Souris

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par la bléomycine, puis elles reçoivent un anticorps par injection quotidienne sous-cutanée pendant quatorze jours et deux injections intrapéritonéales par semaine, avant prélèvement des poumons. Le porteur indique que les souris pourraient développer une détresse respiratoire, mais que la durée courte de l'expérience conduit à les mettre à mort avant l'apparition des symptômes. Il affirme qu'il est impossible d'évaluer l'effet de l'anticorps sur l'ensemble du métabolisme sans recourir à un modèle animal.

Objectifs

Nous souhaitons étudier in vivo l'effet d'anticorps dirigés contre la molécule d'intérêt dans la fibrose pulmonaire dans un modèle murin ainsi que les mécanismes d'action intervenant dans cet effet.

Bénéfices attendus

Nous espérons observer par immunohistochimie une diminution de la fibrose dans les groupes traités avec l'anticorps. Ceci sera mesuré par immunohistochimie.

Procédures

Les animaux recevront une injection quotidienne en sous cutanné pendant 14 jours et une injection IP 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec la bléomycine pourraient développer une détresse respiratoire cependant la durée courte de l'expérience (14 jours) fait que les animaux seront mis à mort avant le développement des symptômes physique de la maladie. Cependant le suivi journalier des animaux nous permettra d'euthanasier les animaux qui développeraient une détresse respiratoire précoce.

Devenir

Afin d'évaluer la fibrose pulmonaire par immunohistochimie sur les tissus pulmonaires les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

De part la complexité des intéractions cellulaires et moléculaire il est impossible d'évaluer l'effet de nos anticorps sur l'ensemble du métabolisme sans avoir recours à des modèles animaux. Le modèle de souris a été choisi car nous disposons d'un anticorps ciblant la molécule murine équivalent à notre anticorps ciblant la protéine humaine. Si l'effet bénéfique est observé dans le modèle murin nous pourrons justifier l'intérêt de l'anticorps humains pour la clinique.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit à 100 (25 souris / groupes) ce qui nous permettra d'évaluer de façon statistique l'effet de l'anticorps sur la fibrose pulmonaire. Afin de limiter les variations entre les souris au sein d'un groupe, nous prévoyons 25 animaux par groupe afin d'être sûr d'obtenir des résultats statistiques. Le poids corporel des animaux des différents groupes sera comparé par le test statistique Two Way RM ANOVA et leur survie par Log Rank test. Approche statistique : Nous utiliserons un t Test pour comparer le groupe contrôle avec chaque groupe test

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours. Les animaux montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal être (une perte de poids supérieure à 20%, la présence de sang dans les matières fécales,l'impossibilité de mouvement ou la voussure sévère du dos) seront euthanasiés. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement sont standards à l'espèce, les souris seront par groupe social de 5 maximum par cage, avec des moyens d'enrichissement. Une surveillance quotidienne ainsi qu’un suivi clinique etcomportemental des animaux (poils hérissés, dos voûté, agressivité…) sera réalisé. Tous les animaux traités et ceux des groupes contrôles seront analysés à la fin du protocole afin d’en obtenir un maximum d’information post mortem (analyse cellulaire par cytométrie, immunohistologie, analyse d'expression ARN). Les résultats obtenus permettront de déterminer le potentiel thérapeutique de nos anticorps pour limiter/empêcher la fibrose pulmonaire.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été choisi car nous disposons d'un anticorps ciblant la molécule murine équivalent à notre anticorps ciblant la protéine humaine. Si l'effet bénéfique est observé dans le modèle murin nous pourrons justifier l'intérêt de l'anticorps humains pour la clinique. L'âge : les souris commandées seront des souris adultes entre 18-24 mois pour leur poids stable en fin de croissance, cela limitera les différences entre individus. L'espèce : pour la facilité de manipulation (injection des molécules en s/c et ip), de prélèvement et d'analyse d'échantillons, d'évaluation physique (bien être)

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrose leur est induite par injections de collagénase dans le genou, suivies de l'injection d'agents dits sénothérapeutiques et de deux prélèvements sanguins à la queue, avant la mise à mort pour prélever l'articulation. Le porteur indique que l'injection de collagénase peut provoquer une douleur au genou, et attend des bénéfices à long terme, aucun traitement n'existant à ce jour contre l'arthrose. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la sénescence cellulaire dans l'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants.

