Souris

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques développent une sclérose latérale amyotrophique évolutive, avec troubles de la démarche, perte de force musculaire et perte de poids, reçoivent une injection tous les deux jours pendant plus de trois mois, et subissent des tests de locomotion ainsi qu'un test d'évitement par choc électrique aux pattes. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur la drosophile puis sur des larves de poissons zèbres avant de recourir à la souris. Il affirme que les modèles murins "ne peuvent pas être remplacés" en vue d'un développement clinique.

Objectifs

notre objectif est de valider une cible thérapeutique pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique. Notre étude permettra d'identifier des molécules capables de réduire les défauts locomoteurs et les atteintes cellulaires liés à cette maladie

Bénéfices attendus

Valider une cible thérapeutique et identifier un/des agents thérapeutiques pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique

Procédures

Tous les animaux (n=768) recoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours. L'impact sur le comportement est évalué du 21ème jour au 124ème jour. Les tissus nerveux des animaux sont analysés post-mortem

Impact sur les animaux

Les souris utilisées présentent un phenotype pathologique avec un décours différent suivant le sexe . Les mâles ont un phénotype plus rapide et prononcé. A 30 jours : apparition des trouble de la démarche et de l'équilibre. A 60 jours : aggravation des défauts de locomotion (diminution de la force musculaire). A 90 jours : début de la perte de poids (mâles). A 120 jours : perte de poids (femelles et mâles).Comme les souris montrent des déficit au niveau intestinal, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30ème jour pour limiter la perte de poids. La nuisance liée à l'injection en intrapéritonéale tous les 2 jours est minimisée en alternant le côté d'injection. Les tests de locomotion utilisés provoquent très peu d'effet indésirable. Pour le test d'évitement, les animaux reçoivent un faible choc électrique aversif par les pattes et on note leur réaction. Les chocs sont limités en intensité et en durée de façon à limiter la nuisance aux animaux. Toute variation importante de la sensibilité aux chocs conduit à l'arrêt de la procédure. Ce test ne sera pratiqué qu'une seule fois à la fin du projet

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre l'étude des mécanismes d'action de la thérapie

Remplacement

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie complexe se traduisant par une perte progressive des neurones de la moelle épinière et du cortex moteur. Elle se traduit par une diminution progressive des capacités motrices. Pour minimiser l'utilisation d'animaux vertébrés, nous avons dans un premier temps démontrer chez la drosophile que l'activation d'un récepteur est une cible thérapeutique d'intérêt. Pour identifier 3 nouveaux activateurs de ce récepteur avec un fort potentiel thérapeutique, une série d'activateurs sera d'abord testée sur des larves de poissons zèbres de 5 jours. Ensuite pour valider les 3 meilleurs activateurs candidats, nous avons besoin d'un modèle vertébré proche de la maladie avec une perte de neurones moteurs de la moelle épinière et des déficits progressive de locomotion. Les modèles murins sont les plus adaptés à ce type d'étude et ne peuvent pas être remplacés par d'autres modèles en vue d'un futur développement clinique.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécéssaire, on se base sur les études antérieures utilisant la même stratégie thérapeutique et les mêmes tests comportementaux pour d'autres maladies neurodégénératives. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance, l'environnement des animaux sera enrichi avec des copeaux de cartons qui permettront aux animaux de se cacher et constituer un abri. Les animaux seront également manipulés toutes les semaines afin de réduire le stress que peut engendrer un expérimentateur lors d'une procédure expérimentale. Afin de réduire la difficulté des souris transgéniques pour s'alimenter, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30 ème jour. Afin de contrôler le bien-être des animaux, les souris seront pesées deux fois par semaine dès la naissance. Une feuille de bien-être, avec les points limites sera complétée par l'expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanés, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, ...) sera remarqué. Dès lors une grille d'évaluation sera complétée tous les jours pour le suivi de l'animal. Si une souris présentait un score de souffrance trop élevé sur la grille d'évaluation, elle sera immédiatement euthanasiée par l'expérimentateur qualifié après en avoir averti le chef de projet et le vétérinaire.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques utilisée a fait l'objet de nombreuses publications et son phénotype est donc bien caractérisé. L'utilisation de ces animaux est indispensable à l'élaboration de thérapies efficaces car ils représentent un des modèles les plus pertinents de la sclérose latérale amyotrophique. Ces souris présentent une altération progressive de leurs performances motrices et mnésiques comme observée dans cette pathologie : A 30 jours : apparition des premiers défauts de locomotion A 90 jours : début de la perte significative des neurones moteurs A 120 jours : aggravation des symptômes

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Citrobacter rodentium pour reproduire un syndrome de l'intestin irritable, reçoivent un gavage de probiotiques, puis subissent un labyrinthe en croix surélevé, un test de nage forcée et une distension colorectale avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux persistant jusqu'à la fin des expériences. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux et que les modèles cellulaires in vitro ne sont pas envisageables.

