'induire un stress, soit injectées de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation, avec mesure de la température rectale, puis tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur indique que le lipopolysaccharide peut provoquer hypoactivité et perte de poids et que l'isolement dure jusqu'à 72 heures. Il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne permet d'évaluer l'hyperthermie induite par le stress ou l'inflammation.
Objectifs
Les troubles anxieux sont des troubles mentaux multifactoriels avec une étiologie complexe. Selon le DSM-V, les troubles anxieux comprennent le trouble anxieux généralisé, le trouble panique, les phobies et le trouble de stress post-traumatique. Ces troubles ont un impact sévère sur la qualité de vie et les traitements sont inconstamment efficaces et associés à des effets secondaires. Afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur l’hyperthermie, deux modèles animaux seront utilisés. Le premier modèle animal est celui reflétant l’anxiété anticipatrice : l'hyperthermie induite par le stress (SIH). La première utilisation du SIH dans la recherche sur l'anxiété a eu lieu après que l'on ait remarqué que le fait de retirer les souris une par une d'une cage où elles étaient logées en groupe augmentait la température corporelle de la dernière souris par rapport à la première. Par la suite, ce modèle a été affiné en hébergeant individuellement les animaux et la température rectale a été mesurée deux fois à 10 minutes d'intervalle. Cela a permis de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires par expérience. Ainsi, les effets reproductibles du SIH rendent ce modèle très approprié pour le criblage de nouveaux candidats médicaments. Par ailleurs, l’hyperthermie peut être également d’origine infectieuse. Pour cela, un second modèle par injection de Lipopolysaccharide (LPS), qui mime une réaction inflammatoire, sera utilisé. Chez l’homme, l’administration de médicament contre la fièvre (aspirine, paracétamol etc…) va réduire la température corporelle induite par l’infection. Cependant, ces traitements peuvent interagir avec d’autres médicaments. C’est le cas de l’Aspirine avec les anticoagulants et le paracétamol qui, quant à lui, est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Ainsi, ce second modèle d’hyperthermie peut être utile pour le développement de cible thérapeutique pour traiter cette problématique.
Bénéfices attendus
Depuis quelques années, il a été démontré que le stress/anxiété provoquait une hausse de la température corporelle. Ce phénomène est appelé "hyperthermie fonctionnelle". Celle-ci peut entraîner une augmentation de la température corporelle jusqu’à 41°C chez des personnes exposées à d’intenses événements émotionnels (comme par exemple les personnes souffrant d’anxiété généralisée, de trouble panique, de phobies et de troubles de stress post-traumatique). Dans notre premier modèle, la contention de l’animal engendre un stress/anxiété provoquant une augmentation de la température. Ce modèle est donc pertinent pour le développement de molécules contre l’anxiété/stress contrecarrant l’hyperthermie fonctionnelle. Le second modèle concerne l’hyperthermie d’origine infectieuse. Le plus connus et utilisé des traitements de l’hyperthermie chez l’homme est le paracétamol. Son efficacité clinique est variable et il est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Notre second modèle est donc pertinent pour le développement de candidat médicament pour traiter l’hyperthermie induite par une inflammation d’origine infectieuse.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis aux interventions suivantes : (1) Des administrations sont réalisées sur animaux vigiles (moins d'une minute par administration). Les fréquences d'administration dépendent des caractéristiques pharmacologiques des produits (une à deux administrations par jours pendant un mois maximum) - (2) La température rectale est mesurée deux fois à 10 minutes d’intervalle (durée de l’acte moins d’une minute) - (3) La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont réalisés à la fin du test d’hyperthermie (après la seconde prise de température); juste avant la mise à mort de l’animal. Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale profonde (anesthésie gazeuse sous isoflurane 2%). La durée totale pour réaliser ces prélèvements est d’environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables sont : (1) dans le premier modèle, la contention de l'animal engendre un stress chez celui-ci provoquant une augmentation de la température. Dans le second modèle, l’administration de LPS engendre une hyperthermie. Le LPS peut également induire chez la souris une hypoactivité et une baisse de masse corporelle durant les heures qui suivent l’injection. ; (2) Dans les deux modèles d’hyperthermie, les animaux sont logés individuellement durant 72h maximum ; et (3) lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. De par notre expérience, les effets indésirables sont rares car la toxicité des candidats médicaments est généralement testée en amont.
Devenir
Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux sont soumis à la fin de l’expérience (juste après la dernière prise de température) à un prélèvement sanguin et de cerveau.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer l’hyperthermie induite par un stress ou par l’administration de LPS. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d'une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux candidats médicaments, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d'assurer un nombre minimum d'animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Toutes les expériences sont réalisées après une période d’acclimatation de 6 à 10 jours. Les animaux sont hébergés par 5 dans des cages transparentes. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (Physiologie clinique, aspect général, comportement...) est effectuée durant la période d’acclimatation et d’expérimentations.Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) est mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer facilement les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur ces pathologies dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont utiles pour modéliser la base biologique des troubles anxieux, du stress ainsi que l'inflammation. Ils sont donc nécéssaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Dans ce projet, seuls les animaux adultes (entre 6 à 12 semaines au moment du test) seront utilisés car il n'a pas pour objectif d'étudier les effets du candidat médicament sur l'animal à d'autres stades de développement.
Cycle hormonal et déficits de reconnaissance chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
974 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des frottis vaginaux, des tests de mémoire nommés, reconnaissance et association objet-place, des IRM répétées et, pour 114 d'entre elles, une ovariectomie, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur soutient que le phénotype de ces souris n'est pas dommageable et que leurs déficits de mémoire n'affectent pas leur bien-être. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou cellulaire ne reproduit encore les processus cognitifs de façon fiable.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par des pertes de mémoire et par la pathologie tau et la pathologie amyloïde qui sont liées respectivement à des formes de la protéine tau et de la protéine amyloïde anormalement aggrégées dans le cerveau. L’APP est la protéine précurseur du peptide amyloïde. Les modèles rongeurs actuels surexpriment des gènes humains de l’APP avec des mutations rares provoquant la MA (formes familiales) et/ou des gènes mutés de tau qui ne sont pas associés à la MA mais qui provoquent une pathologie tau. La présence de pathologies tau et amyloïde chez ces animaux ont permis des progrès dans la compréhension de la MA, mais la surexpression de l’APP et/ou de tau provoque aussi d’autres effets qui ne se retrouvent pas dans la MA. Les souris double knock-in (dKI) AppNL F/MAPT évitent ces effets car elles ont un gène de l’APP humanisé avec deux mutations familiales humaines (Swedish et Iberian : AppNL,F) et le gène humain normal de tau (MAPT) au lieu des mêmes gènes chez la souris. En analysant la mémoire de nos souris dKI de l’âge de 2 à 6 mois, nous avons découvert que les femelles dKI ne parviennent plus à reconnaitre un objet après un délai de 24h (test RO24h) dès l’âge de 2 mois. De plus, elles n’ont pas de bons résultats dans un test de changement de la règle dans un labyrinthe, contrairement aux mâles dKI. Or ces deux tests dépendent du dialogue entre deux structures du cerveau, l’hippocampe (HC) et le cortex préfrontal (CPF). Ces résultats sont cohérents avec une étude montrant une altération de la connectivité HC-CPF plus marquée chez les femmes que chez les hommes en début de MA. Une perturbation des rythmes veille/sommeil, comme celle observée chez le patient, peut perturber le dialogue HC-CPF. A 4 mois, les dKI des deux sexes oublient rapidemment une association objet-place (OiP). Cette forme de mémoire dépend du dialogue HC-cortex entorhinal latéral (CEL). Elle est atteinte chez des personnes âgées des deux sexes et c’est un signe précurseur de la MA. En conclusion, chez les souris dKI de 4 mois, la voie CEL-HC semble affectée chez les deux sexes, tandis que les femelles semblent affectées en plus et plus tôt sur la voie HC-CPF. Les souris dKI sont les premières à montrer une perturbation aussi précoce et aussi proche de celle trouvée en phase préclinique des patientes développant une MA. Le but de ce projet est de comprendre l’origine de cette vulnérabilité féminine dans la pathologie Alzheimer.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’origine de la vulnérabilité féminine dans les premiers stades de la MA. Il est important d’explorer le rôle des oestrogènes car le développement de la MA a maints fois été attribué à la baisse marquée de production d’œstrogènes privant ainsi le cerveau d’un puissant neuroprotecteur contre les pathologies amyloïde et tau. Ici, nous analyserons chaque étape clé de l’implication des œstrogènes dans les processus de mémoire affectés chez les dKI femelles dès les premiers signes de la pathologie. Si nous découvrons une altération d’une ou plusieurs étapes, cela aidera à la compréhension de cette vulnérabilité féminine et révèlera des cibles intéressantes pour mettre au point des tests de diagnostique précoce et/ou de traitements adaptés à la femme. Cette démarche s’insère dans la statégie actuelle de développement d’une médecine personalisée. Le projet décrit ici ne représente que l’approche fondamentale développée dans un vaste. Ce programme inclue aussi des approches translationnelles en utilisant des techniques applicables à l’Homme : investigations en IRM (IRM fonctionnelle, tractographie, …), en électroencéphalographie à haute densité (EEGhd) et en biologie des rythmes (évaluation comportementale du fonctionnement de l’horloge circadienne). De plus, après adaptation et validation des tests de RO24h et OiP à l’Homme, ils pourront être intégrés dans des évaluations neuropsychologiques pour un dépistage. En conclusion, le programme dans son ensemble aborde certes les cibles neurobiologiques (présente saisine) qui seront utiles à long terme, mais il ouvre également des perspectives à moyen terme pour le développement d’outils de diagnostique par IRM, par EEGhd et par de nouveaux tests neuropsychologiques. Les résultats de notre étude bénéficieront d’abord à l’Homme puisque les souris ne développent pas la MA. Néanmoins, certains animaux de compagnie (chien, octodon) ou sauvages (microcèbe, ours blanc) développent une pathologie rappelant la MA avec pathologie amyloïdes et tau. Au mois deux de ces espèces (octodon ; microcèbe) possèdent un gène de risque génétique majeur pour la MA (APOE4). Chez l’Homme, l’APOE4 peut multiplier par 10 le risque de développer une MA. Il est donc tout à fait envisageable que les progrès réalisés dans le domaine de la MA en termes de dépistage et de traitement pourraient être adaptés à des pathologies proches chez l’animal, puis intégrée dans une approche vétérinaire.
Procédures
Procédure 1 modérée: 4 groupes de souris (de génotype et sexe différents, maximum 60 au total) sont mises dans des cages individuelles placées côte à côte sur une étagère munie de détecteur de mouvement (petites cellules de détection) pour mesurer leur activité locomotrice sur 4 jours. Malgré la proximité de leur congénères, cette séparation pourrait générer un stress modéré, mais transitoire. Les autres procédures P2 à P8 et P10 sont légères pour 800 souris. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration), 2) la passation d’un ou deux tests d’exploration d’objet dans un environnement rendu familier par une habituation (10 min) préalable avec leur groupe social, et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations. dans la procédure 8, les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour effectuer un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. Seule la procédure 9 modérée concerne une chirurgie pour l'ovariectomie sur 114 souris.
Impact sur les animaux
Le suivi de lignée jusqu’à l’âge de 12 mois indique que le phénotype des souris dKI n’est pas dommageable : le succès reproducteur, le poids et l’occurrence d’anomalies comportementales ou physiologiques restent identiques entre les WT et les dKI. Leur fonds génétique C57BL/6J est entretenu par backcross pour éviter une dérive génétique. Par ailleurs, il faut préciser que ces souris ont été caractérisées dans des tests de mémoire et d’anxiété classiques et dans des tests hypersensibles à la pathologie Alzheimer. Les mâles et femelles dKI de 2 à 6 mois réussissent comme leurs témoins les tests classiques (test spatial en labyrinthe de Barnes, tests de reconnaissance d’objet et de place jusqu’à un délai de 3h). Même à 12 mois, il n’y a toujours pas de déficit dans ces tests. Entre 2 et 6 mois, le problème n’apparait que dans des tests hypersensibles : une performance moindre au premier jour du changement de règle dans un labyrinthe, un déficit marqué dans les tests d’association objet-place (test OiP), de mémoire du détail et pour un long délai de rappel (RO24h). En conclusion, les souris dKI présentent des problèmes légers de mémoire qui sont présents chez des personnes âgées déclarées cognitivement normales. Ces déficits ne sont donc pas de nature à affecter le bien-être des souris dKI par rapport à leurs témoins WT. Seules deux procédures pourraient induire un stress transitoire : la procédure 1 pour l’isolement en cage permettant de mesurer l’activité locomotrice individuelle sur 4 jours et la procédure 8 où les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. La procédure 9 impliquant une ovariectomie ne devrait pas affecter le bien-être avec les traitement analgésiques et précautions de manipulation prévues. La couverture analgésique, les soins et le suivi individuel des souris devrait permettre d'éviter toute souffrance ou de l'interrompre rapidement s'il y a complication.
Devenir
Le but du projet est de découvrir les altérations neuropathologiques impliquées dans le dimorphisme sexuel face à l’émergence d’une pathologie Alzheimer afin de mieux comprendre les causes de la vulnérabilité du cerveau des souris dKI femelles par rapport aux mâles. A part pour les mises au point de techniques, les cerveaux seront systématiquement recueillis et analysés afin de déterminer ces causes.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la MA est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible actuellement de modéliser les processus cognitifs de façon fiable et complète dans un modèle in silico ou en culture cellulaire. Il est donc encore nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie et les performances cognitives.
Réduction
Pour étudier le lien entre les performances comportementales (mémoire et rythme circadien de l’activité locomotrice) et les données neuropathologiques obtenues par des approches histologiques ou biochimiques (P1 à P6, et P10), le nombre d’animaux sera au maximum de 15 animaux par groupe pour assurer l’efficacité des statistiques dans les tests comportementaux. Cet effectif est nécessaire en particulier dans notre modèle car nous testons des souris avec une pathologie débutante et des déficits subtils qui pourraient passer inaperçus si les groupes sont trop petits. La procédure 8 est une étude longitudinale d’animaux destinés à des analyses en IRM. Elle permet donc le suivi d'un même animal à trois âges pour étudier l’émergence et l’évolution de la pathologie ce qui permet une réduction du nombre d'animaux. Le nombre de souris sera au maximum de 35 animaux par groupes (4 groupes mâles et femelles des génotypes dKI et témoins WT) afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables pour les données IRM et pour des analyses corrélatives avec les données comportementales et histopathologiques obtenues sur les mêmes animaux au sein de notre laboratoire. La procédure 9 fait appel à la technique d'ovariectomie pour tester l'origine cérébrale de la vulnérabilité des souris femelles dKI. Le risque de perte avec une opération chirurgicale est couvert en augmentant à 16 le nombre de souris par groupe. L’ensemble du projet requiert 974 souris.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Elles seront maintenues en groupe sociaux sauf pendant deux périodes de 10 minutes/jours pour chacun des tests de mémoire. Tous ces tests sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris dans un milieu adapté à l’espèce (lumière faible de 20 lux maximum et ambiance sonore atténuée à 45 dB). Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés est mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Trois nouvelles techniques de raffinement sont à mettre/mise en place au cours du projet. Elles concernent la manipulation/transport des souris, l’habituation à l’enceinte des tests de mémoire et une méthode non invasive de prélèvement pour le génotypage. Les souris sont d’ores et déjà transportées de la cage à l’enceinte de tests (et vice versa) grâce au tube refuge présent dans leur cage. L’habituation à l’enceinte des tests se fait depuis plus de 6 mois avec l’ensemble du groupe social de chaque cage. Le bien-être qui en résulte se reflète par une plus grande régularité dans la durée d’exploration des objets présents dans l’enceinte au cours des tests de mémoire réalisés ensuite en individuel. Enfin, la nouvelle méthode de prélèvement non invasive pour le génotypage à partir d’une pincée de poils (au lieu du punch d’oreille de 2 mm) est désormais appliqué en routine pour cette lignée.
Choix des espèces
A ce jour, les modèles animaux de la MA ont essentiellement été créés chez la souris, même s'il existe des modèles chez la drosophile et d'autres espèces. Nous avons un modèle de souris qui est en rupture par rapport aux modèles précédents, car il n’a pas les effets secondaires dûs à la surexpression des protéines clé. Il présente une différence entre les deux sexes dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui ressemble à celle trouvée au stade préclinique de la MA, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le premier diagnostic. Toutes les souris seront sur un fonds génétique C57BL/6J. Dans toutes les procédures sauf une, les souris seront utilisées entre 1 et 4 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire dans ce modèle de maladie d’Alzheimer. Dans la procédure 8, les souris atteindront l'âge de 12 mois pour analyser leur neuropathologie lorsqu’elle devient manifeste (plaques amyloïdes notamment).
Validation d’un dispositif de mesure de la prise alimentaire et de la motivation chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles sont entraînées à un distributeur automatique de nourriture puis, pour certaines, reçoivent une injection de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation ou subissent un régime hypercalorique de six à sept semaines, avec des périodes d'isolement en cage. Le porteur décrit ces atteintes comme modérées et transitoires, alors que le projet est déclaré en gravité sévère. Il présente l'étude, menée avec une entreprise privée, comme devant à terme améliorer le bien-être des animaux non-humains dans ses recherches futures.
Objectifs
Les dérégulations de la prise alimentaire sous-tendent certaines conditions médicales comme l’obésité ou les troubles du comportement alimentaire (anorexie, boulimie, binge eating, addiction alimentaire). Dans ce contexte, nous nous intéressons en particulier aux modulations de la prise alimentaire par l’axe microbiote-intestin-cerveau dans des modèles murins. Outre la mesure de la prise alimentaire totale, la compréhension des troubles du comportement alimentaire nécessite d’explorer également des processus psycho-neurobiologiques comme la motivation. Ces processus peuvent être analysés chez le rongeur à travers la réalisation de tâches opérantes. Ainsi, dans une volonté d’affiner et d’automatiser les outils permettant l’étude du comportement alimentaire dans ces modèles, nous souhaitons tester un système embarqué permettant i) une mesure automatique de la prise alimentaire et ii) de tester le comportement opérant des animaux dans leurs cages d’hébergement. Ce système permet à la fois de mesurer la prise alimentaire au sein des cages d’hébergement avec une haute résolution temporelle et de mesurer la motivation alimentaire par le biais du comportement opérant. Ainsi les objectifs de ce projet sont : 1- Tester la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire 2- Mesurer des désordres motivationnels dans une tâche de comportement opérant dans deux modèles animaux. Cette étude sera réalisée sur des souris consanguines immunocompétentes. Afin d’examiner un potentiel effet dépendant du sexe, nous réaliserons cette étude sur des individus mâles et femelles. Cette étude correspond à la première phase d’un projet en collaboration avec une entreprise privée. Le but de ce projet est de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Ainsi, les résultats issus de ce projet sont nécessaires afin de passer à la phase suivante qui permettra d’améliorer le dispositif et d’avoir un impact positif sur le bien-être des animaux lors de nos études futures.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet permettront de passer à une phase d’évolution du dispositif dans son design pour permettre notamment une utilisation autorisant l’hébergement en groupe. Scientifiquement, les analyses post-mortem envisagées (histologie, biologie moléculaire) contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux sous-jacents et à établir de futurs protocoles expérimentaux. Ce projet contribuera également à alimenter la collaboration avec une entreprise dans le développement du médicament et permettra éventuellement de tester des molécules en développement pour des indications de troubles du comportement alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des entraînements à utiliser un dispositif embarqué qui leur permettre de s'alimenter d'une part (durée : env. 2 semaines). D'autre part une partie des souris seront entraînées à utiliser ce dispositif pour réaliser des tâches opérantes (durée : env. 1 semaine). Certaines souris recevront une administration unique de lipopolysaccharides ou seront exposées 6-7 semaines à un régime riche en lipides pour induire des désordres motivationnels.
Impact sur les animaux
Les procédures contiennent des périodes d’hébergement en individuel. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. L’hébergement en individuel dans ce projet a été limité au maximum et durera au maximum 2 semaines. Un surenrichissement des cages sera proposé. Dans une des procédures, certains animaux seront injectés avec du LPS. Cet agent induit une réaction inflammatoire systémique pouvant être objectivée à travers des signes cliniques. Les modalités d’administration choisies altèrent modérément l’état clinique de l’animal et conduisent à une résolution de la réponse moléculaire pro-inflammatoire en moins de 9h. Dans une des procédures, certains animaux seront exposés à un régime hypercalorique. La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment hypercalorique riche en lipides (HFD) conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des mofifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition à ce régime dans notre projet (6-7 semaines) perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Cette étude vise à tester un distributeur alimentaire pour souris dans le but de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de vérifier la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire et de mesurer des désordres motivationnels dans deux modèles animaux. Plus précisément, des tests statistiques permettant une analyse de l’effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou l’effet sexe des animaux lors de mesures répétées seront employés ; des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données seront utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés soit en groupe, soit en individuel. Les cages d’hébergement contiendront un objet leur permettant de se mettre à l’abri, des carrés de cotons ou des sticks de papier pour réaliser leur nid. Pour les animaux hébergés en individuel, un surenrichissement par rapport aux individus hébergés en groupe sera prévu. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Le bon fonctionnement et chargement des dispositifs distributeur d'aliments sera vérifié régulièrement voire quotidiennement (lors de l’apport d’aliment uniquement par le dispositif). Le design de la procédure comportementale a été conçu pour assurer la validité des données obtenues tout en limitant la durée de l’hébergement individuel au minimum.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). De plus, le dispositif testé a été conçu pour la souris. Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Carence en vitamine D chez la souris mâle et conséquences sur la descendance.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et une partie des descendants est tuée dès quatre jours après la naissance. Des mâles sont nourris pendant dix semaines d'un régime privé de vitamine D ou d'un régime contrôle, puis accouplés à des femelles qui ont eu une oreille percée à leur arrivée, et les procédures décrites ajoutent un isolement d'une trentaine de minutes pour recueillir des fèces et une prise de sang à la queue sur souris éveillée. Les autres descendants sont pesés chaque semaine puis tués à différents âges pour étudier leur tissu adipeux, le porteur en attendant des recommandations nutritionnelles pour les hommes en âge de procréer. Six groupes de dix descendants font 60 souris, le total déclaré, sans que le texte dise où se comptent les pères, les femelles accouplées et les trois cohortes de géniteurs prévues sur trois ans.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter des données permettant d’évaluer l’impact d’insuffisance en vitamine D chez la souris mâle, sur les trajectoires métaboliques de la descendance. Des souris mâles seront nourris pendant 10 semaines avec un régime contrôle ou un déficient en vitamine D. Les males carencés seront étudiés (suivi de l'evolution pondérale, prise alimentaire, impact sur le microbiote). Ces males seront ensuite accouplés avec des souris femelles nourries avec une alimentation contrôle. Ceci permettra de générer une descendance issue de pères carencés ou non. L'etude portera ensuite sur cette descendance. Des groupes de 10 animaux de chaque sexe sont utilisés. Au total, l'etude sur la descendance portera donc sur 6 groupes d'animaux étudiés à différents stades de leur vie (4 jours post naissance; post-sevrage et age adulte), repartis de la façon suivante : mâles après naissance, femelles après naissance, mâles post-sevrage, femelles post-sevrage, mâles adultes, femelles adultes. Sur la descendance, à l'exception des animaux mis à mort 4 jours apres la naissance, un suivi de croissance sera réalisé par pesée toutes les semaines ainsi que la quantification de la consommation alimentaire. Les animaux seront euthanasiés à différents stades afin d'etudier l’adiposité, l’expression génique du tissu adipeux et l’empreinte épigénétique du tissu adipeux. A noter qu'il est prévu de réaliser 3 cohortes de géniteurs sur la période des 3 années sur laquelle va se dérouler ce projet.
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l'impact d'une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommendations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.
Procédures
Les animaux femelles seront soumis à un perçage d'une oreille une fois à leur arrivée. À 9 semaines d'alimentation contrôlée, un prélèvement de fécès nécessitant de les ioler pendant ~30 minutes sera réalisé; suivi d'une prise de sang à la queue sur animal vigile à 10 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux mâles seront soumis à un régime carencé en vitamine D, aucune souffrance n'est attendue mais des nuissances peuvent survenir (nuissance de gravité légère, longue durée). Les animaux seront également maintenu en isolement lors des recueils de fécès ce qui peut constituer une source de stress (nuissance de gravité légère, courte durée). Un prélèvement de sang sera réalisé à la veine caudale (nuissance de gravité légère, courte durée). Enfin l'induction de l'anesthsie puet constituer une source de nuisance (nuissance de gravité légère, longue durée).
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite analysés.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d’une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de student, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 2 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 8 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Approches physiopathologiques et thérapeutiques du syndrome de Sanfilippo B EU 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles du syndrome de Sanfilippo B, une maladie neurodégénérative pédiatrique, elles passent des séances d'IRM d'une heure sous anesthésie, puis sont tuées par prélèvement intracardiaque à 2, 5 ou 9 mois pour mesurer le fer cérébral. Le porteur présente l'IRM comme non invasive et le prélèvement intracardiaque terminal comme la nuisance la plus importante du projet. Il affirme qu'à ce stade le recours à l'animal est "inévitable" pour confirmer les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
Le projet financé est une étude préclinique de thérapie génique intraveineuse pour le syndrome de Sanfilippo B. Ce syndrome est une pathologie neurodégénérative pédiatrique touchant 1 enfant sur 200 000 et pour lequel il n’y a aucune thérapie aujourd’hui. Ce syndrome est dû à la déficience d’une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation d’un glycosaminoglycane, l’héparane sulfate. Cette déficience conduit à l’accumulation de ce substrat qui présente une toxicité majeure pour les cellules du système nerveux central. Nous souhaitons, à travers cette étude, pouvoir proposer un essai clinique par thérapie génique permettant d’apporter l’enzyme déficitaire (N-acétylglucosaminidase). L'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de vérifier s'il est possible de détecter de façon reproductible et fiable des variations de susceptibilités magnétiques caractéristiques de la teneur en fer (Fe) dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux sans mise à mort des animaux comme c’est le cas pour les méthodes classiques de mesures post-mortem. L'IRM est un outil important pour le diagnostic in vivo des pathologies ainsi que pour suivre au cours du temps la réponse à différents traitements ou procédures chirurgicales. La durée maximale des acquisitions sera d’une heure par animal.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de l’étude physiopathologique, l'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de mesurer des valeurs de susceptibilités magnétiques T2* dans le cerveau des animaux. Ces mesures permettront de comparer la teneur en Fe dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux. L’accumulation de fer ou non dans le cerveau est un marqueur de validation de l’efficacité du traitement de nos souris en préclinique. A terme, cette mesure IRM pourrait remplacer les mesures faites post-mortem et devrait donc nous permettre de réduire le nombre d'animaux mis en œuvre pour mesurer la quantité de fer dans les tissus et permettre de suivre l'évolution au cours du temps de la teneur en fer de différents organes d'intérêt dans un même animal renforçant ainsi la valeur statistique des résultats.
Procédures
L'IRM est une procédure d'imagerie in vivo, non invasive et atraumatique. La totalité de la procédure étant menée sous anesthésie volatile (1h maximum), les animaux ne subissent que le stress dû à la préhension avant induction de l'anesthésie. Le réveil post-anesthésique est la seconde étape critique, les animaux restent sous surveillance pendant toute la phase de réveil.
Impact sur les animaux
L'IRM est une technique non invasive d'imagerie qui n'entraine aucune douleur chez les animaux. Les signes vitaux (respiration, fréquence cardiaque et température) sont contrôlés tout au long des manipulations afin de garantir le suivi du bien-être des animaux. La procédure est cependant susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans la cage d'induction de l'anesthésie. Le prélèvement intracardiaque que subiront les animaux au moment de leur mise à mort (sans réveil) est la nuisance la plus importante du projet, elle est cependant indispensable pour réaliser dans des conditions optimales la mesure de teneur en fer intra-tissulaire de référence.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des délais 2, 5 ou 9 mois de vie suivant une technique réglementaire qui permettra de pouvoir obtenir des prélèvements de qualité tout en protégeant l'animal de la douleur.
Remplacement
Une modélisation intégrée est nécessaire pour valider les études in vitro. Les animaux sont utilisés en fin d’étude afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Les études sont systématiquement optimisées (quantité de vecteurs, temps de traitement et nombre d’animaux) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. Même si le traitement est administré en injection intraveineuse, il est réalisé par un personnel compétent.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Nous allons utiliser des tests statistiques afin de comparer les groupes. Les tests sont réalisés avec un logiciel de statistique. Nous utiliserons des groupes de 10 souris par expérience et nous répéterons les expériences à 3 âges différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo. L'IRM étant une technique d'exploration non invasive, elle permet le suivi longitudinal des lots d'animaux mis en œuvre ce qui participe à la réduction globale.
Raffinement
Cette procédure expérimentale a pour objectif d'évaluer la possibilité de remplacer une procédure post-mortem (mesure de la teneur en fer dans les tissus prélevés) par une procédure non invasive, in vivo qui permettra de suivre une même cohorte au cours du temps dans un but de raffinement (suivi du même animal pour s'affranchir de la variabilité interindividuelle et réduction du nombre de lots d'animaux nécessaire pour assurer ce suivi longitudinal selon la procédure classique). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Nous nous attachons à ne pas laisser un animal seul dans une cage (groupes sociaux de 5 individus maximum par cage). Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Lors des expériences d’imagerie, les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (gaz vecteur O2) dès le début de la procédure pour réduire leur stress et éviter tout mouvement au cours de l’exploration IRM. La cellule d’imagerie dans laquelle est maintenue la souris est thermo régulée. Pendant la phase de réveil, la cage est également placée sur tapis chauffant et reste sous contrôle visuel jusqu’au réveil complet de l’animal. Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus est un modèle animal adapté aux pathologies de surcharge lysosomale. L’application de la politique de réduction mise en place permet d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer d’un minimum d’animal un maximum d’information. De plus la formation des personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoir dans des conditions appropriées (temps de formation respecté) permet de réaliser nos expérimentations animales dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Il est nécessaire d’utiliser les souris à partir de d'âge de 2 mois afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux obtenus dans nos précédentes études et celles décrites dans la littérature.
Evaluer l’impact d’anticorps murins dirigés contre des peptides impliqués dans la fonction de reproduction sur la fertilité chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les souris traitées étant tuées et les non traitées et leurs petits réutilisés. Des souris saines reçoivent une à trois injections d'anticorps dirigés contre des peptides de la fertilité, puis sont accouplées en trios pour mesurer le nombre de portées et de nouveau-nés. Le porteur indique que les injections intraveineuses peuvent provoquer saignement, inflammation, voire une opacification avec cécité. Il affirme que seul un "organisme complexe" comme la souris permet de prouver l'effet de ces anticorps, produits pour explorer un lien supposé entre Covid-19 et troubles de la fertilité.
Objectifs
Les agents infectieux jouent un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes et ce par divers mécanismes dont le plus important est le mimétisme moléculaire consistant à déclencher une réactivité auto-immune lorsque l’agent pathogène et l’antigène tissulaire humain sont structurellement similaires(1). L'épidémie de COVID-19 a incité les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une auto-immunité par le biais d'une réactivité croisée. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains partageant des séquences communes avec la protéine SPIKE, entraînant une réactivité auto-immune. Pour exemple, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns pouvant par exemple conduire à une altération de la spermatogenèse et notamment de l'étape de spermiogénèse nécessaire à la maturation des spermatozoïdes . Une première analyse in-silico a permis d'identifier 4 peptides liés à la spermatogénèse qui partageaient au moins 5 acides aminés communs avec la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons découvert que les patients infectés par la COVID-19 développaient des anticorps contre 2 peptides (peptide A et B dans l'étude) impliqués dans la spermiogénèse. Une analyse biochimique a prouvé que les anticorps anti-Spike S du virus Sars-COV2 peuvent reconnaitre les deux peptides A et B liés à la spermatogenèse chez les hommes mais également chez les femmes affectés par la COVID-19. Ce résultat indique l'apparition possible de nouveaux troubles de la fertilité et féconditité dans la population. Pour aller plus loin dans cette étude, nous avons produit des anticorps murins de sous-classe IgG réagissant avec les peptides A et B en immunisant des souris saines contre ces peptides. Le but de ce projet est d’évaluer la pathogénicité de ces anticorps en les administrant à des souris mâles et femelles saines et en déterminant leur effet sur la fertilité (nombre de portées) et la féconditité (nombre de nouveaux-nés)..
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur l'ensemble de la population. Cette étude permet de mieux comprendre les effets de l'infection par le SARS-Cov-2 sur les humains, en particulier la pathogénicité d'auto-anticorps sur le système reproducteur.
Procédures
Les souris mâles et femelles recevront 1 à 3 injections maximum d’une durée de 2 minutes chacune sur animal vigile ou anesthésié. L'accouplement est composé d'un trio : 1 mâle et 2 femelles. Temp d'accouplement 12 heures.
Impact sur les animaux
L'administration dans la cavité abdominale peut induire une inflammation, une induration, un hématome ou une infection de la cavité péritonéale et l'administration Intra-veineuse peut induire un un saignement, une inflammation, une infection ou une opacification avec cécitéselon que l'animal recevra une injection ou au maximum 3. Ces injections pourront induire une douleur légère transitoire si réalisée une seule fois sur l'animal voire modérée transitoire si au maximum selon les résultats de l'étude pilote 3 injections devaient être réalisées.
Devenir
Tous les souris traitées seront mise à mort pour analyses ultérieures. Les souris non traitées et les souricaux seront réutilisés.
Remplacement
Le projet actuel représente la partie finale d'une étude plus étendue préalables visant l'identification des peptides partageant des identités de séquence avec la protéine Spike (S) du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, elle a été suivie des studios dans les sérums des patients atteints de COVID-19 . Actuellement, le seul modèle disponible pour prouver le rôle des anticorps anti-peptides sur le système reproducteur est un organisme complexe comme le modèle murin. Aujourd'hui, notre objectif ne peut pas être atteint en utilisant des modèles cellulaires artificiels. Le modèle murin représente la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux dans le projet est évalué selon les calculs de puissance visant à réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude.
Raffinement
Nous avons établi des points-limites qui permettent de soustraire l'animal à la souffrance sur la bse d'une grille de score permettant d'évaluer l'état de santé des animaux ainsiq ue la douleur. L'injection intra-veineuse est réalisée sous anesthésie. Afin de réduire la douleur, une goutte d'anti-douleur sera ajoutée après l'injection. Les souris sont logées en groupe social et chaque cage sera équipée de matériaux de nidification pour que les mères puissent construire le nid et d'un bâton à ronger.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme et elles développent des pathologies similaires à celles observées chez l'homme. De plus, le modèle murin a un taux de reproduction élevé permettant d'obtenir rapidement des résultats. Les souris CD1 sont utilisées à l'âge de 6-8 semaines après avoir atteint leur maturité sexuelle.