Objectifs

Comme évoqué précédemment, l’arthrose est la maladie la plus répandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage. Aucun traitement n’est disponible. Il a été montré, dans une récente étude in vitro et in vivo, chez la souris ou sur des prélèvements de patients, que la sénescence cellulaire s’accumule dans le cartilage arthrosique. Cette découverte a permis de proposer une nouvelle approche thérapeutique de l’arthrose en ciblant les cellules sénescentes par injection d’agents dits séno-thérapeutiques. Nous proposons ainsi, dans ce projet, de : 1- établir la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite à la collagénase chez les souris jeunes et âgées; 2- de valider l’effet sur la sénescence induite par l’arthrose d’agents séno-thérapeutiques (molécules, anticorps ou cellules) que nous avons identifié au cours d’études in vitro dans le laboratoire.

Bénéfices attendus

Nous attendons des bénéfices à long terme, le but étant de retarder et/ou éliminer l’accumulation des cellules sénescentes articulaires qui entrainent le développement de l’arthrose.

Procédures

Procédures chirurgicales : injection intra-articulaire (2 fois avec la collagénase et 1 fois avec la molécule sénothérapeutique), le temps d'une injection + Prélévement caudal 2 fois.

Impact sur les animaux

L’injection de la collagénase en intra-articulaire peut induire une douleur au niveau du genou.

Devenir

A la fin du projet, les souris seront sacrifiées pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.

Remplacement

L’analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’est donc pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé en tenant compte des pertes éventuelles lors des protocoles et en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intraarticulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la souffrance et l'angoisse infligé aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Le modèle murin d'arthrose induite à la collagénase présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c'est-à-dire chez le sujet jeune après le trauma articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. Les animaux seront utilisés à 2 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à l’arthrose induite. Chez les souris de 18 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à une arthrose spontanée et naturelle. Sur les 2 modèles (jeunes et âgées), on va étudier l’effet de l’élimination de ces cellules sénescentes par des injections articulaires d’agents séno-thérapeutiques

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène cinq jours de suite pour supprimer le gène Pk2 dans les oligodendrocytes, puis sont anesthésiées pour une perfusion terminale du cerveau. Le porteur indique que ces injections répétées sont un facteur de stress douloureux et que la délétion peut entraîner des troubles locomoteurs, voire des crises d'épilepsie. Il relie ce travail fondamental à l'autisme et à la maladie d'Alzheimer chez l'humain, mais affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne peut reproduire ces interactions cérébrales.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : (1) créer deux lignées de souris dans lesquelles nous pouvons supprimer spécifiquement le gène Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. (2) étudier l'effet de la délétion de Pk2 sur les cellules de la lignée oligodendrocytaire.

Bénéfices attendus

Ce projet étudiera pour la première fois le rôle du gène de polarité Pk2 spécifiquement dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire. Nos expériences visent à comprendre le rôle de ce gène au niveau cellulaire. Chez l'homme, la déficience de Pk2 a été liée à l'autisme et des altérations de Pk2 ont été observées dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Dans l'autisme, les circuits neuronaux qui sous-tendent certains comportements sont altérés et les oligodendrocytes jouent un rôle dans la stabilisation des circuits neuronaux et la facilitation des connexions neuronales. Notre recherche contribuera donc à évaluer si les oligodendrocytes pourraient être considérés comme une cible putative dans ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pendant 5 jours consécutifs, après es souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. Pour chaque injection, l’animal sera manipulé par l’expérimentateur entre trente secondes et une minute. L'injection aura lieu pendant ce temps et durera environ 10 à 15 secondes. À la fin de l'expérience, les animaux recevront une injection intrapéritonéale pour induire une anesthésie profonde afin de réaliser une perfusion transcardiaque sous anesthésie. Dans la mesure du possible, les animaux seront anesthésiés par inhalation d'isoflurane à 3 % avant l'injection pour l'anesthésie terminale afin de réduire davantage le stress. L'induction à l'isoflurane prendra environ 3 minutes et l'injection en intrapéritonéal de l’anesthésique prendra 10 secondes. Une anesthésie profonde est obtenue dans les 5 à 10 minutes en fonction de l'induction préalable à l'isoflurane.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale inflige aux animaux des injections intrapéritonéales pendant 5 jours consécutifs. Il s'agit d'un facteur de stress récurrent et d'une procédure qui peut être douloureuse pour les souris. La délétion de Pk2 dans les cellules de la lignée oligodendrocytaire pourrait avoir un effet négatif sur les souris en entraînant des modifications de l'activité locomotrice et, potentiellement, le knockout pourrait conduire avec une faible probabilité à des crises d'épilepsie.

Devenir

Les souris recevront une injection intrapéritonéale de tamoxifène pour induire une invalidation génique conditionnelle. Les souris resteront ensuite en vie jusqu'à la fin de la période expérimentale. La durée maximale de la période expérimentale est définie comme étant de 8 semaines après la dernière injection (âge maximal de 100 jours ou 14 semaines). Cette période est nécessaire pour s'assurer que la délétion génétique est effective. Après un maximum de 8 semaines, nous serons en mesure d'étudier l'effet cellulaire de l’invalidation génique conditionnelle. À la fin de l'expérience, toutes les souris seront profondément anesthésiées et le cerveau sera préservé par perfusion intracardiaque de fixateur. Une analyse histologique ultérieure sera effectuée au niveau cellulaire. Cette procédure sera effectuée pour tous les animaux afin d'effectuer une analyse biologique et statistique des différentes étapes d'analyse prévues.

Remplacement

Le projet a pour but d'étudier la trajectoire développementale et de signalisation cellulaire de la lignée oligodendrocytaire dans le cerveau murin. La suppression des gènes induite par l'injection de tamoxifène est déterminée par l'âge de développement de l'animal et le stade cellulaire. Cette chronologie complexe ne peut être reproduite in vitro car les voies de signalisation putatives nécessitent des interactions intactes entre les différentes cellules du cerveau. Il n'existe aucun modèle informatique ou "in vitro" capable d'imiter ces processus biologiques tout en respectant la physiologie ; l'utilisation d'animaux est donc nécessaire pour étudier ce mécanisme biologique fondamental.

Réduction

Notre approche expérimentale nous permettra d'aborder les questions expérimentales avec les meilleures expériences possibles. Le nombre d'animaux sera réduit au minimum, tout en permettant des tests statistiques robustes et des expériences contrôle suffisantes. La production de souris sera optimisée en mettant en place un programme d'élevage qui correspond étroitement à la demande et qui est mis à jour tous les 3 mois. Nous élèverons le nombre minimum d'animaux nécessaires pour réaliser les expériences.

Raffinement

L'approche expérimentale est affinée par l'utilisation d'une délétion génétique conditionnelle qui minimise les effets indésirables sur les organes et les cellules non concernés. Ainsi, la délétion du gène Pk2 dans l'oligodendrocyte ne se produit qu'après l'injection d'un modulateur (tamoxifène). Cette injection est effectuée à des moments expérimentaux précis au cours du développement de la souris. Nous mettrons en œuvre les meilleures pratiques pour garantir le bien-être des animaux en ajoutant un enrichissement aux cages, en traitant si nécessaire les douleurs survenues, en limitant tout risque d'infection et en limitant la souffrance des animaux lorsque les objectifs expérimentaux sont atteints.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. Par définition, pour nos études intégrées évaluant l’impact d’une mutation d’un gène sur le cerveau et les troubles du comportement, l'utilisation de techniques in vitro ou d'organismes d'une plus faible sensibilité neurophysiologique (invertébrés par exemple) n'est pas appropriée pour les questions auxquelles nous cherchons à répondre. En outre, la création de modèles animaux est très importante. Par conséquent, nous pensons qu'il n'existe pas de remplacement disponible qui permettrait d'atteindre les objectifs scientifiques du travail proposé. Pour le maintien de l'élevage, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines ou plus. L’invalidation génique chez les souris expérimentales sera induit à différents moments. Pour supprimer le gène Pk2 dans les cellules précurseurs des oligodendrocytes, des injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 2 et 7 et entre les jours postnatals 28 et 40. Pour le ciblage des oligodendrocytes, les injections de tamoxifène auront lieu entre les jours postnatals 11 et 21 et 28 et 40. Toutes les analyses seront effectuées lorsque les souris seront âgées de 3 semaines à 14,5 semaines. L'analyse à ces différents moments est nécessaire d'un point de vue scientifique car nous analyserons le rôle de la Pk2 dans le développement des cellules de la lignée oligodendrocytaire et dans le maintien des oligodendrocytes chez l'animal adulte.

361 rongeurs, 280 souris et 81 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs du défaut génétique de la maladie de stockage du glycogène de type III, ils reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique à doses croissantes, quatre anesthésies générales, des prélèvements sanguins répétés et des tests de force musculaire, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de déterminer la dose efficace de cette thérapie génique en développement non clinique, en vue d'une future application chez l'humain. Le porteur affirme que le ciblage simultané de trois tissus n'est pas réalisable in vitro et que les deux espèces sont nécessaires, seul le rat reproduisant l'atteinte cardiaque.

Objectifs

La maladie de stockage du glycogène de type III (ou GSD III pour glycogen storage disease III) est une maladie génétique héréditaire rare causée par des mutations dans le gène AGL (pour amyloglucosidase glucanotransférase) qui fabrique l’enzyme débranchante du glycogène nommée GDE. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans la transformation du glycogène, molécule de stockage composée de successions de glucose, en unité élémentaire de glucose dans les muscles et le foie. Dans la pathologie, le glycogène non décomposé s’accumule dans les muscles squelettiques et cardiaque et dans le foie, altérant leurs fonctions. L'apparition de la maladie commence dès la petite enfance et comprend l'hypoglycémie, l'hyperlipidémie (excès de graisses dans le sang) et l’élévation des taux sanguins d'enzymes hépatiques causée par la mort des cellules du foie. Au niveau du foie, les symptômes tardifs peuvent inclure une hépatomégalie (foie anormalement gros), reflétant une affection chronique (cirrhose) et, parfois, des tumeurs hépatiques non cancéreuses. Des maladies du cœur peuvent apparaitre. Les fonctions immunitaires sont altérées. Certaines personnes sont de petite taille. Aucun traitement curatif n'existe à ce jour. Notre étude vise à définir la dose efficace d’un traitement de thérapie génique ayant pour but de réintroduire un gène fonctionnel fabriquant la GDE dans les cellules hépatiques et musculaires. Un vecteur recombinant dérivé d’un virus portant le gène AGL fonctionnel sera injecté à doses croissantes dans des modèles de souris et de rats porteurs du défaut du gène agl et l'effet de la thérapie génique sera évalué au cours du temps au niveau des fonctions musculaires, cardiaques et hépatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris et les rats porteurs du défaut du gène agl devraient permettre de stabiliser ou de diminuer l'accumulation de glycogène au niveau du foie et des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une régénération des tissus, une amélioration de la masse et de la force musculaire et une amélioration de la fonction cardiaque. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace du traitement sur tous les organes cibles afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la GSDIII par thérapie génique.

Procédures

Les souris et les rats recevront tous une injection intraveineuse unique de vecteur thérapeutique en début de protocole : chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Pour réaliser l’ensemble des tests et prélèvements, les souris et les rats recevront 4 anesthésies générales par voie intrapéritonéale. Chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures de test fonctionnels de suspension et de test d'agrippement et trois mesures de l'activité électrique musculaire espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques. Les rats subiront 3 mesures d’électrocardiogramme et d’échocardiogramme. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les rats subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats seront euthanasiés après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des périodes de jeûne contrôlé de 4 heures avant les prélèvements sanguins, ce qui pourraient entrainer une sensation de faim, de stress et une hypoglycémie. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation fonctionnelle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil en cas de surdosage. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un petit morceau de queue ou d’oreille (acte réalisé pour l’identification des animaux), au moment des injections intraveineuses du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la pose d’électrodes transcutanés au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé, notamment si un animal présente des blessures aux griffes ou aux pattes au moment du test. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

P1 et P2: Euthanasie. P3: toutes les souris hétérozygotes seront euthanasiées, toutes les souris homozygotes seront utilisées dans la procédure 1, une partie des souris wild-type sera utilisée dans la procédure 1 (14 souris) et le reste des souris wild-type sera euthanasié (56 souris).

Remplacement

Le projet consiste à mesurer l'effet thérapeutique du transfert génétique du gène agl au niveau du foie, du cœur et des différents muscles squelettiques: ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler trois tissus simultanément in vitro et d’étudier la biodistribution relative de notre molécule thérapeutique entre les différents organes cibles. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une amélioration de la fonction musculaire dans les 2 modèles murins utilisés (souris et rats). Ces calculs permettent de prévoir un effectif de 7 souris et de 8 rats par groupe et par sexe, les deux sexes devant être inclus dans les études de recherche de dose thérapeutique afin de prendre en compte une éventuelle variabilité des effets liée au sexe (soit 14 et 16 individus par groupe pour les souris et les rats, respectivement). Pour les études réalisées sur les souris, 4 doses seront testées en parallèles d’un témoin non traité et d’un groupe de référence d’animaux en bonne santé, et 3 doses seront utilisées pour les études réalisées sur les rats avec les mêmes groupes témoins, soit un total de 84 souris et de 80 rats pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les souris et les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux recevront une injection unique du traitement par veine caudale, et subiront 3 prélèvements de sang au cours des 4 mois du protocole (un avant le traitement et un tous les deux mois). Ces prélèvements seront réalisés au niveau d'une veine du museau sur animaux vigiles maintenus en contention (souris) ou sous anesthésie gazeuse (rats). Les animaux subiront également un prélèvement de sang d’un volume plus important au moment de l’euthanasie, par prélèvement au niveau du sinus rétro-orbital, sous anesthésie générale. Au cours du protocole, tous les animaux seront soumis à différents tests fonctionnels permettant de mesurer l’effet du traitement au niveau des muscles squelettiques (souris et rat) et du cœur (rats seulement). Les tests douloureux seront réalisés soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie générale et un antalgique fort sera administré par voie sous cutanée avant de le réaliser. Le même antalgique sera également administré pendant les 48 heures qui suivront la fin de certains tests. Tous les tests fonctionnels seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur les pathologies génétiques. Le modèle de souris de la GSDIII permet une évaluation fonctionnelle très complète de différents groupes musculaires, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque des individus affectés par la GSDIII. Le rat est le seul modèle reproduisant cet aspect de la pathologie. L'utilisation des deux modèles de GSDIII permettra de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les souris et les rats seront de jeunes adultes âgés de 4 mois au moment du traitement et de 8 mois à la fin du protocole. La caractérisation préalable des deux modèles a permis de déterminer que la pathologie sera déjà présente au moment du traitement, ce qui permettra de tester l’effet de réversion de la pathologie, et non pas sa simple prévention. Ce choix permet de se rapprocher au plus juste de la pathologie humaine, qui sera traitée majoritairement après l’apparition des symptômes.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées privées de gènes clés du métabolisme sont créées, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés, à des tests de tolérance au glucose après jeûne et à une diète cétogène presque totalement dépourvue de sucres, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de mesurer les contributions respectives du foie et du rein dans la production des corps cétoniques, avec une visée translationnelle vers l'usage humain de la diète cétogène. Le porteur affirme que l'étude des délétions géniques tissu-spécifiques n'est faisable que sur des souris.