Objectifs

L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du SII. La prise en charge de ces douleurs en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces douleurs afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes périphériques impliqués dans l’initiation et/ou le développement d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux. En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du système immunitaire ou des modifications de la composition du microbiote intestinal pouvant être l’origine d’une micro-inflammation locale et/ou d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre microbien, immunitaire et/ou inflammatoire à bas bruit et le développement d’une HSVC afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement de la douleur viscérale d’origine colique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs associées au syndrôme de l'intestin irritable afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie . L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au syndrome de l'intestin irritable et, in fine, à soulager les patients douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Prélèvement de fèces à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif. Suite à cela, les souris recevront un traitement par gavage orale à base de bactéries probiotiques entre J16 et J23. A J21, les souris subiront un premier test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état d'anxiété des souris (Labyrinthe en croix surélevé) puis à J23 un second test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état de dépression des souris (test de la nage forcée). Enfin, à J24, les souris subiront un dernier test (40 min par souris sur l'ensemble des souris), le test de distension colorectale, afin d'évaluer leur sensibilité colique avant d'être mis à mort à la suite de ce test de distension colorectale.

Impact sur les animaux

Une perte de poids (au maximum, 5% du poids initial) peut être observée chez certains animaux durant la phase d’infection et notamment au pic d’infection (7 jours post-infection), mais ce phénomène est temporaire et naturellement résolu avec l’élimination du pathogène (16 jours post-infection). Ensuite, cette infection par C. rodentium induira chez les animaux les symptômes associés au SII-PI à savoir une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux en phase post-infectieuse (16 jours post-infection) et jusqu’à la fin des expérimentations prévues (24 jours post-infection).

Devenir

A l'issu de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort par overdose d'isoflurane suivi par une dislocation cervicale afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis une injection de lymphocytes T par voie rétro-orbitale, avant le prélèvement de leurs tumeurs, rate et ganglions, pour étudier le rôle d'une protéine dans l'efficacité de l'immunothérapie du cancer. Le porteur fixe un point limite à un volume tumoral de 2 500 mm3, seuil au-delà duquel les souris qui l'atteignent sont mises à mort. Il indique avoir mené des expériences in vitro au préalable mais conclut que les interactions entre cellules tumorales et microenvironnement immunitaire "ne peuvent actuellement pas être remplacées" par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

La progression du cancer est grandement influencée par un équilibre délicat entre l'immunité et la tolérance aux tumeurs. En particulier, les lymphocytes T (LT) CD8 ont pour fonction de détruire les cellules tumorales. Leur étude a conduit au développement de deux types d’immunothérapies du cancer, qui ont révolutionné la prise en charge des patients : l’administration d’anticorps anti- PD-1 qui ciblent la fonction défectueuse des LT CD8, ainsi que l’injection de LT spécifiques d’un antigène tumoral et capables d’éliminer directement la tumeur. La combinaison de ces deux traitements est testée actuellement en clinique mais les mécanismes moléculaires régissant la réponse ou la résistance à ces thérapies sont mal connus. La protéine X joue un rôle critique dans la tolérance immunitaire dans le cancer et nos données préliminaires suggèrent qu’il pourrait également être un régulateur majeur de l’activité des LT CD8+. Dans ce contexte, nous émettons l’hypothèse que l’élimination des tumeurs par l’injection de LT spécifiques, en combinaison ou non avec une thérapie par anti-PD-1, requiert l’activation de X.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un mécanisme moléculaire impliqué dans l’effet curatif des thérapies du cancer par injection de LT. D’autre part, ces études pourraient révéler des activités spécifiques de la protéine X qui peuvent être ciblées par de nouveaux agents thérapeutiques pour améliorer la fonction des LT, seule ou de concert avec des immunothérapies existantes.

Procédures

- Rasage du flanc des souris après désinfection a l’alcool 70% sous anesthésie isofluorane (1x 2 minutes/souris) -Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie isofluorane, de cellules tumorales resuspendues dans du PBS1X stérile, dans un volume total de 100uL (1x 2 minute/souris) -Injection intraveineuse par voie rétro-orbitale, sous anesthésie isofluorane, de cellules LT resuspendues dans du PBS1X stérile, (ou du PBS1X comme témoin) dans un volume total de 100uL. (1x 2 minute/souris)

Impact sur les animaux

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Chez la souris, l’injection d’anti-PD-1 ne provoque pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, effectuées sous anesthésie isofluorane, mais susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux 2 fois par semaine. Un enrichissement (morceau de coton) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsqu’un des points limite (volume tumoral de 2500 mm3, nécrose de la tumeur ou altération de l'état général de la souris) sera en passe d’être atteint, par dislocation cervicale ; les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous allons tout d’abord effectuer un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine X dans l’immunothérapie par transfert de LT. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Dans des études antérieures décrivant les lignées cellulaires utilisées ici, il a été démontré un écart-type de 150 mm3 au point final (1250 mm3). L'effet minimal souhaité de l’ablation de X serait une augmentation > 50% de la croissance tumorale, donc une taille de 2500 mm3 au point final. En prenant en compte une puissance de 90% et un alpha de 0.05, nous calculons une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un test ANOVA à 2 voies suivi du post-test Bonferroni sera utilisé pour analyser la significativité des résultats. L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin du protocole (au plus tard à J21) ou dès l’atteinte d’un point limite par un individu pour réduire la variabilité expérimentale. Pour assurer la reproductibilité des résultats, nous répéterons l'expérience une fois. Il n’y a pas de double emploi des souris.

