Souris

4 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ingèrent une molécule qui endommage la barrière de l'intestin et reçoivent un agent qui provoque des tumeurs, développant diarrhée, douleur viscérale, saignements et perte de poids, avec prélèvements de sang répétés et traitements deux fois par jour. L'objet est de tester des molécules anti-inflammatoires et anticancéreuses contre les maladies inflammatoires de l'intestin et le cancer du côlon, y compris sur des souris au système immunitaire humanisé. Le porteur qualifie ces modèles d'"indispensables" tout en reconnaissant que la réponse immunitaire de la souris diffère de celle de l'humain.

Objectifs

Les deux principales formes de maladies inflammatoires de l'intestin, la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, sont des troubles inflammatoires chroniques récidivants du tractus gastro-intestinal. L'étiologie est très probablement une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux favorisant la désintégration de la barrière épithéliale intestinale et la dérégulation de la réponse immunitaire au microbiote intestinal. Rien qu'en France, on dénombre plus de 200 000 patients atteints de MICI. Les cancers de l’intestin, notamment le cancer colorectal, peuvent être associés à la forme chronique des MICI et/ou aux traitements associés. N’ayant pas de traitement efficace pour les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer colorectal, de modèles pré-cliniques sont nécessaires afin de tester l’efficacité de produits candidats à visée thérapeutique. L'un des modèles les plus utilisés pour étudier les maladies chroniques de l’intestine est le modèle d'inflammation intestinale induite par le DSS (Dextran Sulfate Sodium). Afin de modéliser le cancer du colon, l’injection d’azoxymethane (AOM) associé au modèle chronique de DSS est ainsi un outil indispensable. Les modèles précliniques sont donc indispensables pour tester l'efficacité des médicaments à cet égard. Les modèles murins d’inflammation intestinales sont couramment utilisés pour l’étude de la fonction de la barrière intestinale ainsi que le microbiote. En revanche, on craint de plus en plus que les mécanismes immuno-pathogènes observés dans les ces modèles ne soient pas les mêmes que ceux que l'on pense observer chez l'homme. Nombreuses études ont démontré que la réponse immunitaire murine différencie en structure et en fonction dans des nombreux cas de celles de l’homme, ce qui peut expliquer les taux d’échec dans l’utilisation des données précliniques prometteuses en nouveaux traitements en clinique. Cette réalité inconfortable a incité un certain nombre de chercheurs à entreprendre une série d'études visant à humaniser le système immunitaire murin par le transfert adoptif de cellules progénitrices lymphoïdes ou hématopoïétiques dans une nouvelle génération de receveurs immunodéficients. Ainsi, les souris humanisées au niveau du système immunitaire permettront de comprendre l’interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et également avec les tumeurs.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, le projet validera les doses de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d'AOM (azoxymethane), avant de tester l'efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires et anticancéreux) en utilisant différents modèles/stades de pathologies intestinales. En outre, ce projet évaluera ces maladies intestinales dans un modèle de souris au système immunitaire humanisé. Ces souris recevront des cellules souches humaines capables de se différencier en cellules immunitaires humaines. Il s'agit d'un modèle innovant, car peu étudié à ce jour, et qui répondra à la crainte de plus en plus exprimée vis-à-vis des modèles murins traditionnels : la réponse immunitaire humaine diffère de la réponse murine, donc les souris humanisées au niveau du système immunitaire (NXG-HIS) seront un atout comme modèle préclinique pour l'étude de ces maladies, où la composante inflammatoire et le système immunitaire jouent bien évidemment un rôle primordial. Ce modèle nous permettra également de comprendre l'interaction des cellules humaines dans le contexte inflammatoire au niveau intestinal et avec les tumeurs.

