Souris
Formation continue en chirurgie expérimentale chez les rongeurs
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 200
300 souris et rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil. Ils servent de support à une formation continue à la chirurgie, subissant une canulation de vaisseaux sanguins ou une castration réalisées par des stagiaires, non pour produire des connaissances mais pour que ces derniers soient ensuite autorisés à opérer. Le porteur indique avoir ramené la formation de quatre à deux séances de travaux pratiques et réserver l'entraînement aux sutures à des dispositifs artificiels. Il affirme qu'il est "difficile d'envisager" la formation chirurgicale sur les seuls simulateurs.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de former les stagiaires de la formation continue aux gestes de base de la chirurgie chez les rongeurs: préparation des locaux, des animaux, du chirurgien, anesthésie, techniques chirurgicales, sutures, réveil et soins post-opératoires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre aux stagiaires de notre formation les bases de la chirurgie chez les rongeurs et qu'ils soient ensuite autorisés à pratiquer la chirurgie. Tout concepteur ou réalisateur de projet en expérimentation animale a l'obligation d'acquérir et de maintenir les compétences qui lui seront nécessaires pour l'accomplissement de ses projets. Notre formation fait partie des formations réglementaires agréées par le ministère de l'agriculture et de la souveraineté alimentaire. Elle entre donc parfaitement dans le cadre de l'aquisition de compétences pour les personnels souhaitant pratiquer la chirurgie sur les rongeurs dans le cadre de leurs projets.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales d'anesthésiants chimiques sous anesthésie gazeuse. Ils subiront ensuite des opérations chirurgicales: - deux opérations de canulation de vaisseaux sanguins chez des rats (entre 1h et 1h30 pour l'opération complète). - une opération de castration chez la souris (30 min d'opération max). Afin d'éviter de potentielles douleurs post-opératoires, tous les animaux sont mis à mort avant leur réveil.
Impact sur les animaux
Les opérations chirurgicales sont des sources potentielles de douleurs, essentiellement post-opératoires. Les animaux seront traités préventivement pour les douleurs per-opératoires et ils seront mis à mort avant leur réveil pour supprimer toute douleur post-opératoire.
Devenir
Les animaux seront mis à mort immédiatement à la fin des opérations chirurgicales afin d'éviter d'éventuelles douleurs post-opératoires après le réveil.
Remplacement
L'objectif est de former des stagiaires aux principaux gestes chirurgicaux chez les rongeurs. Il est difficile d'envisager cela uniquement sur des dispositifs artificiels. L'entraînement à la réalisation des points de sutures est réalisé sur des dispositifs articifiels.
Réduction
Cette formation comprenait à l'origine 4 séances de travaux pratiques sur les animaux. Petit à petit, nous avons réduit le nombre de séances de travaux pratiques, ce qui a permis de fait de réduire le nombre d'animaux utilisés. Il n'y a plus que 2 séances de travaux pratiques aujourd'hui. Avec l'aide du service audiovisuel de l'Université, nous avons réalisé des vidéos commentées et légendées des différentes opérations chirurgicales réalisées par les stagiaires. Cela nous permet de montrer les opérations aux stagiaires de façon très efficace et sans avoir à faire des démonstrations sur des animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux d'une dizaine d'individus avec présence systématique de dispositifs d'enrichissement ( bâtons à ronger, tunnel en carton, maisonnette en plastique...). Les animaux sont acclimatés dans les locaux pendant au moins une semaine. Les souris et les rats sont hébergés dans des pièces différentes. Les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Seuls les animaux en parfaite santé seront intégrés dans les procédures de chirurgie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale. D’autre part, notre formation est spécifique aux rongeurs. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes. Ils sont ainsi atteint leur taille adulte, mais ne possèdent pas trop de tissu adipeux sous-cutané, ce qui pourrait compliquer les opérations chirurgicales pour des stagiaires peu expérimentés.
Examens IRM sur modèles rongeurs en provenance d’établissements utilisateurs extérieurs
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
600 rongeurs, 400 souris et 200 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à six examens d'IRM sous anesthésie gazeuse de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste au gadolinium, le porteur signalant un risque de non-réveil après la narcose. Il s'agit d'un service de plateforme mutualisant un appareil d'imagerie pour des équipes extérieures, chaque animal étant ensuite réintégré au protocole autorisé dont il relève, où les procédures se poursuivent. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne permet d'étudier le cerveau entier et présente l'IRM répétée comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment le phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie. Une IRM à très haut champ magnétique ainsi que des antennes dédiées à l’imagerie du cerveau de souris et de rat sont des déquipements de pointe qui peuvent apporter des informations déterminantes dans des projets scientifiques variés impliquant le petit animal via l’utilisation d’un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants. Ce projet a pour but de faciliter la mise en place de collaborations avec des équipes externes pour réaliser des études d’imagerie IRM sur des modèles rongeurs de diverses pathologies ou des modèles de rongeurs sains afin d’investiguer des questions plus fondamentales sur le fonctionnement cérébral. Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices scientifiques à long terme aussi bien pour la plateforme que pour les équipes utilisatrices. Du point de vue scientifique, il permet d’intégrer de nouvelles données d’imagerie pour répondre à une question scientifique précise (expliquée dans les projets scientifiques autorisés par le ministère de l’étude concernée) et aider à la compréhension de pathologie humaine sur les modèles animaux en vue d’un traitement thérapeutique ou de l’aide au diagnostic. D’autre part, dans le cas d’étude longitudinale l’imagerie par résonance magnétique (IRM) présente un grand intérêt en réduisant le nombre d’animaux.
Procédures
Les animaux, 600 au total incluant 400 souris et 200 rats, seront soumis à des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection intraveineuse dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés au maximum 6 fois sur le même animal avec un délai de 72h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : (i) Risques liés à l’anesthésie: stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose ; (ii) Risques liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement ; (iii) Risques liés au transport (stress) lors du changement d’établissement utilisateur.
Devenir
A l’issue des examens IRM (imagerie par résonance magnétique), les animaux seront réintégrés dans leur hébergement d’origine pour réaliser les procédures décrites dans le projet scientifique global autorisé par le ministère de l’étude concernée. Les examens IRM ne couvrent qu'une étape dans le cadre du projet scientifique global. Il s'agit ici d'une utilisation continue des animaux et non d'une réutilisation car les animaux ne peuvent être remplacés par d'autres. Ils sont inclus dans un projet scientifique global autorisé par le ministère et subissent une suite de procédures (avant et après les examens IRM) décrites dans le projet global.
Remplacement
Il n’existe pas d'alternatives (études in vitro, in silico ou sur animaux invertébrés) qui permettent d’étudier des mécanismes cellulaires, moléculaires, métaboliques complexes à l’échelle global du cerveau. Le rongeur est une des espèces les plus appropriées pour les études d'imagerie par résonance magnétique (IRM) dans un contexte neurologique, d’autant plus que l’IRM permet l’étude longitudinale des paramètres d’intérêt de façon non invasive.
Réduction
600 animaux au total sont inclus dans le projet dont 400 souris et 200 rats. Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Des études pilotes et tests statistiques ont préalablement étaient réalisés pour estimer le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante pour chaque étude. Les tests statistiques seront dépendants des différentes études qui auront une phase d’imagerie dans leurs protocoles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans leur établissement utilisateur avec les mesures de raffinement et conditions d’hébergement décrites dans projet initial autorisé par le ministère. Les animaux sont transportés de leur lieu d’hébergement initial vers le laboratoire au calme dans une cage adaptée avec de la nourriture, de l’eau à dispositions des animaux ainsi que l’enrichissement mis en place dans leur hébergement d’origine. L’arrivée se fait au niveau du quai de livraison où l’expérimentateur réalisant les IRM (imagerie par résonance magnétique) amène les animaux dans la pièce de préparation à l’aide d’un chariot en empruntant un monte charge. Les animaux sont laissés dans leur cage pendant 30 min à 1h dans la pièce de préparation, et une vérification de l’état des animaux (état du poil, comportement dans la cage, position des oreilles et du museau) est réalisée à la fois par l’expérimentateur réalisant les IRM et une personne responsable des animaux de l’établissement extérieur. La tête des animaux est maintenue immobile par un système de contention (barres d’oreille et mors à dent) intégré au berceau. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui des barres d'oreilles, un gel ophtalmique est appliqué pour limiter la déshydratation oculaire. De la vaseline sera également appliquée avant d’introduire la sonde rectale. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration anormale (trop rapide ou trop basse malgré l'ajustement d'anesthésique) ou une température anormale (trop élevée ou trop basse malgré l'ajustement de la consigne de température du bain marie ou de la modification de l’anesthésie). Nous accorderons également une grande importance à la période de réveil (chambre thermostatée, stimulation régulière de l’animal). Une personne référente des animaux à imager sera présente de façon à guider l’expérimentateur qui réalise l’IRM et à contrôler au mieux l’anesthésie de l’induction au réveil complet de l’animal.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles de rongeurs génétiquement modifiés sont développés pour mimer des pathologies humaines. En raison de sa taille, le rat possède un cerveau plus facile à imager (plus gros). Il est donc plus facile d’obtenir un meilleur signal chez le rat, notamment dans des zones cérébrales de petite taille. Cependant, de nombreuses pathologies cérébrales sont préférentiellement induites et étudiées chez la souris que nous pouvons imagées plus aisément avec des antennes adaptées. Le stade de développement sera décrit dans le projet initial autorisé par le ministère de l’étude concernée. L’âge minimum requis pour passer un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) est fixé à 3 semaines (rats et souris confondus), en raison des contraintes de berceau IRM que nous possédons à la plateforme IRM et de l’anesthésie gazeuse qui sera optimale sur des animaux sevrés qui ont acquis une capacité respiratoire suffisante. De même pour la récupération, elle sera plus facile si on travaille sur des animaux qui sont sevrés.
Développement d’outils pour la thérapie des cancers de la prostate résistants à la castration
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 530 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous la peau de cellules tumorales de prostate humaine, 180 d'entre elles subissant en outre une castration, avant l'administration répétée de composés de thérapie génique pendant onze semaines et le prélèvement terminal du sang et des tumeurs. Le porteur décrit une technologie "prometteuse" relevant de la médecine de précision, dont les bénéfices pour les patients sont renvoyés au futur, l'étape immédiate étant de mesurer l'efficacité de composés déjà criblés in vitro. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à la souris pour cette phase préclinique.
Objectifs
Le cancer de la prostate est l'un des cancers les plus courants dans les pays développés. Les patients atteints d'un cancer localisé peuvent être traités par chirurgie ou radiothérapie, tandis que la castration est utilisée comme traitement initial pour les patients atteints d'une maladie avancée. Bien que la plupart des patients répondent initialement à cette thérapie hormonale, une résistance peut apparaître dans les deux ans, ce qui signifie que le cancer de la prostate devient résistant à la castration. Les chimiothérapies actuelles ne permettent qu'une survie de 12 à 18 mois, provoquant 9000 décès par an et faisant de ce cancer l’un des plus mortels. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration. Une stratégie appelée thérapie d'acides nucléiques ou thérapie génique peut améliorer les traitements actuels en ciblant les gènes actifs après la castration pour retarder ou empêcher l'apparition de la résistance aux traitements. La thérapie génique présente un intérêt thérapeutique pour notre laboratoire. Nous avons développé des composés qui ont été utilisés pour induire la mort des cellules tumorales in vitro et pour réduire la progression tumorale in vivo chez la souris. Notre laboratoire souhaite réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de nos composés de troisième génération. Les modèles que nous utiliserons sont basés sur la transplantation de cellules de prostate humaines résistantes aux traitements à des souris immunodéficientes, capables de mimer la maladie observée en clinique. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Bénéfices attendus
La thérapeutique génique est de plus en plus considérée comme une solution prometteuse pour la prise en charge des cancers de la prostate. Elle s'intègre dans la médecine de précision et permet de fabriquer un traitement individualisé en quelques semaines, pour une guérison plus rapide et efficace. Contrairement aux médicaments classiques, qui peuvent prendre jusqu'à dix ans pour être développés et cibler spécifiquement la mutation génétique responsable de la tumeur, la technologie génique agit directement sur des gènes impliqués dans la prolifération tumorale. Notre technologie est conçue pour contourner les principales limites de l'expansion du marché des composés géniques, notamment la faible biodisponibilité, la toxicité et la difficulté à atteindre les tissus cibles. En utilisant des lipides comme vecteurs de délivrance des composés géniques, nous sommes en mesure d'augmenter la stabilité, la solubilité et la spécificité de nos composés. De plus, notre technologie offre également la possibilité de co-délivrer sélectivement des agents diagnostiques ou thérapeutiques, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour la médecine personnalisée. En résumé, notre technologie représentent une avancée majeure dans la lutte contre les cancers de la prostate, en offrant une approche plus ciblée, efficace et personnalisée pour le traitement de cette maladie complexe.
Procédures
Les interventions sont les suivantes : a) Xénogreffe sous-cutanée : Les 1530 animaux de ce projet seront injectés sous-cutanément avec des cellules tumorales prostatiques sous anesthésie. Cette procédure dure environ 3 minutes par animal. b) Castration : Cette procédure concerne un groupe de 180 souris. Elle sera réalisée directement après la xénogreffe pour les animaux concernés, sous anesthésie. La durée maximale de la castration est de 30 minutes par souris. c) Suivi par imagerie : Cette procédure sera effectuée pour un groupe de 180 souris. La fréquence des imageries dépendra de la vitesse de croissance tumorale : une fois par semaine les deux premières semaines, puis une imagerie tous les 15 jours pendant 11 semaines de traitement. Le temps d'imagerie sera adapté à chaque modèle de tumeur. d) Traitement : L'administration des composés thérapeutiques se fera pendant 7 jours consécutifs pour les 450 souris dans la procédure d'évaluation de la spécificité des composés, et 3 fois par semaine pendant 11 semaines pour les 1080 souris dans la procédure d'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Nous utiliserons l'injection intrapéritonéale, qui ne durera que quelques secondes par souris et ne nécessitera pas d'anesthésie. À la fin de l'étude, ainsi qu'en cours d'étude si nécessaire en fonction des critères limites, les souris seront euthanasiées et le sang ainsi que les tumeurs de tous les individus seront collectés.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales chez les souris peut causer des effets indésirables tels que des douleurs, une faiblesse générale et une perte de poids. De même, l'injection d'oligonucléotides peut également provoquer des réactions indésirables telles que des inflammations et des douleurs au site d'injection. En outre, la castration peut également avoir des effets négatifs sur le comportement et la santé des souris, tels que des changements hormonaux et des modifications de l'activité locomotrice. Les modalités d'imagerie choisi n'entrainent pas d'algie chez l'animal. Cependant, l'induction anesthésique est une source de stress potentiel avant et pendant l'imagerie et l'acte chirurgical.
Devenir
À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées. Le sang et les tumeurs de tous les individus seront collectés pour des analyses post-mortem afin de contrôler la toxicité de nos composés et de valider la spécificité de chaque composé testé.
Remplacement
Afin de vérifier la pertinence des composés développés dans le laboratoire, le premier criblage sera effectué in vitro sur des modèles cellulaires en culture. Seules les composés positives démontrant leur efficacité in vitro seront utilisées dans les études in vivo du présent projet. Cependant, le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie. La souris immunodéficiente est un modèle de choix puisqu'elle permet le développement et le suivi de lignées tumorales humaines, de mimer la maladie observée en clinique. L'induction des tumeurs par xénogreffes chez la souris est une technique maîtrisée et documentée. Il n'existe actuellement aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l'expérimentation animale durant cette étape préclinique.