Objectifs

Le projet a pour objectif de déterminer les contributions relatives foie et des reins dans la production des corps cétoniques lors d’une administration d’une diète cétogène. Pour pouvoir déterminer les contributions des deux organes à la foi dans l’anabolisme (synthèse) des corps cétoniques (par les deux organes) et dans le catabolisme (utilisation) par le foie, les enzymes clé pour la synthèse (HMGCS2) et l’utilisation (OXCT1) des corps cétoniques seront deletée dans le foie ou les reins (OXCT1) et dans le rein (SCOT1) pour générer de lignées knock out tissues spécifiques. La génération des lignées de souris constitue le premier objectif du projet. Le deuxième objectif est d’étudies le métabolisme de ces lignées de souries pendant une diète contrôle, enrichie en gras et sucres et cétogène.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à améliorer les connaissances scientifiques sur le métabolisme des corps cétoniques. Dans les humaines, la diète cétogène est utilisé dans des conditions cliniques particulières come approche nutritionnel reconnu (épilepsie) ou dans des études exploratoires (certains types de cancer, ou comme diète avant une chirurgie bariatrique). Notre projet pourra apporter des nouveaux acquis scientifiques utiles dans ce contexte translationnelle vers l’utilisation de la diète cétogène dans l’homme.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera dans des prélèvements sanguins et prélèvement de queue pour génotypage. La prise de la glycémie chaque deux semaines (7 fois pendant le protocole nutritionnel) sera faite à l'état vigil après 6 heures de jeûne. Une ponction de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) permettra de mesurer la glycémie au glucomètre. La tolérance au glucose sera évalué à 8 et 16 semaines (2 fois pendant le protocole nutritionnel) à l'état vigil après 6 heures de jeûne, suite à une injection intra-péritonéale de glucose 2mg/g du poids de la souris. Pour cela, des ponctions de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) seront effectués à l'extrémité de la queue aux temps 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes, afin de suivre la courbe de la glycémie et de l'insulinémie. L'incision de la queue sera réalisée au temps t0, puis les prélèvements suivants seront effectués par simple grattage du caillot sanguin. Lors des prélèvements d'un fragment minime de queue pour le génotypage l’utilisation d’une crème anesthésiante à la lidocaïne sera envisagée afin de minimiser toute douleur et/ou souffrance associée au prélèvement.

Impact sur les animaux

Par rapport aux données de la littérature sur les souris sauvages (wild-type), les protocoles d’alimentation cétogène présentés dans ce projet ne devraient pas être susceptibles de générer des effets indésirables. Néanmoins, si l’administration de la diète cétogène (presque totalement dépourvue en sucres) devrait générer de la souffrance (inappétence, perte de poids, troubles comportementales), notamment dans les lignées transgéniques, le protocole sera terminé et les souris retournées à la diète standard avant mise à mort. La génération de souris transgéniques pourrait aussi engendrer un phénotype dommageable. Celui-ci pourrait consister dans des effets sur les paramètres métaboliques qui pourraient être manifestes à la naissance tels que hypo or hyperglycémie ou cétoacidose. Pour déceler ces événements, si les nouveaux nés montreront des signes de souffrance, la glycémie et cétonemie seront mesurées avec le kit Nova pro glu/ket qui mesure la glycémie et cétonemie de façon simultanée. Si avérées, ces évènements mèneront à l’arrêt de la génération de la ligne transgénique.

Devenir

Les protocoles se termineront avec une prise de sang retroorbitale (après anesthesie), et mise a mort par dislocation cervicale pour pouvor recuperer differents organes et tissues. La necessité de faire les analyses biochimiques justifie la mise à mort et recuperation de ces tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l’analyse des effets des diètes au niveau de l’organisme et, d’un point de vue mécanistique, l’étude des Knock-outs tissue-spécifiques pour les gènes Oxct-1 et HMGCS2 ne peut être faisable que sur des souris.

Réduction

Notre stratégie de réduction, tout en restant dans de limites imposée par la nécessité d’obtenir une puissance statistique satisfaisant, nous permet d’avancer une demande d’utilisation de 256 souris au maximal.

Raffinement

Dans ce projet nous essayerons de raffiner et optimiser les procédures expérimentation pour réduire au maximum l’inconfort et les stress subie par les animaux. En plus, les protocoles ont été prévus de façon d’obtenir le plus d’informations possible de chaque animal en imposant, en même temps, le "moindre coût" en terme de mal être des animaux. Le raffinement dans le protocole expérimentale s’applique tout au long de la vie des animaux, et en particulier pendant la durée des protocoles nutritionnels. Pour satisfaire les conditions de raffinement, nous planifierons les protocoles de façon à éviter des perturbations susceptibles de procurer le stress de l’animal. De plus, les recours à l’anesthésie/analgésie est prévu pour les prises de sang et nous utiliserons des procédures d’euthanasie appropriées (dislocation cervicale) et sous anesthésie. Ces procédures de raffinements nous permettront aussi de générer des résultats de meilleure qualité et d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de l’expérimentation.

Choix des espèces

Comme notre projet est à l’interface entre le métabolisme et la signalisation cellulaire, le recours au model murin nous permettra i) dans les études nutritionnelles sur les souris wild-type d’obtenir des données nouvelles et originales dans le contexte de la grande quantité de littérature décrivant les effets d’une diète obésogène sur les souris et ii) en ce que concerne les études mécanistiques en utilisant les modèles KO, tissue-spécifiques, d'éclaircir les métabolisme des corps cétoniques et des effets bénéfiques potentielles de la diète cétogène. L’intervention nutritionnelle (diète contrôle, hypercalorique, cétogène) débutera chez des souris âgées de 5 semaines et se poursuivra pendant 16 semaines consécutives. Il est important que le protocole nutritionnel débute peu de temps après le sevrage pour maximiser les effets métaboliques. La présence de troubles métaboliques (hyperglycémie, intolérance au glucose …) chez la souris sous diète hypercalorique/hyperglycémique après 8 semaines de régime est connue, permettant de valider les potentiels effets bénéfiques d'une diète cétogène administée après les 8 semaines de diète hypercalorique/hyperglycémique. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 21 semaines.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs mammaires 4T1, elles passent des examens d'IRM sous anesthésie, les effets indésirables déclarés se limitant au développement de la tumeur. L'objectif est de concevoir et valider des agents de contraste ciblant la nétrine-1 pour détecter plus tôt le cancer mammaire métastatique. Le porteur décrit très brièvement les procédures et affirme que l'étude préclinique ne peut se faire que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le projet a pour objectif la conception et la validation de nouveaux agents de contraste qui ciblent spécifiquement la nétrine-1, pour le diagnostic précoce du cancer mammaire de type métastatique.

Bénéfices attendus

Les bénfices de ce projet concerne la possiblité d'une détection précoce du cancer mammaires pour une prise en charge plus rapide et plus éfficace

Procédures

les animaux passeront des examens d'imagerie non invasive in vivo d'IRM

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés au développement de la tumeur 4T1. Une grille descoring a été établie et des points limites ont été définis.

Devenir

à l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par disclocation cervicale

Remplacement

le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’observation des animaux et l’imagerie in vivo. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront observées chaque jour de la semaine et les critères comportementaux et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du pallier de douleur (point limite) sont présentés dans les procédures. Les mêmes animaux seront utilisés pour les différents temps du suivi. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour en avoir 5 de taille homogène, nombre nécessaire permettant l’obtention d’une étude avec des souris homogènes en taille de tumeurs par stade de développement tumoral. Des tests t non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris (n=5).

Raffinement

les animaux sont observés scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Des points limites prédictifs ont été mis en place. Durant les acquisitions d’imagerie les animaux seront anesthésiés

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigénèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Les tumeurs mammaires métastatiques 4T1 étudiées sont spécifiques du modèle murin. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.