Procédures

Pour induire l’inflammation intestinale chez la souris, de l’eau de biberon contenant du DSS (Dextran Sulfate Sodium-une molécule capable d’endommager la barrière intestinale) sera donner aux animaux pendant 7 jours (modèle aigu) ou 5 jours (modèles chroniques) en 3 cycles. Pour l’induction de la tumeur au niveau du côlon, une injection d’azoxymethane (intrapéritonéale) sera donnée avant les cycles de DSS. Les animaux auront des prélèvements de sang en avant l'induction de l'inflammation intestinale ou de la tumorigenèse. Le prélèvement sera fait à la veine maxillaire (en vigile) ou au sinus retro orbitaire (sous anesthésie). D’autres prélèvements au cours de l’étude sont prévus : 1 fois après 15 jours d'intervalle pour le modèle aigu et 3 fois avec un intervalle de 12 jours entre chaque prélèvement pour les modèles chroniques. Le volume à prélever sera de maximum 10% du volume total de sang circulant de l'animal par prélèvement (64mL/kg). Les animaux seront quotidiennement traités par une des voies suivantes : orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, deux fois par jour en respectant le volume journalier à être administré. Pour le DAI (l’indice d’activité de la maladie), les fèces seront récoltées quotidiennement (pendant 12 jours, en modèle aigu et 60 jours, en modèles chroniques) afin de vérifier la présence de sang et sa consistance. La récolte est faite par isolement de l’animal dans une cage propre et sans enrichissement, nourriture et l’eau pendant maximum 30 minutes/jour. A la fin de la phase expérimentale, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement maximal de sang par ponction cardiaque. Ensuite, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’effet attendu du DSS (Dextran Sulfate Sodium) est l’inflammation intestinale qui perturbe la digestion et l’absorption des nutriments dû à l’altération de la barrière intestinale. Les effets du DSS sur la santé de l’animal seront la diarrhée, la douleur viscérale, le saignement, la perte de poids et l’apathie, principalement. Le score de l’indice d'activité de la maladie qui consiste en évaluer la perte de poids corporel, la diarrhée et le saignement) est mesuré tous les jours pendant la phase expérimentale et permettra rapidement de connaître l’avancement de la maladie et la détérioration de l’état de santé de l’animal. L’objectif du modèle est d’avoir des animaux malades, mais pas dans un état sévère d’inflammation. L’AOM (azoxymethane) est un mutagène qui induit la formation des tumeurs. Il est donc attendu que les souris perdent du poids, aient de la diarrhée, des douleurs abdominales et deviennent apathiques. On attend le développement des tumeurs au niveau intestinal, sans pour autant induire la mort des animaux. Les effets secondaires des candidats thérapeutiques à tester ne sont pas connus, ni leur nature. De ce fait, il nous est impossible de prévoir les nuisances pour les animaux. En ce qui concerne la souris humanisées et son phénotype, celui-ci n’est pas dommageable pour la souris, c’est-à-dire cela n’augmente pas la sévérité des pathologies étudiées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les modèles in vitro, tels que les organoïdes intestinaux ou simplement des lignées cellulaires, ne peuvent pas mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En revanche, ces modèles permettent de sélectionner au préalable des molécules d’intérêt avant de passer dans un modèle pré-clinique in vivo. Ensuite, une fois les pilotes in vivo faites et le screening in vitro réalisés, des tests peuvent être fait en nombre réduit d’animaux à une quantité relevant pour garantir la puissance statistique.

Réduction

L’objectif des études pilotes prévues dans ce projet est de limiter le plus possible le nombre d’animaux dans les modèles qui seront ensuite utilisés. Pour les études pilotes, le suivi quotidien et accru des animaux permettra de sélectionner la dose de DSS (Dextran Sulfate Sodium) et d’AOM (azoxymethane) la plus juste afin d’avoir un phénotype pathologique, sans pour autant induire la mort des animaux. En revanche, dans les modèles pré-cliniques, le fait de ne pas connaître les effets indésirables des molécules à visée thérapeutique in vivo et avec l’objectif de garder la puissance statistique, la quantité d’animaux devra être augmentée de 20% par groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et plusieurs types d’enrichissement seront mis dans les cages qui hébergent les animaux (tunnel, Aspen brick, igloo et Sizzle-Nest). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence des points limites à savoir : la prostration ou absence de mouvement, la perte de poids supérieure à 20% du poids d’origine et la diarrhée liquide accompagnée d’un saignement accru. Si un animal présente un des points limites, il serait pris en charge par l'équipe zootechnique. Si son état ne s’améliore pas dans les 24h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieront. Si l’animal présente une plaie, par exemple, des soins de nettoyage et désinfection seront effectués.