Réduction
Pour chacun des composés, nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux tout en restant une statistique fiable permettant de caractériser leur efficacité sur les modèles de xénogreffes de cellules tumorales de cancer de la prostate. Nos approches pour évaluer l'efficacité de chaque composé étudié comprendront des groupes témoins. Afin de réduire au minimum le nombre d'animaux et dès que cela sera possible, ces groupes témoins seront communs à plusieurs tests d'efficacité. Par ailleurs, nous réaliserons des études pilotes sur un petit nombre d'animaux par groupe afin de garantir une bonne tolérance aux molécules et d'adapter les doses à administrer avant de passer aux tests d'évaluation d'efficacité thérapeutique sur un nombre plus important d'animaux.
Raffinement
Nos études in vivo seront réalisées de manière séquentielle pour déterminer l'action des drogues sur le développement tumoral. Des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux afin de vérifier leur tolérance aux molécules et d'ajuster les doses à administrer à notre souche de souris. De plus, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives sur les animaux. Enfin, nous améliorerons les conditions d'hébergement des animaux en proposant de la litière enrichie (copeaux de bois compactés et/ou coton) et en maintenant les souris en groupe de 4 à 5 individus pour éviter le stress lié à l'isolement. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans une pièce avec des cycles de lumière obscurité de 12 heures, où la température et l'hygrométrie seront constamment contrôlées. Elles auront un accès libre à la nourriture et à l'eau. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d'intervenir rapidement dès le moindre signe de souffrance. Pour minimiser la souffrance et le stress des animaux, les manipulations pourront être effectuées sous anesthésie gazeuse pour un endormissement et un réveil rapides, et une analgésie sera administrée en cas de signes de douleur. Tout signe ou comportement anormal tels que des difficultés respiratoires, une souris prostrée ou en retrait, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial des animaux entraînera la fin de l'expérimentation et leur euthanasie immédiate afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce de la classe des mammifères proche de l'homme pour sa physiologie (ici le cancer de la prostate). Sur cette base, en adéquation avec nos objectifs, le modèle murin apparaît le plus pertinent. La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d'un individu ou d'une lignée d'une espèce donnée chez un individu hôte d'une espèce différente. L'accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de nos approches. En effet, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise tumorale et éviter la réaction de l'hôte vis-à-vis du greffon. Pour la réalisation de xénogreffes de lignées tumorales humaines, cette espèce constitue le modèle in vivo le plus adapté : la maîtrise zootechnique (élevage/confinement); la praticabilité chirurgicale (technicité, accessibilité du site sous-cutané ou orthotopique); les connaissances actuelles et la diffusion dans le domaine scientifique (littérature, collaborations). Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris mâles âgées de 6 semaines qui ont atteint leur maturité sexuelle, afin de garantir la sécrétion d'hormones masculines qui ont une influence sur le développement du cancer de la prostate chez l'homme.
étude de la modulation de l’extinction de la memoire
- Formation professionnelle
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 90 opérées puis tuées sans réveil et 30 soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet n'est pas de produire des connaissances mais de former des étudiants de master et de thèse à l'implantation de canules dans le cerveau et à un test d'extinction de la mémoire de peur liée à un contexte. Après une chirurgie d'une heure, les souris subissent plusieurs séances d'exposition puis une injection intracérébrale, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau. Le porteur affirme que ces techniques, une fois maîtrisées par les stagiaires, réduiront le nombre d'animaux utilisés dans leurs propres laboratoires.
Objectifs
Nous proposons de former de nouveaux chercheur, des étudiants en master et des étudiants en thèse, sur les méthodes modernes de mesure d’activités neuronales impliquées dans la codification de la memoire. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront appris et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et de comportement leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et de comportement leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.
Procédures
Les animaux suivront une chirurgie (1 heure) qui permettra l’implantation de deux canules intracérébrales. Deux semaines plus tard, les animaux suivront un test comportemental qui permet d’évaluer la formation et la disparition de la mémoire de peur liée à un contexte spécifique. Ce test comprend : 4 jours d’habituation à la manipulation de l’expérimentateur. (Entre 3 et 5 minutes par jours). Test jour 1 : 1 fois 3 minutes. Test jour 2 : 1 fois 5 minutes. Test jour 3 : 6 fois 2 minutes (intervalle 1 heure) À la fin de la dernière exposition, les animaux recevront une injection dans la canule intracérébrale. 5minutes/hémisphère = 10minutes total. Test jour 4 : 1 fois 2 minutes. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé.
Impact sur les animaux
- Nuisances liées à la procédure chirurgicale : douleurs post opératoires, perte de poids, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration de la canule. - Nuisances liées au test comportemental : stress, douleur, agressivité vers les congénères. - Nuisances liées à la connexion des animaux au niveau de la canule : stress de la contrainte de la contention auquel l’animal doit s’habituer. - Nuisances liées aux injections intracérébrales: stress, risque mineur d’infection.
Devenir
Les animaux ayant suivi la chirurgie et le test comportemental, seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques. Les animaux ayant suivi que la procédure chirurgicale (sans réveil) seront euthanasie par dislocation cervicale.
Remplacement
Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est inévitable car aucun modèle in vitro ne permet l’étude des circuits neuronaux impliqués dans la modulation de la mémoire de la peur. Les souris sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux
Réduction
L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.
Raffinement
Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cage de 4-5 souris sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil ainsi que pendant les jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Afin de palier le stress lie à la manipulation, un programme d’habituation est mis en place.
Choix des espèces
La souris est la espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système central est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.
Evaluation du potentiel immuno-modulateur d’extraits de plantes et de probiotiques et de leur capacité à renforcer et à stimuler la réponse immunitaire anti-infectieuse au cours du vieillissement.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent pendant quinze jours des extraits de plantes et des probiotiques par voie orale, une vaccination antigrippale sous anesthésie, puis des prélèvements sanguins répétés à la mâchoire ou en rétro-orbital jusqu'à trois mois, avant l'euthanasie et le prélèvement de la moelle, de la rate et du foie. L'objet réel est de tester si ces compléments renforcent la réponse au vaccin chez des souris âgées de 18 à 20 mois, les retombées pour les personnes âgées restant présentées comme une validation à venir. Sur le remplacement, le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut pas mimer la réponse vaccinale et conclut au recours aux souris âgées.
Objectifs
Le vieillissement croissant de la population impose de prévenir les infections sévères et fréquentes par des vaccins. Néanmoins le vieillissement altère l’intensité et la qualité des réponses vaccinales, limitant ainsi la portée des recommandations vaccinales dirigées contre la grippe, le pneumocoque, la coqueluche mais également le tétanos ou le zona après 65 ans. Toutes les étapes des réponses vaccinales sont altérées par le vieillissement du fait de l’altération du système immunitaire appelés l’immunosénescence. Ce projet nous permettra d’une part de mieux comprendre les mécanismes de l’immunosénescence et les raisons de ces limitations. Le second objectif sera donc de définir des stratégies de renforcement de la réponse immunitaire via l’administration d’extraits de plantes et de probiotiques. Ainsi, nous avons montré dans une étude précédente la capacité d’extraits de plantes à renforcer et à stimuler la réponse immunitaire anti-infectieuse au cours du vieillissement. Ces données nous amènent à investiguer leur impact en association de souches probiotiques sur la réponse immunitaire à la vaccination antigrippale au cours de l’âge. L’objectif étant de déterminer in vivo le potentiel adjuvant d’extraits de plantes et d’une association de souches probiotiques à renforcer et /ou prolonger la réponse immunitaire antigrippale au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’une part de mieux comprendre les mécanismes de l’immunosénescence et les raisons du défaut de réponse vaccinale chez le sujet âgé. D’autre part, cette étude permettra de valider la pertinence scientifique d’utiliser des extraits actifs de plantes et des probiotiques pour renforcer le système immunitaire et améliorer la réponse vaccinale.
Procédures
Afin de définir des stratégies de renforcement de la réponse immunitaire antigrippale au cours du vieillissement, nous administrerons pendant 15 jours des extraits de plantes et des probiotiques quotidiennement par voie orale à des souris jeunes (5 mois) et âgées (18-20 mois) . Après 15 jours de traitement, ces souris seront vaccinées contre la grippe saisonnière par voie intra-dermique au niveau de la patte sous anesthésie générale ou par voie intrapéritonéale. Le choix du mode d’injection sera fait sur l’étude « pilote ». Le traitement sera poursuivi 7 jours post-vaccination. Sur l’ensemble des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 jour avant la vaccination, puis à 15 jours, 30 jours, 60 jours et 90 jours après vaccination, pendant 3 mois afin d’évaluer l’apparition d’anticorps au cours du temps. Une numération de la formule sanguine sera réalisée, ainsi que le dosage des anticorps IgG anti-HA dans le sérum. Ces prélèvements sont prévus au niveau mandibulaire et seront alternés d’un côté et de l’autre et pourront être remplacé par un prélèvement retro-orbital. Le sang sera prélevé en rétro-orbital sous anesthésie générale et analgésie locale. Ensuite après une injection intra-péritonéale de l’antigène viral, l’efficacité vaccinale sera déterminée en étudiant différents paramètres immunologiques sur les organes prélevés après euthanasie des souris. Pendant toute la durée du protocole, un suivi journalier de l’état général et un suivi hebdomadaire du poids des animaux seront effectués.
Impact sur les animaux
L’administration quotidienne des extraits de plantes et l’association de souches probiotiques pourrait altérer la prise alimentaire des souris. Afin d'éviter le stress de la manipulation aux animaux, le suivi du poids se fera de manière hebdomadaire. Les prélèvements de sang peuvent entrainer des lésions. Ces prélèvements sont prévus au niveau mandibulaire seront alternés d’un coté et de l’autre et pourront être remplacé par un prélèvement retro-orbital.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes (moelle osseuse, rate, foie…)
Remplacement
Les mécanismes de la réponse vaccinale sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les groupes d’animaux seront constitués de 6 à 10 individus pour permettre une étude statistique. Les extraits ou probiotiques évalués ont recut des autorisations d'utilisation pour l'homme. L’innocuité et la toxicité des extraits ou probiotiques seuls ou en association seront déterminées in vitro par l’évaluation de leur cytotoxicité. Le choix des extraits ou probiotiques est effectué avant administration aux animaux.
Raffinement
A l’arrivée des souris, l’enrichissement de leur cage d’arrivée est maintenu pour minimum 15j d’acclimatation. Des igloos ou tunnel seront disposés au fond de la cage. Du papier sera disposé dans les cages afin de permettre la formation de nid. L’hébergement est en cage collective sur portoir ventilé (atmosphère contrôlée, avec alternance jour/nuit) avec accès illimité à l’eau et à l’alimentation standard. Les procédures font l’objet d’un suivi du bien-être des animaux adapté à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Afin de diminuer le stress et la douleur, des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les actes pouvant présenter de la douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement (prostration, apathie, ventilation, comportement, aspect des poils, piloérection) et le suivi du poids une fois par semaine ou quotidiennement si une perte de poids est constatée. Une grille d'évaluation permet au personnel en charge de la surveillance et/ou du suivi des procèdures d'évaluer de manière objective ces critères permettant de déterminer les points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances . L'étude sera conduite par des personnes qualifiées et formées au respect des conditions de bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les mécanismes de la réponse vaccinale sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité et ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris âgées nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Souris jeune (adulte) minimum 5 mois et souris âgées (15/18mois) afin d'étudier l'impact des extraits de plantes et des probiotiques sur la réponse immunitaire au cours du vieillissement
Interaction entre les neurones sensoriels et le système immunitaire pendant l’infection par le virus herpès
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
4 651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée, dont 2 479 individus en gravité modérée. Leur peau est abrasée puis infectée par le virus de l'herpès, avec des injections cutanées répétées et une molécule les rendant insensibles à la chaleur, pour étudier le rôle des neurones sensoriels dans la réponse immunitaire. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne pourra être administré sans compromettre les résultats, alors que les procédures peuvent provoquer des douleurs modérées. Il affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Objectifs
Les neurones sensoriels permettent à un organisme de détecter le danger grâce à une sensibilité aux stimuli mécaniques, thermiques et chimiques. Ces neurones sensoriels sont impliqués dans la perception de la douleur à ces différents stimuli. Il est de plus en plus évident que les neurones sensoriels et le système immunitaire interagissent pour réguler la douleur, l'inflammation et les défenses de l'hôte contre les pathogènes. Lors d’’une infection, des molécules inflammatoires activent les neurones dont les terminaisons nerveuses sont présentes dans les tissus, permettant ainsi la transmission de signaux au cerveau et la sensation de douleur. Ces neurones libèrent également des neuropeptides au niveau de la lésion, qui peuvent en retour moduler les cellules immunitaires présentes localement. Les neurones sensoriels innervant la peau sont hétérogènes : certains sont impliqués dans la détection de la chaleur et d’autres dans la détection du toucher. Ces différences sont dues à l’expression de différents marqueurs qui nous permettent de modifier génétiquement des animaux afin qu’ils ne soient plus capables de détecter ces sensations. Ainsi, l’objectif de notre projet de recherche est de comprendre comment les neurones sensoriels de la peau régulent l’inflammation et la réponse immunitaire au cours d’une infection par le virus herpès.
Bénéfices attendus
L'influence des neurones sensoriels sur la régulation de la réponse immunitaire inflammatoire lors d'une infection virale par le virus herpès reste inexplorée. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes sous tendant cette régulation permettrait d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur l'inhibition ou l'activation locale des neurones sensoriels dans le cas d'infections virales, ou pour aller plus loin, lors de pathologies inflammatoires très invalidantes, telles que la polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
L’infection cutanée par le virus herpès nécessite une légère altération de la peau, celle-ci étant réalisée par une légère abrasion de la couche superficielle de la peau pendant 20 secondes réalisée sous anesthésie générale (par injection intrapéritonéale d’un anesthésiant). Les animaux subiront également des injections intradermiques quotidiennes de traitements immunomodulateurs afin d'évaluer leurs rôles potentiels dans la régulation de la réponse immunitaire et donc dans la résolution de l'infection. Pour évaluer le rôle des neurones sensoriels qui détectent la chaleur, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec une molécule spécifique qui rend les animaux insensibles à la chaleur. Les injections intrapéritonéales (ip), intradermiques (id) et sous-cutanées (sc) n’excédant pas 10 secondes. Les ip seront réalisées 1 seule fois par animal, les id seront réalisées quotidiennement pendant 4 jours et les sc 3 fois pendant 3 jours. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les animaux seront infectés par le virus herpès après une légère abrasion de la peau. L’infection va déclencher une réponse immunitaire inflammatoire et une plaie cutanée se développera à partir du point d’infection. En revanche, cette plaie se résout spontanément chez une souris sauvage, ainsi que chez les souris qui n’ont plus de neurones sensoriels. Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs modérées chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d'explorer l'effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Après l'infection, un pansement sera appliqué au niveau du flanc des souris pendant 2 jours. Cela peut induire des difficultés pour se mouvoir. Le suivi de la taille des plaies cutanées ainsi que les procédures incluant des injections cutanées peuvent induire du stress chez l’animal liées aux contentions. Les injections de molécules immunomodulatrices sont connues pour induire des démangeaisons légères sans induire d'auto-blessure de l'animal. Les tests comportementaux peuvent induire une douleur légère si le génotype de l'animal fait qu'il développe une hypersensibilité accrue suite à l'infection par le virus herpès.
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (peau et ganglions).
