Souris

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris génétiquement modifiées développent des lésions de la protéine Tau et une neurodégénérescence, avec des difficultés de mobilité, et reçoivent une instillation nasale de peptides cinq jours par semaine pendant environ six mois. Le porteur les tue ensuite pour prélever sang et cerveau et évaluer l'effet des peptides sur la maladie d'Alzheimer. Il souligne le coût social de la maladie et l'échec des essais cliniques passés et présente les peptides comme de "potentiels agents thérapeutiques" sur la seule base de travaux préliminaires in vitro.

Objectifs

A ce jour 260 millions de citoyens européens souffrent de troubles cérébraux. La maladie d'Alzheimer (MA) représente la forme la plus fréquente de démence cérébrale. Selon les prévisions épidémiologiques, avec le vieillissement de la population, cette maladie devrait toucher 14 millions d'Européens d'ici à 2040 et coûter environ 140 milliards d'euros en soins par an, faisant de cette maladie un véritable enjeu de santé publique. En dépit des recherches intensives menées depuis plusieurs années, la maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Seuls des traitements symptomatiques sont disponibles. La recherche de thérapies efficaces et spécifiques de la MA est donc un objectif clinique majeur. Cette pathologie se caractérise par la mort progressive des neurones causée par l'accumulation anormale de deux protéines dans le cerveau: le peptide Amyloïde β (Aβ) et la protéine Tau. En s’agrégeant ils forment des lésions cérébrales caractéristiques : (i) des dépôts de plaques amyloïdes de Aβ à l'extérieur des neurones, et (ii) des enchevêtrements de fibres de Tau à l'intérieur des neurones. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement curatif prouvé pour la MA. Les essais cliniques ciblant ces deux protéines suscitent beaucoup d'espoir mais ne se sont pas révélés concluants. Un essai clinique européen de phase 2 par immunothérapie ciblant les formes pathologiques de la protéine Tau a démontré un ralentissement de la pathologie et une diminution des troubles cognitifs uniquement chez les patients pré-symptomatiques. Ainsi, les stratégies visant à bloquer l'agrégation de la protéine Tau semblent prometteuses pour ralentir la maladie, ou être utilisées en thérapie préventive. Ce projet propose de développer des peptides pour traiter la maladie, ces peptides agiraient spécifiquement sur l’agrégation anormale de la protéine Tau. L'analyse in vitro d’une quarantaine de peptides présélectionnés a permis d'isoler une douzaine de candidats potentiellement adaptés au diagnostic et d’envisager leur utilisation pour la thérapie. Dans ce projet nous proposons de tester quatre de ces peptides seuls ou en combinaison sur le développement de la pathologie dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (MA).

Bénéfices attendus

Des travaux préliminaires, in vitro, indiquent que les peptides générés ont un fort potentiel bloquant sur l’agrégation anormale de la protéine Tausont de forts inhibiteurs de la fibrillation de la protéine Tau, ce qui en faitfaisant d’eux de potentiels agents thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Entre le 1er et le 7ème mois, les souris seront traitées par instillation nasale (5 min par souris), 5 fois par semaine. A la fin de l’expérimentation, les souris seront soumises à, un prélèvement de sang (durée 5 min) sous anesthésie avant euthanasie

Impact sur les animaux

Cette étude utilise un modèle murin de la MA basé sur une mutation de la protéine Tau, entrainant l’agrégation anormale de la forme mutée de Tau à l’origine de la mort progressive des neurones.ce qui entraine une neurodégénérescence . Les études rapportent que la mort neuronale s’effectue dans les régions du tronc cérébral, zone de passage de nombreuses voies motrices et sensitives. Des difficultés de mobilités apparaissent donc au cours du développement de la maladie. Le traitement par les peptides thérapeutiques par voie intranasale est moins invasif que par injection. Cette méthode va toutefois nécessiter une période d’habituation à la manipulation des souris pour qu’elles soient le moins stressées possible lors de l’administration des peptides.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasié afin de récolter (i) des échantillons sanguins pour faire des dosages des marqueurs utilisés pour diagnostiquer la maladie d’Alzheimer et (ii) les cerveaux afin de faire des études immunohistologiques pour évaluer le potentiel des peptides à limiter le développement de la pathologie