Choix des espèces

Les modèles d’inflammation intestinale par DSS (Dextran Sulfate Sodium) et le modèle de cancer du colon induit par l'AOM (azoxymethane) suivi de l'inflammation chronique induite par DSS sont très bien décrits et caractérisés dans la littérature. Pour les souris normalles, non-humanisées, la maturité sexuelle est atteint pour les mâles à 8 semaines et pour les femelles à 6 semaines. Donc, pour que les animaux soient matures, ils rentreront en étude qu'à partir de l'âge de 8 semaines. En revanche, pour les animaux humanisés, dû au processus d’humanisation, les animaux rentreront en étude à partir de 15 semaines d'âge.

16 575 animaux non-humains, 15 750 souris, 615 rats et 210 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une administration unique d'un candidat médicament, par voie orale ou par injection, puis un prélèvement de sang sous anesthésie profonde avant la mise à mort et le prélèvement d'organes. L'objet, pour une entreprise pharmaceutique, est de mesurer la distribution du produit dans l'organisme. Le porteur affirme que des cellules isolées ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes d'un "organisme entier".

Objectifs

L'entreprise développe des médicaments pour l'homme qui ciblent certains récepteurs, en particulier ceux du cerveau. Il est donc important de connaître la distribution du produit dans le corps entier, en particulier dans les organes cibles et pour cela, il faut faire des études pour voir comment le médicament se distribue après administration (orale ou injection). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer l'exposition dans le temps d'un futur médicament et de ses produits dans les divers organes chez différentes espèces animales rongeurs (rat, souris, cobaye) après un traitement unique. Les dosages dans les tissus et dans le sang nous donneront alors une bonne indication quant à l'exposition au composé dans le temps et nous aideront à relier les expositions aux effets bénéfiques et toxiques de la molécule en développement. Ce projet d'utilisation des animaux s'intègre dans un projet de recherche plus global de la molécule au profit de la santé humaine qui sera en complément d'autres études au laboratoire.

Bénéfices attendus

L'implication des animaux dans ce projet va permettre d'avoir une meilleure connaissance du devenir du médicament dans un organisme proche de l'homme et d'obtenir les expositions du médicament dans les tissus et le sang.

Procédures

Prélèvement sanguin (environ pendant 2 minutes) sous anesthésie générale profonde après administration du produit (administration orale ou injection d'une durée d'environ 1-3 minutes) puis, prélèvement de divers organes après mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à la contention pouvant induire un stress chez l'animal, l'administration du produit à tester et aux effets indésirables du produit.

Devenir

Le cerveau et le cœur au minimum étant récupéré pour être analysés, chaque animal est donc mis à mort.

Remplacement

L'utilisation d'animaux pour des évaluations de distribution d'un médicament est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de la molécule à tester sur un organisme entier reflétant l'humain. La complexité et des interactions organes-médicament ne nous permettent pas d'utiliser des modèles avec des cellules isolées car ils ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes biologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux par temps est de minimum 3 à maximum 5 individus pour avoir une fiabilité de résultats. 5 à 9 points de temps nécessaire pour avoir assez de points pour le calculs des paramètres d'exposition.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie et sont acclimatés au minimum 5 jours avant toute expérimentation pour s'habituer au nouvel environnement. Pour le bien-être de l'animal et lui éviter un stress, chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour aider à la nidation et d'un enrichissement (igloo ou tunnel). Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin (exemple : désinfection d'une plaie). Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal anxieux soit durant le temps d'acclimatation, soit le jour même de l'expérimentation au moment de sa manipulation pour la sortie. Les traitements se feront par du personnel formé avec du matériel adéquat pour chaque animal.