Remplacement
Nous proposons que les neurones sensoriels régulent l'évolution de la réponse immunitaire locale au niveau de la peau au cours de l'infection par le virus herpès. Seuls les modèles animaux permettent d'étudier le développement de l'activation simultanée du système immunitaire et du système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions qui innervent la peau infectée. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l'interaction neurone/cellule immunitaire ou des molécules produites par ces neurones sensoriels après infection, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la culture cellulaire de neurones et de cellules immunitaires.
Réduction
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d'infection par abrasion du flanc est un modèle très bien décrit et maitrisé au sein du laboratoire permettant à l'infection de se développer dans quasiment 100% des souris infectées. Nos données obtenues dans un projet précédent nous ont permis de déterminer le nombre de souris nécessaires par expérience, en limitant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Pour une différence clinique et statistiquement significative, nous avons estimé que la taille d’un groupe était de 11 souris pour les infections par le virus herpès en considérant des moyennes de taille de lésion de 2,5 mm2 pour les souris contrôles, une différence significative de 1,5 mm2 et un écart-type commun de 1,2 mm2. Ainsi, des lots de 11 souris seront constitués pour chaque condition testée afin de répondre aux exigences de test statistique de rang non paramétrique. Pour chaque groupe d'animaux utilisés, tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, taille de la plaie, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate et ganglions) afin d'éviter de répéter inutilement les expériences inutiles. Pour minimiser l'impact du microbiote intestinal sur le développement de l'infection et donc la variabilité de nos expériences, nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec les souris provenant de la même portée mais non génétiquement modifiées.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Eau et nourriture seront fournies ad libitum et les animaux seront libres de leur déplacement. Pour réduire la souffrance : une surveillance quotidienne sera réalisée. Les points d’observation seront réalisés quotidiennement suivant l’infection et consisteront en une vérification du poids, de la vivacité et de l'état du pelage des animaux. Au besoin et au moindre signe de dégradation de l'état général, d'autres points d'observation intermédiaires seront assurés. Une souris qui aura perdu 20% de son poids initial sera systématiquement mise à mort. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux pendant 2 jours suivant l'infection pour faciliter au maximum l'alimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées. Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature.
Etude préclinique de la récupération fonctionnelle et de la plasticité cérébrale après accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 960 individus en gravité sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine ou occlusion au chlorure de fer, suivi d'examens IRM et de tests moteurs, cognitifs et émotionnels répétés sur soixante jours. Le porteur décrit un affaiblissement de la patte, des douleurs post-opératoires et une mise à mort si la perte de poids dépasse 15 % ou si le score de douleur est trop élevé. Il rappelle que les traitements neuroprotecteurs efficaces chez l'animal ont échoué chez l'humain, tout en affirmant que les méthodes sans animaux n'apportent pas le même niveau d'information.
Objectifs
A l’échelle mondiale, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est l’une des causes majeures de décès, d’invalidité et de perte socioéconomique. Face à ce fardeau, le seul traitement pharmacologique approuvé consiste en l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Néanmoins, il existe des critères d’éligibilité stricts qui excluent une grande majorité des patients. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Lors d’un AVC ischémique (i.e. dû à une occlusion vasculaire), le débit sanguin cérébral (DSC) diminue drastiquement et les tissus cérébraux alentours sont altérés de manière plus ou moins définitive. Selon différents facteurs tels que la durée et l’ampleur de la diminution du DSC, l’étendue de la lésion cérébrale et sa localisation, les handicaps résiduels post-AVC peuvent être de différentes natures (moteurs, cognitifs et/ou émotionnels) et extrêmement invalidants. Plusieurs agents thérapeutiques ont été développés et ont montré un bénéfice en termes de neuroprotection chez l’animal. Cependant, la transposition des effets neuroprotecteurs des modèles animaux à l’Homme reste un échec. En effet, alors que la récupération fonctionnelle est au cœur des préoccupations humaines, les études précliniques se sont principalement concentrées sur l’évaluation du volume de lésion cérébrale pour évaluer l’efficacité d’un traitement. Par ailleurs, l’’étude comportementale après un AVC chez les modèles expérimentaux est encore peu utilisée, incomplète voire inadaptée. En effet, la majorité des études ayant travaillé sur les déficits fonctionnels n’ont examiné que les déficits à court terme et particulièrement les déficits moteurs. L’objectif de ce projet consiste donc à caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la plasticité cérébrale et les déficits fonctionnels chroniques de l’accident vasculaire cérébral ischémique, afin de mettre au point de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces troubles.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de plasticité cérébrale et de récupération fonctionnelle après un AVC ischémique. Elle permettra également de proposer des pistes pour caractériser de nouvelles stratégies thérapeutiques en combinaison ou non avec le tPA, afin d’améliorer de manière optimale la récupération des patients.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (15 minutes). 1 - Le modèle d'ischémie par injection de thrombine sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) (50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 2 - Le modèle d'ischémie par occlusion au chlorure de fer sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par IRM (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC ; 50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 3 - La totalité des animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleurs quelques heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée lors de l’AVC) qui disparait dans la première semaine après l’AVC. Une perte de poids, des douleurs post-opératoires ou un stress pourraient être observés les jours suivants. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes prélevés post mortem permettront de réaliser des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Remplacement
Les expériences in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. De plus, les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information pour évaluer une récupération fonctionnelle et cognitive de manière longitudinale. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale, la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale. La physiologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé grâce à nos expériences antérieures et selon les données disponibles dans la littérature. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses, le bruit et la lumière selon le cycle. La température en salle d’expérimentation sera contrôlée et adaptée au bien-être des animaux. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil sera disposée de manière à avoir une partie sur un tapis chauffant, laissant le choix à l’animal de la température dans la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront mis à mort si une perte de poids de plus de 15 % est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (petites maisons), des carrés de cotons et des paillettes seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront mis en place jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale suite à un AVC ischémique. Les souris C57BL/6 utilisées dans cette étude seront âgées de 8 semaines car cela correspond au stade de développement jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l’étude des AVC.
Exploration des effets vasculaires de l’apolipoprotéine A-I et de composés mimant son action
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 320 individus en gravité sévère. Elles sont soumises à un régime gras, à des chirurgies pour poser des cathéters dans les vaisseaux des pattes et du cou, puis à des mesures prolongées de la fonction cardiovasculaire sur animal conscient. Le porteur décrit des douleurs, de la fièvre, des blessures possibles des vaisseaux et une gêne pour s'alimenter après les actes sur les carotides. Il affirme que la coordination in vivo de signaux nerveux, hormonaux et cardiovasculaires ne peut être remplacée, tout en prévoyant quelques études sur cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet d'étudier, le rôle de certains récepteurs ou cibles sur les vaisseaux dans le maintien de la fonction vasculaire et l'amélioration de la perfusion des tissus. Il permet en particulier d'évaluer leur contribution dans la régulation de la glycémie ce qui est d'un intérêt pour la prise en charge des sujets diabétiques. Nos résultats préliminaires obtenus sur des souris saines explorant le rôle de ces cibles au niveau du vaisseau, montrent que leur activation induit une vasodilatation. Des travaux publiés suggèrent que ces récepteurs auraient un rôle protecteur au cours des maladies métaboliques dans le sens qu'il induiraient une diminution de la formation de l'athérome au sein des parois des vaisseaux. D'autres études discutent aussi un rôle potentiel dans l'amélioration de la sensibilité périphérique à l'insuline.
Bénéfices attendus
Sur nos modèles expérimentaux, il est attendu une amélioration des paramètres vasculaires et métaboliques chez les animaux transgéniques sains ou malades avec un fond génétique dit contrôle. Cet effet sera mesuré sous l'action d'un traitement et, ce bénéfice sera mesuré par comparaison aux animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires étudiées. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (athérome, diabète, ...) chez les animaux transgéniques invalidés pour les cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 704 animaux dans le projet de recherche. Les souris seront placées sous un régime gras favorisant le développement de l’obésité et du diabète (352 souris vigiles). Leur statut diabétique sera évalué lors d’un test de tolérance au glucose. Ce dernier sera administré dans l’abdomen lors d’une injection puis la glycémie sera mesurée sur du sang prélevé à la queue à différents temps à l’aide de bandelettes et d’un lecteur de glycémie. Les souris seront par la suite soumises à des interventions chirurgicales au cours desquelles elles seront anesthésiées afin de poser un cathéter intraveineux dans un vaisseau de la patte (durée: 15 minutes, 384 souris anesthésiées). Cette chirurgie est suivie quelques jours après, d'une autre chirurgie permettant la pose, sur un vaisseau de la seconde patte arrière, d'un dispositif de mesure du débit sanguin et du rythme cardiaque (durée: 30min, 384 animaux anesthésiés). Ces deux chirurgies permettront par la suite d’étudier sur l’animal vigile, les effets de l'insuline sur le système cardiovasculaire, et, la sensibilité des tissus à son action antidiabétique (durée: 3h, 384 souris vigiles). Sur une autre série d'animaux, un cathéter sera posé dans un vaisseau du cou (carotide) de la souris anesthésiée afin de mesurer la pression artérielle sur les animaux vigiles (durée: 90min, 320 animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations peuvent induire des effets indésirables ou des nuisances sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration au niveau de l'abdomen d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances peuvent survenir à l'occasion de procédures chirurgicales comme une blessure du vaisseau lors de l'introduction du cathéter. Il est aussi possible d'induire une blessure d'un organe lors de l'injection dans l'abdomen de substances (anesthésiant, par exemple). D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier dans un tissu ou organe, au sein d'un organisme vivant, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques. Il s'agit d'études fondamentales bien en amont d'un transfert à l'homme. Il s'agit de mesurer in vivo des mécanismes biologiques en considérant la participation de mécanismes nerveux, endocriniens et les adaptations mises en jeu par le système cardiovasculaire. Pour ces explorations spécifiques coordonnant l'action de multiples signaux in vivo, l'animal ne peut pas être remplacé. Par contre, il peut-être envisagé des études in vitro sur des cellules cultivées afin d'étudier des mécanismes précis portant sur des intéractions pures mises en jeu entre cibles et composés étudiés. Ainsi, des études, in vitro, sur des lignées de cellules endothéliales commercialisées sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter pour ce champ d'exploration précis, dans la mesure du possible, l'utilisation des animaux à cette fin.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : la mesure de la tolérance au glucose, la mesure de la sensibilité périphérique à l'insuline, la vasodilatation, des prélèvements de tissus, le prélèvement de plasma pour l'étude des lipoprotéines (profils), le prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique (recherche bibliographique et examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative) est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Il est aussi prévu d'utiliser des tests statistiques comme le t de Student et l'ANOVA (logiciel Graphpad) pour estimer le nombre d'animaux nécessaires au cours de nos expérimentations. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voir supprimer la douleur et le stress, et, améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre: - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agrée. - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux manipulés avec delicatesse dans les procédures ce qui facilite les prélèvements et les mesures (par exemple: en laissant l'animal libre dans la cage et en assurant un geste délicat, naturel, lors du passage de la main sur la queue pour le prélèvement de sang lors du test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné (par exemple, une navette qui permet d'acheminer des animaux depuis l'établissement éleveur vers l'établissement principal) - des points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits. - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (anesthésie/analgésie), - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques), - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet. Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Etude de l’impact du polymorphisme N363S du gène NR3C1 codant le Récepteur Glucocorticoïde sur le rétrocontrôle négatif de l’axe corticotrope par les glucocorticoïdes exogènes
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris d'une nouvelle lignée, porteuse d'une mutation du récepteur des glucocorticoïdes, passent deux fois dans leur vie un test comportemental de stress de cinq minutes, destiné selon le porteur à l'évaluation du "bien-être" de la lignée. Une partie des adultes reçoit une injection sous anesthésie locale, d'autres sont opérées sous anesthésie générale pour la pose sous la peau d'un dispositif qui délivre un traitement pendant cinq semaines, et repassent cinq semaines plus tard un test de stress de cinq minutes, sans que le texte précise lequel. 240 souris vont être utilisées, la déclaration en comptant 132 en souffrance légère et 108 en souffrance modérée, certaines passant par plusieurs procédures. La déclaration ne prévoit aucune souris gardée vivante, et le texte annonce leur mise à mort à la fin des procédures, lorsque les analyses de sang et d'organes l'exigent.
Objectifs
Les hormones glucocorticoïdes sont sécrétées par la glande surrénale. Elles sont sécrétées pour permettre à l’organisme de s’adapter en cas de stress et de diminuer la réponse inflammatoire. C’est pourquoi les glucocorticoïdes sont largement utilisés comme traitement. Ils sont utilisés notamment dans le traitement des maladies inflammatoires, des allergies, de l’asthme ou de nombreux cancers. Les glucocorticoïdes n’agissent pas seulement sur la réponse inflammatoire mais sur de nombreux autres organes. C’est pourquoi, lorsqu’il y a un déséquilibre, ils peuvent entrainer des effets secondaires. Lors d’un traitement prolongé par glucocorticoïdes, il n’y a plus de production par l’organisme de glucocorticoïdes. Lorsqu’on arrête le traitement, la production de glucocorticoïdes par l’organisme ne reprend pas chez 40% des patients. Cela entraine un manque de glucocorticoïdes qui peut entrainer des complications graves et s’appelle l’insuffisance corticotrope. Pour le moment, il est difficile de prédire chez quels patients surviendra cet effet secondaire. C’est pourquoi nous essayons de mieux comprendre cette maladie pour améliorer la prise en charge des patients. Les glucocorticoïdes agissent par l’intermédiaire du récepteur glucocorticoïde. Chez 2% de la population mondiale, il existe une mutation de ce récepteur qui entraine une augmentation de l’effet des corticoïdes et donc, théoriquement, une augmentation du risque de complications. Pour étudier si cette mutation augmente le risque d’insuffisance corticotrope, l’utilisation de modèles cellulaires est insuffisante. En effet, ils ne permettent pas de reproduire la complexité de la sécrétion de glucocorticoïdes ainsi que les différents niveaux de régulation. Aussi, il est nécessaire de générer un modèle murin afin d’évaluer les différents acteurs impliqués dans la régulation de l’axe corticotrope. Ce modèle murin permettra d’étudier l’effet de la mutation sur la sécrétion de glucocorticoïdes et d’évaluer si elle constitue un facteur de risque d’insuffisance corticotrope.
Bénéfices attendus
La variabilité inter-individuelle dans la sensibilité aux corticoïdes est un enjeu important en médecine, en effet on considère que près de 2% de la population mondiale reçoit un traitement par glucocorticoïdes exogène. La mise en évidence du variant N363S, retrouvé chez 2-4% de la population, comme facteur de risque pourrait permettre d’adapter de façon personnalisée leur prescription afin de limiter la survenue d’effets indésirables.
Procédures
Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, les animaux seront soumis à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes, 2 fois au cours de leur vie. Une partie des souris adultes recevront une injection après anesthésie locale. D’autres souris seront opérées par anesthésie générale pour mise en place d’un système de délivrance de traitement par perfusion pour une durée de 5 semaines. Ce dispositif permet de ne faire qu’un geste chirurgical, sans avoir à faire plusieurs injections. De plus, les souris seront soumises 5 semaines plus tard à un test comportemental d’évaluation du stress, d’une durée de 5 minutes.
Impact sur les animaux
La modification génétique des animaux ne devrait pas entrainer de souffrance spécifique puisqu’il n’existe pas chez l’être humain de pathologie liée à cette mutation. Cependant, les personnes ayant cette mutation ont tendance à avoir plus de troubles métaboliques et à être plus à risque d’obésité, ces aspects seront donc recherchés et pris en charge le cas échéant chez les animaux génétiquement modifiés. Les nuisances des procédures proposées sont faibles à modérées pour les animaux. L’injection de traitement peut entrainer une douleur au niveau du point d’injection et la pose d’un dispositif sous cutané peut entrainer des douleurs. Ces douleurs sont prévisibles et prises en charge par l’anesthésie.
Devenir
Dès que possible, les animaux seront utilisés dans plusieurs procédures, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures quand cela sera nécéssaire pour permettre les analyses de sang et des organes post-mortem.
Remplacement
Les corticoïdes agissent sur l’ensemble de l’organisme et sont sous le contrôle de l’axe corticotrope, composé de plusieurs niveaux, comprenant une partie du cerveau, la glande hypophyse et la glande surrénale. Leurs effets sont très finement contrôlés car un excès de corticoïdes entraine des complications métaboliques, psychiatriques et cardiovasculaires et un manque de corticoïdes entraine le décès. Pour permettre cet équilibre, leur sécrétion est contrôlée à différents niveaux, qui est difficile d’étudier de façon dissociée. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle vivant permettant de reproduire le dialogue entre les différents organes impliqués. L’utilisation de modèles cellulaires in vitro est compliqué, d’une part car il existe un seul modèle de cellules corticotropes immortalisées hypophysaires, issu de cellules tumorales ne réagissant pas forcément de la même façon que des cellules saines aux corticoïdes. D’autre part, car la culture cellulaire ne permet pas de rendre compte de la dynamique de l’axe corticotrope au cours du temps.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance afin d'inclure uniquement le nombre d'animaux nécéssaire pour répondre à la question posée dans chaque procédure. Le nombre minimal d’animaux a été choisi pour l’ensemble des procédures. Dès que possible, les animaux seront utilisés dans deux procédures pour permettre la réduction du nombre d'animaux nécéssaires.
Raffinement
Les conditions d’élevage et d’hébergement seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : cages adaptées à l’animal et à sa taille en maintenant les animaux par deux minimums dans chaque cage, et par enrichissement du milieu par copeaux de bois/tunnel en carton et cabanes. * Souris : 5 animaux par cage au maximum (nombre susceptible de varier en fonction de la taille des animaux) - Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaître les points limites. - Les mesures des animaux (poids, taille) seront couplés afin de réaliser l’analyse de plusieurs paramètres pour limiter au maximum le stress des animaux. - Une anesthésie générale ou locale de courte durée sera réalisé pour chaque procédure entrainant une douleur.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris, en effet, les souris sont souvent utilisées dans la recherche car les manipulations génétiques sont bien connues et maitrisées dans cette espèce. De plus, la séquence du gène chez la souris est très proche de celle de l’être humain, ce qui permettra d’extrapoler les données obtenues. Les souris étudiées seront des souris adultes, car les effets attendus de la mutation s’expriment à l’âge adulte.
Rôle d’un régulateur dans la production d’oestrogènes au cours du cycle hormonal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
Entre deux et six frottis vaginaux, les premiers sous anesthésie gazeuse, puis une ponction du cœur sous anesthésie en prélèvement terminal : 30 souris femelles vont subir ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour la récolte de leurs tissus. Le but est de mesurer leur taux d'œstrogènes au fil du cycle hormonal, une protéine régulatrice de la peau n'ayant montré d'effets que chez les femelles dans des résultats préliminaires obtenus sur une lignée développée pour l'étudier. Le porteur choisit la souris pour une organisation des organes qu'il dit "très semblable à l'Homme" et des étapes du cycle hormonal conservées. Sur l'effectif, il écrit seulement que le nombre a été "défini a minima" pour des résultats interprétables, sans calcul ni chiffre par groupe.
Objectifs
L'objectif du projet est de mieux comprendre le rôle d'un protéine régulatrice impliquée dans la physiologie de la peau. Pour cela, un modèle de souris spécifique a été développé, ce qui permet l'étude du rôle de la protéine au sein de la peau. Des résultats préliminaires obtenus sur ce modèle, ont montré son implication dans le développement des vaisseaux sanguins ainsi que dans le métabolisme des lipides, mais cela uniquement chez les souris femelles. Ce rôle sexe-dépendant pourrait être expliqué par les hormones sexuelles, notamment les oestrogènes qui sont des hormones importantes chez les femelles. De plus, un article récent a montré l'expression de la protéine d'intérêt dans l'hypophyse, petite glande située sous le cerveau qui contrôle la sécrétion d'hormones responsables de la production d'oestrogènes. Pour cela, le taux d’œstrogènes dans le sang sera exploré dans le modèle d'intérêt.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances sur le contrôle de la production d'oestrogènes chez la souris. L’apport de connaissances fondamentales est un prérequis pour comprendre la physiopathologie des maladies vasculaires et permettre le développement de thérapies à plus long terme.
Procédures
Entre 2 et 6 frottis vaginaux seront réalisés, geste qui dure une 15aine de secondes par souris. La ponction cardiaque en prélèvement terminal sera réalisé sur souris anesthésiées 1 fois et durera environ 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Le frottis vaginal réalisé pour vérifier le stade hormonal dans lequel les souris sont peut causer un léger stress momentané chez l’animal et sera donc réalisé sous anésthésie gazeuse au début pour diminuer ces effets.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour la récolte des tissus.
Remplacement
Les expérimentations in vitro on déjà été réalisées et ont donné des résultats concluants quant au rôle de la protéine dans la peau. Il est nécéssaire aujourd'hui de confirmer son rôle dans un modèle plus intégré comme la souris. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.
Réduction
Dans la procédure, le nombre d’animaux a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée au moins trois fois par semaine grâcfe à des points limites précoces et prédictifs qui ont été définis.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation des différents organes qui nous intéressent très semblable à l'Homme et les différentes étapes du cycle hormonal sont conservées. Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 6-20 semaines pour rester cohérent avec les expériences déjà réalisées sur ce projet.
Traitement de la fibrose par des cellules T génétiquement modifiées pour améliorer la thérapie génique dans les maladies musculaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère, pour tester des cellules immunitaires modifiées contre la fibrose musculaire. Ces souris modèles de dystrophie reçoivent des injections de cellules anti-fibrose puis de vecteurs de thérapie génique, une échographie cardiaque sous anesthésie et un test de force par pincement de la queue, avant d'être tuées pour prélever muscles et cœur. Le porteur annonce peu de toxicité attendue et décrit des douleurs liées aux piqûres. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et que l'interaction des lymphocytes avec les cellules cibles exige un milieu physiologique.
Objectifs
Notre laboratoire cherche à traiter un certain type de myopathies (maladie des muscles) qui comprennent en particulier la dystrophie musculaire de Duchenne et les dystrophies musculaires des ceintures. Ces myopathies sont des maladies génétiques rares, progressivement invalidantes et conduisent à la perte de la marche. Le muscle sans ses protéines structurales finit par se détruire puis l’apparition de la fibrose rigidifie le tissu et entraîne de sévères complications. Aucun traitement curatif n'est actuellement disponible. Des approches de thérapie génique sont en cours d’étude et consistent à introduire un gène médicament dans l’organisme du patient à l’aide d’un vecteur viral inoffensif pour remplacer le gène malade et rétablir le fonctionnement de la protéine. Cependant, la présence de fibrose qui se développe au cours du temps, empêche le vecteur de thérapie génique de pénétrer correctement dans les tissus atteints réduisant ainsi son efficacité thérapeutique. Récemment, il a été montré dans des modèles de souris que certains types de cellules pouvaient être utilisés pour éliminer les cellules responsables de la fibrose. Il s’agit de lymphocytes T qui sont des cellules du système immunitaire et qui participent naturellement à la lutte contre les agents pathogènes menaçant notre intégrité physique. Ces cellules possèdent un récepteur qui va leur permettent de reconnaitre et de se fixer sur un déterminant que l’on appelle antigène, présent à la surface d’autres cellules et ainsi pouvoir éliminer ces cellules ciblées. Il est possible de modifier ce récepteur pour obtenir une cellule avec un récepteur spécifique de la fibrose. Ces cellules sont déjà utilisées chez l’homme dans le traitement de certains cancers du sang. Nous avons déjà démontré l’efficacité de ces cellules pour réduire la fibrose du muscle squelettique dans un premier modèle de souris. Nous souhaitons maintenant étendre cette preuve de principe à un autre modèle présentant des problèmes de fibrose à la fois dans le cœur et le muscle squelettique pour définir si l’approche peut être généralisée. Nous souhaitons enfin modéliser chez la souris une approche thérapeutique combinant un traitement par ces cellules ciblant la fibrose avec une thérapie génique pour traiter les dystrophies musculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Il vise à valider l’effet thérapeutique des cellules anti-fibrose pour un groupe de maladies humaines sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie, et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.
Procédures
- Prélèvement de sang: 1 seul prélèvement sous anesthésie gazeuse pour vérifier la présence des cellules anti-fibrose, durée 5 minutes. - Injection des cellules anti-fibrose sous anesthésie gazeuse : 2 injections à une semaine d'intervalle, durée 5 minutes. - Injection de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie gazeuse : 1 seule injection 15 jours après la dernière injection de cellules, durée 5 minutes. - Pour l’évaluation de la fonction cardiaque, les animaux sont soumis à une échocardiographie en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes. - Pour le test de force musculaire, le test est limité à 5 min et ne peut être réalisé qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour injection du traitement et pincement de la queue pour le test de force musculaire. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.
Devenir
Les animaux de chaque procédure seront tous euthanasiés pour collecter les muscles squelettiques et le cœur et analyser au laboratoire les effets de nos traitements.
Remplacement
Nous réalisons systématiquement des tests préalables in vitro pour exclure les cellules anti fibrose de mauvaise qualité. En effet, les cellules sont d’abord contrôlées et testés fonctionnellement in vitro avant leurs injections. Nous vérifions le phénotype des cellules en mesurant l’expression de différents marqueurs d’activations et de différenciations, et nous testons leurs capacités à reconnaître et à tuer leur cible. Afin de valider l’effet ces cellules sur la fibrose in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro n’est capable de développer cet aspect de la pathologie. En effet, il n’existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l’interaction et l’élimination des cellules fibrotiques par les lymphocytes T nécessite un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.
Réduction
Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 212 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôle pour les différents modèles évalués. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Nous administrerons les cellules anti-fibrose par voie sanguine car c’est le moyen le plus efficace et le moins invasif pour cibler tous les muscles de l’organisme. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. Nous privilégierons des prélèvements de sang à la veine submandibulaire plutôt qu’au sinus rétro-orbitaire. Les quantités de cellules anti fibrose injectées sont faibles donc aucune toxicité n’est attendue. Les doses de vecteurs de thérapie génique administrées aux souris ne seront pas suffisantes pour induire de toxicité hépatique ou cardiaque ni même de douleur. Néanmoins une surveillance de l’état général des animaux sera effectuée régulièrement. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi. Aucun animal n’est seul dans une cage, sauf si problème d’agressivité.
Choix des espèces
Ce projet se place dans le cadre de la recherche de traitements pour des maladies génétiques humaines touchant le muscle squelettique. Les modèles murins inclus dans ce projet portent des anomalies génétiques ciblant le gène de la pathologie chez l’homme qui va entraîner le plus souvent des désordres musculaires sans impact sur l’activité naturelle de la souris. Ces modèles permettent d’analyser les perturbations de la fonction musculaire et sont donc pertinents pour nos études. Le développement de la fibrose musculaire est progressif et varie d'un muscle à l’autre. Typiquement, dans les deux modèles de souris, pour des souris âgées de 2 mois, le diaphragme et un muscle spécifique du mollet (gastrocnemius) sont déjà très fibrosés alors que le cœur n’est pas encore atteint. Il faut attendre minimum 6 mois pour voir apparaitre du collagène dans le cœur de souris malades. D'autres muscles du mollet (par exemple le tibialis anterieur) présentent une fibrose variable à 2 mois alors qu’à 6 mois le processus fibrotique est déjà terminé. Chacun des deux modèles étudiés développent de la fibrose entre 2 et 6 mois en fonction des cycles de régénération musculaire. Nous utiliserons donc pour ce projet des souris jeunes d’environ 2 mois pour lesquelles le processus de fibrose est juste présent dans les muscles squelettiques et des souris plus âgées de 6 à 10 mois dans lesquelles le processus de fibrose est présent dans le cœur.
Etude et manipulation du micro-environnement tumoral dans les méningiomes de haut grade chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier le micro-environnement des méningiomes de haut grade. Elles reçoivent des injections intracrâniennes de cellules tumorales ou de virus pour induire des tumeurs cérébrales, suivies d'injections modulant le système immunitaire. Le porteur décrit des symptômes possibles comme une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement et des crises convulsives, avant une mise à mort pour analyse du cerveau. Il affirme qu'aucune culture cellulaire de méningiome n'existe et juge le modèle murin "primordial" pour cette étude.
Objectifs
Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutations NF2 et représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une morbidité et une survie réduite sans option disponible médicamenteuse ou d’immunothérapie. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire par la diversité de leurs cellules immunes et la présence de vaisseaux lymphatiques méningés. Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes bénins par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire constitué par les cellules immunes méningées et les lymphatiques méningés, régule la progression histologique maligne des méningiomes NF2-mutés et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité en manipulant le micro-environnement pour déterminer (i) si les lymphatiques méningés régulent effectivement la malignité des méningiomes et (ii) évaluer la participation des populations de cellules immunitaires dans l'initiation et la progression du méningiome.
Bénéfices attendus
Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes-NF2 en manipulant ses composantes lymphatiques et immunitaires dans les méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme.
Procédures
Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisées selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Injection intra-crânienne pour induire des tumeurs – de lignées celullaires ou de virus recombinants (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Injection intra-cérébrale pour augmenter le drainage lymphatique (Durée : 1 heure, préparation 30 min) Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Une injection sous-cutanée au niveau de la peau du crane (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) 2. Une injection intra-péritonéale (Durée : 3 minutes, préparation : 10 minutes) . les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet inclure les nuisances suivantes : Les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale et intracérébrale tels que dépression cardio vasculaire, hypothermie, hypovolémie, sécheresse cornée et les douleurs post-opératoires. Le stress de la contention et la douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous-cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifié par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs de l'ensemble des procédures expérimentales.
Remplacement
Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles souris déjà existants. La complexité du cerveau/méninges des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau/méninges humain. L’utilisation d’un modèle murin est donc primordiale pour cette étude.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 540 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Afin d'assurer la fiabilité statistique et de limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif a priori sur la base de travaux antérieurs et sur un calcul de puissance, et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interpétation fiable des résultats.
Raffinement
A la réception des animaux en provenance de l’exterieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification, des bâtonnets à ronger et des maisons sont également disponibles. Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau. Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et déposé sur la litière et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie,) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zoothechnique et chaque jour de la semaine par un des membres de l’équipe de recherche (et plus si nécessité). Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine tout au long de la procédure expérimentale à partir de la première expérimentation (à l’âge de 2 mois) jusqu’à l'euthanasie (entre 5 et 15 mois selon les procédures). Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgiques.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement. Les autres expériences prévues dans le projet doivent être réalisées chez la souris car elles utilisent un modèle souris déjà publié et validé par la communauté scientifique internationale. Les animaux seront utilisés de 2 à 15 mois de manière similaire aux précédents modèles de meningiomes publiés précédemment, un suivi d’au moins 12 mois étant nécessaire pour les modèles souris de méningiomes bénin génétiquement modifié où les méningiomes apparaissent de manière tardive