Raffinement

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de NF-kB dans les réponses immunitaires anti-tumorales. D’autre part il existe un certain nombre de modèles de tumeurs transplantables chez la souris, largement décrits et utilisés par le passé. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 10 semaines.

1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, le sein, le pancréas ou l'ovaire, puis des examens IRM répétés avec injection d'agents de contraste au gadolinium, avant une mise à mort par dislocation cervicale et le prélèvement d'organes pour doser le métal. Le porteur présente l'IRM comme "non invasive et atraumatique" et affirme qu'elle réduit le nombre d'animaux en permettant un suivi répété. Il indique que l'étude "ne peut se faire que sur un organisme vivant entier".

Objectifs

L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. C’est une méthode qui utilise des champs magnétique et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnement ionisants. Elle est non invasive et atraumatique. Pour un examen IRM les animaux sont endormis (anesthésie gazeuse sous isoflurane1.5%) afin d’éviter tout mouvement dans l’imageur qui provoque du flou sur les images et les rend ininterprétables. Leur fréquence respiratoire est contrôlée tout au long de l’acquisition des images (à l’aide d’un capteur placé sous la cage thoracique) Plusieurs étapes seront nécessaires afin d’étudier la réponse de l’agent de contraste pour détecter le carcinome ovarien : 1) Induction des modèles tumoraux. 2) Etude de la perfusion tumorale (vascularisation de la tumeur et perméabilité des vaisseaux) au cours du développement de la tumeur. Il s’agit de suivre l’intensité du signal au cours du temps (1heure) après injection de DOTAREM (agent utilisé en routine clinique) ou d’autres agents de contraste (4 différents). Un traitement mathématique de la courbe permet d’extraire des paramètres quantitatifs de perfusion afin de déterminer le stade de développement de la tumeur où elle est le plus vascularisée. 6 stades de développement seront utilisés au maximum (J2, J7, J14, J21 et J28 et J35 en fonction du modèle tumoral). Ce sont les mêmes souris que l’étape 1. Les agents de contraste (à base de lanthanides) qui seront synthétisés partent tous de la structure des agents commerciaux utilisés en routine clinique. Ils ont donc été approuvés pour leur mise sur le marché. Notre projet ne nécessite dons pas d’étude in vitro au préalable. Les agents de contraste seront injectés par voie intraveineuse. L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. Cette une méthode qui utilise des champs magnétiques et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnements ionisants. Elle est non invasive et atraumatique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’identifier le stade tumoral où la tumeur sera la plus vascularisée et les vaisseaux les plus perméables afin d’optimiser le passage de l’agent de contraste dans la tumeur pour un diagnostic le plus précoce possible. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement d'une tumeur en terme d'hétérogénéité tissulaire et d'angiogénèse. Il devrait permettre de fournir une fenêtre temporelle là où la tumeur est le plus vascularisée et les vaisseaux suffisamment perméable pour laisser passer des agetns de contraste pour un diagnostic précoce ou des molécules thérapeutique.

Procédures

Imagerie par résonance magnétique. 1H par acquisition. Implantations de cellules tumorales en orthotopqiue (cerveau, sein, pancréas, ovaire)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à la croissance tumorale et feront l'objet de points limites.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale. Certains organes (rein, foie, rate) seront prélevés pour dosage de gadolinium par spectroscopie

Remplacement

le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique de croissance tumorale ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi des tumeurs permet aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de l’IRM réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Les mêmes animaux seront suivis tout au long de la procédure d'imagerie au temps (J2, J7, J14, J21, J28, J35 post induction tumorale).

Raffinement

Les animaux seront hébergés 5 par cage et en portoir ventilé. Un enrichissement est mis en place avec des tubes, du côté et des petites maisonnettes en plastique. Ils sont observés quotidiennement scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Les animaux sont anesthésiés pour les actes IRM. De plus, des points limites prédictifs ont été mis en place.

Choix des espèces

- La souris est un modèle adapté à notre imageur IRM (taille de l’ouverture). - Le modèle murin présente de nombreux avantages : nombreuses lignées génétiquement modifiées disponibles, existence de lignées immuno-compromises autorisant la greffe de cellules tumorales humaines (ici utilisation de souris Nude pour faciliter la prise de greffe tumorale dans le cas d’injection de cellules humaines). - L’administration de l’agent de contraste et son efficacité étant dépendantes de la physiologie, l’utilisation du modèle animal in vivo reste indispensable pour le présent projet Des souris femelles adultes de 8 semaines ; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation. Ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins)