Souris
Développement d’un modèle murin pour l’étude de la physiologie de la glande mammaire et du cil primaire au cours du cycle de reproduction.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
689 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 200 remises à disposition d'autres équipes et les autres tuées. L'étude repose sur deux élevages de souris génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue avant sevrage et administration de tamoxifène aux femelles pendant l'allaitement. Le porteur reconnaît que certaines souris peuvent présenter perte de poids, perte d'appétit et hypothermie persistante. Il rattache le projet à la compréhension des cancers du sein et affirme travailler en parallèle sur des mini-glandes mammaires in vitro pour limiter le recours à la souris.
Objectifs
Le développement et le remodelage de la glande mammaire lors du cycle de reproduction dépendent de plusieurs types cellulaires. Sous influence hormonale, les cellules mammaires prolifèrent et se différencient pour permettre le développement du tissu mammaire et la lactation. Une partie des cellules mammaires meurt post-lactation pour permettre le retour de la glande mammaire à un stade semblable à la glande vierge. Ce processus est appelé involution. Des cellules immunitaires de la glande mammaire permettent l’involution par l’élimination des débris de cellules mammaires. La nature des communications entre cellules mammaires et immunitaires qui permettent l’involution reste méconnue. Nous avons récemment montré que des cellules mammaires assemblent une antenne cellulaire nommée cil primaire. Cette antenne pourrait être impliquée dans la régulation des communications entre cellules pour permettre l’involution mammaire. Notre objectif est de tester cette hypothèse chez la souris à l’aide d’animaux génétiquement modifiés. Ces animaux permettent une inactivation de la formation de l’antenne cellulaire spécifiquement au cours du cycle de reproduction dans la glande mammaire. Ils représentent le seul moyen de pouvoir étudier le rôle du cil dans ce processus physiologique qui implique de nombreux acteurs cellulaires en interaction et sous influence hormonale.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de révéler de nouveaux mécanismes qui coordonnent la lactation et l’involution de la glande mammaire. Le bon déroulement de ces deux processus physiologiques est nécessaire à l’allaitement et au remodelage de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Des anomalies de lactation et de remodelage de la glande mammaire post-lactation peuvent conduire à des défauts d’allaitement et à des cancers du sein aggressifs. Les résultats du projet permettront le développement de nos connaissances sur la physiologie de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Ils révéleront de nouvelles informations sur les causes des maladies qui y sont associées et pourraient à long-terme révéler de nouvelles pistes pour améliorer l’allaitement et prévenir les cancers du sein suite à une grossesse. Le développement d’un modèle murin est essentiel pour comprendre la biologie de la glande mammaire qui répond à des hormones dans l’organisme entier. Le modèle murin nous permettra d’étudier la physiologie de la glande mammaire dans un contexte unique et pertinent.
Procédures
Le développement du projet nécessite la constitution de deux élevages de souris génétiquement modifiées. L’identification des animaux d’intérêt au sein de ces élevages nécessitera de petites biopsies sur l’extrémité de la queue d’animaux avant leur sevrage (intervention < 1 min). Cette intervention n’interviendra qu’une fois dans la vie de la souris. De plus, du tamoxifène (un médicament qui est utilisé chez l’homme pour le traitement de certains cancers) sera administré à un groupe restreint de souris adultes dans le projet, soit par la nourriture ou par injection sous la peau. L’administration du tamoxifène se fera durant 5 jours à la fin de la lactation, en continue dans la nourriture, ou par injection à 5 reprises sous la peau au cours des 5 derniers jours de l’allaitement (durée < 1 minute/animal/injection, 1 injection par jour sur 5 jours).
Impact sur les animaux
Les petites biopsies de l’extrémité de la queue chez la souris ne devraient pas engendrer de douleur car elles se feront sous anesthésie mais pourraient générer une nuisance pour les animaux qui serait liée au processus de cicatrisation. Nous injecterons du tamoxifène par voie sous cutannée chez des souris femelles en allaitement. Cet acte pourrait générer un incomfort pour les souris. Nous n’excluons pas que des animaux pourraient démontrer des signes de mauvais état général (du fait de la procédure ou non) comme la perte de poids et d’appétit ainsi qu’une hypothermie persistante. Des observations et examens cliniques seront réalisés très régulièrement afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques atteignant des points limites qui nécessite des soins adaptés. Nous suivrons les recommandations éthiques de la Structure de Bien-Être Animal de notre établissement.
Devenir
Les animaux reproducteurs qui détiennent les modifications génétiques souhaitées dans nos élevages seront maintenus en vie tout au long du projet pour l'élevage et l'administration au tamoxifène puis mis à mort à la fin du projet pour collecter les tissus et afin d'effectuer nos analyses ex vivo. Les animaux qui ne détiennent pas les modifications génétiques souhaitées et qui auront toutefois été exposés au tamoxifène avant leur sevrage (par allaitement) seront mis à mort au sevrage car le tamoxifène pourrait interférer avec d'autres expérimentation si les animaux étaient mis à disposition de la communauté. Les animaux qui ne détiennent pas les modifications génétiques souhaitées dans le projet et qui n’auront pas été au contact du tamoxifène seront mis à disposition de la communauté pour pouvoir être réutilisés.
Remplacement
Le projet vise à identifier des nouvelles connaissances sur le fonctionnement de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Notre objectif est d’étudier les communications intercellulaires dans cet organe et l’implication d’une antenne cellulaire, le cil primaire, dans ces communications au sein de ce tissu qui répond aux hormones dans l’organisme entier. Il n’existe pas à ce jour de modèle alternatif à l’animal pour la culture en dehors de l’organisme de divers types de cellules qui répondent aux hormones et miment le cycle de reproduction. L’utilisation de la souris est essentielle à la compréhension fine du fonctionnement de la glande mammaire. Toutefois, nous travaillons sur la culture de mini-glandes mammaires en dehors de l’organismes (organoides in vitro) qui contiennent les différents types cellulaires mammaires. Nous nous efforçons d’utiliser ces modèles alternatifs pour répondre à nos questions scientifiques qui ne concernent que la biologie du tissu mammaires en absence d’autres types cellulaires et sans stimuli hormonaux. Nous avons par exemple utilisé ces modèles pour développer notre stratégie génétique chez la souris. Nos travaux in vitro nous permettent de limiter tant que possible le recours à la souris et de proposer des stratégies pertinentes et optimisées lorsque le recours à la souris est indispensable.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale. Les protocoles d’administration du tamoxifène, issus de la bibliographie, sont validés par la communauté internationale et robustes. Nous anticipons donc que notre stratégie avec un nombre d’animaux restreint au minimum aboutira à une étude féconde et à de nouvelles découvertes. Le personnel collaborera avec d’autres équipes, notamment dans le partage des animaux (pour les animaux disponibles et inadaptés pour notre projet) et dans le partage des données notamment par la mise en commun des données et des expertises analytiques.
Raffinement
Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible, notamment via un maintien des groupes sociaux et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier, cabanes). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une manipulation la plus rapide et la moins fréquente possible. Différents lieux accueilleront les animaux pour une distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et d’euthanasie. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment suivi par un examen clinique afin de déterminer le plus précocement possible les douleurs éventuelles qui nécessitent d’adapter le protocole et d’apporter des soins nécessaires.