Choix des espèces

Les espèces rongeurs sont des espèces relativement proches de l'homme, les données obtenues seront pertinentes afin d'extrapoler les résultats à l'homme. Les animaux sont utilisés au stade adulte, cela permet de refléter un organisme mature et développé (en particulier au niveau du foie).

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses ou une implantation chirurgicale de tumeur sous la peau, puis des injections répétées d'anticorps, la tumeur pouvant provoquer perte de poids et douleurs. L'objet est de créer plusieurs modèles de cancers rendus résistants à des immunothérapies pour tester de nouveaux traitements. Le porteur affirme que la mise en place d'une résistance acquise est "davantage pertinente" dans un organisme entier qu'in vitro.

Objectifs

Plusieurs traitements par anticorps ont été approuvés pour le traitement de diverses tumeurs solides, permettant au système immunitaire d’être à nouveau activé et fonctionnel pour détruire les cellules tumorales et constituant une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Cependant, un nombre croissant d’observations réalisées chez les patients mettent en évidence un phénomène de résistance, parfois innée mais plus souvent acquise au fil des traitements à ces thérapies par anticorps. La recherche se concentre donc maintenant à contourner ou reverser cette résistance grâce à de nouveaux traitements, et il y a un besoin urgent de nouveaux modèles permettant de modéliser ce phénomène de résistance acquise. Nous avons ces dernières années développé une forte expertise dans ce domaine grâce à la mise en place de plusieurs modèles de résistance à des anticorps. L’objectif du présent projet vise donc à développer plusieurs modèles de cancers de différentes indications (pancréas, colon, mélanome, vessie, foie et poumons) avec une résistance dite acquise à des anticorps spécifiques en utilisant la méthodologie que nous avons précédemment validée. Ces modèles permettront de tester de nouvelles thérapies dans le but de contourner la résistance acquise aux anticorps et également d’investiguer les mécanismes de résistances mis en jeu.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il existe aujourd’hui peu de stratégies thérapeutiques pour les patients résistants aux thérapies par anticorps. L’étude de nouvelles stratégies grâce à la génération de lignées résistantes va permettre de développer en phase préclinique de nouveaux traitements qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Injection (unique) des cellules cancéreuses sur souris vigiles en sous-cutanée dans le flanc droit : contention et geste de quelques minutes - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous la peau, 5 minutes maximum - Injections intrapéritonéales d'anticorps non toxiques, durée du geste : 30 secondes - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention et une douleur courte à l’injection. Les animaux vont subir une douleur sur plusieurs heures liée à l'implantation par chirurgie de tumeurs en sous-cutanée, contrôlée par de l'analgésie et réalisée sous anesthésie gazeuse. Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur courte lors de l’injection intrapéritonéale. La pousse tumorale peut engendrer de la perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement de la tumeur dans le cadre d'un passage ou d'une analyse ultérieure. Ils seront également euthanasiés si le volume tumoral atteint le volume éthique.

Remplacement

Les interactions entre la tumeur et le reste du corps sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur. Une fois les tests in vitro réalisés, il est nécessaire par la suite d'étudier leur comportement au sein de l'organisme vivant en présence de ces interactions et de ces paramètres précédemment cités. Pour ces raisons, la mise en place d’un modèle de résistance est davantage pertinente dans un organisme entier.

Réduction

Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 1152 animaux au total pour cette étude.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux).

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Cette souche de souris a déjà été utilisée pour la mise en place de ces modèles au sein de notre laboratoire et nous avions de bons résultats de prise tumorale. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

570 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous la peau un système diffusant un corticoïde pendant cinq mois, puis des prélèvements de sang et d'urine chaque semaine, des injections sous-cutanées et intramusculaires deux fois par semaine, des gavages quotidiens et des radios, provoquant traumatismes et inflammations aux sites d'implantation. L'objet est d'évaluer un traitement contre la fragilité osseuse induite par les corticoïdes. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" en affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité du traitement étudié à résorber les atteintes osseuses qui surviennent lors d’une corticothérapie chronique (La corticothérapie est un traitement à base de corticoïdes, des médicaments aux propriétés anti-inflammatoires). En effet, des études de pharmacovigilance ont montré qu’une fragilisation osseuse est induite lors d’une corticothérapie et est caractérisée par une réduction de la minéralisation osseuse, altération de l’architecture et de la densité minérale de l’os. De plus, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques agissant sur le métabolisme osseux, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal la capacité d’un traitement à éviter l’apparition d’atteintes osseuses, comme de caractériser les effets indésirables que pourrait entrainer le composé thérapeutique étudié. Cette étude permettra de définir les types de lésions osseuses (ostéoporose) qui sont observées lors de la corticothérapie, de proposer des schémas thérapeutiques d’administration adaptés afin de réduire et/ou abolir ses potentiels effets délétères, et de caractériser la capacité du traitement à stopper le développement des lésions osseuses. .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesureront à plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra de générer des informations sur la potentielle toxicité osseuse du traitement étudié. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications physiologiques osseuses chez les animaux après application du traitement. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Une implantation sous-cutanée de système de diffusion continue de corticoïde est prévue pour chaque animal. Cette procédure durera environ 20 min et se fera sur animal anesthésié. Le système de diffusion restera en place pour une période maximum de 5 mois. Des prélèvements sanguins et urinaires sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des injections sous-cutanées sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 1 min. Des injections intra-musculaires sont prévues 2x/semaine sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque injection durera moins de 2 min. Des gavages se feront sur animal vigile 1x/jour sur animal vigile en commençant 1 mois après implantation du système de diffusion continue de corticoïdes. Chaque gavage durera moins de 5 min. Des radios sont prévues 2x/mois sur animal anesthésié. Chaque radio durera moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’implantation du système de type ALZET (dispositif de diffustion de molécules en continu). Cette procédure étant douloureuse à court terme, une anesthésie, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le traitement et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser le composé et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés/principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 12 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité et de ceux obtenus entre chaque protocole de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion altérée, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant et analysable de liquides biologiques peut parfaitement être récupéré à partir de cet animal de laboratoire. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents traitements seront utilisés.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections abdominales déclenchant la mutation d'une myopathie génétique, subissent une perte de force et de poids, puis des tests de force et de course répétés pendant douze semaines et des injections d'agents thérapeutiques, avant le prélèvement de leurs muscles. L'objet est d'identifier des candidats médicaments pour une myopathie à cores sans traitement curatif. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal vivant ne permet d'évaluer la force musculaire et son évolution sous traitement.

Objectifs

Les myopathies à cores sont des maladies génétiques rares sans aucun traitement curatif actuellement. Elles sont caractérisées par la présence de zones anormales, appelées "cores", à l’intérieur des fibres musculaires, et sont souvent liées à des mutations génétiques bien identifiées dont une en particulier sur laquelle est basée ce projet. Il en résulte que la fibre musculaire est moins performante car sa structure est modifiée. Chez l'Homme, la diminution de la force musculaire se manifeste dès la naissance pour les cas sévères ou plus tardivement. Les mécanismes conduisant au développement de la pathologie ont été identifiés grâce à des altérations observées sur les cellules musculaires de souris en culture et sur un modèle de souris précédemment développé et reproduisant une grande partie des problèmes musculaires rencontrés chez les patients. Ces mécanismes constituent des pistes thérapeutiques potentielles. Pour la plupart de ces pistes, des modulateurs ont été décrits et présentent donc un intérêt thérapeutique. Pour chacune de ces pistes candidates, nous avons retenu un ou plusieurs agents capables de corriger les altérations observées in vitro. Le présent projet propose d'évaluer leur potentiel in vivo en suivant l'évolution de la force musculaire chez des souris modèle génétique de la myopathie à cores. Ainsi, l'objectif de notre étude est d'identifier des candidats médicaments ayant la capacité de redonner de la force musculaire à des patients atteints de myopathie à cores afin d'améliorer leur espérance et leur qualité de vie.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre étude est d'identifier des candidats médicaments ayant la capacité de redonner de la force musculaire à des patients atteints de myopathies.

