Souris

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cinq jours de vie, les souriceaux subissent une chirurgie du cou pour isoler la carotide et, pour une partie, une privation d'oxygène à 8 % pendant quarante-cinq minutes destinée à provoquer des lésions cérébrales proches de la paralysie cérébrale humaine, avec des séparations maternelles répétées. Le porteur reconnaît que ces séparations déclenchent des appels à la mère et cherche à tester des molécules neuroprotectrices, avec des tests comportementaux jusqu'à l'âge adulte. Il juge le recours à la souris "indispensable" pour suivre la plasticité cérébrale sur le cerveau entier.

Objectifs

La paralysie cérébrale (PC) est la première cause de handicap moteur de l’enfant. En France, elle concerne 4 nouveau-nés chaque jour, avec une vulnérabilité accrue chez les garçons. La prématurité, une hypoxie-ischémie (HI) et le stress sont des facteurs de risque de la PC, pouvant engendrer des lésions cérébrales. La problématique générale du projet est de valider chez l’animal des approches de neuroprotection périnatale, en comparaison avec les effets du MgSO4 (unique molécule, à effet neuroprotecteur partiel, recommandée en clinique). Un modèle expérimental chez la Souris permet d’induire ces lésions en réalisant une HI périnatale, tout en reproduisant les différences intersexuelles observées en clinique. La vulnérabilité cérébrale en période périnatale évolue rapidement, montrant des profils lésionnels dépendants de l’âge d’exposition et du sexe. En effet, la période de la naissance correspond à une phase tardive du développement cérébral (gliogénèse, migrations cellulaires, synaptogénèse, vasculogénèse). La compréhension des mécanismes lésionnels et de plasticité cérébrale sont un préliminaire aux études de neuroprotection. Celles-ci consistent à tester à court et long termes les effets de molécules pharmacologiques sur le comportement sensori-moteur et cognitif des souris ayant subi une HI néonatale, ainsi qu'à analyser leurs effets aux niveaux tissulaire, cellulaire et moléculaire.

Bénéfices attendus

Les études cliniques ont permis d’affirmer qu'à court terme le MgSO4 diminue significativement les séquelles neuromotrices graves à type de paralysie cérébrale justifiant son administration en routine aux mères en menace d’accouchement prématuré. Le projet permettra d'étudier les effets mécanistiques et comportementaux du MgSO4 administré seul, en différenciant les sexes. D'autre part, des travaux récents du laboratoire rapportent que l’administration de MgSO4 chez le souriceau hypoxo-ischémié à P5 prévient à court terme, les déficits sensorimoteurs, l’inflammation et l’apoptose induits pas une HI néonatale. Cependant, il est remarquable qu’à long terme, le MgSO4 ne parvient pas à prévenir les troubles moteurs et cognitifs alors qu’il semble prévenir les modifications tissulaires induites par l’HI (désorganisation des fibres myélinisées du corps calleux). En clinique, aucun effet délétère du MgSO4 n'a été rapporté chez la mère ni chez le foetus. Cependant, des études précliniques ont alerté sur le fait qu'une dose élevée de MgSO4 pouvait entrainer des altérations de l'angiogenèse corticale. Ainsi, ce projet permettra également de tester les effets de l'association du MgSO4 avec d'autres molécules pharmacologiques. L'une des molécules qui sera étudiée dans le cadre de ce projet est le 4-Phénylbutyrate (4-PBA) qui a des propriétés neuroprotectrices, qui est un inhibiteur d'histone déacétylase (iHDAC) et qui est administré chez le nouveau-né en clinique pour traiter des troubles du cycle de l'urée.

Procédures

Les souriceaux subiront une procédure chirurgicale (uniquement isolement de la carotide ou hypoxie-ischémie) à 5 jours de vie (P5) afin d'induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés prématurément entre 24 et 32 semaines d'aménorrhée. Tous les souriceaux subiront 4 isolements maternels, respectivement de 8, 10, 45 et 10 minutes, le jour où seront réalisés à la fois la chirurgie et les traitements. Ils ne seront isolés de la fratrie que pendant l’acte chirurgical et la phase de réveil (8 minutes en tout). La chirurgie impliquera de faire une injection sous-cutanée (d’analgésique), une incision de la peau du cou et du tissu sous-jacent afin d’isoler la carotide, puis de réaliser deux points de suture. Tous les animaux seront tatoués pendant l’anesthésie. Les traitements nécessiteront de réaliser 2 injections intrapéritonéales par individu. Les animaux des groupes hypoxo-ischémiés subiront une hypoxie à 8% d’O2 pendant 45 minutes. Les tests comportementaux réalisés chez le souriceau, la souris adolescente puis chez l’adulte visent à évaluer son développement sensorimoteur et ses capacités cognitives lors d’activité spontanées.

Impact sur les animaux

Les phases d’isolement maternels provoquent systématiquement des appels à la mère de la part des souriceaux. Les manipulations des petits et de la mère se font quotidiennement dès 24h après la naissance et évitent ainsi des stress répétés lors des tests comportementaux. La molécule A peut provoquer une vasodilatation, bradycardie et myorelaxation, mais à la dose injectée, le comportement des souriceaux et de la mère envers ses petits n’est pas altéré. La molécule B ne provoque pas non plus d’altération du comportement des souriceaux ni de la mère envers ses petits. Du fait de la variabilité interindividuelle, certains animaux hypoxo-ischémiés présenteront à court et long termes des déficits sensorimoteurs et cognitifs très discrets, mis en valeurs par des tests comportementaux spécifiques. Les animaux restent autonomes et tout à fait mobiles. Ils maintiennent des interactions sociales. Les souriceaux étant retirés progressivement à la mère pendant la chirurgie, celle-ci n’est jamais totalement dépourvue de ses petits.

Devenir

Les souriceaux opérés sont maintenus en vie pendant une durée allant de 6 à 60 jours post-opératoires puis euthanasiés sous anesthésie profonde pour le prélèvement des cerveaux en vue des différentes expérimentations

Remplacement

Il est indispensable pour notre étude d'avoir recours à l'animal, ici la Souris: 1) Le stress est connu pour être l’un des facteurs de risque de la PC. Les séparations subies par le couple mère-souriceau à P5 renvoient aux difficultés rencontrées par les parents d'enfants prématurés pour être en contact avec leur enfant en couveuse, intubés et portant de multiples sondes; 2) Plasticité cérébrale: celle-ci apparaît au cours du développement cérébral ce qui nécessite de travailler de façon longitudinale sur le cerveau entier. L'analyse à long terme des altérations comportementales, histologiques et neurochimiques et de la neuroprotection, nécessite de travailler sur l'animal au stade juvénile, adolescent et adulte; 3) Interactions intercellulaires: les altérations tissulaires induites par l'HI à P5 ciblent préférentiellement, mais pas seulement, la substance blanche cérébrale produite par les oligodendrocytes (OL). La prolifération, la migration et la différenciation des OL sont vasculo-dépendantes et fonction de l'activité neuronale. Une approche intégrée est donc indispensable dans le cadre de ce projet.

Réduction

Nous aurons 8 groupes de souris : 4 groupes contrôles et 4 groupes ayant subi une chirurgie. Chez les contrôles, comme chez les opérés, nous testerons les effets de deux traitements A et B, séparés ou combinés. Notre modèle de chirurgie reproduit les variabilités interindividuelles rapportées en clinique, nous contraignant à avoir des effectifs importants par groupe. Notre modèle chirurgical reproduit également les variabilités sexuelles rapportées en clinique. Dans un 1er temps, les groupes d’animaux seront constitués sans différencier les sexes. Ce n'est que dans le cas où des différences intersexuelles sembleraient apparaitre que le dédoublement des groupes sera fait afin de pouvoir analyser statistiquement les potentiels effets sexe. Les mêmes animaux réaliseront à la fois les études comportementales à court et à long terme et leur cerveau sera prélevé pour les études histologiques et/ou neurochimiques. Les données obtenues chez les groupes contrôles pourront être utilisées pour la mise au point de protocoles afin d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.

Raffinement

Les chirurgies réalisées à 5 jours de vie seront effectuées dans une pièce isolée, au calme, avec seulement un ou deux manipulateurs expérimentés présents. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale. On pratique une hyperoxygénation avant anesthésie. Un analgésique sera injecté. Le souriceau sera maintenu sur une couverture thermique. Après la chirurgie, les souriceaux seront remis dans leur cage avec la mère dans un environnement calme permettant la nidification et les soins maternels et stabilisé. Les comportements des souriceaux et de la mère seront observés très attentivement et ceci de façon répétée pendant les 24 premières heures post-chirurgie. Un suivi post-opératoire quotidien sera réalisé : suivi du poids des animaux, observation de leur apparence, vérification de l'accès aux mamelles, léchage des petits. Chez l'adulte, l'indice de grimace facial sera utilisé pour évaluer le niveau de douleur et le comportement de l'animal sera régulièrement observé.

Choix des espèces

La Souris est une espèce couramment utilisée en Neurosciences. L’espèce est prolifique (cycle de reproduction court (21 jours)), à faible coût d’élevage, utilisée abondamment dans la bibliographie scientifique. Une Hypoxie-Ischémie (HI) réalisée chez la Souris à 5 jours de vie permet d'induire des lésions cérébrales similaires à celles observées dans le cerveau de certains enfants nés entre 24 et 32 semaines d'aménorhée. Ce modèle expérimental permet également de reproduire les différences intersexuelles observées en clinique. Les souris NMRI étant non consanguines, les données obtenues sont plus proches de ce que l'on observe chez l'Humain. L'inconvénient est que cela est à l'origine d'une plus forte variabilité interindividuelle que chez des souris consanguines, ce qui nécessite des effectifs plus importants pour le traitement statistique des données. Les souriceaux seront utilisés : - durant les deux premières semaines de vie (le stade de 5 jours de vie chez le souriceau correspond au stade 24-32 semaines d’aménorrhée chez l’Humain au cours duquel la substance blanche est particulièrement vulnérable). Durant ces deux premières semaines, des tests sensorimoteurs seront réalisés ainsi que des études histologiques et/ou neurochimiques. Le sevrage sera réalisé à 21 jours de vie si le poids corporel est supérieur à 10 grammes. - puis à l’adolescence (P30-P45), - puis à l’âge adulte (60 à 90 jours). Ce sont souvent les mêmes souriceaux qui seront utilisés aux différents âges car de potentielles corrélations seront recherchées entre d'une part les déficits comportementaux discrets et les altérations histologiques observés à long terme et d'autre part les altérations comportementales discrètes observées à court terme. Les souris femelles non utilisées dans le projet pourront être mises en reproduction, si besoin, à partir de l'âge de 8 semaines et pour une durée maximale de 6 mois. Entre le sevrage d'une portée et le prochain accouplement, un repos d'une durée de 14 jours est respecté pour les mères. Les pères seront mis en reproduction à partir de 8 semaines pour une durée totale de 1 an.

438 souris vont être utilisées, en majorité tuées à l'issue et dix-huit femelles réutilisées comme reproductrices, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les phalanges sont tatouées ou amputées pour l'identification et le génotypage, une hypothyroïdie est induite pendant trois semaines par l'alimentation, y compris chez des femelles gestantes, ce qui ralentit la croissance des souriceaux. La plupart des animaux sont ensuite mis à mort après un prélèvement de sang à la veine cave ou une perfusion de fixateur dans le cœur, pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à identifier les gènes cibles de l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus et affirme qu'aucun modèle in vitro pertinent n'existe pour cette structure.

Objectifs

L'hormone thyroïdienne est primordiale pour le bon fonctionnement de l'organisme, autant pendant le développement foetal que pendant la vie adulte. Elle régule notamment le neurodéveloppement durant la vie foetale, et le maintien de fonctions vitales, comme la production de chaleur par le corps, à l'âge adulte. L'ormone thyroïdienne agit dans presque tous les tissus de l'organisme. Les perturbations de cette signalisation entraînent des conséquences délétères sur la santé des individus : hypothyroïdie, problèmes de développement cérébral, déficit intellectuel... L'hormone thyroïdiennes agit en activant ou en inhibant la transcription de gènes cibles. Toutefois, ces gènes-cibles sont globalement mal connus et ne sont pas les mêmes d’un tissu à l’autre. Le manque de compréhension des mécanismes d’action de l'hormone thyroïdienne freine le développement de traitements adaptés aux différentes pathologies associées. Ce projet consiste à déterminer les gènes cibles de l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus chez la souris, à la fois chez le jeune et chez l'adulte. Cette aire cérébrale représente un élément essentiel du contrôle des fonctions physiologiques. L’influence qu’y exerce l'hormone thyroïdienne est importante, mais la façon dont cette influence s’exerce, c’est-à-dire la nature des gènes-cibles de l'hormone, est très peu connue.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à faire avancer les connaissances fondamentales dans un domaine dans lequel beaucoup d’inconnues persistent. Il devrait permettre d’effectuer une distinction fondamentale entre les processus développementaux et les régulations physiologiques contrôlés par l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus. À terme on peut en attendre les bénéfices suivants : - une compréhension des liens qui existent entre différents phénomènes qui dépendent de l'hormone thyroïdienne dans l’hypothalamus : le déclenchement de la puberté, la perception des saisons, la régulation de l'activité de la glande thyroïde... - des hypothèses innovantes pour des traitements pharmacologiques de l’obésité. L'hormone thyroïdienne donnée en excès est capable d’augmenter la dépense calorique et de provoquer une perte de poids. Un tel traitement reste cependant inenvisageable en raison de ses effets secondaires majeurs (fonte de la masse musculaire et tachycardie). Si nous parvenons à identifier un type cellulaire de l’hypothalamus dans lequel l'hormone thyroïdienne exerce un effet favorable, il sera possible de cibler ces cellules pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques de lutte contre l'obésité, en évitant les effets indésirables sur d'autres organes.

Procédures

Les souris utilisées à l'âge adulte seront identifiées individuellement par tatouage des phalanges à l'âge de 10-12 jours (geste < 1 minute). Une biopsie de queue (< 20 secondes) sera réalisée le même jour sur ces animaux pour pouvoir réaliser des analyses génétiques. Les souris utilisées à l'âge de 15 jours seront identifiées entre 5 et 7 jours d'âge par prélèvement d'une phalange distale sur un ou deux doigts (< 1 minute). Ces prélèvements permettront également de réaliser des analyses génétiques. Des souris adultes seront nourries pendant 3 semaines avec un aliment contenant un médicament qui bloque la fonction de la glande thyroïde et induit une hypothyroïdie. Ce traitement pharmacologique prolongé n’a pas d’effet flagrant chez les adultes, mais peut causer une légère perte de poids. Des mères gestantes seront également nourries avec cet aliment, à partir du 10ème jour de gestation et jusqu'à 15 jours après la mise bas. Ce traitement provoque chez les souriceaux en développement un net ralentissement de la croissance pondérale après la naissance. Des souris adultes et des souriceaux âgés de deux semaines précédemment rendus hypothyroïdiens recevront une injection unique d'hormone thyroïdienne (< 20 secondes). Certaines souris recevront également une injection (< 20 secondes) d'un marqueur de prolifération cellulaire, 24h avant leur mise à mort. En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées (par injection de médicaments, < 20 secondes), après injection d'un analgésique (< 20 secondes). Sur une partie d'entre elles, nous réaliserons un prélèvement sanguin à la veine cave (2-3 minutes), puis elles seront mises à mort sous anesthésie. Sur les autres souris, une procédure chirurgicale sera employée (durée < 10 minutes) pour injecter dans le coeur un produit qui permet d'assurer une bonne conservation de la structure du cerveau, pour la réalisation d'analyses histologiques. Ces souris seront également mises à mort sous anesthésie après la procédure chirurgicale.

Impact sur les animaux

Les actes liés à l'identification des souris et aux biopsies pour analyses génétiques (tatouage des phalanges, biopsie de queue ou de phalange) induisent une douleur aigüe temporaire. Chez la souris adulte, nous induirons une hypothyroïdie temporaire, qui a un effet modéré et réversible. Cela se traduit par une perte de poids modérée (inférieure à 10% du poids initial) et une légère baisse d’activité, qui n'est pas détectable de façon évidente, mais qui peut être mesurée en utilisant des tests comportementaux dédiés. Par analogie avec les données médicales humaines, on peut supposer une fatigue générale. Le médicament utilisé donne un goût amer à l'aliment, ce qui limite la prise de nourriture par les souris. L’induction d'une hypothyroidie au cours de la gestation a des effets significatifs sur le développement des petits. Toutefois, notre expérience passée montre que le degré d’hypothyroïdie atteint dans nos conditions expérimentales ne compromet pas la survie des souriceaux, le seul effet notable étant un retard de croissance (10-15 % de retard pondéral par rapport aux souris témoins). L'injection d'hormone thyroïdienne induit une douleur temporaire liée à l'injection mais ne provoque pas d’inflammation ni d'altération notable du bien-être animal. Le prélèvement d'un grand volume de sang sous anesthésie générale, ainsi que l'injection d'un produit fixateur dans le coeur, également sous anesthésie générale, n'induisent pas de douleur et sont systématiquement suivis de la mise à mort des souris.

Devenir

420 souris de ce projet seront mises à mort pour prélèvement de leur cerveau. Les femelles utilisées pour mettre au monde des souriceaux pourront être gardées et réutilisées comme reproductrices au sein de l'animalerie, après une période de récupération d'au moins 2 semaines pour les femelles qui auront reçu l'aliment induisant une hypothyroïdie.

Remplacement

L’hypothalamus est une structure neurale pour laquelle il n’existe aucun modèle in vitro pertinent. Le recours aux cultures primaires n'est possible pour quelques types cellulaires. Nous avons mesuré la réponse à l'hormone thyroïdienne de cultures primaires de certaines cellules de l’hypothalamus, mais il n’est pas encore démontré qu’elle soit comparable à leur réponse in vivo. Il n’existe pas de situations qui permettraient de prélever des tissus provenant de patients hypothyroïdiens ayant reçu un très court traitement hormonal pour évaluer les modifications d'expression de gènes induites par l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus.

Réduction

Les méthodes prévues pour l'analyses du tissu cérébral ont été optimisées pour être applicables avec des quantités minimes de matériel. Pour les études impliquant un séquençage des ARN , notre expérience passée montre que des lots de 6 animaux minimum (3 mâles + 3 femelles) sont requis pour garder une marge de sécurité. L’analyse statistique est effectuée à l’aide d’une méthode dédiée capable de mettre en évidence des différences mineures avec des effectifs très faibles en prenant en compte une interférence possible entre la réponse hormonale et le sexe des animaux. Toutefois, ces méthodes peuvent conduire à l’élimination occasionnelle d’un échantillon en raison de problèmes techniques. Des animaux surnuméraires permettent également de réaliser des expériences de confirmation (analyse ciblée sur certains gènes identifiés comme intéressants par l'analyse globale). Le nombre de femelles nécessaire pour générer les souriceaux pour l'étude du développement du cerveau a été déterminé sur la base de l'obtention d'environ 6 souriceaux par portée. Nous réutiliserons les femelles pour plusieurs portées. Notre estimation prévoit également de possibles problèmes de reproduction (interruption de gestation, mortalité des souriceaux...).

Raffinement

Les souris adultes et juvéniles seront observées et pesées régulièrement pendant toute la durée des procédures. En cas d'approche d'un point limite par l'un des animaux, la surveillance sera réalisée quotidiennement. Chaque femelle sera utilisée au maximum pour 2 gestations sous traitement hypothyroïdien, avec une période de repos d'au moins 15 jours (alimentation normale) entre la mise à mort des petits et la nouvelle mise en reproduction. En fin de procédure, les souris seront profondément anesthésiées pour éviter toute douleur liée au prélèvement sanguin ou à la perfusion intracardiaque de fixateur. Elles recevront également un analgésique 30 minutes avant induction de l'anesthésie.

Choix des espèces

Le recours à des outils génétiques performants et la spécificité du métabolisme énergétique des espèces homéothermes impose le choix de la souris comme modèle. Le mode d’action de l'hormone thyroïdienne, ainsi que la structure des récepteurs, sont similaires chez l’homme et la souris. Des adultes âgés de 2 à 4 mois seront utilisés pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'hypothalamus chez l'adulte. La maturation de l’hypothalamus est considérée comme terminée à l’issue de la puberté. Des juvéniles traités indirectement (via la mère) dès le 10ème jour de vie foetale et âgés de 15 jours en fin de procédure seront utilisés pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne au cours du développement de l'hypothalamus.