Choix des espèces
La souris est particulièrement adaptée pour notre étude puisque les phases du cycle de reproduction sont bien décrites. Le remodelage de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction est rapide chez la souris et la physiologie de la glande mammaire murine et humaine est similaire. Nous avons déjà des résultats préliminaires chez la souris sur la biologie de la glande mammaire. Nous avons accès à des souris génétiquement modifiées et ne devons pas créer de nouveaux modèles. Pour ces raisons nous choisissons de poursuivre nos travaux chez la souris. Nous souhaitons étudier la biologie de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction. Nous élèverons des souris mâles et femelles pour créer nos modèles d’étude. Une fois les modèles établis, nous travaillerons avec des femelles en cours d’allaitement, post-allaitement et en gestation pour nos analyses du fonctionnement de la glande mammaire femelle. Nous travaillerons avec des souris entre 6 semaines et 1 an d'âge. Les animaux de cette classe d'âge sont aptes à la reproduction. Ils permettent nos analyses de la physiologie de la glande mammaire au cours du cycle de reproduction.
Evaluation de l’injectabilité de polymère d’anticancéreux par voie sous cutanée
- Recherche appliquée
- Cancers
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée d'un nanopolymère anticancéreux au moyen d'un injecteur sans aiguille, puis des séances d'imagerie sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever la peau au site d'injection. Le porteur décrit un projet visant surtout à évaluer un dispositif d'auto-injection destiné au confort des patients en oncologie. Il affirme que l'étude de la distribution du produit impose un "organisme entier" et écarte les modèles ex vivo.
Objectifs
Le projet global de l’équipe est de fabriquer de nouvelles formulations galéniques injectables par voie sous cutanée , de type nanopolymères (molècule chimique de taille nanométrique) contenant des molécules à visée thérapeutique dans le domaine du cancer. La plupart des chimiothérapies anticancéreuses actuelles présentent une toxicité systémique importante limitant l’augmentation des doses administrées et donc les résultats thérapeutiques. Afin de permettre aux patients en oncologie de s'injecter en autonomie par voie sous cutanée leur chimiothérapie, 5 formulations de nanopolymères ont été développés par nos partenaires et ont fait preuve de résultats prometteurs sur les cellules. Des études d’innocuité permettant de vérifier que ces nanopolymères n’ont pas d’effet toxique au niveau du tissu sous-cutané, ainsi que des études d'efficacité antitumorale de ces nanopolymères après injection sous cutanée ont également déjà démontré des résultats prometteurs. L'objectif de cette étude est alors de tester l'administration de ces nanopolymères à l'aide d'un injecteur sans aiguille, afin de toujours améliorer le confort de vie du patient.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendues sont l'aide à la décision de la définition du nanopolymère optimal pour une administration sous cutanée d'agents anticancéreux. L'emploi d'un tel dispositif d'injectabilité permettrait en effet de faciliter l'autoadministration du patient ainsi que son confort.
Procédures
1/ Administration unique des traitements par voie sous cutanée (102 animaux) - durée de l'intervention: quelques secondes 2/ Imagerie répétée sur animal anesthésié (51 animaux) - durée de chaque intervention: 10 minutes sous anesthésie 3/Prélèvement de sang et peau (51 animaux)- durée de l'intervention: 5 minutes sous anesthésie
Impact sur les animaux
Bien qu'administré par voie sous cutanée, du fait de ce nouvel dispositif, la douleur à l'injection devrait être de très courte durée et largement réduite. Lors des études de biodistribution par imageur et de prélèvement de peau au niveau du site d'injection, entre les omoplates, les animaux seront anesthésiés par cage à induction ce qui peut stresser l'animal avant l'endormissement.
Devenir
Afin d'évaluer la non toxicité des nanopolymères et leur bonne administration sous cutanée, nous devrons prélever chez lintégralité des animaux des échantillons de peau au niveau du site d'injection, nécessitant donc leur mise à mort.
Remplacement
Le développement de nouveau médicament nécessite la mise en place d’expérience chez l’animal, afin de pouvoir étudier sa distribution et sa toxicité éventuelle dans un organisme entier. Ceci est essentiel pour la prise en compte des mécanismes de défense et de métabolisation qui seront mis en place par l’organisme et qui ne peuvent pas être reproduit in vitro du fait de l’implication de nombreux systèmes biologiques (système immunitaire notamment). Des modèles ex vivo ne permettraient pas de mimer l'injection sous cutanée, l'atteinte de la circulation sanguine et la biodistribution des polymères.
Réduction
Les études de biodistribution sont faites par imagerie et sont donc longitudinales et non invasives. Une étude pilote est mise en place pour limiter le nombre d'animaux par la suite.
Raffinement
Le bien être animal est respecté: - Conditions d'hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d'un cycle jour/nuit inversé par périodes de 12 heures - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - souris hébergées en groupe (6 souris par cage) - enrichissement des cages avec des domes en plastique et cotons prédécoupés spécifiques/stériles, réduction du stress (les études de biodistribution seront conduites sous anesthésie générale gazeuse au sévoflurane) et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (exemple de critères d'évaluation de la douleur: difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). L'intégralité de la conduite à tenir et la définition exacte des points limites se trouvent dans une grille des scores de la douleur qui évalue le bien être animal sur chacun de ces points et donne les directives à suivre en fonction de l'état de l'animal (ex de conduite à tenir: augmentation des fréquences de suivi, utilisation d'analgésique, mise à mort immédiate).
Choix des espèces
La plupart des études publiées dans la littérature concernant l’évaluation de nouveaux médicaments anticancéreux ainsi que nos études préalables sont effectuées sur la souris. De plus tous nos travaux préliminaires de biodistribution, pharmacocinétique et d'efficacité antitumorale ont déja été fait sur cette espèce. Le dispositif d'administration sous cutanée sans aiguille testé pour cette étude n'est également développé que sur les souris ou rats. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanopolymères. De plus 6 semaines est considéré comme l'âge adulte, âge le plus retrouvé dans les cancers du sein.
Mécanismes cellulaires et moléculaires de la calcification valvulaire aortique dépendante de Pou5f1/ERRalpha et d’une dyslipidémie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras sans vitamine D pendant quatre mois, ces souris ApoE-/- reçoivent un gavage de tamoxifène et des échographies cardiaques sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les valves aortiques. Le porteur reconnaît que le régime gras apporte un inconfort mais affirme qu'il n'affecte pas la mobilité des animaux. Il présente la souris comme "un des très rares modèles" de calcification des valves et attend des données extrapolables à l'humain.
Objectifs
Environ 500 millions de personnes dans le monde souffriront de calcification de la valve aortique (CVA) d’ici 2050. La CVAest une maladie progressive caractérisée par une inflammation, une fibrose et finalement une calcification de la valve. Cela conduit à un retréssissement aortique, une maladie grave précipitant le patient vers une insuffisance cardiaque. Le seul traitement pour la CAVD, le remplacement de la valve , n’est pas disponible pour 85% de la population mondiale. En France, 10000 remplacements valvulaires aortiques sont effectués chaque année sans toujours un bon résultat et avec des suites à la chirurgie ou même au protocole sans chirurgie . Il n’existe aucun médicament pour cette pathologie. La dyslipidémie joue un rôle majeur dans la CVA. Cependant, les cellules valvulaires (unités biologiques composant la valve) spécifiquement impliquées dans la maladie sont encore en débat. De plus, les femmes, même atteintes de dyslipidémie, sont beaucoup moins sujettes à la CVA que les hommes. Fait intéressant, le microbiote intestinal masculin et féminin diffère. Notre projet propose : 1. Le suivi et l'identification des cellules et de leur profil de gènes à l’origine de la CVA dans un modèle murin de dyslipidémie- 2. L 'analyse du microbiote des souris mâles et femelles atteintes de dyslipidémie au cours de la CVA et après dérégulation de la voie dépendante de des hormones oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux cibler une thérapie anti calcification valvulaire par une connaissance plus précise du mécanisme pathologique notre étude devrait apporter des informations sur la différence de pathologie valvulaire ches les hommes et les femmes et des pistes de médicaments pour la maladie. Comme le microbiote de l'intestin de la souris est fonctionnellement similaire à plus de 90 % à celui de l'homme, nous nous attendons à ce que les données soient extrapolables à la situation des patients humains.
Procédures
régime riche en acide gras (42% matière grasse, ENVIGO MD.88137 sans vitamine D3) :24 4 mois echocardiographie sous anesthésie isoflurane 30 min: 48 gavage tamoxifène: protocole de 1 min: 6
Impact sur les animaux
L’obésité des souris ApoE-/- en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie . Le gavage au tamoxifène
Devenir
tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la dernière étape (Echocardiographie) du projet. Cela permetra de plus de collecter les valves aortiques pour les experience de transcriptomique.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous avons au laboratoire et utiliserons des cellules valvulaires aortiques de patients CVA VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et avons dérivé à partir de ces cellules des cellules iPS spécifiques ; nous les re-différencions en cellules valvulaires et faisons des co-cultures 3D de VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et identifier les cibles médicamenteuses.
Réduction
Les mêmes souris serviront à nos deux objectifs analyse clonale et micobiote intestinal . Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une signification statistique
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage. Le tamoxifène est donné en présence de progestérone pour éviter les effects néfastes de blocage des récepteurs endogènes. L’anesthésie est utilisée pour l’échocardiographie qui se réalise en positionant l'animal sur un tapis chauffant et une sonde rectale pour controller sa température pendant les 20-30 min du protocole d’ échocardiographie.
Choix des espèces
la souris ApoE-/- est un des très rares modèles animal de calcification des valves les souris seront adultes, seul stade pour observer la pathologie
Etude du rôle des Facteurs de Transcription de la famille Ikaros dans la mégacaryopoïèse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales de tamoxifène cinq jours de suite et subissent jusqu'à six prélèvements de sang à la queue espacés d'une semaine, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour étudier le rôle de la famille de protéines Ikaros dans la formation des plaquettes. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des lésions cutanées ou une surinfection au point d'injection. Il affirme que les cellules souches humaines ne parviennent pas encore à maturer suffisamment en culture pour ce type d'étude.
Objectifs
Les thrombopénies constitutionnelles sont un groupe de maladies rares d’origine génétique caractérisées par un faible nombre de plaquettes sanguine ce qui est à l’origine de l’apparition de troubles hémorragiques. Récemment, des mutations dans la protéine PEGASUS (Ikzf5), appartenant à la famille IKAROS (IKZF), ont été identifiées chez des patients présentant une thrombopénie modérée, des plaquettes de grande taille et une absence de granules. La famille de protéines Ikaros est composée de 5 membres, Ikaros (Ikzf1), Hélios (Ikzf2), Eos (Ikzf3), Aiolos (Ikzf4) et Pegasus (Ikzf5) qui n’avaient jusqu’ici qu’été impliqués dans le contrôle de la production des globules blancs. Dans ce contexte, nous souhaitons mieux comprendre le rôle des différents membres de la famille Ikaros dans la biogénèse des plaquettes sanguines et identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu.
Bénéfices attendus
La compréhension des thrombopénies constitutionnelles a bénéficié ces dernières années d’une amélioration des connaissances des étapes de formation des plaquettes (mégacaryopoïèse). Cependant, ces maladies restent encore largement incomprises et sous-diagnostiquées. Etudier le rôle de facteurs de transcription comme ceux de la famille Ikaros permettra d’accroître nos connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les différentes étapes de maturation des plaquettes (extension du cytoplasme, biogénèse des granules, capacité des mégacaryocytes à produire des plaquettes). Ce projet nous permettera d’améliorer notre compréhension de l’étiologie des saignements observés chez les patients et leur prise en charge.
Procédures
Des injections intra-péritonéales d'une durée de quelques secondes seront réalisées sur 72 animaux vigiles à raison d'une injection par jour pendant 5 jours consécutifs. Des prélèvements sanguins de moins d'une minutes seront toujours faits sur animaux sous anesthésie générale. 72 souris auront un prélèvement unique de sang de quelques microlitres à la queue puis une semaine plus tard un prélèvement de sang terminal (grand volume), toujours sous anesthésie générale. 72 souris auront 6 prélèvements de sang à la queue espacés d'une semaine chacun. Après les 6 semaines de prélèvements, un prélèvement de sang terminal (grand volume) sera effectué, toujours sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des lignées - possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue (environ 30s avant l’endormissement). -possibilité et/ou difficulté de mobilité/engourdissement au réveil des suites de l’anesthésie gazeuse, durée maximale estimée à 3min. - prélèvements de sang à la queue : possible apparition d’inflammation ou de douleur au site de coupure - Apparition de lésions cutanées ou à des surinfections au site d’injection du tamoxifène en intra-péritonéale.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort à la fin des procédures car un grand volume de sang est prélevé afin de compter et analyser différents composants du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes).
Remplacement
Les différentes étapes de la biogénèse des plaquettes sanguines ne sont pas suffisamment caractérisées chez l'humain alors qu’elles le sont dans les modèles murins. En effet, si les cellules iPS (cellules pluripotentes induites) peuvent être utilisées pour reproduire des mutations retrouvées chez l'Homme, les techniques de culture cellulaires actuelles ne leur permettent pas encore de maturer de manière suffisamment efficace pour réaliser des études approfondies de la biogénèse des plaquettes.
Réduction
Nous avons estimé la taille des groupes selon nos expériences du modèle le but étant de réduire le plus possible le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse statistique de notre étude.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours jusqu’à la mise à mort et les observations seront consignées dans une fiche de suivi. A la moindre apparition d’un signe de souffrance, un score sera calculé et des mesures seront prises. Tous les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le laboratoire possède une expérience éprouvée de l’étude de la biogénèse des plaquettes dans les modèles murins. Les animaux seront utilisés au stade adulte, pubères âgés de 8 à 20 semaines maximum, tranche d’âge où il y a un intérêt à observer et analyser la biogénèse des plaquettes au stade adulte afin d’avoir des groupes représentatifs.
Elevage d’une lignée murine immunodéficiente à phénotype dommageable
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
9 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 8 882 transférées vers d'autres projets d'expérimentation et les autres tuées. Issues du croisement de deux lignées immunodéficientes, elles portent un phénotype déclaré dommageable qui les rend vulnérables à toute infection, et sont élevées en conditions stériles pour que ce phénotype ne s'exprime pas. Le porteur indique que le génotypage combine tatouage des phalanges et biopsie de la queue sur des animaux de dix jours, geste qui peut provoquer un inconfort. Il revendique l'intérêt de ces souris pour "mimer les cancers humains" et présente la demande comme une simple déclaration d'élevage imposée par la réglementation.
Objectifs
La lignée de souris qui est l'objet de cette Demande d'Autorisation de Projet (DAP) est un croisement entre deux lignées immunodéprimées : les animaux issus de ce croisement sont donc fortement immunodéficients (sans défenses immunitaires). Leur phénotype (l'ensemble des caractères visibles) est par conséquent considéré comme dommageable : ils deviennent sensibles et vulnérables à tout pathogène, dont l'infection peut leur être délétère. Cependant, ce phénotype peut ne pas s'exprimer si leur élevage est réalisé dans des conditions sanitaires optimales : statut sanitaire contrôlé sans pathogène, hébergement en cages ventilées, manipulation sous hotte, utilisation d'équipements, d'aliment, d'eau de boisson et d'enrichissements stériles, ce qui est le cas dans notre Etablissement Utilisateur. Désormais la règlementation européenne nous demande de déclarer l'élevage de ces animaux à phénotype dommageable, même si ce phénotype ne s'exprime pas grâce aux conditions adéquates de maintien de cette lignée. C'est l'objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Cette lignée est utilisée par de nombreuses équipes de notre Etablissement Utilisateur, étant immunodéficiente elle représente un modèle de choix en oncologie afin de pouvoir mimer les cancers humains. Elle est également très résistante aux rayons X, ce qui permet de combiner la chimiothérapie et radiothérapie lors de protocoles de traitement, et de s'approcher au plus près des protocoles thérapeutiques humains.
Procédures
Il y aura une biopsie de queue (1-2 mm) sur certains nouveaux-nés d'environ 10 jours, une seule fois, pour leur génotypage. Ce prélèvement dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’élevage en lui-même de la lignée de souris qui fait l'objet de cette DAP ne présente pas de nuisance ou d’effet indésirables : étant donné les conditions d’hébergement et de soin, le phénotype délétère ne s’exprime pas. La technique de génotypage décrite dans cette DAP pour les animaux nécessaires au rafraichissement génétique est composée de 2 actes techniques invasifs: l'identification par tatouage des phalanges, et la biopsie de queue. Chacun de ces actes à lui seul n'induit pas de douleur, mais le cumul des deux actes de manière très rapprochée (quelques secondes d'intervalle) peut induire un inconfort léger et transitoire pour l'animal âgé de 10 jours.
Devenir
Procédure 1: Les animaux arrivant en fin de fertilité (environ 6 mois d'âge) sont mis à mort par inhalation d'un gradient de CO2. Les animaux destinés à être expérimentés sont transférés en zone d'Expérimentation et inclus dans d'autres DAP en utilisation continue. Procédure 2: Après génotypage, si le génotype n'est pas d'intérêt, les animaux seront mis à mort par inhalation d'un gradient de CO2. Si le génotype correspond à celui qui doit être utilisé pour le rafraichissement génétique, alors ils seront destinés à la mise en accouplement.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. De plus, les lignées de souris immunodéficientes restent très intéressantes pour appliquer des paramètres humains en oncologie sans risque de rejet.
Réduction
Nous essayons de prévoir nos plans de production au plus précis afin de ne pas surproduire. Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Seuls les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt au moment du rafraichissement génétique seront sacrifiés.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Ils sont hébergés par couple pour les reproducteurs, ou par 5 pour les animaux de stock avant transfert en expérimentation. Nos conditions d'élevage permettent au phénotype dommageable de ne pas s'exprimer : cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, aliment, eau et enrichissements stérilisés. Ces derniers sont variés et adaptés au type d'animaux dans la cage (reproducteurs : plateforme+boule papier kraft+cotons; stock : plateforme+tunnel+cotons). Concernant les lots d'animaux qui doivent être génotypés (rafraichissement génétique), les préleveurs de notre Etablissement Utilisateur sont des expérimentateurs chevronnés et ont plusieurs années de pratique dans cette procédure de génotypage. Le geste est précis, rapide et maîtrisé. Ainsi l'inconfort et le stress de l'animal sont de courte durée.
Choix des espèces
Au sein de notre Etablissement Utilisateur, l'ensemble des équipes de recherche utilise le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de mimer Les animaux utilisés dans cette DAP sont déclarés dès leur naissance, génotypés aux environs de 10 jours (procédure 2), puis mis en accouplement à l'âge de 8 semaines (procédure 1), jusqu'à la fin de leur période fertile (environ 6 mois).
Etude de l’interaction des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique avec les lymphocytes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 150 étant classées en gravité sévère. Une pathologie neuro-inflammatoire est induite par injection intra-péritonéale et 100 souris chimères subissent une irradiation, pour étudier le passage des lymphocytes dans le système nerveux central. Le porteur indique que les souris malades présentent perte de poids et troubles moteurs, et mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne fournit de résultats exploitables et décrit son modèle comme "unique".
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'étudier les interactions entre les lymphocytes et les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique afin de cerner les mécanismes et particularités permettant un passage des lymphocytes dans le système nerveux central et le rôle de ce passage en condition physiologiques et pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mieux comprendre les interactions entre système immunitaire et système nerveux central, en condition physiologique afin de comprendre les conséquences de ces interactions en terme de susceptibilité aux infections, aux maladies auto-immunes mais aussi dans le cadre du vieillissement et des pathologies neurodégénratives. En conditions pathologiques, les modèles développés, in vitro et in vivo permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
Une pathologie neurologique inflammatoire sera induite par injection intra péritonéale unique chez certains animaux, pathologie qui pourra être surveillée pour étude entre 2 jours et 90 jours. Certains animaux seront des modèles de souris chimères et subiront une irradiation (100 souris) unique de 6 minutes et 36 secondes.
Impact sur les animaux
Une pathologie neurologique est attendue lors de l'étude de la condition pathologique. Dans ce cas les souris présentent des signes cliniques (perte de poids, troubles moteurs) et immunologiques qui seront alors surveillés.
Devenir
Au total l'ensemble des animaux sera mis à mort afin de pouvoir quantifier et étudier l'infiltrat lymphocytaire dans le système nerveux central.
Remplacement
L’étude de l’implication des cellules endothéliales dans la migration des lymphocytes dans le système nerveux central via la reconnaissance de l’antigène, nécessite des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées telles que l’activation et la différenciation lymphocytaire in vivo, la migration cellulaire, l’entrée et l’activation dans le tissu cible. Il n’existe pas actuellement des méthodes alternatives à ces études in vivo pour l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents des pathologies humaines. Notre modèle d’étude unique permet d’obtenir des informations nouvelles et importantes concernant les affections neuro-inflammatoires.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé d'après les conditions minimales nécessaires à une puissance statistique permettant d'établir des conclusions statistiques recevables. Les animaux de ces procédures étant utilisés pour des expérimentations in vivo ou in vitro pour générer des cultures primaires, le nombre peu difficilement être réduit. Cependant, la nouvelle version de ce protocole intègre une révision à la baisse des effectifs estimés en raison des premiers résultats d'étude sur les lymphocytes CD4 ayant mis en lumière des difficultés techniques non résolvables à l'heure actuelle. L'ensemble des organes étudiés sont prelevés chez les souris (système nerveux central mais aussi rate, ganglions, et tube digestif) afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux inclus dans les procédures en condition pathologiques ou dans la procédure chimère auront une surveillance accrue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance anormale induisant son exclusion de la procédure et sa mise à mort. Les points limites à surveiller identifiés sont : Activité extrême (grattage ou léchage anormal) - Posture (courbée ou prostrée) - Aspect (perte de poids, déshydratation, poil hérissé, taches) - Absence de toilettage et diminution de l’appétit - Respiration anormale (rythme et mouvement) - Stéréotypies et hyperactivité (démangeaisons, léchage) - Présence d’anomalie (blessure, inflammation). Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie après une anesthésie gazeuse par isoflurane. Les animaux seront au maximum 5 par cage et auront un enrigissement permettant une stimulation de leurs comportements naturels et l'amélioration de leur bien être selon les recommandations en cours dans l'établissement utilisateur. Lors du suivi par test comportemental, les animaux auront une période d'entrainement progressive de 3 jours avant de débuter les tests comportementaux mesurés.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines (maladies infectieuses, maladies inflammatoires) comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques. Notre modèle, floxé, a été développé dans cette espèce et aucune autre espèce d’animaux possédant ce transgène n’est disponible. De plus, l’utilisation de la souris permet une compatibilité cellulaire avec les autres modèles murins développés. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Adultes entre 6 et 16 semaines d’âge car nous avons besoin d'animaux adultes qui ont un développement des systèmes immunitaire et nerveux central complet pour nos expériences. Seule la procédure 1 pour l'induction du modèle est réalisée plus tôt.
Cibler les protéines de sporozoïtes de Plasmodium pour prévenir le paludisme dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de parasites et de protéines, sont exposées 45 minutes à des piqûres de moustiques sous anesthésie et subissent des prélèvements de sang tous les un à deux jours, pour tester des protéines de Plasmodium comme cibles vaccinales contre le paludisme. Le porteur indique que l'infection provoque affaiblissement, anémie et symptômes neurologiques, et que les animaux sont tués avant d'atteindre les points limites. Il écarte le remplacement au motif qu'aucune culture in vitro continue du parasite n'existe et qu'il faut un "organisme muni d'un système immunitaire", tandis que la preuve de concept vaccinale annoncée reste au conditionnel.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans la recherche de nouvelles cibles vaccinales ou thérapeutiques ciblant la phase hépatique du paludisme, qui constitue la première étape d'infection chez l'homme après la transmission de Plasmodium, le parasite responsable du paludisme, par un moustique. Plusieurs protéines de Plasmodium ont été identifiées comme jouant un rôle essentiel au cours de l'infection et constituent des cibles vaccinales potentielles. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei pour caractériser la fonction de ces protéines et tester si elles sont des cibles potentielles pour des anticorps neutralisants.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait d'une part améliorer notre compréhension des mécanismes d'infection du foie par Plasmodium au cours du paludisme, d'autre part apporter la preuve de concept que de nouveaux antigènes de Plasmodium peuvent être ciblés par des anticorps neutralisants. La validation pré-clinique de nouvelles cibles vaccinales pourrait ouvrir de nouvelles perspective pour lutter contre le paludisme.
Procédures
Administrations sur animaux vigiles: injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes), injection sous-cutanée de protéines (3 injections espacées de 2 semaines, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes), administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours). Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement d'une goutte de sang ( tous les 1 à 2 jours pendant 3 à 21 jours, durée du geste 10 secondes). Prélèvements sur animaux anesthésiés: prélèvement de sang (acte unique, durée 10 minutes). Exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes). Imagerie en bioluminescence sur animaux anesthésiés (pendant moins de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales, intraveineuses ou sous-cutanées sur animaux vigiles, stress ou douleur de courte durée lors de l'administration orale de médicament sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, douleur au site des injections sous-cutanées, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie, symptômes neurologiques).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.
Remplacement
Le projet vise à caractériser dans un modèle murin la fonction de protéines essentielles du parasite Plasmodium, l'agent du paludisme, et à évaluer l'efficacité d'une vaccination contre ces protéines. Il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue de Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour les études fonctionnelles. D'autre part, l'analyse de l'effet protecteur d'une immunisation nécessite le recours à un organisme muni d'un système immunitaire (en l'occurence la souris) pour pouvoir étudier les réponses anticorps.
Réduction
Au total ce projet utilisera 430 souris. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires aux études fonctionnelles. Pour les immunisations, la taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La mesure de la charge parasitaire par bioluminescence est une méthode peu invasive, contribuant au raffinement des procédures. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites infectant l'homme. Ce modèle est en particulier pertinent pour étudier la fonction de protéines essentielles du parasites, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. La souris est également un hôte doté d'un système immunitaire permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies de vaccination contre le paludisme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.
Caractérisation du métabolisme glucidique chez des souris atteintes de glycogénose de type III.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses par transgénèse d'une glycogénose de type III, elles subissent des biopsies de la queue, des jeûnes répétés de 6 à 12 heures, des injections intra-abdominales puis des incisions de la queue pour mesurer leur glycémie, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort pour prélever foie, reins et intestins. Le porteur indique que le jeûne peut provoquer des hypoglycémies avec prostration et refroidissement, et que 10 à 30 % de ces souris développent des tumeurs du foie entre 15 et 18 mois. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la régulation du sucre entre organes impose de travailler sur l'organisme "en entier" et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Le glycogène est la forme de stockage de sucre apporté par l’alimentation. Il est principalement accumulé dans le foie et dans les muscles. Sa dégradation par le foie permet de libérer du sucre dans le sang pour maintenir la glycémie (concentration de sucre dans le sang) autour de 1g/L, et cela dès la fin d’un repas. Une baisse de la glycémie en dessous de 0,7 g/L est appelée hypoglycémie. La glycogénose de type III est une maladie génétique rare due à l’absence de l’enzyme qui permet la dégradation du glycogène en molécule simple de sucre. Cette maladie se caractérise, dès le plus jeune âge, par des hypoglycémies, lors de jeûnes courts, et l’accumulation de glycogène dans le foie. Il est connu que ces patients peuvent maintenir leur glycémie en induisant la production de sucre par l’organisme par une autre voie métabolique à partir de substrats comme les acides aminés (produits de dégradation des protéines). Ainsi, pour éviter les hypoglycémies qui peuvent être fatales, les patients doivent manger régulièrement, en privilégiant les sucres lents (maïzena cru) et des aliments riches en protéines. Ce projet a pour objectif de caractériser les conséquences exactes de l’absence de la dégradation du glycogène sur le métabolisme du foie et la régulation de la glycémie, en déterminant le rôle des deux autres tissus capables de produire du sucre, les reins et l’intestin. Pour cela, nous disposons d’un modèle de souris transgéniques qui développent les mêmes symptômes que les patients atteints de glycogénose de type III. Nous proposons d’étudier la régulation de la glycémie à partir de différents substrats qui sont connus pour être préférentiellement utilisés par le foie ou par les reins/l’intestin. Ceci nous permettra d’identifier la contribution de ces 3 organes dans le maintien de la glycémie chez les patients atteints de glycogénose de type III. Nous étudierons aussi le métabolisme hépatique, rénal et intestinal après un jeûne limité à 12h, temps nécessaire pour l’utilisation des stocks de glycogène du foie chez les souris saines. Ce projet devrait permettre de mieux définir les mécanismes moléculaires permettant aux souris atteintes de glycogénose de type III de maintenir leur glycémie et d’évaluer le rôle des reins et de l’intestin en l’absence de dégradation des stocks de glycogène par le foie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet devrait permettre de mieux caractériser l’adaptation du métabolisme chez des souris atteintes de glycogénose de type III pour maintenir une glycémie physiologique, évitant le décès des souris par hypoglycémie lors de jeûne court. Notre hypothèse est que les reins et l’intestin pourraient compenser la perte de la production de sucre par le foie. Ainsi, ce projet devrait mettre en exergue la contribution des reins et de l’intestin dans le maintien de la glycémie. Cette étude permettra aussi de comprendre les mécanismes moléculaires induits chez les patients traités par des régimes enrichis en protéines. Ces régimes sont connus pour apporter des acides aminés, après dégradation des protéines, qui sont utilisés comme substrats pour produire du sucre, principalement par les reins et l’intestin, alors que le foie ne peut pas produire de sucre à partir de ces acides aminés.