Procédures

1- injection dans l'abdomen de l'agent chimique permettant l'induction de la mutation: 1 fois par jour pendant 5 jours; durée moins de 30 secondes. 2- test de comportement pour la mesure de la force: entrainement et réalisation du test : 1 fois par semaine, 12 semaines, durée moins de 5 minutes par test. 3- Test de course: entrainement et réalisation du test tous les 15 jours, pendant 12 semaines, durée moins de 30 minutes par test. 4- injection de l'agent thérapeutique par différentes voies, une fois par semaine; durée moins de 30 secondes pour l'injection dans l'abdomen, jusqu'à 5 min anesthésie comprise pour l'injection dans le muscle. Ces injections n’auront pas lieu si le traitement dans l’eau de boisson ou dans les croquettes est possible.

Impact sur les animaux

1- Une souffrance légère liée à la répétition des injections est à envisager ainsi que les risques de formation d’un hématome au site d'injection. 2- La perte de la force musculaire et la perte de poids liées au modèle de la myopathie. 3- l'injection dans le muscle peut engendrer une douleur au site d'injection, elle se réalisera sous anesthésie gazeuse. 4- une perte de poids ou autres effets secondaires actuellement imprévisibles des candidats médicaments

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les muscles et réaliser des analyses moléculaires

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'agents et donc le nombre d'animaux vivants utilisés, un grand nombre de candidats médicaments seront testés sur des cellules musculaires in vitro. Les candidats médicaments les plus efficaces seront testés chez les animaux. Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation de la force musculaire d'une myopathie génétique et d'en suivre l'évolution au cours d'un traitement thérapeutique.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'agents et donc de réduire le nombre d'animaux vivants utilisés, les candidats médicaments sont auparavant testés sur des cellules musculaires en culture. Seuls les plus efficaces seront testés chez les animaux. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de répétitions des expériences sont déterminés à l'aide de tests statistiques appropriés tout en optimisant l'interprétation statistique des informations recueillies. Aussi souvent que possible, afin de limiter le nombre d'animaux, un seul groupe controle sera utilisé en parallèle de deux groupes traités simultanément.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du premier février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Les injections dans l'abdomen sont réalisées à l'aide d'aiguilles fines et changées pour chaque animal afin de limiter l'apparition d'hématome suite aux injections répétées, le site d'injection (droit ou gauche) est changé chaque jour. Les injections intra musculaires se réaliseront sous anesthésie. De la nourriture gélifiée et appétente est donnée lors de la perte de poids liée à la fonte musculaire observée chez les animaux modèles de la myopathie. Les tests de comportement sont réalisés après une période d'entrainement permettant de limiter le stress de la nouveauté. Enfin, une grille de cotation adaptée au modèle souris de la myopathie à cores centraux est établie et permet d'identifier et d'utiliser des points limites précoces et adaptés et de définir les critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Le projet utilisera une souche de souris permettant de modéliser les altérations musculaires observées chez des patients atteints de myopathie à cores. Il est nécessaire que le développement musculaire se déroule normalement avant d'induire la mutation dans ce modèle. Ainsi les animaux seront étudiés dès l'âge de 8 semaines, car les fibres musculaires sont matures à partir de ce moment là.