Sous anesthésie générale, des souris subissent une ouverture du crâne et des injections dans le cerveau pour y faire produire des protéines fluorescentes, au cours d'une opération d'environ 90 minutes, puis toutes sont tuées trois semaines plus tard sous anesthésie, sans réveil, pour prélever leur cerveau. 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec comme risques cités l'hypothermie, l'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie, la douleur après l'opération et une perte de poids rapide. Le projet relève de la recherche fondamentale sur un noyau du thalamus, et le porteur relie ses retombées aux troubles psychiatriques par des données d'imagerie selon lesquelles des altérations de ces circuits "pourraient contribuer aux symptômes". Pour décrire ce qui est injecté, il parle de "techniques de biologie moléculaire" et ne mentionne qu'une fois, en passant, une "injection de virus", sans en préciser la nature.

Objectifs

Le thalamus, porte d'entrée du cortex, est constitué d’un ensemble de structures subdivisées sur des critères anatomiques en deux catégories : les noyaux de premier ordre et les noyaux d’ordre supérieur. Les noyaux thalamiques de premier ordre ont fait l’objet de nombreuses études. Les relations entre les neurones de ces noyaux et les autres structures cérébrales ont été bien décrites et leurs rôles dans le traitement des informations, en particulier sensorielles, sont en partie établis. En revanche, l’organisation anatomique et les fonctions des noyaux d’ordre supérieur sont très mal connues. Les neurones de ces noyaux reçoivent des informations excitatrices et inhibitrices issues de nombreuses régions cérébrales mais la manière dont ces différentes entrées sont distribuées au niveau de la cellule thalamique unique et comment elles interagissent sont à ce jour inconnues. Centré sur un noyau d’ordre supérieur lié au système somatosensoriel, le noyau postérieur médian, notre projet vise à comprendre comment ces diverses informations sont intégrées par le neurone thalamique pour aboutir à un traitement complexe sensorimotreur.

Bénéfices attendus

Le thalamus est une structure sous-corticale par laquelle transitent la plupart des circuits neuronaux de notre cerveau ; elle établit de multiples connexions avec les régions corticales, sous-corticales et cérébelleuses. En tant que nœud de ce vaste système, le thalamus joue un rôle central dans le traitement des données sensorielles et constitue une plaque tournante essentielle pour le traitement cognitif, tel que mise en œuvre dans la mémoire de travail, l'attention ou pendant le sommeil. Des anomalies dans le système de connectivité thalamique ont été décrites chez les patients atteints de schizophrénie, de troubles bipolaires, de troubles dépressifs majeurs et de troubles du spectre autistique. De récentes données de neuro-imagerie proposent que des altérations de la circuiterie thalamique pourraient contribuer aux symptômes et aux déficits présents chez des patients psychiatriques. L’étude de la circuiterie thalamique aurait donc une grande utilité translationnelle et transdiagnostique mais les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à ces altérations sont peu connus. En étudiant de manière précise comment s’organise d’un point de vue fonctionnel la circuiterie thalamique, ce projet de recherche fondamentale apportera des données cellulaires et moléculaires indispensables pour répondre à ce type de question.

Procédures

Toutes les souris du projet recevront sous analgésie et anesthésie générale des injections intracérébrales afin de faire exprimer des protéines fluorescentes dans des régions spécifiques du cerveau par des techniques de biologie moléculaire. Chaque souris est opérée une fois et l'ensemble de la procédure chirurgicale, de l'induction au réveil de la souris, dure environ 90 minutes. Trois semaines après injection les protéines fluorescentes sont exprimées dans les neurones. Les souris sont alors euthanasiées sous anesthésie générale sans réveil et le cerveau est prélevé soit dans le but d'effectuer des études anatomiques, soit pour étudier les propriétés fonctionnelles des régions cérébrales d'intérêt, comme par exemple d'analyser le fonctionnement des réseaux de neurones.

Impact sur les animaux

Dans de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous analgésie et anesthésie générale pendant lesquelles une ouverture de la boîte crânienne est réalisée afin de procéder à des injections dans une région cérébrale donnée. Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : i) une hypothermie, ii) un arrêt cardio-respiratoire liée à l’anesthésie, III) une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux et iv) une perte de poids rapide.

Devenir

Toutes les souris sont euthanasiées environ 3 semaines après les injections intracérébrales. Les cerveaux sont ensuite prélevés soit dans le but d'effectuer des études anatomiques, soit pour étudier les propriétés fonctionnelles des régions cérébrales d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente du cerveau impose l'utilisation de modèles animaux. Ainsi, l’étude du fonctionnement des réseaux synaptiques ne peut être abordée que par des enregistrements effectués dans un cerveau intact ou sur des préparations ex-vivo qui préservent une grande partie de la circuiterie neuronale comme les préparations de tranches de cerveau. Par ailleurs, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris, qui permettent de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines, fait de cette espèce le modèle animal privilégié. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour les différentes procédures afin d’obtenir des résultats fiables a été dimensionné en s’appuyant sur nos études antérieures. L’analyse en continue des résultats nous permettra de limiter le nombre de souris dès que les valeurs moyennes estimées par rapport à notre échantillon seront dans l’intervalle de confiance satisfaisant. 250 souris seront nécessaires. Les animaux mâles et femelles seront utilisés. Cela permet de maximiser l’utilisation des animaux et de ne pas euthanasier inutilement des souris générées dans l’animalerie. Cette démarche s’inscrit donc dans l’esprit de la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans l’animalerie sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux est réalisé conformément à la directive européenne 2010-63-EU en terme d’espace et d’environnement. Les souris sont soumises à un cycle de lumière-obscurité dans un environnement à température et hygrométrie contrôlées avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. L’anxiété des animaux est réduite par un maintien en groupe social. Les cages complètes sont changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal est placé dans la cage. Après les interventions chirurgicales, le réveil des souris est étroitement surveillé. Afin de faciliter l’hydratation des croquettes humidifiées sont disposées au fond de la cage. Des analgésiques sont administrés pour gérer la douleur post-opératoire. Lorsque le réveil est complet, la souris retourne dans sa cage avec ses congénères. Une surveillance accrue journalière est réalisée pendant 5 jours suivant l’opération afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être. Les critères absolus suivants seront observés : i) Apparence et position anormale: poil ébouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie, ii) Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déshydratation, iii) une perte de poids rapide. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie puis 1 fois par semaine, et iv) difficulté respiratoire. Puis une surveillance quotidienne est assurée soit par l’expérimentateur soit par les zootechniciens qui préviennent le responsable du projet en cas d’anomalie. Celui-ci prend alors une décision sur le devenir de cet animal en coordination avec le vétérinaire-référent.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car il s’agit du modèle mammifère de référence pour les approches expérimentales nécessitant des modifications génétiques. La puissance des outils génétiques permettra de connaitre la nature des neurones, par exemple excitatrice ou inhibitrice, et d'étudier comment l'activation de ces neurones contrôle le fonctionnement des réseaux synaptiques. Les injections intracérébrales sont effectuées chez des souris âgées d'environ 6 à 8 semaines afin que le système somatosensoriel soit parfaitement mature. Les expériences anatomiques ou les enregistrements électrophysiologiques sont réalisés 3 à 4 semaines après l'injection de virus pour permettre l’expression des protéines, soit chez des souris âgées de 9 à 12 semaines.

Le but affiché est de commercialiser des agents qui font entrer de l'ADN ou de l'ARN dans les cellules, et les essais sur des souris doivent en vérifier l'activité et l'absence de toxicité. 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois injections, sous la peau, dans la veine, le muscle, le péritoine ou par le nez selon le produit, puis une prise de sang sous anesthésie avant d'être tuée pour l'examen de ses organes, avec un risque de thrombose, de réactions inflammatoires et de troubles de la démarche. Le porteur affirme que l'administration par voie locale ou générale est "nécessaire pour permettre de valider l'activité et l'absence de toxicité des produits", et choisit la souris parce qu'elle permet "d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.

Bénéfices attendus

Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.

Procédures

Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection et un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%). Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).

Raffinement

Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.

1 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le plexus veineux derrière l'œil, par la trachée, par gavage ou dans l'abdomen, et sont infectées par des bactéries pour provoquer un sepsis suivi d'une perte de poids et de poils hérissés. Le porteur indique retenir un inoculum faible censé éviter la mortalité, et précise qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré sur un projet portant sur le système immunitaire. Il étudie le rôle de lymphocytes régulateurs dans l'immunodépression qui suit une infection sévère et affirme que seule l'étude in vivo permet cette approche globale.