Procédures
Les souris subissent une biopsie de l’extrémité de la queue qui est un geste qui dure quelques secondes. Les souris seront soumises à 2 périodes de jeûne de 6 h, et à une période de jeûne de 12h. Pour déterminer l’effet des 2 produits administrés aux souris, la solution sera injectée progressivement, en environ 30 sec-1 min, dans l’abdomen des souris. Leur glycémie sera ensuite mesurée sur une période de 2 heures, après l’incision de l’extrémité de leur queue. L’incision est un geste très rapide qui dure 1 ou 2 secondes, et qui sera réalisé juste avant l’injection des produits à tester. Une prise de sang sera réalisée en moins de 1 minute, avant la mise à mort des souris. Au total, l’expérimentation s’étalera sur 3 semaines.
Impact sur les animaux
- Les souris atteintes de glycogénose de type III sont susceptibles de développer des hypoglycémies au cours du jeûne de 12h qui peuvent entrainer un mal-être général, caractérisé par un ralentissement de leur déplacement, même sous stimulation du zootechnicien, une prostration, et éventuellement un refroidissement de l’animal. - De plus, ces souris (entre 10 et 30%) peuvent développer des tumeurs hépatiques entre 15 et 18 mois. - L’entaille de l’extrémité de la queue des souris entraine une légère douleur. - L’injection de produits chimiques peut entrainer une légère inflammation du péritoine. - La prise de sang réalisée peut entrainer une légère douleur due à la piqure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissu par une méthode éthiquement autorisée. Le foie, les reins et les intestins seront prélevés pour des analyses moléculaires.
Remplacement
La production de sucre par l’organisme implique 3 organes, le foie, les reins et l’intestin qui agissent de façon coordonnée pour maintenir les taux de sucre dans le sang à des valeurs comprises entre 0,7 et 1,1 g/l en dehors des repas. Le maintien de l’homéostasie glucidique implique une régulation inter-organe, via l’action de diverses hormones et de signalisations nerveuses. Notre étude nécessite donc de travailler sur l’organisme en entier pour conserver ce dialogue complexe entre organe.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, du modèle animal, et du métabolisme, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider les approches expérimentales utilisées. Afin de pouvoir faire une analyse statistique avec une puissance de 80% et p
Raffinement
-Pour habituer les animaux aux manipulations et aux zootechniciens, les animaux seront pesés de façon hebdomadaire permettant aussi de suivre leur poids. A noter que l’ensemble du personnel a suivi une formation aux techniques de contention des souris moins stressantes que sans soulever l’animal par la queue. -Afin d’éviter les éventuelles hypoglycémies et l’épuisement des souris qui pourrait être dû à leur faiblesse musculaire, les souris ont accès à la nourriture directement dans la cage et des embouts des biberons longs. - La connaissance des modèles animaux atteints de glycogénose a permis de définir des points limites, en identifiant les manifestations physiologiques liées aux hypoglycémies chez la souris. Un suivi de glycémie sera réalisé si un animal reste prostré dans une cage, et/ou ne répond pas ou peu aux stimulations du zootechnicien. En cas d’hypoglycémie sévère (glucose inférieur à 30-40 mg/dL), la souris sera systématiquement injectée avec une solution de glucose et une partie de sa cage sera placée sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle. -À la suite de la prise de sang en veine submandibulaire, l’arrêt du saignement sera rapidement maitrisé par un point compressif de la veine. -Pour prévenir la douleur due au prélèvement de sang, de la crème anesthésiante sera appliquée localement sur l’extrémité de la queue des souris ou la zone de piqure, 30 min avant l’incision. - Une perte de poids de plus de 15%, associée à une dégradation de l’état général de l’animal (poils hérissés, yeux fermés...) sera un point limite pouvant survenir lors d’une atteinte hépatique ou du développement d’une tumeur du foie -Enfin, l’état de bien-être sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (état du pelage, mouvements/posture de la souris, morsures...). En cas de petites plaies, une crème à base de teintures mères et d’huiles essentielles qui apaise et cicatrise sera systématiquement appliquée par les zootechniciens en charge du suivi du bien-être animal.
Choix des espèces
Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Les expériences seront donc réalisées avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme et qui reproduisent toute la pathologie observée chez les patients. Par ailleurs, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kits biochimiques…). Le génotypage des souris par l’analyse d’ADN purifié à partir d’une biopsie de queue sera réalisée à l’âge de 15 jours, afin de sélectionner les souris avant leur sevrage. Les protocoles seront ensuite réalisés chez des souris adultes âgées d’environ 12 mois qui correspond à un stade précédant le développement de tumeurs du foie chez les souris atteintes de glycogénose de type III. Cette étude s’intègre dans un projet global d’étude des mécanismes de la tumorigenèse du foie en relation avec les perturbations du métabolisme.
Optimisation de vecteurs viraux en thérapie génique dans le système musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Différents vecteurs viraux dérivés de l'AAV9 leur sont injectés, dès le premier jour de vie pour une partie, par voie abdominale, intraveineuse ou derrière l'œil, avec un suivi hebdomadaire par bioluminescence. Le porteur reconnaît que l'injection derrière l'œil peut provoquer un gonflement de l'œil, une proptose ou une cécité, et que les anesthésies prolongées peuvent causer des troubles cognitifs. Il compare l'efficacité de ces vecteurs pour la thérapie génique musculaire et juge le recours à l'"organisme entier" nécessaire.
Objectifs
Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.
Bénéfices attendus
L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.
Procédures
La cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte "injections rétro-orbitales" seront soumises aux procédures suivantes :- Injection rétro-orbitale (1 minute) unique chez la souris sous anesthésie -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence
Impact sur les animaux
L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal. L’injection rétro-orbitale peut provoquer l'apparition de gonflement oculaire au site d'injection, une proptose ou encore une cécité. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.
Devenir
Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.
Raffinement
Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. A partir de la modification, La cohorte RO à P1 utilisera des souris dès le premier jour postnatal. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte RO à 6w utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. Le groupe de 10 souris pour l'apprentissage du geste RO à P1 utilisera des souris à P1.
Caractérisation du microchimérisme des cellules maternelles vers le fœtus in utero et chez la descendance lors d’une supplémentation en Human Milk Oligosaccharides (HMO) pendant la gestation.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Des femelles sont accouplées de façon répétée jusqu'à gestation, nourries d'un aliment enrichi en sucre du lait humain, puis mises à mort au dix-huitième jour de gestation ou après le sevrage, avec prélèvement des tissus fœto-maternels. La descendance femelle est tuée à trois semaines et les mâles conservés pour des cultures cellulaires avant d'être tués. Le porteur étudie le transfert de cellules immunitaires de la mère au fœtus et affirme qu'il est "impossible" de reproduire ces échanges in vitro.
Objectifs
La grossesse constitue la première période au cours de laquelle l’alimentation de la mère peut influencer le système immunitaire du fœtus par des transferts mère-enfant de facteurs immuns, nutritionnels et bactériens. De nombreuses études ont déjà démontré que l’alimentation maternelle impacte le développement du fœtus et du nouveau-né et peut provoquer des maladies futures chez la descendance. Dans ce contexte, il a été démontré dans un modèle de souris qu’une supplémentation en sucre du lait maternel (HMO : Human Milk Oligosaccharide ou Oligosaccharide du lait humain) pendant la gestation protège de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Les HMO sont connus pour leurs effets bénéfiques sur le système immunitaire et le microbiote intestinal. Ces effets sont liés notamment à l’augmentation d’une population de cellules immunes que l’on appelle lymphocytes B régulateurs dans le fœtus mais aussi chez la descendance. Nous savons que des cellules de la mère peuvent être transférées à son fœtus ainsi nous émettons l’hypothèse qu’une supplémentation en HMO pendant la gestation va augmenter les lymphocytes B régulateurs chez la mère qui vont être transférées au fœtus puis perdurer chez la descendance permettant l’établissement d’un environnement protecteur de l’allergie alimentaire. L’objectif de ce projet est d’identifier précisément ces transferts cellulaires in utero et leur durabilité chez la descendance induite par la prise de HMO pendant la gestation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier chez la souris les cellules régulatrices maternelles présentes chez le fœtus et la descendance pouvant expliquer la mise en place de la protection contre l’allergie alimentaire induite par la prise de HMO durant la gestation. Ces cellules régulatrices peuvent être issues d’un transfert de cellules de la mère vers le fœtus afin de protéger les petits de l’allergie alimentaire
Procédures
Lors de la première procédure, les souris sont mises en accouplement une nuit autant de fois que nécessaire jusqu'à qu'elles soient gestantes. Elles sont pesées tous les 2 jours. Le 18ème jour de gestation, les souris femelles reçoivent une injection intraveineuse d’anticorps 1 fois par femelle. Lors de la première procédure, les souris du groupe exposé à l’aliment enrichi en 2’FL sont mis sous aliment 2’FL une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à leur mise à mort au 18ème jour de gestation. Lors de la procédure 2, les souris sont mises en accouplement une semaine. Elles sont pesées tous les 2 jours pour toutes les souris femelles. Lors de la procédure 2, les souris du groupe exposé à l’aliment supplémenté en 2’FL sont mises sous aliment 2’FL une semaine après leur arrivée à l’animalerie et ceci jusqu’à la mise bas. Elles repassent ensuite à un régime avec l’aliment contrôle.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont pesées tous les deux jours afin de confirmer la grossesse par la prise de poids. Au 18ème jour de gestation, le jour de leur mise à mort, elles sont déplacées pour les prélèvements de selle, la pesée et l'injection intraveineuse. Le point d'injection peut provoquer une douleur légère et un stress dû à la douleur et la contention.
Devenir
Lors de la procédure 1, les femelles sont mises à mort à 18 jours de gestation afin de récupérer les tissus fœto-maternels ainsi que les mâles pour des mises au point et expériences de culture cellulaire (car nous n'vons pas d'autres protocoles de reproduction en parallèle). Lors de la procédure 2, les mères et des descendantes femelles sont mises à mort afin de récupérer des tissus et mise à mort pour les mâles et descendance mâle pour des mises au point et expériences de culture cellulaire (car nous n'vons pas d'autres protocoles de reproduction en parallèle).
Remplacement
Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices des HMO (Human Milk Oligosaccharides) comme le 2’-fucosyllactose.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour être statistiquement pertinent en fonction du modèle utilisé dans notre équipe et du taux de reproduction des souris pour chaque protocole. Nous avons pris en compte le temps de reproduction, la souche des souris mâles et femelles ainsi que la duplication des protocoles.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 2 (femelles) ou 3 à 4 (mâles) par cage selon les groupes dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.
Choix des espèces
L’objectif de ce travail est d’évaluer s’il existe un transfert de la mère à son fœtus de lymphocyte B régulateurs connus pour protéger de l’allergie alimentaire et de voir si ces cellules transférées persistent chez la descendance. Le transfert placentaire ainsi que les échanges mère-fœtus sont impossibles à reproduire in vitro, il faut prendre en compte l’organisme dans sa globalité pour évaluer ces paramètres. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément essentiel dans ce projet afin de reproduire la période de vie de la gestation et ainsi visualiser ces échanges. Les souris mâles et femelles seront âgées de 6 semaines à leur arrivée à l’animalerie, car à cet âge elles sont mâtures sexuellement et peuvent ainsi se reproduire. Après une semaine d’acclimatation donc à 7 semaines de vie, elles seront mises en accouplement. Pour le protocole P1, Les souris gestantes seront mises à mort au 18ème jour de gestation soit à 10 semaines de vie. Les fœtus étudiés chez les mères gestantes auront un stade de développement de 18 jours, soit le troisième tiers de gestation. Si la reproduction sous 24h n’a pas été efficace, les souris non-gestantes seront de nouveau accouplées avec d’autres mâles la semaine suivante et ceci, jusqu’à ce qu’elles soient gestantes. Les mâles seront mis à mort à la fin du protocole, une fois que toutes les femelles seront gestantes. Pour le protocole P2, Les souris gestantes seront mises à mort à la fin du sevrage de la descendance, soit à 13 semaines de vie. La descendance femelle sera mise à mort à 3 semaines de vie pour rechercher la présence de cellules d’origine maternelle. Les descendants mâles seront conservés dans le cadre d’études in vitro et donc mis à mort à partir de 6 semaines de vie.
Mesure de la biodistribution de produits pharmacologiques et de sondes par imagerie in-vivo chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des injections de candidats-médicaments ou de sondes, subit jusqu'à huit anesthésies gazeuses sur une semaine pour l'imagerie et jusqu'à dix micro-prélèvements de sang. Le porteur teste la biodistribution de molécules aux applications variées, du traitement anticancéreux à l'antidépresseur, et affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'absorption et l'élimination d'un médicament dans l'organisme. Il indique renoncer à toute grille de score, celle-ci supposant de "maintenir la souffrance de l'animal pour en évaluer l'évolution".
Objectifs
Pour le développement de nouveaux médicaments ou de cibles thérapeutiques, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active ou de la sonde dans l'organisme, dans le but de déterminer l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du médicament (dose administrée et fréquence d'administration) ou permettre la mise en évidence du devenir de la sonde et in fine la localisation in situ de cible. L’objectif scientifique est de suivre la biodistribution de produits pharmacologiques ou de sondes en cours de développement chez la souris, visualisée par fluorescence ou par bioluminescence à l’aide d’un imageur. Les produits pourront être de différentes natures: chimique, peptidique, oligonucléotidique et pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…
Bénéfices attendus
La mesure de la bio-distribution des candidats-médicaments permettra de sélectionner les candidats-médicaments ou les sondes les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les critères tels que l’ADME, l'affinité et la spécificité de la sonde pour sa cible et sa capacité à atteinte la cible. Ces caractéristiques sont indispensables pour les futures études pharmacologiques. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments et des sondes pour le traitement des pathologies humianes ou leur diagnostique et permettra de séléctionner les molécules les plus interressante. Cette séléction évitera de mesurer ensuite l'activité pharmacologique chez l'animal de toutes les molécules éliminées et permettra donc de réduire le nombre d'animaux nécéssaire tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis a des injections effectuées afin d'administrer les candidat-médicaments, sondes, médicaments et/ou compétiteurs étudiés. Les molécules pourront être administrées par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intra-dermique, intr-anasale ou par voie orale. Généralement 1 (sonde) à 2 (sonde + compétiteur) administrations seront effectuées. Pour l'aquisition des images ("photos"), des anesthésies gazeuses de quelques minutes chacune sont nécessaires pour que la souris soit parfaitement immobile. Ces anesthésies pourront être répétées jusqu’à 8x sur une période de 24h à 7j pour suivre la liaison puis l'élimination de la sonde et determiner son activité. Afin de suivre la concentration sanguine de la sonde au cours du temps, des micro-prélèvements de sang pourront être réalisés à l’extrémité de la queue. Ces prélèvements seront réalisés durant l’anesthésie nécessaire à la "photo"ou sur les animaux vigiles et non contraints. Un maximum de 10 micro prélèvements de sang seront réalisés sur une durée minimum de 48h.
Impact sur les animaux
Les administrations uniques du candidat médicament, de la sonde (administrations orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous cutanée ou intradermique ou intranasale) et/ou répétée de la luciférine (intrapéritonéale) nécessite une préhension et une contention des animaux. Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant les "photos" : quelques minutes chacune et pouvant être répétée jusqu’à 8x sur une période de 24h à 7j. Des micro-prélèvements de sang sont réalisés à l’extrémité de la queue sur les animaux anesthésiés (simultanément à une "photo") ou vigiles et non contraintes. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée minimum de 48h.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.
Remplacement
Les candidats-médicaments et les sondes auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la bio-distribution sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et qu’elle permet d’avoir recourt à des animaux génétiquement modifiés.
Réduction
La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testées. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques ou d’images. Aucune comparaison statistique n’est requise. Le plus souvent 2 à 5 conditions seront testées pour un composé (doses, voies d’administration, en présence ou absence d’un compétiteur). La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre les paramètres sanguins mesurés. Il est prévu de mesurer la bio-disponibilité de 5 candidats-médicaments ou sondes par an chez la souris (30 à 75 souris) sur une période de 5 ans, soit un maximum de 375 souris.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation d'une semaine sera respectée. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre des acquisitions efficaces et parfaitement répétables. Les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés lorsque les animaux seront anesthésiés ou sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention) à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.
Choix des espèces
La mesure de la biodistribution sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments, le plus souvent car sa petite taille permet d’utiliser moins de composés (des composés souvent difficiles à synthétiser) et qu’elle permet d’avoir recourt facilement à des animaux génétiquement modifiés. Le recourt à des animaux génétiquement modifiés, déficients pour la cible, peuvent s’avérer indispensable pour la validation de la spécificité de la sonde dans l'organisme. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’évolution de l’expression de la cible durant la vie de l’animal selon les informations disponibles dans la littérature. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.
Caractérisation phénotypique de souris mutantes dans le cadre du consortium international IMPC (International Mouse Phenotyping Consortium)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
23 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance légère à modérée. Chaque animal subit une batterie de tests de phénotypage sur 150 lignées mutantes, dont un conditionnement à la peur par choc électrique délivré au plancher, un test de plaque chauffée à 52 °C provoquant une douleur brève, des chocs électriques plantaires et un isolement de vingt-quatre heures. Le porteur cherche à établir la fonction de gènes d'intérêt dans un consortium international et affirme que seul un "organisme complet" permet cette caractérisation. Le volume atteint près de 24 000 souris pour un programme de description systématique du génome.
Objectifs
L’objectif du projet et d’étudier le rôle de 150 lignées, soit délétées pour un gène d'intérêt, soit des lignées consanguines "Collaborative Cross" (CC), potentiellement impliquées dans des maladies humaines. Nous allons réaliser une analyse des effets de la mutation de ces gènes ou des fonds génétiques CC sur les différentes fonctions physiologiques (neurologiques, comportementales, cardiaque, respiratoire, sensorielle et métabolique). Pour procéder à cette étude, des lignées CC ou des souris mutantes pour le gène d’intérêt sont générées et étudiées. Les animaux, seront soumis à une batterie de tests de phénotypage, permettant de déterminer l’impact de la mutation ou du fond génétique sur les fonctions physiologiques majeures et sur l’état de santé de l’animal. Dans le cadre d'un consortium international, le choix des lignées à étudier est fait en coordination avec les autres partenaires afin d’éviter toute redondance quant à l’analyse des souris mutantes pour un gène dans 2 centres différents.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’identifier la fonction de chacun des gènes d’intérêt dans le génome de la souris. Le génome entier de nombreuses espèces a maintenant été publié et le séquençage du génome entier devient relativement rapide et peu coûteux à réaliser. Malgré ces progrès, la fonction de la majorité des gènes reste encore inconnue. Les gènes testés ici sont impliqués dans les fonctions physiologiques suivantes : neurologiques, comportementales, cardiaque, respiratoire, sensorielle et métabolique. Leurs études permettront de mieux comprendre leur rôle dans l’organisme et par conséquent l’impact que pourrait avoir leur dysfonctionnement dans le cadre de pathologies.
Procédures
-Une biopsie d'oreille sera réalisée sur les animaux devant être génotypés. (contention 5-10 secondes)- Lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information, des sons de 110 dB pour une durée de 40 msec et d'autres plus faibles (65-70- 75-85-90 dB ; durant 10 msec) sont présentés à l'animal. Chaque type de stimulus est présenté 10 fois aléatoirement durant le test. Un intervalle de 20 sec sépare 2 stimuli. Avec 11 types de stimuli présentés 10 fois, une session dure environ 45 min. - Les mécanismes d’action de la peur et de la mémoire seront étudiés grâce à un test de conditionnement à la peur d’une durée cumulée de 10+20 min - Un test de calorimétrie qui nécessite d'isoler les souris durant 24h maximum - Une évaluation cardiaque sera effectuée et implique une anesthésie gazeuse de 10 minutes environ - Un test de tolérance au glucose, après une administration de glucose par injection intrapéritonéale, 5 prélèvements d'une goutte de sang (chaque acte durant environ 30 secondes) sont réalisés – Les animaux recevront trois doses d’anesthésiques (durée = moins d’une minute) - Insertion d'électrodes en sous-cutanée à la base du crâne pour enregistrer les réponses évoquées (durée = 15 minutes)-Etude de la structure de l'œil par histologie in vivo (durée = 10 minutes)-Mesure de la composition corporelle et anlayse du squelette par rayons X (durée = 18 minutes). -La conductivité sensorielle sera mesurée à l’aide d’un test sur la sensibilité plantaire d’une durée de 10 min -La sensibilité thermique intégrée sera mesurée à l’aide d’un test de plaque chaude d’une durée de 30 secondes - 1 prélèvement sanguin qui dure 2-3 minutes
Impact sur les animaux
Une biopsie d'oreille sera réalisée sur les animaux devant être génotypés. Le test d'altérations des capacités de filtrage de l'information présente un inconfort léger en raison des stimuli auditifs qui sont de 110 dB et durent quelques ms. Lors du test de conditionnement à la peur un choc électrique d’intensité modérée sera délivré à la souris par le plancher (grille) pouvant provoquer un léger inconfort. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés durant la durée du protocole (maximum 24h) occasionnant un stress modéré dû à l'isolement. Lorsque nous étudierons la fonction cardiaque, les animaux seront anesthésiés par méthode gazeuse. Durant les 4 dernières minutes de l'anesthésie, dans le protocole d'électrocardiographie, 4 électrodes seront piquées en surface de la peau pour obtenir les signaux électriques. Pour étudier les mécanismes de régulation du glucose, les animaux subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers : 20, 40, 60 et 90 minutes après l’injection de glucose, afin de suivre leur glycémie. Les animaux recevront une dose d’anesthésiques lors de l’étude de l’imagerie du squelette, du test des réponses évoquées et de l'étude de la morphologie de l'oeil. Lors de l’étude de la sensibilité plantaire aux chocs électriques, plusieurs chocs électriques plantaires sont réalisés et lors du test de la plaque chaude l'animal est placé sur une plaque à 52 degrés, provoquant une douleur de très courte durée. Enfin, afin de suivre les paramètres biochimiques, 1 prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser les fonctions de gènes d'intérêt, ce qui ne peut être modélisable que dans un organisme complet capable d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Par ailleurs, seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude. Ces données pourront ensuite permettre de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. En particulier, nous utiliserons la souris car nous pouvons retirer les gènes d’intérêt dans ce modèle.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé à la suite d'autres projets présentant les mêmes tests. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 8 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques paramétriques ou non paramétriques en fonction de la normalité des données.
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal blessé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement des modèles d'intérêt porteurs des modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. Les animaux seront de jeunes souris adultes (8-16 semaines), afin d’avoir un développement suffisant.