Remplacement

Des études in vitro ont permis de sélectionner des peptides pouvant bloquer la formation de fibres amyloïdes Tau, comme retrouvées dans les cerveaux de patients malades de la maladie d’Alzheimer. Ces peptides sont développés à des fins thérapeutiques. Pour cela ils ont été précédemment testés sur des cellules représentatives du tissu cérébral pour étudier leur innocuité vis-à-vis de ces cellules et leur biodisponibilité cellulaire. De plus, afin d’étudier les mécanismes d’action de ces peptides sur la formation des fibres Tau, des études vont être menées sur des cellules qui reproduiront les lésions Tau caractéristiques décrites chez les patients. Ces étapes indispensables nous permettent de définir les caractéristiques et de sélectionner quels sont les meilleurs candidats pour bloquer la formation des agrégats toxiques de Tau sous forme de fibres. Toutefois, afin de définir l’efficacité réel d’un potentiel traitement de la maladie d’Alzheimer (sur l’apparition et la progression des lésions pathologiques au sein du cerveau) avec tel ou tel peptide, il est nécessaire de faire ces tests chez l’animal qui va développer la pathologie au cours du temps et dans son contexte biologique, qui est le cerveau. L’efficacité d’un traitement thérapeutique doit être éprouvé dans un organisme vivant au vu de la complexité de l’apparition et de la progression de la MA.

Réduction

Une étude du phénotype de la pathologie sera mis en place : étude de 14 animaux (7 femelles et 7 mâles) sur 2 portées différentes Cette étude se déroule en 2 étapes. Dans un premier temps, quatre peptides, à 3 doses différentes, seront instillés pendant 6 mois, séparément ou en combinaison (13 préparations possibles), avec 12 souris T par groupe de traitement . Cette étude qui va évaluer l’efficacité de chaque préparation sur la survie et sur le développement des lésions neurofibrillaires dans le cerveau des souris traitées, nous permettra de définir la dose et les 3 peptides les plus efficaces. A partir de ces données, une nouvelle étude sur 12 mois sera engagée avec 12 souris par combinaisons (7 préparations au lieu de 13). Deux groupes contrôles seront à nouveau réalisés (n=12 pour chaque groupe). Donc le nombre maximum de souris engagées dans l’étude est de 760 souris sur 60 mois. Les groupes de souris contiendront 12 animaux (les tests d’innocuité des peptides permettent de diminuer le nombre de souris) afin d’avoir des groupes valides pour les analyses statistiques des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe de 10 souris dans un environnement enrichi. En cas de bagarre entre les animaux, l’isolement de façon transitoire sera envisagé afin de garantir leur bien-être. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience selon une grille de score dépendante de certains critères ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. De plus, une étude du bien-être animal est menée sur ces souris afin de définir précisément le phénotype de la souche à ce jour et dans nos locaux. Cette grille nous permettra de suivre l’efficacité des traitements sur la souche Tau-P301S.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de développer des traitements contre la maladie d’Alzheimer. Cette pathologie se développe sur plusieurs années de vie avant que les premiers symptômes n’apparaissent, 20-30 ans plus tard. Nous avons donc besoin d’un modèle animal qui développe les lésions neurofibrillaires également au cours de son développement et de sa vie pour évaluer son efficacité. C’est pour cela que nous avons donc choisi la souche de souris, Tau-P301S, qui produit des lésions Tau au début de sa vie (avant 6 mois), mais les symptômes apparaissent quelques mois plus tard (8-12 mois) et sont évolutifs. Les animaux seront étudiés entre 1 et 12 mois, c’est à direc’est-à-dire dès le début du développement des lésions NFT et jusqu’au stade le plus tardif que les souris de ce modèle le permette entre le début de la maturité et l’âge adulte.Ainsi on pourra évaluer si les traitements peuvent prévenir ou ralentir le développement pathologie

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur déclenche un asthme allergique par cinq administrations intranasales d'extraits d'acariens, administre les molécules à tester, puis ouvre la trachée sous anesthésie pour mesurer la fonction pulmonaire avant un lavage bronchoalvéolaire. Il décrit surtout un stress lié aux instillations et à l'anesthésie et une biopsie pour le génotypage. Ce projet vise à établir une "preuve de concept" sur le rôle de certains lymphocytes, présentée comme une base pour de futurs essais cliniques, et le porteur juge le modèle murin "nécessaire" pour accéder aux cellules pulmonaires.

Objectifs

L’asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches qui se caractérise par des crises récurrentes. Les symptômes sont toux, sifflements, essoufflement et/ou oppression thoracique. Cette pathologie peut être allergique ou non-allergique, et impliquer différents types d’inflammations. Récemment, un nouveau type de cellules lymphoïdes ont été impliquées dans l'inflammation pulmonaire. L'objectif de cette étude est de déterminer dans un modèle d'asthme allergique expérimental les mécanismes par lesquels ces lymphocytes contribuent à la sévérité de l'asthme afin de pouvoir proposer dans le future des nouvelles thérapies. Ce projet est multisite car il comporte des étapes nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire sera ajouté.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de comprendre les mécanismes par lesquels une nouvelle population des lymphocytes influencent la sévérité de l'asthme allergique. Les résultats obtenus serviront de preuve de concept pour poser les bases de futurs essais cliniques chez l'homme.

Procédures

Le protocole d’asthme est réalisé par 5 administrations intranasales des extraits d’acariens ou le contrôle, d’une durée de 30 secondes. Les animaux subissent l'administration des molécules à tester par voie intrapéritonéal (6 administrations) d’une durée de 30 secondes. L’ouverture de la trachée est réalisée pour mesurer les fonctions pulmonaires grâce à un appareil dédié sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes). Biopsie de la queue ou de l’oreille pour génotypage d’une durée de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les administrations intranasales peuvent entrainer un stress, une modification de la respiration ainsi qu’un changement de comportement. Les anesthésies peuvent entrainer un stress et le génotypage un stress ainsi qu’une douleur légère. Le stress dû au transport, lorsque les animaux sont déplacés d'une animalerie à l'autre.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses de l'inflammation pulmonaires : histologie, cellules immunes présentes dans le tissu.

Remplacement

L'asthme est une pathologie complexe et hétérogène. Pour déterminer le rôle des lymphocytes que nous nous proposons d'analyser dans l'asthme sévère, il est nécessaire d'utiliser un modèle murin d'asthme pour avoir accès aux cellules présentes dans les poumons. L'étude sur la souris est donc une étape nécessaire, qui ne peut être remplacée par des expériences in vitro, pour valider une preuve de concept qui pourrait ensuite déboucher sur des essais cliniques impliquant ces lymphocytes.

Réduction

Le nombre de souris utilisé a été déterminé sur la base de nos travaux, des travaux publiés et d’une analyse sur logiciel statistiques approprié permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables.

Raffinement

Toutes les souris inclues dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance ou de difficultés respiratoires. La surveillance de l’état des animaux (poids, mobilité, comportement) sera faite 1 à 2 fois/semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Un enrichissement des cages composé de maisonnettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections. En cas de signes de souffrance, les animaux seront traités par injection d'antalgique.

Choix des espèces

Les modèles d’asthme induit par les extraits d’acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine dont les atteintes pulmonaires. La souris est ainsi un modèle de choix pour étudier les mécanismes immuns impliqués dans la sévérité de l’asthme. Les souris utilisées auront entre 4 et 18 semaines. A 4 semaines les souris seront génotypées. Le protocole expérimental sera appliqué à des souris âgées de plus de 6 semaines car, comme décrit la littérature, à cet âge le système immunitaire est complétement développé.

6 000 rongeurs, 3 000 souris et 3 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce prestataire de services précliniques implante des tumeurs, par abrasion chimique ou injection dans la paroi de la vessie, puis administre des composés de clients par de multiples voies et parfois de la radiothérapie. Le porteur décrit une hématurie et des douleurs modérées liées à l'induction tumorale et une privation d'eau imposée quatre heures avant certaines injections. Il met en avant un large "panel de modèles in vivo" pour transposer des candidats-médicaments à l'humain et affirme que les méthodes alternatives restent "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (inférieur à15min). L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h30). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes en poids et/ou volume tumoral. Au cours des études, des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée, potentiellement après un transport (inférieur à 2h). Des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h). Les animaux sont traités par voie : - - intra-veineuse, intrapéritonéale, sous cutanée avec (inférieur à 15min) ou sans anesthésie générale (3min) - intra-musculaire ou intra-dermique sous anesthésie générale avec analgésie (

Impact sur les animaux

Différentes méthodes d’induction pourront être réalisées : induction tumorale dans la vessie après abrasion chimique ou injection des cellules directement sur la face interne de la paroi de la vessie. Cela pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. L’induction de tumeur dans la vessie pourra engendrer une gêne, une hématurie pouvant engendrer une douleur modérée. Les animaux recevront des traitements par voie intramusculaire, intradermique, sous cutanée, intraveineuse, orale, intrapéritonéale, intra-vésicale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère compte tenu de l’analgésie adaptée mise en place. L’imagerie, induira un stress léger. Le jour de la constitution des nouveaux groupes, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress léger de 1-2j. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. L’apport d’eau des animaux sera supprimé 4h avant injection, Cela pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe avec tumeur, non traité et un groupe avec tumeur, traité; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 10% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant sélection) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

Dans le cadre de l’abrasion chimique, la greffe est réalisée sous anesthésie générale avec couverture analgésique par opiacé (30 minutes avant l’acte, 3h et 7h post-op, le lendemain matin et soir). L’injection dans la paroi vésicale sera réalisée après une administration sous-cutanée d’anesthésique local, sous anesthésie générale avec couverture analgésique par opiacé (a 30 minutes avant l’acte, 3h et 7h post-op, le lendemain matin et soir). Dans les deux cas, un AINS sera administré avant la chirurgie puis le lendemain et le surlendemain de la chirurgie. La chirurgie sera réalisée de façon aseptique, avec maintien de la température corporelle, et surveillance post-op jusqu’au réveil puis toutes les 2h sur 6h au total. Les chirurgies seront systématiquement effectuées le matin pour mieux surveiller les animaux. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaire en termes d’anesthésie, de volume, fréquence et antalgie. Ces actes seront réalisés sous anesthésie (sauf administration orale) avec l’analgésie appropriée pour les injections en intramusculaire/intradermique (opiacés) et intra-vésicale par cathéter urétrale enduit de gel de xylocaïne (AINS). Les traitements par radiothérapie seront effectués sous anesthésie générale. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur soumet une partie des souris à une irradiation du corps entier suivie d'une greffe de cellules, et l'ensemble à des injections intrapéritonéales répétées et à des prélèvements sanguins rétro-orbitaux tous les quinze jours pendant trois mois, qu'il reconnaît pouvoir altérer leur vision. Ce travail vise à comprendre le rôle d'une molécule dans une forme agressive de mastocytose, un cancer du sang. Il cite un "dépôt de brevet" et des financements parmi les retombées attendues et affirme le modèle animal "indispensable", la complexité des interactions cellulaires n'étant selon lui pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les mastocytoses systémiques (MS) sont des formes incurables de maladies du sang particulièrement difficiles à traiter. Ces maladies très hétérogènes allant de formes indolentes à des leucémies fatales, sont caractérisées par l’accumulation et l’activation incontrôlée des cellules immunitaires appelées mastocytes dans la moelle osseuse. Plus de 30% des patients atteints de MS agressives ne répondent pas aux traitements administrés en clinique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le métabolisme des cellules est fortement perturbé dans les cellules cancéreuses afin de répondre à leur besoin en énergie pour proliférer de façon aberrante. Nous avons donc identifié les altérations métaboliques dans les mastocytes de patients afin de tester le potentiel clinique de leur inhibition. Nous avons mesuré une forte concentration de kynurénine (L-Kyn), une petite molécule chimique, dans le plasma des patients atteints de formes agressives comparé aux indolentes et confirmé l’activité de la voie dont elle fait partie dans des mastocytes issus de la moelle osseuse de patients.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment la L-Kyn dont la concentration est élevée de façon physiologique dans le plasma des patients atteints de MS agressive, exacerbe les fonctions mastocytaires en régulant directement les fonctions des mastocytes ou leur microenvironnement (adipocytes médullaires). Ces analyses nous permettront d'une part de tester le potentiel de la voie de la kynurénine comme cible thérapeutique dans les MS agressives dans un contexte physiologique mais également d'identifier de nouvelles cibles en aval de la L-Kyn qui pourraient également être pertinentes. Cette étude est la première étape vers le développement de nouveaux médicaments ciblant ces régulations en combinaison ou non avec les traitements utilisés pour cette pathologie en routine clinique. Elle permettra également le dépôt de brevet et de financements indispensables pour la poursuite de ce projet. Ces pathologies agressives sont particulièrement invalidantes ; la médiane de survie des patients au diagnostic est de moins de 3 ans et de moins de 6 mois pour les formes les plus agressives. Cette étude est donc indispensable pour améliorer le devenir des patients et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de prévenir ou freiner le développement de ces pathologies.

Procédures

Les animaux (procédures 1-2) recevront une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 3 fois par semaine pendant une semaine puis 5 fois par semaine pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins seront réalisés en rétro-orbital sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à l’atteinte des points limites. Les animaux (procédures 3-5) recevront une irradiation sous-létale sur corps entier sur animaux vigiles. Une greffe intraveineuse en rétro-orbital unique sera réalisée. Une injection intra-péritonéale sur animaux vigiles 5 fois par semaine sera réalisée pendant deux semaines. Les prélèvements sanguins en rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane tous les 15 jours pendant 3 mois ou jusqu’à atteinte des points limites.

Impact sur les animaux

La manipulation et la pesée pourraient entraîner du stress chez les animaux. Une mauvaise tolérance à l’irradiation sous-létale pourrait entraîner une inactivité et une mobilité réduite pendant quelques heures après l’irradiation (rare). Le même phénotype pourrait être observé après une greffe partielle des cellules injectées quelques jours après la transplantation. Une perte de poids pourra être observée et sera monitorée. Les prises de sang répétées dans le sinus rétro-orbital pourraient causer des problèmes de vision aux souris.

Devenir

La totalité des individus impliqués seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de plusieurs modèles cellulaires in vitro seuls ne permet pas de rendre compte de la complexité des interactions cellulaires impliquées dans la maladie. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal afin de valider notre hypothèse. A cette étape du projet, il n’existe aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Le calcul d’effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul d'effectif pour chaque groupe dans chaque procédure sera réalisé en utilisant un calcul statistique approprié. Cette approche nous permet de conserver une méthode scientifique rigoureuse tout en réduisant au minimum le nombre d'animaux nécessaires. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes contrôles. Afin de réduire à son minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes contrôles seront commun à plusieurs tests d'efficacité. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos expériences.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les expérimentateurs et le personnel qualifié de l'animalerie sont formés pour limiter au maximum le stress des animaux lors de leur manipulation. Les animaux utilisés dans ces expériences seront soumis à une surveillance quotidienne. Les objectifs de toute procédure étant de donner à l’animal la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute souffrance due aux procédures soit détectée et réduite. Pour ce faire, le suivi de la maladie se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs. Dès l’apparition des points limites, que nous avons choisis le plus précoce possible pour que l’animal reste asymptomatique, l’animal sera mis à mort. Par conséquent, cette mise à mort intervient avant l’apparition de symptômes et de nuisances dues à la pathologie. Nous optimiserons les conditions d'hébergement des animaux par la présence d'enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactes et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 4 ou 5 afin d'éviter le stress de l'isolement. Pour limiter au maximum la souffrance des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie, et une analgésie sera mise en place si nécessaire (voir points limites).

Choix des espèces

Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici l'hématopoïèse). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. En effet, bien que des formes ancestrales de systèmes hématopoïétiques aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers parmi lesquels, le poisson zèbre et la souris, sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, les outils développés chez cette espèce et l’absence d’expertise sur le poisson zèbre au sein de l’institut satisfait aux exigences d’utilisation de la souris comme espèce la moins susceptible de ressentir de la souffrance ou de la douleur pour les expérimentations proposées. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ces types de modèle de MS et ce type d'injection de cellules néoplasiques mastocytaires en intraveineux, c'est à dire des souris "jeunes adultes" âgées de 6 à 10 semaines au moment de la transplantation et/ou des injections intra-péritonéale prévues.

895 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ligature ou pose un manchon sur la carotide et la jugulaire sous anesthésie, pour étudier la relation entre veine et artère lors du remodelage artériel, y compris dans un modèle d'athérosclérose. Il décrit des interventions d'une trentaine de minutes qu'il qualifie de "peu invasives" et prévoit d'écarter et de tuer les animaux dont la souffrance ne s'améliore pas sous 24 heures. Il présente ce travail fondamental comme une piste vers de nouvelles cibles thérapeutiques cardiovasculaires et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier ces interactions.

Objectifs

Le remodelage artériel est un mécanisme d’adaptation de l’artère en réponse à un état physiologique ou pathologique. Au cours des expérimentations précédentes, nous avons montré l’existence d’une relation entre la veine et l’artère lors du remodelage artériel. Cette relation a été mise en évidence dans un modèle de remodelage physiologique par variation du flux artériel, mais également dans un modèle pathologique d’athérosclérose (maladie des grosses artères conduisant à un dépôt de graisse appelé athérome). Le signal conduisant au remodelage de l’artère serait transmis par l’intermédiaire du système immunitaire depuis la veine vers l’artère en passant par le tissu adipeux ou fibrotique. Nous devons compléter ces premiers résultats par l’identification des acteurs de la mise en place de cette relation. Pour cela, nous allons réaliser une étude des variations d’expression transcriptomique à partir des jugulaires et carotides lors de la mise en place du remodelage carotidien dans les 2 modèles expérimentaux physiologique et pathologique. Ensuite, nous allons mettre en évidence la localisation des acteurs moléculaires identifiés. Enfin, nous identifierons les facteurs circulants impliqués dans l’activation de la composante veineuse. Concernant le remodelage artériel pathologique d’athérosclérose, nous avons déjà montré qu’en inhibant la composante veineuse, le dépôt de plaque d’athérome était plus faible au niveau de la carotide. Nous devons montrer que c’est un phénomène local et non global. Pour cela, nous réaliserons une observation histologique à distance des carotides (l’aorte) pour montrer la persistance des plaques d’athérome sur ces sites alors qu’elles seront fortement diminuées sur les carotides.

Bénéfices attendus

Le rôle de la veine et du tissu périphérique dans le remodelage artériel est actuellement très peu connu. L’intérêt est donc dans un premier temps, de démontrer la place importante de ces tissus dans la physiologie artérielle. De plus, identifier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le remodelage pathologique va permettre de proposer des cibles thérapeutiques cardio-vasculaires et de proposer la veine et non plus uniquement l’artère comme cible thérapeutique.

Procédures

- Ligature de la carotide et jugulaire : geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale couplée à une analgésie, avec une durée d'intervention de 30 minutes. 277 souris sont concernées. - Pose d’un manchon sur la carotide et la jugulaire ou ligature de la jugulaire : geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale couplée à une analgésie avec une durée d'intervention de 30 minutes. 456 souris sont concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures opératoires sont peu invasives et n’entraînent pas de douleurs importantes. Un protocole d'analgésie est mis en place. Le modèle d’athérosclérose entraîne une prise de poids mais n’entraîne pas d’effets secondaires délétères sur le temps du protocole limité à 10 semaines maximum selon l’objectif technique.

Devenir

Les animaux sont systématiquement mise à mort afin de récupérer les tissus d’intérêts pour analyse.

Remplacement

Aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne permet d’étudier les mécanismes d’interaction entre la veine, l’artère et le tissu périphérique dans un contexte physiologique et encore moins pathologique. Les modèles prévus sont des modèles standards et bien documentés dont l’impact sur l’animal est bien maîtrisé.

Réduction

Le nombre d’animaux pour les expériences ont été précisément définies à l’aide d'un logiciel pour avoir assez de puissance statistique lors de l’étude. Des tests statistiques sont réalisés au cours du projet . Concernant l’étude transcriptomique de l’ensemble des transcrits, le nombre d’animaux inclus est conseillé par la plateforme technique réalisant l’expérience. Une procedure d'analyse est assurée par la plateforme pour obtenir une analyse statistique adéquat. Il est à noter que le choix de réaliser la technique de séquençage haut-débit plutôt que l’étude de cibles prédéfinies permet d’observer plus de cibles avec moins d’échantillons et donc moins d’animaux.

Raffinement

Pour les souris ayant été opérées, la réponse nociceptive des animaux sera régulièrement testée en cours d’intervention. Les éventuelles modifications du rythme cardiaque et respiratoire seront observées pour évaluer la souffrance, la détresse et l’inconfort des animaux pendant l’intervention chirurgicale. La douleur de l’animal sera évaluée quotidiennement selon une grille d’évaluation de la douleur. Nous nous intéressons à un processus inflammatoire sur un temps très court, nous surveillerons étroitement les animaux le jour de la chirurgie (ajout d’une visite en fin de journée) puis le lendemain (matin puis après-midi). En cas de souffrance constatée, l’animal sera isolé et mis à mort. Seules les souris prévues pour les temps longs à J56 post chirurgie pourront recevoir une nouvelle dose d’analgésique. Si aucune amélioration n’est constatée rapidement (24h maxi), l’animal sera écarté et mis à mort. Pour toutes les procédures, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter d’éventuels inconforts.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées représentent des outils spécifiques dans la plupart des domaines de la recherche médicale. La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme et peuvent être modifier pour se rapprocher au mieux de la pathologie recherchée. L’ensemble des souris utilisées seront des souris adultes âgées entre 3 et 6 mois, âge qui permet de standardiser la taille attendues des vaisseaux et qui permet un développement optimal du remodelage artériel.

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur provoque un accident vasculaire cérébral en poussant un fil dans l'artère cérébrale moyenne pour l'obstruer une heure, avant de tester quatre thérapies géniques virales censées limiter la lésion. Il décrit un déficit sensorimoteur, une désorientation au réveil et des pertes d'équilibre, puis une perfusion transcardiaque terminale pour prélever le cerveau. Il rattache le projet à un financement industriel et juge "indispensable" de développer de nouvelles stratégies, les procédures ne pouvant selon lui être remplacées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester quatre virus adéno-associé (AAV) par administration de manière prophylactique en intra veineuse 14 jours avant l’induction de l’ischémie afin d’étudier la diminution des volumes lésionnels et œdème après AVC. Pour cela, ces AAV seront étudiés à l’aide d’un modèle d’ischémie-reperfusion. Leurs mécanismes d'action est suceptible d'agir sur la phase aigüe de l'AVC pour limiter la lésion et la formation d'oedème.

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet d’un financement industriel afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la diminution de la lésion causée par l’occlusion artérielle. L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

L’injection des virus adéno-associé (AAV) se fera par voie intra-veineuse. Cette méthode d’administration durera 1 minute. Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monolfilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirugical durera 20 minutes. 1 heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirugical durera 10 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur. Une perfusion transcardiaque sera réalisée permettant de rincer le système vasculaire et pouvoir récupérer le cerveau. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour le prélèvement du cerveau. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique. Une fois le cerveau récupéré, des tranches d’1mm d’épaisseur seront faite à l’aide d’une matrice permettant de les colorer et ainsi déterminer les volumes lésionnels et oedème.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisance n’est à prévoir concernant les injections d’AAV car les gènes injecter ne sont pas délétères pour les hôtes. De plus, ces AAV ne sont pas réplicatifs. Les injections i.v par le sinus rétro orbital peuvent engendrer une hemorragie, un gonflement autour du site d’injection ou une cécité partielle.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau pour analyse.

Remplacement

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC, ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 28. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) dans la zone de sécurité L2 du bâtiment. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par une ischémie-reperfusion. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 25g pour les C57BL6N. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

Pour tester un anticorps contre le canal TRPV6 sur les métastases du cancer de la prostate, notamment osseuses, 650 souris swiss nude, immunodéficientes, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une fois sous anesthésie des cellules cancéreuses humaines, sous la peau pour 260 d'entre elles, dans le cœur, dans la veine ou dans le tibia pour 130 chacune, et des injections d'anticorps dans le péritoine deux fois par semaine, pendant une durée qui peut atteindre trois mois. Le porteur attend des tumeurs pouvant entraîner prostration, perte de poids, pelage dégradé, comportements agressifs avec morsures et, en cas de métastases osseuses, une destruction de l'os suivie aux rayons X. Les souris montrant des signes graves associés à un point limite sont mises à mort, et toutes les autres le sont à la fin de chaque protocole, le porteur donnant pour raison de "mettre fin à la souffrance des animaux".

Objectifs

Un vaste ensemble de preuves suggèrent que l'expression de la protéine TRPV6 est un événement commun dans le développement du cancer de la prostate. En effet, cette protéine qui constitue un canal calcique est totalement absente dans la prostate saine mais devient de plus en plus exprimé au cours du développement du cancer jusqu'à être présente chez 100% des patients ayant des stades tardifs du cancer. Pourtant, le rôle de cette protéine dans le développement des métastases et notamment les métastases osseuses (apparaissant majoritairement chez les patients atteint du cancer de la prostate) reste entièrement méconnu. Pour cela, notre projet vise à étudier la possibilité de cibler et supprimer des tumeurs et des métastases exprimant TRPV6 en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses humaines dans des souris immunodéficientes afin de déterminer la faisabilité du traitement par notre anticorps TRPV6 ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Afin de préciser le rôle du canal TRPV6 dans la formation de métastases in vivo, dont les métastases osseuses, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles d’injection qui reflètent divers mécanismes/étapes de cancérogénèse.

Bénéfices attendus

Retombées scientifiques et économiques attendues : Comme partie fondamentale du projet, nous allons d’abord démontrer le rôle du canal TRPV6 dans l’acquisition du phénotype agressif/métastatique tels que la migration, l’invasion et, et ainsi évaluer son implication dans le guidage et l’installation des cellules cancéreuses dans l’os. Ces données nous permettront de corréler la présence/expression de ce canal à sa fonction pathophysiologique particulière et le proposer comme outil de diagnostique en clinique. Ce dernier point est crucial pour le diagnostic du cancer de la prostate pour éviter un sur-traitement inutile et possiblement nocif pour le patient. L’application la plus importante de ce projet sera la preuve de concept de la stratégie thérapeutique en utilisant l’anticorps mabTRPV6 afin de cibler spécifiquement et de stopper les tumeurs exprimant TRPV6. Finalement, nos outils pour cibler TRPV6 in vivo comme mabTRPV6 seront validés pour être humanisés et utilisés chez l’humain. Les perspectives quant à la possibilité d’empêcher l’apparition de métastases et/ou leur expansion, notamment, les métastases osseuses, seront également considérées afin de les mettre sur l’échelle des essais cliniques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis une fois à l'injection de cellules cancéreuses sous anesthesie par isoflurane : soit par la voie souscutanée: 260 animaux soit par la voie intracardique: 130 animaux soit par la voie intraveineuse: 130 animaux soit par la voie intratibiale : 130 animaux Les animaux seront injectés en intrapéritoneal avec des anticorps monoclonaux anti-TRPV6 (2 fois par semaine) pour suivire le développement des tumeurs. Au maximum cela sera 650 animaux. La durée peut aller jusq'à 3 mois. Les tumeurs seront photographiées une à deux fois par semaine sous anesthésie par isoflurane si les animaux développeront des métastases.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules cancéreuses entraînera l’apparition de tumeur qui constituera la nuisance principale attendue. Des signes de stress peuvent apparaître à la suite du développement de la tumeur : prostration, perte de poids, pelage dégradé ou encore des comportements agressifs avec morsures qui seront suivis quotidiennement. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse (qui sera suivie par rayons X). L’anesthésie par isoflurane ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant extrêmement rapidement (quelques secondes).

Devenir

Afin de mettre fin à la souffrance des animaux, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit en pathologie humaine. De plus, le trafficking/guidage et l’installation dans l’os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro.

Réduction

Réduction : Le logiciel statistique BiostaTGV a été utilisé pour réaliser une analyse de puissance afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 10 souris par groupe expérimental (nombre de groupes: 13) seront nécessaires pour réaliser un test de Wilcoxon requis pour ce type d’étude. Nous ferons donc 5 protocoles de 130 souris chacun. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale de mAbs, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (tunnel en papier, batôn à ronger, coton) pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront révisés régulièrement. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques (perte de poids, aspects du pelage, morsures, etc). Les expérimentations se feront dans un environnement confiné. Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. En cas de plaies causées par les souris (lutte entre animaux), des soins seront immédiatement prodigués afin de réduire la douleur. En cas de signes graves de stress associé à un des points limites, les animaux correspondant seront mis à mort afin de mettre fin à leur souffrance.

Choix des espèces

Les souris swiss nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T, mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines. L’incidence, et le développement des tumeurs humaines est très faible chez les animaux plus âgés.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, porteuses d'une insuffisance rénale chronique d'apparition spontanée, reçoivent des traitements pharmacologiques quotidiens et subissent des passages en cage métabolique jusqu'à quatorze heures et une injection rétro-orbitaire pour mesurer la filtration rénale. Le porteur prévoit de tuer les animaux perdant plus de 20 % de leur poids ou présentant des signes de souffrance, seuils qu'il présente comme des points limites. Il affirme le recours à l'animal "indispensable", les mécanismes de la maladie étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si l’IRC n’est pas correctement traitée, elle peut conduire à la dialyse. L’IRC mettant en jeux plusieurs organes, la découverte de nouveaux traitements de cette maladie nécessite des études précliniques chez l'animal. Nos travaux antérieurs ont montré l’efficacité de certains traitements chez la souris diabétiques Notre objectif est de tester l’efficacité de ces traitements dans un autre modèle non-diabétique présentant un développement spontané et rapide de l’IRC .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre les mécanismes de mise en place de l'insuffisance rénale, et de proposer de nouvelles pistes de traitement.

Procédures

Les souris de 4 semaines seront soumis à des 3 séries de traitements pharmacologiques quotidiens jusqu'à 8 /10 semaines d'âge. Au cours du traitement, les souris seront soumises (1) à un suivi régulier de leur poids (1 fois par semaine), (2) à une mesure de leur composition corporelle (2 à 3 fois), (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois), (4) à une évaluation du débit de filtration glomérulaire (DFG) (1 fois, 1 semaine avant la fin du traitement. A l’issue des traitements, les souris seront euthanasiées et analysées.

Impact sur les animaux

(1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vis versa (2) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) dans ll’EchoMRI (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois): léger stress lié au passage (14h max) dans la cage métabolique (4) évaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine, et leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans le développement de l’IRC et qui sont impossibles à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal. Il est prévu d’utiliser 410 souris. Le nombre de souris par groupe (n=10) est calculé au plus juste pour espérer observer une différence significative.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère : 4 souris par cage équipée d’éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), et alimentée en eau et en aliment ad libitum. Les animaux sont observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale, et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Signes de souffrances (posture de prostration ou léthargie, comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Les traitements pharmacologiques débuteront sur des souris âgées de 4 à 6 semaines quel que soit le génotype. A ces âges, les reins sont pleinement développés et les souris ne présentent aucune altération détectable de protéinurie ou d’urémie (critères de détérioration de la fonction rénale). Les traitements seront poursuivis durant 8 à 10 semaines avant euthanasie.