Objectifs

Notre laboratoire a montré que suite d’une infection sévère, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec des perturbations prolongées des capacités des organismes à se défendre contre une nouvelle infection. Cette cicatrice immunitaire associé à un plus haut risque de complication infectiologique secondaire est associée à l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes dont l’activation des lymphocytes dit « T régulateurs » spécialisés dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons montré qu’une sous population ces lymphocytes T régulateurs porteur d’un récepteur de type 2 au Tumoral Necrosis Factor (aussi appelé TNFR2) jouaient un rôle majeur la survenue de cette immunodépression faisant suite à une infection sévère. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes T régulateurs porteur du récepteur TNFR2 au cours de la défense anti-infectieuse et lors de la phase d’immunodepression post-septique.

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances des mécanismes d’extinction des capacités de réaction du système immunitaire faisant suite à une infection sévère aussi appelée immunosuppression post-septique (IS). Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par le sepsis sur les fonctions des lymphocytes des Treg et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection. Ceci nous permettra la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre les infections bactériennes.

Procédures

Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-veineuse retro-orbitale sous anesthésie générale. Un tiers des animaux de ce projet est soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale. Deux tiers des animaux sont soumis à une administration unique per os (sonde de gavage pour l’administration du traitement) en condition vigile. Un tiers des animaux est soumis à des injections intrapéritonéales en condition vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection bactérienne : Le modèle d’infection par administration de bactéries par voie intra-veineuse, a déjà été validé dans ce projet, nous utiliserons des souches bactériennes de référence de laboratoire. Nous réaliserons une injection dans le plexus veineux sous orbitaire d’une suspension bactérienne. Suite à l’administration de bactéries (inoculum faible concentration) par voie intra-veineuse, une inflammation est attendue durant les 4 premiers jours avec comme signes cliniques une perte de poids inférieure à 20% et des poils hérissés, suivis d’une récupération progressive de leur poids au 5ième jour du sepsis. Cette injection entraine une septicémie sans induction de mortalité, permettant d'évaluer l'impact d'une seconde infection et d'éviter les biais de sélection. Les procédures de gavage et de transfert adoptif utilisées au cours des procédures expérimentales n’induisent pas d’effets indésirables connus chez la souris. La pesée de référence est réalisée au J0 avant le début de l’induction du sepsis ou de tout autre procédure. Avec l’utilisation d’un inoculum bactérien faible pour l’induction du sepsis (permettant de reproduire l’IS), aucun signe de souffrance n’est observé en dehors d’une perte de poids inférieure à 20% et les poils hérissés. L’effet de la délétion du TNFR2 sur les Treg sur le sepsis. Il est envisageable que les Treg étant moins suppresseurs, les effets du sepsis sur l’état général des souris pourraient être plus marqués. Il en est de même pour l’effet du traitement par des anticorps anti-TNFR2 sur le sepsis. Pour ces raisons, Les animaux seront observés quotidiennement pendant 3 jours après l’induction du sepsis et pesés tous les 48 à 72h de façon à s’assurer que s’il y des effets, ils ne soient pas durables dans le temps. Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (inférieure à 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les mécanismes responsables d’une immunosuppression suite au sepsis sont à l’heure actuellement mal compris. Les méthodes in vitro développées par d’autres laboratoires de recherche ne permettent pas une étude globale des modifications entrainées par une activation du système immunitaire. L'étude du rôle des Treg dans cette maladie et la mise au point de nouveaux traitements ne peut se faire qu'in vivo. Cependant, dès que la question scientifique le permet nous privilégions l’utilisation de méthodes substitutives (méthode in vitro et ex vivo) pour y répondre. Nous avons développé des protocoles de culture de Treg primaires permettant de disposer d’une grande quantité de Treg.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=7) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative.

Raffinement

L’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. L’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas possible dans le cas de projet sur le système immunitaire. Comme indiqué dans notre tableau de points limites, il est également prévu un apport d’enrichissement en cas de signes cliniques légers ou modérés, définis par les scores de 1à 14 suivant notre échelle de suivi (cf annexe). Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’anesthésiant local afin d’anesthésier localement la trachée. Une anesthésie générale est réalisée pour les procédures d’injection intraveineuse. Pour les injections IV en retro-orbital, en plus de l'anesthésie par inhalation, une anesthésie ophtalmique sera réalisée sur l'œil qui recevra l'injection. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable, en comparaison des souris contrôles, elles ne développent aucune forme de maladie apparente même à l’âge d’un an.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections bactériennes sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature