Souris
Role de la proteine de densite post-synaptique PSD-95 dans la myelinisation et la remyelinisation du systeme nerveux central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle épinière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la myéline leur est provoquée par injection d'un agent dans la moelle épinière sous anesthésie, précédée de cinq injections quotidiennes, pour étudier le rôle d'une protéine dans la réparation de la myéline, comme dans la sclérose en plaques. Le porteur indique un risque d'hypothermie, de saignement et une douleur postopératoire légère de 48 heures, ainsi que des hématomes liés aux injections répétées. Il affirme qu'après des essais sur cellules, seul le modèle animal reproduit les lésions observées dans la maladie humaine.
Objectifs
L’établissement de la gaine de myéline du système nerveux, processus nommé myélinisation, vise à protéger l’axone et à accroître considérablement la vitesse de conduction de l’influx nerveux. Dans le système nerveux central, cette myélinisation est assurée les oligodendrocytes. Au cours du développement, la formation de la gaine de myéline requiert que ces cellules subissent deux processus : la migration/prolifération des progéniteurs, appelé progéniteurs d’oligodendrocytes, puis leur différentiation en cellules capables de myéliniser. L’établissement de la gaine de myéline est crucial et les déficits occasionnés résultent en de lourdes pathologies telle que la sclérose en plaques dans le système nerveux central. L’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la myélinisation est donc vitale afin d’accéder à une meilleure connaissance de ce processus physiologique en conditions normale et pathologique. Des études récentes ont montré que les cellules oligodendrogliales expriment des protéines synaptiques, protéines dont les fonctions sont bien établies dans les neurones. Plusieurs études scientifiques récentes suggèrent un rôle de ces protéines dans le processus de myélinisation. Notre projet a donc pour objectif de déterminer les fonctions précises de certaines de ces protéines dans le contrôle de la myélinisation et de la remyélinisation du système nerveux central.
Bénéfices attendus
La protéine synaptique qui nous intéresse est connue pour être impliqué dans certaines maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, et dans lesquelles une hypomyélinisation est aussi observée. Il est donc intéressant d’étudier l’implication spécifique des protéines synaptiques dans les oligodendrocytes afin de déterminer son implication dans le processus de myélinisation et de remyélinisation du système nerveux central. In fine, ce projet pourrait nous permettre de découvrir de nouvelles cibles moléculaires pour les thérapies de neuromodulation visant à promouvoir la régénération de la myéline dans les maladies démyélinisantes.
Procédures
Afin de répondre à notre question scientifique, nous allons générer un modèle de démyélinisation de la moelle épinière par injection de lysophosphatidylcholine (LPC). Ce modèle consiste pour chaque animal âgé de 12 semaines, en une injection dans la moelle épinière, effectuée sous anesthésie générale, d’un agent induisant une lésion focale de la myéline. Cette intervention dure environ 30 minutes par animal. L’analyse de la lésion permettra d’évaluer l’impact de notre protéine sur la réparation des lésions de la myéline semblable à celles observées lors de la sclérose en plaques. Nous allons utiliser 126 animaux. Dans le cadre de notre étude, une semaine avant la procédure de chirurgie, les animaux âgés de 12 semaines recevront 5 injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs sur animal vigile (5 secondes par animal). 48 heures après la dernière injection, les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et analgésie pour une injection unique dans la moelle épinière (30 minutes par animal). Ils seront maintenus pendant différents temps post-chirurgie (4, 7, 14, 21 ou 30 jours). A l’issue du temps de maintien prévu, les animaux seront tous euthanasiés selon une méthode réglementaire en vue des prélèvements des moelles épinières. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions, quand cela s’avèrera nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors des procédures sont liées à la chirurgie : risque hypothermique, lésion musculaire, saignement et douleur post-opératoire légère (faim, soif, stress physique et/ou thermique) durant 48 heures. Il est aussi possible d’observer un stress ainsi que l’apparition d’hématomes dus à l’injection quotidienne répétée de solutions, avant la chirurgie.
Devenir
Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Après des essais préalables sur différents modèles cellulaires, seul le modèle animal est pertinent pour cette étude car nous pouvons ainsi analyser l’effet de ces molécules dans un contexte in vivo reproduisant le mieux les caractéristiques des lésions observées dans la pathologie humaine.
Réduction
Ce modèle a déjà démontré sa pertinence pour l’analyse des mécanismes de réparation des lésions de la myéline. Le nombre d’animaux (126 au total) est limité au stricte nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et coton), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées quotidiennement. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie recommandées par les normes européennes. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe dans un nid). Les points limites sont : - perte de poids rapide ou progressive de 20 pourcents en 24h par pesée tous les jours pendant la première semaine puis 2 fois par semaine avant euthanasie ; - tumeur dont le volume est supérieur à 2 cm3; - état de choc, léthargie, inconscience, immobilité; - difficultés respiratoires L’euthanasie de l’animal sera réalisée si on observe l’un de ces critères.
Choix des espèces
Pour établir si notre protéine d’intérêt a un effet positif ou négatif sur les processus de myélinisation et de remyélinisation, la souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’Homme. De plus, la facilité d’élevage et le cours temps de reproduction de cette espèce sont des avantages. Grâce à nos collaborations, l’obtention des lignées transgéniques déjà préétablies, nous a permis d’accélérer considérablement le temps nécessaire à l’obtention de la réponse scientifique, mais aussi de réduire le nombre d’animaux à générer. Notre étude aura lieu sur des animaux mâles et femelles. Ce modèle murin de démyélinisation et de réparation de la myéline est bien établi dans la littérature et au sein de notre laboratoire. La chirurgie de démyélinisation sera réalisée sur des animaux lorsqu’ils seront âgés d’au moins 12 semaines (jeunes adultes), afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central. De plus, à ce stade du développement, la chirurgie de la moelle épinière est facilitée par la relative faible masse musculaire et de tissus graisseux des animaux, permettant ainsi une meilleure accessibilité à la moelle lors de la chirurgie. Par la suite, les animaux seront euthanasiés à 4, 7, 14, 21 et 30 jours post-lésion, afin d’observer respectivement : -Le recrutement des cellules progénitrices des oligdendrocytes au site de lésion (4 jours post-lésion), -Leur pic de prolifération (7 jours post-lésion), -Leur pic de différenciation (14 jours post-lésion), -Et le processus de remyélinisation (entre 14 et 30 jours post-lésion).
Etude de l’impact du dysfonctionnement de la connectivité neuronale cérébelleuse sur l’ataxie de Friedreich
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une partie subit une chirurgie lourde du crâne de deux heures et demie, pose d'une fenêtre crânienne et injection de virus dans le cervelet, d'autres passent des tests de coordination motrice, pour étudier l'ataxie de Friedreich sur un modèle de souris privé d'une protéine. Le porteur reconnaît une douleur postopératoire possible après la chirurgie du crâne, mais qualifie les tests comportementaux de non invasifs et non stressants. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire en culture des réseaux neuronaux aussi complexes, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive des neurones sensoriels. Elle mène à l’apparition de symptômes ataxiques, comme la perte de coordination des mouvements volontaires, mais affecte aussi d’autres organes comme le cœur et le pancréas. L’AF peut être déclenchée par plusieurs facteurs et est due à un déficit de la protéine frataxine (FXN) dans tous les tissus. Un modèle murin a été créé pour comprendre la maladie. Les résultats de nos collaborateurs et de notre laboratoire montrent que le modèle murin utilisé présente les symptômes de l’ataxie et peut donc être un bon modèle pour notre projet. Le projet va se diviser en plusieurs parties. En premier lieu, nous allons caractériser le comportement de ces souris à plusieurs temps, en utilisant des tests non douloureux et sans stress pour les animaux. En parallèle, nous caractériserons les cellules du système nerveux impliquées dans l’évolution de la maladie. La deuxième partie du projet vise à pratiquer de l’imagerie in vivo afin de visualiser l’activité du cervelet. Ceci nous permettra d’observer d’éventuels changements dans les réseaux neuronaux de façon directe chez les animaux. Ceci sera fait avant et après apparition des symptômes. Le dernier axe visera à utiliser les données d’imagerie obtenues précédemment afin de moduler les circuits neuronaux du cervelet par des approches chimiogénétiques. Cette approche consiste à injecter sous anesthésie différents types de récepteurs qui pourront être activés par un composé qui sera distribué dans l’eau de boisson des animaux. Ceci est dépendant des données obtenues précédemment, et notre approche sera adaptée au cours du projet. Nous espérons ainsi compenser les déficits comportementaux et obtenir des données fondamentales pour mettre en place le développement d’une thérapie. Ce projet présente donc deux intérêts majeurs, qui sont en premier la récolte de données fondamentales indispensables à une meilleure compréhension de la maladie, afin que la communauté scientifique puisse en bénéficier, et l’avancée vers un développement d’une thérapie pour traiter les patients atteints de l’AF.
Bénéfices attendus
Ce projet combine plusieurs techniques afin d’obtenir des données les plus complètes possibles sur ce nouveau modèle. En effet, bien que plusieurs modèles aient déjà été générés par le passé, notre modèle murin est celui qui est le plus proche génétiquement de ce qu’il se passe chez le patient, car il présente une quantité de la protéine Frataxine très basse dans tout le corps, dès le développement de l’embryon. Nos approches combinées de comportement, biologie moléculaire et microscopie vont permettre d’avoir une vue d’ensemble des événements responsables de l'évolution de la maladie. Ce projet permettra d'isoler des pistes pour mettre en place un traitement. Nous pourrons partager ces données avec l’ensemble de la communauté scientifique afin que d’autres travaux puissent utiliser ces connaissances et progresser dans la recherche fondamentale et pré-clinique. Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques. De plus, les techniques utilisées pour ce projet pourront être déclinées sur d’autres modèles. Les mécanismes sous-jacents de l’AF sont en cours d’étude et de nombreux éléments ne sont pas encore compris. Ce projet va permettre de rassembler une quantité de données non négligeable dans la compréhension de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes : -Tests comportementaux pour la caractérisation neurologique à 3, 6, 9, et 12 mois. 80 animaux au total (10 témoins et 10 mutants par temps). Les tests effectués visent à évaluer la coordination générale des animaux, et ne sont pas invasifs ni stressants. Comme pour toutes les procédures de comportement, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant plusieurs sessions avant le début des tests. Les tests ont une durée comprise entre 30 secondes et 5 minutes, et une période de repos est prévue entre chaque test. Au total, chaque souris passe au maximum 15min à être évaluée en comportement. Les tests comportementaux seront répétés à 4 temps différents. -Imagerie in vivo à 40j et 150j. 48 animaux au total. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique pour l’implantation d’une fenêtre crânienne et l’injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. L’intervention dure 2.5h par souris, et se fait sous anesthésie générale avec suivi vétérinaire quotidien pendant les 10 jours suivant l’intervention. -Modification chimiogénétique des circuits neuronaux cérébelleux par injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. 240 animaux au total, injectés à 40j et 150j -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, activés chimiquement via un produit dans l’eau de boisson (CNO) -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, qui ne seront pas activés chimiquement -40 animaux injectés avec un virus ne codant pas pour les récepteurs -20 animaux injectés avec le virus codant les récepteurs et traités au CNO -20 animaux injectés avec le virus non codant, traités également au CNO Les 4 premiers groupes seront utilisés pour les tests de comportement décrits précédemment, ainsi que des études histopathologiques. Les 2 derniers groupes seront utilisés pour des études protéomiques. Tous ces animaux seront soumis à l’intervention d’1h décrite précédemment, avec le même suivi vétérinaire.
Impact sur les animaux
Les données recueillies par nos collaborateurs et notre laboratoire montrent que notre modèle murin de l'AF ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois. A partir de 4 à 5 mois, des symptômes légers d’incoordination motrice commencent à apparaître. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs ni stressants, et ne causent donc aucun dommage aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection et d’implantation de fenêtre crânienne est une chirurgie lourde, et les mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires ont été prises en amont. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. Les traitements pharmacologiques pour les animaux concernés se fera via l’eau de boisson, et n’apportera donc aucun stress pour les animaux. Lors des sessions de microscopie, la tête des animaux sera immobilisée sur une courte période de 30min maximum par souris, pour assurer une acquisition optimale des images.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques. Tous les animaux sont réutilisés d’un autre projet de notre laboratoire dont l’un des axes vise à étudier le comportement néonatal des souriceaux. Ces 2 projets sont donc complémentaires et permettront l’obtention de données sur toute la durée de vie des animaux. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l’Ataxie de Friedreich affecte de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. De plus, nous effectuons un marquage de couleur à la base de la queue avec une encre légère non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Pour la prise en charge de la douleur per-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet, comprenant plusieurs molécules, avec la vétérinaire référente de la structure. Pour éviter au maximum de séparer les animaux lors de la phase post-opératoire, nous allons tester un système séparateur de cage qui permettrait aux animaux de se voir, se sentir et d’avoir des contacts sociaux réduits afin qu’ils soient moins stressés lors de cette période critique du projet. Pendant cette période, de l’enrichissement supplémentaire sera fourni pour prévenir toute apparition de comportement stéréotypique, marqueur de souffrance. De plus, un suivi vétérinaire sera effectué quotidiennement pendant 10j, avec une grille de score adaptée et plusieurs types d’analgésiques disponibles pour prévenir toute douleur post-opératoire. Des points limites adaptés à cette chirurgie ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Ceux-ci comprennent notamment l’évaluation de la consommation d’eau et de nourriture, le toilettage et les mouvements de chaque animal. L’administration de molécules pharmacologiques sera faite via l’eau de boisson, qui sera sucrée pour en masquer le goût. Ceci permettra un traitement sans aucune manipulation supplémentaire, ce qui ne stressera pas les souris.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Ce nouveau modèle va permettre de raffiner l’étude de l’AF car il s’agit du premier modèle disponible qui présente une perte de FXN dans le corps entier. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale de la progression de la maladie. La caractérisation neurologique par tests comportementaux se fera à 3, 6, 9 et 12 mois. A 3 mois, les souris ne présentent pas encore de symptômes, mais il est possible que des dégradations neuronales soient déjà en cours. Les 3 stades suivants nous permettront de relier l’évolution des symptômes avec l’état de dégradation du système nerveux central. Pour les expériences d’imagerie in vivo, les animaux seront opérés à 40j puis observés à 70j pour la partie pré symptomatique. Pour la partie post symptomatique, ils seront opérés à 150j et observés à 180j. comme précédemment, ceci nous permet de mesurer les paramètres d’intérêt avant et après l’apparition de la maladie, pour déterminer la gravité des changements qui ont lieu.
Altération de l’activité corticale et maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau, reçoivent des injections pendant sept jours et passent des tests comportementaux, dont un conditionnement par la peur, pour étudier les altérations précoces de la mémoire dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur qualifie le conditionnement par la peur de peu stressant en s'appuyant sur des projets antérieurs, et reconnaît un inconfort modéré et une perte de poids possible après la chirurgie. Il affirme qu'aucun modèle in silico ne reproduit le cerveau entier et que seule la souris réunit les critères recherchés.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie progressive, mortelle et est la cause principale de syndrome démentiel et en représente au moins deux tiers des cas la plus courante. MA commence bien avant le stade démentiel par l’apparition de troubles cognitifs donc le diagnostic précoce est un objectif important pour la recherche préclinique et clinique sur la MA. Il peut représenter une fenêtre thérapeutique critique où les interventions peuvent être initiées avant que ne se produise un déclin cognitif sévère. Une accumulation de peptide bêta-amyloïde (Aß) dans le cortex préfrontal est corrélée à un oubli rapide. Ensable, ils constituent un symptôme précoce de la MA qui peut être détecté par des mesures d'évaluation cognitive expérimentale et clinique bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers symptômes rapportés par les familles de patients. Aβ a des effets sur les signalisations impliquées dans la régulation des diverses formes de plasticité corticale et donc la formation de la mémoire. L'objectif de notre projet actuel est d'aboutir à une meilleure compréhension des processus neurobiologiques qui sous-tendent les mécanismes sous-jacents de la formation de mémoire altérée aux premiers stades de la maladie. Nous proposons d'explorer les altérations corticale en tant que marqueur précoce de l'oubli anormal dans la MA.
Bénéfices attendus
La diagnose précoce de la maladie d`Alzheimer est l'étape la plus importante dans l'identification : i) de l'altération cérébrale initiale et par conséquent ii) des thérapies possibles. L'oubli précoce pourrait représenter une cible pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'apparition de formes plus sévères de la MA. Notre projet vise à relier l'oubli précoce aux changements moléculaires responsables de l'altération de l'activité corticale en offrant une nouvelle voie pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent les interventions chirurgicales (< 40 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementale se compose de deux épreuves, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque épreuve dure 6 à 7 minutes). Ils reçoivent également des injections pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un ou deux brèves procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces procédures sont un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Les autres procédures expérimentales de ce projet comprennent des tests comportementaux : conditionnement par la peur (CdP) et procédure sans reveil. Le conditionnement par la peur peut être un événement stressant pour les souris. Afin de réduire le stress, nous gardons le groupe d'animaux en cage, ce qui leur permet d'exprimer leur comportement social naturel et nous permet de suivre le toilettage mutuel et la nidification des animaux après l'exécution de la tâche. Les projets précédents qui ont utilisé cette tâche comportementale ont montré que les animaux expriment leur comportement naturel dans les 15 minutes qui suivent la tâche, ce qui signifie que cette procédure n'entraîne pas une augmentation significative du niveau de stress. Le test est également effectué dans une pièce différente, avec des odeurs différentes de celles de la cage, afin de désactiver le lien entre la cage d'origine et l'événement redoutable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la mémoire dans le néocortex et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et par conséquent ne sont pas adaptés à l'objet de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : Selon les caractéristiques de nos données (normalité, variance, cohérences avec les critères de chaque test), nous appliquons les tests statistiques. Selon les caractéristiques de nos données certains tests supplémentaires seront effectués.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Manipulation quotidienne des animaux avant les expériences pour réduire le niveau de détresse. iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. vii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant la production d’amyloïde beta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Selon les données précédemment rapportées et les données sur le développement de la pathologie, nous les utilisons à l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave.
Evaluation par bioluminescence de l’efficacité combinée de la radiothérapie et du temozolomide sur un modèle de glioblastome opéré ( EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
85 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance déclarés modérés à sévères. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, 72 subissent une chirurgie d'exérèse partielle de la tumeur et 54 des séances de radiothérapie, pour reproduire le protocole appliqué aux patients atteints de glioblastome. Le porteur indique que la tumeur ne peut être contrôlée et atteint des points limites qui conduisent à la mise à mort de toutes les souris, et reconnaît une chirurgie classée sévère et le stress de l'hébergement individuel. Il affirme que la chirurgie ne peut pas être menée sur des modèles in vitro, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
Nos projets de recherche portent sur le développement et la validation de stratégies innovantes pour le traitement des glioblastomes, tumeurs cérébrales très agressives et de très mauvais pronostic. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner nos modèles , tant in vitro qu'in vivo afin qu'ils deviennent plus pertinents et plus représentatifs de la réalité clinique de cette pathologie. Nos modèles jusqu'à présent étaient limités car l'intervention chirurgicale pratiquée en première intention chez les patients n'était pas appliquée dans nos expérimentations. Nous sommes parvenus à mettre au point le modèle de glioblastome opéré chez la souris immunodéprimée porteuse d'une tumeur intracérébrale. Nous souhaitons donc maintenant appliquer à nos animaux, le traitement classiquement délivré aux patients (appelé "protocole de Stupp") qui combine chirurgie + radiothérapie + chimiothérapie : l'objectif est de caractériser les effets des traitements et de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la récidive tumorale.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'un modèle de glioblastome opéré dans nos expérimentation permettra de replacer nos recherches dans un contexte thérapeutique plus représentatif de la pratique clinique. En particulier, cette étude devrait nous aider à comprendre les mécanismes induits par la radiothérapie et la chimiotherapie, lorsque celles-ci sont administrées juste après une chirurgie, et déterminer comment les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement favorisent la rechute. Au final, ces données seront essentielles pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les phénomènes de récidives.
Procédures
Tous les animaux (85) recevront une injection de cellules tumorales dans le cerveau : l'injection est réalisée une fois au début de l'étude (durée 45min) et le suivi du développement de la tumeur intracérébrale se fait par imagerie de bioluminescence 2 à 3 fois par semaine (durée de chaque examen environ 15 min). Parmi les 85 animaux prévus, 72 animaux subiront une intervention chirurgicale permettant de retirer partiellement la tumeur qui s'est développée dans le cerveau : cette chirurgie d'exérèse est réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45min) et les animaux sont placés après l'opération en cage individuelle pendant 4 jous pour convalescence. Pour 54 animaux : traitement par radiothérapie (chaque irradiation dure environ 5 min ; 18 animaux recevront 1 irradiation ; 18 animaux recevront 2 irradiations espacées de 72h, 18 animaux recevront 5 irradiations à raison d'1/jour pendant 5 jours consécutifs)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine en phase péri-opératoire de l'exerèse) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux, qui se produiront de surcroit lors de la phase péri-opératoire. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire et l'augmentation du volume injecté est de l'ordre d'une dizaine de µL entre le début et la fin des expérimentations. La bioluminescence et la radiothérapie sont des protocoles rapides et nécessitent une anesthésie de 15 minutes maximum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de raffinement. Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exérèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux.
Devenir
Tous les animaux du projet développent une tumeur qui ne peut pas être contrôlée par les traitements appliqués : la tumeur finit par provoquer l'apparition de points limites qui expliquent la mise à mort à l'issue de chaque procédure (soit 85 souris au total)
Remplacement
Dans notre contexte, le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est clairement pas possible puisque nous tentons de modéliser chez l'animal l'impact de l'ablation chirurgicale des tumeurs dans le cas de tumeur cérébrale très agresssives et de très mauvais pronostic : la chirurgie ne peut pas être réalisée sur des modèles in vitro.
Réduction
Pour deux groupes d'études, nous avons réduit le nombre d'animaux car nous avons, lors une étude préliminaire, acquis des données qui pourront être compilées avec celles acquises dans ce nouveau projet. Afin de suivre la croissance tumorale, nous utiliserons une méthode d'imagerie permettant ainsi un suivi dans le temps de chaque animal. De plus, concernant les animaux qui recevront les différentes modalités de radiothérapie, les procédures se feront de façon séquentielle, palier par palier, de la procédure d'irradiation la moins contraignante à la procédure d'irradiation la plus contraignante pour les animaux. Seules les procédures bien tolérées seront conduites.
Raffinement
Un soin tout particulier sera apporté aux animaux notamment par un suivi post-opératoire rigoureux (désinfection de la plaie, analgésie, réhydratation par injection de glucose à 37°C...). Les souffrances de l'animal seront évaluées en appliquant une grille de score adaptée aboutissant à une prise de décision adéquate, en fonction de points limite et de crières d'arrêt préalablement définis et validés pour nos protocoles. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement garantiront les conditions de bien-être animal. Le transport des animaux se fera de façon à éviter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles souris et rats. Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de son accessibiltié et de sa facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines. Nous privilégions des souris femelles, plus dociles et moins agressives, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur crâne a une conformation très bien définie qui permet l'injection de cellules tumorales sans danger et sans difficulté.
Infection à Bacillus cereus sensu lato : nouvelles thérapies et réponses de l’hôte chez le nouveau-né dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de deux jours sont infectés par la bactérie Bacillus cereus puis traités par injection, et sont tués au bout de 48 heures avec les mères, susceptibles d'avoir été contaminées. Le porteur indique que l'infection provoque une baisse d'activité, une pâleur, puis le rejet par la mère et l'absence d'alimentation, la survie des animaux étant le critère suivi. Il affirme avoir déjà testé les composés in vitro mais conclut à la nécessité de vérifier l'effet dans un modèle d'infection vivant.
Objectifs
L’identification d’un nombre croissant de cas d’infections dues aux bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato, pathogène opportuniste (ne causant en général pas de maladie chez les personnes en bonne santé) présent dans l’environnement, représente un problème majeur en santé publique. Il s’agit de la 3ème cause d’intoxications alimentaires dans le monde (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments : EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA J, 2016), et de plus en plus de travaux font aussi état d’infections fatales chez le nouveau-né prématuré. Le traitement antibiotique de référence contre ces infections à Bacillus cereus consiste en une association vancomycin/aminoglycoside. Cependant, la recherche d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place serait un plus dans la prise en charge de ce type d’infections. Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l’EFSA et de l’ANSES (Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement et du Travail) sur les risques en santé publique, des bactéries du groupe Bacillus cereus et permettre la mise au point de nouveaux traitements contre ce type d’infection.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Bacillus cereus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection chez le nouveau-né prématuré, la découverte d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.
Procédures
Aucune intervention ne sera effectuée sur les femelles gestantes avant, pendant ou après mise bas. Les souriceaux de 2 jours seront infectés par voie intrapéritonéale, puis, une heure plus tard, traités par injection par voie intrapéritonéale. Le temps nécessaire à l'infection ou au traitement, par voie intrapéritonéale, n'excéde pas 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux liés à l'infection en général, à savoir principalement chez les souriceaux, baisse de l'activité, pâleur, pouvant aboutir au rejet par la mère et à l'absence d'alimentation, visualisée par l'absence de lait dans l'estomac. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées dans un précédent projet. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au bout des 48 heures de la procédure, les souriceaux ayant été infectés et/ou traités avec différents composés chimiques et les femelles gestantes après mise bas ayant pu être contaminées par les souriceaux infectés.
Remplacement
Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Bacillus cereus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats d'un précédent projet. Il pourra être réduit encore en fonction des résultats obtenus.
Raffinement
En termes de raffinement, afin de garantir le bien-être des souris, celles-ci seront hébergées dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Également, ce projet fait suite à un précédent projet au cours duquel les doses infectantes ont été déterminées. Après infection et après traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement (aux temps 2 heures post infection et 1, 2, 4, 6, 8, 24 et 48h post traitement) par les responsables du projet et par le personnel animalier, permettant de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection et pouvant être dus à une mauvaise injection. Le cas échéant, les animaux concernés seraient immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Ce modèle est celui que nous avons utilisé dans nos études précédentes dans un modèle de bactériémie à Escherichia coli chez la souris, dans un modèle murin de bactériémie induite au cours d'une pneumonie à Staphylococcus aureus et dans un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa. Plus précisément, ce modèle d'infection chez la souris C57Bl/6JRj nouveau-née est celui que nous avons utilisé par ailleurs dans l'étude de l'infection à Bacillus cereus chez le nouveau-né prématuré. Les animaux utilisés seront des souriceaux nouveau-nés de 2 jours, afin de coller au plus prés aux cas d'infections fatales observées en clinique chez le nouveau-né prématuré.
TTP de pharmacologie : Étude de l’intérêt d’une prémédication préalable à une anesthésie générale chez la souris
- Enseignement supérieur
305 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit deux injections dans l'abdomen, une prémédication puis un mélange anesthésique qui l'endort de cinq à quarante-cinq minutes, l'exercice étant répété une semaine plus tard, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants au maniement et à l'injection. Le porteur décrit comme seule nuisance le stress de la contention et une légère douleur au point d'injection. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet une formation technique appropriée sur l'animal vigile, et justifie l'usage de la souris par le programme pédagogique national.
Objectifs
Cette séance de travaux pratiques (TP) chez la souris est destinée à des étudiants dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. D’autre part, cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces travaux pratiques sont de plusieurs ordres : - D’un point de vue pharmacologique : mettre en évidence l’interaction entre un neuroleptique et un mélange anesthésique - D’un point de vue éthique (raffinement) : mettre en évidence l’importance d’utiliser une molécule en prémédication (ici le neuroleptique) avant de réaliser une anesthésie, sensibiliser les étudiants à cette notion ainsi qu’à l’utilisation de l’animal en expérimentation. - D’un point de vue expérimental chez l’animal : former les étudiants à la préhension / contention de la souris vigile et à la réalisation d’une injection intrapéritonéale (IP) chez la souris ; apprendre à observer le comportement des animaux traités avec le neuroleptique comparativement aux animaux témoins après administration de l’anesthésique ; savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre aux étudiants de notre formation à réaliser des expérimentations in vivo de pharmacologie. En effet, notre formation prépare à un diplôme, qui est réglementé au niveau national et dont le contenu des enseignements est défini selon un programme pédagogique national. Les étudiants doivent acquérir 5 compétences durant leur formation, et notamment la compétence « mener des études à l’échelle du vivant ». En deuxième année, la validation de cette compétence implique de savoir « expérimenter dans le cadre d'études pré-cliniques en évaluant l'effet de xénobiotiques en pharmacologie notamment sur animal de laboratoire ». Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants sont les suivants : - apprentissage de la manipulation des souris vigiles : pesée, identification, préhension, contention et injection intrapéritonéale - apprentissage du déroulé d’une étude en pharmacologie in vivo : constitution des lots d’animaux, identification des animaux, recueil de données et traçabilité, choix des paramètres à étudier afin de réaliser un suivi exhaustif des animaux, analyse et interprétation des résultats - mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale, notamment mise en évidence des règles de bien-être animal au cours du TP. L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect des règles de bien-être animal dans ce TP.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections intrapéritonéales séparées de 30 minutes : - Injection 1: prémédication avec un neuroleptique ou son véhicule (sérum physiologique) - Injection 2: mélange anesthésique. Chaque injection ne dure que quelques secondes. Le mélange anesthésique aux doses choisies induira la narcose chez environ 50% des individus du lot témoin et chez 100% des souris ayant reçu la prémédication. La narcose durera entre 5 et 45 min environ en fonction des animaux et des lots (les souris traitées avec le neuroleptique dormiront plus longtemps que les témoins). Ce protocole sera répété une deuxième fois dans les mêmes conditions une semaine après pour chaque souris.
Impact sur les animaux
La contention et la manipulation des souris entrainent du stress, les injections en intrapéritonéale engendrent une légère douleur au site d’injection.
Devenir
Chaque souris sera utilisée pour deux séances de TP espacées d'une semaine. Cette réutilisation des animaux pour deux TP a été validée par notre vétérinaire référent à la condition que les souris ne soient pas réutilisées après ces TP. Ainsi, à la fin des séances, les souris seront mises à mort.
Remplacement
Dans la formation de nos étudiants, le programme pédagogique national prévoit, en pharmacologie, l’évaluation in vivo des effets de molécules de référence par la mise en œuvre de protocoles expérimentaux. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants sur le plan technique (manipulation de l’animal vigile, administration des substances chez l’animal vigile…). De plus nous dispensons également au sein de l’établissement une formation à l’expérimentation animale niveau praticien et ce TP participe à cette formation.
Réduction
Pour chaque TP, 2 souris par étudiant seront uilisées. Chaque étudiant prendra en charge les traitements et le suivi d’un animal par lot expérimental pour évaluer les effets d’une prémédication sur la narcose induite par le mélange anesthésique. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés chaque souris participera à deux séances de TP espacées d’une semaine (12-14 étudiants par séance). De plus, afin de pouvoir analyser les résultats correctement sans augmenter le nombre d’animaux par séance les étudiants travailleront sur les données regroupées de toute la promotion, ce qui permettra de mettre en évidence les effets d'un neuroleptique sans augmenter le nombre d’animaux par étudiant. Il y a 52 étudiants maximum par promotion, répartis en 4 groupes de 13 étudiants en moyenne, 2 groupes auront le TP la semaine 1 et les 2 autres groupes la semaine 2. Deux souris seront nécessaires par étudiant lors d’un TP, chaque souris servant à deux séances de TP. Par an, deux souris serviront aux démonstrations (utilisées dans 2 séances de TP) et 5 souris supplémentaires seront prévues en cas de soucis d’intégration d’une souris dans le protocole. Ainsi (2*13*2)+4+5=61 souris par an et 305 souris sur 5 ans. Ce chiffre sera revu à la baisse si la promotion comprend moins d’étudiants. Afin de garantir une formation de qualité aux étudiants, il n’est pas possible de diminuer plus le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe socialement harmonieux en présence de deux éléments d’enrichissement (papier absorbant et une petite maison ou tunnel soit en polycarbonate soit en carton). Les point limites spécifiques du projet seront appliqués : tout animal présentant des signes de stress ou de maladie tels que : poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids telle qu'attendue à l'âge de ces animaux, ne sera pas inclus dans le TP et seront pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référent. Préalablement au TP, les animaux auront été manipulés régulièrement afin de diminuer leur stress lors de l’injection IP et une récompense (de type vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt, billes de céréales…) leur sera donnée afin d'augmenter leur familiarité. De même, une récompense leur sera donnée après chaque acte (pesée/marquage, puis après chaque IP). Afin de diminuer leur stress, la répartition des souris dans leur cage d’hébergement sera conservée à l’issue du TP. Les étudiants sont sensibilisés au bien-être des animaux lors de cours théoriques mais également en TP. Ainsi ils seront invités à parler doucement et à limiter les bruits afin de ne pas stresser les animaux. Chaque souris sera placée sur un tapis afin de la protéger du froid et sous une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie après injection des molécules. La prémedication peut prolonger la narcose induite par le mélange anesthésique sur une durée plus ou moins longue suivant les individus. Pour s’assurer que les souris soient réveillées lors de leur retour dans leur hébergement, les animaux recevant le neuroleptique seront traités avant les témoins.
Choix des espèces
La souris est une des principales espèces utilisées en recherche et notamment en pharmacologie. Il est donc nécessaire que nos étudiants soient formés à la manipulation et à l’observation de celle-ci. Les souris seront utilisées au stade adulte (environ 25 à 35 grammes) correspondant au stade d’utilisation classique de ces animaux lors des essais de pharmacologie précliniques.
Spécification et prolifération cellulaires dans la gonade embryonnaire de souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent une injection dans l'abdomen, parfois précédée de deux gavages destinés à inactiver des gènes, puis sont tuées quatre heures plus tard pour disséquer les embryons et prélever leurs gonades, elles aussi mises à mort. L'objectif est de comprendre les mécanismes de la différenciation sexuelle des gonades chez l'embryon, une recherche fondamentale. Le porteur affirme qu'aucune culture in vitro ne reproduit ce processus de développement et présente la souris comme un modèle "essentiel".
Objectifs
A l’heure où les différences entre les sexes sont reconnues comme des facteurs majeurs dans l’incidence ou l’évolution de nombreuses pathologies, il est surprenant que nous ayons une connaissance très partielle des bases moléculaires et cellulaires de la différenciation sexuelle. Chez l’homme (et la souris) l’appareil génital comprend différents organes, dont les gonades qui sont les organes producteurs des cellules sexuelles ou gamètes. Les spermatozoides sont produits par le testicule chez l’ homme et les ovocytes sont produits par les ovaires chez la femme. Selon le sexe de l’embryon, différents gènes sont activés et vont permettre aux gonades de se développer en testicules chez le futur petit garçon ou en ovaires chez la petite fille, ce qui va initier tout le développement sexuel de l’individu. Des défauts dans la formation des gonades aboutissent à des anomalies du développement sexuel avec des symptômes allant de l’absence de gonades à une inversion de sexe. Les signaux contrôlant la formation et la prolifération des différents types cellulaires qui composent les gonades embryonnaires, ovaires et testicules, demeurent largement inconnus. Cette connaissance est un prérequis pour élucider les mécanismes de développement des gonades et donc pour mieux comprendre l’origine des anomalies du développement sexuel. Notre objectif est de comprendre les mécanismes qui contrôlent la formation des lignages cellulaires du testicule et de l’ovaire embryonnaire. Nous analyserons des lignées de souris porteuses de mutations dans des gènes impliqués dans la différenciation gonadique pour déterminer le statut de différenciation et l’état de prolifération des populations cellulaires gonadiques. Au-delà des nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires de la différenciation sexuelle, nos travaux contribueront à clarifier l’étiologie de certaines anomalies du développement sexuel et à améliorer leur prise en charge.
Bénéfices attendus
A l’heure actuelle, on constate que la plupart des maladies a une incidence et une sévérité qui dépend du sexe de l’individu. Le gène responsable du développement masculin a été découvert il y a plus de 30 ans (gène Sry) mais on ne connait toujours pas à l’heure actuelle, les premières étapes du développement ovarien. Étant donné notre ignorance de ces mécanismes, les cliniciens ont des difficultés à aider les familles dans leur choix pour ou contre une gonadectomie de leur enfant atteint d’anomalies du développement sexuel. Les gonadectomies sont recommandées dans les cas où l’anomalie du développement sexuel s’accompagne d’un risque accru de développer des tumeurs gonadiques. Comprendre les mécanismes de différenciation sexuelle et les pathologies associées représentera une aide inestimable pour soutenir les familles dans leur décision.
Procédures
Des femelles gestantes seront injectées une seule fois dans la cavité abdominale avec un produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire puis mises à mort 4 heures après l’injection pour disséquer les embryons et analyser leurs gonades. Dans d’autres cas les femelles seront d’abord soumises à l’administration d’un produit par gavage oral (pour inactiver des gènes spécifiquement dans les gonades embryonnaires) à deux reprises à 24 heures d’intervalle puis à l’injection du produit qui permet de suivre la prolifération cellulaire avant d'être mises à mort 4 heures après l’injection pour disséquer les embryons et analyser leurs gonades. Aussi bien l’injection que le gavage oral sont réalisées en 20 à 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Les injections dans la cavité abdominale sont utilisées en routine au laboratoire. La nuisance possible est une douleur légère et brève au site d’injection. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage ont été déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. L'administration de produits par gavage a une durée totale de 20 à 30 secondes maximum. Dans de rares cas liés au manque d'expertise de l'expérimentateur, le gavage oral peut résulter en un étouffement dans les minutes suivant l'administration (2 minutes). Après une observation attentive de l'animal immédiatement après le gavage, tout signe de suffocation entraînera la mise à mort immédiate de l'animal par dislocation cervicale. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème.
Devenir
Toutes les femelles gestantes traitées seront mises à mort afin de prélever les embryons aux stades embryonnaires précoces nécessaires aux analyses. Tous les embryons prélevés seront mis à mort afin de procéder à la dissection de leurs gonades pour analyse.
Remplacement
La gonade est formée d’une diversité de cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour le déterminisme sexuel. De plus la différenciation des gonades est un processus très dynamique. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation des organes reproducteurs. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant fidèlement toutes les étapes complexes de ce processus de développement chez le mammifère est donc essentiel. Cependant si de nouvelles conditions de culture satisfaisantes sont développéess, nous les utiliserons dans la perspective de remplacer les souris par ces nouvelles technologies.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs nous avons besoin de 20 embryons par expérience (histologie et analyses quantitatives) et par génotype. Toutefois pour réduire le nombre de souris utilisées, nous analyserons les gonades par lots de trois réplicats pour l’histologie et cinq réplicats pour les analyses quantitatives. Si nous obtenons des résultats statistiquement significatifs, nous ne ferons pas les réplicats supplémentaires.
Raffinement
La qualité de la contention, l’usage d’un matériel autoclavable permettent d’assurer un gavage et une injection intra-péritonéale efficaces et rapides, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel a été formé pour cela. Les solutions à administrer sont maintenues à la température corporelle de 37°C pour éviter tout inconfort de la femelle. Ces mesures sont accompagnées de la mise en place d’un protocole d’observation permettant de déceler précocement tout inconfort des animaux durant les expériences et de proceder à la mise à mort en cas de comportement anormal. Les souris sont hébergées dans des cages contenant 2 à 3 congénères au total dans lesquelles sont placés systématiquement différents types d'enrichissements permettant à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière (igloo en papier mâché, carrés de ouate ou de tissu compressé), et de ronger (baguettes de papier mâché, morceau de bois, coton). Enfin, nous utilisons un sytéme raffiné qui permet la mutation du gène d’intérêt uniquement dans la gonade embryonnaire et uniquement après administration du produit par gavage oral.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons tous les outils à notre disposition et déjà au point pour pouvoir étudier la fonction des gènes d'intérêt dans les gonades de souris. Les femelles gestantes seront mises à mort à différents moments de la gestation couvrant tout le développement des gonades embryonnaires: jour 10.5 (début de la différenciation gonadique), jour 11.5 (détermination du sexe gonadique et début de la différenciation des lignages cellulaires en fonction du sexe), jour 12.5 (début de la formation du testicule et de la différenciation des cellules mâles productrices de testostérone), jour 13.5 (initiation de la division des ovocytes chez la femelle), jour 14.5 (différenciation gonadique établie), jour 17.5 (fin de la différenciation gonadique embryonnaire).
Prélèvements et injections sur des modèles AGA dans un contexte de génotypage, caractérisation moléculaire et phénotypage in-vivo dans un élevage.
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rats : 696
80 905 animaux non-humains, 80 209 souris et 696 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant surtout un niveau de souffrance léger, avec 10 102 cas modérés et 12 sévères. Ils subissent des biopsies de la queue, des injections et des prélèvements de sang pour génotyper et caractériser des lignées génétiquement modifiées, une partie étant tuée pour prélever des tissus ou faute de porter la modification recherchée. Le porteur indique que les animaux d'intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs, et que d'autres sont utilisés pour former le personnel. Il présente le recours à un organisme entier comme difficilement substituable et signale que la suppression de certains gènes provoque des phénotypes sévères, jusqu'à une mort précoce.
Objectifs
Réalisation de prélèvements et injections sur les animaux génétiquement modifiés dans le but de les caractériser, les valider et de réaliser leur production afin de livrer de slots expérimentaux aux aires thérapeutiques (Immuno-Oncologie, Immuno-Inflammation, Maladies Neurologiques Rares, Unité de médecine génétique). La validation du modèle consiste à vérifier la présence de la modification génétique et la caractérisation permet d'une part de vérifier qu’elle soit fonctionnelle puis d’autre part d’en mesurer l’impact sur la santé de l’animal. Ces techniques sont réalisées par du personnel formé et qualifié et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Avantages à court terme : valider, caractériser et vérifier la présence/absence de la modification génétique avant et pendant la production et l’utilisation des animaux présentant un intérêt pour les indications cliniques des aires thérapeutiques. Les unités de recherche ont au préalable déterminé en relation avec le département de biostatistiques le nombre d’animaux à utiliser pour atteindre leurs objectifs scientifiques. Avantages à long terme : les animaux génétiquement modifiés utilisés dans ce projet permettront l’avancée dans la compréhension de la physiopathologie de certaines maladies, améliorer le diagnostic et tester des molécules pour traiter les patients. Les connaissances scientifiques obtenues feront l’objet de publications dans un délai de 2 à 5 ans et le bénéfice sur les patients est attendu par le biais des études cliniques dans un délai de 5 à 10 ans.
Procédures
- Biopsie de queue : de 2mm maximum réalisée entre 10 et 21 jours d’âge - Injection unique ou répétée (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse - Administration de Doxycycline dans l’eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum (contrainte liée à l’inappétence du produit) - prélévement de sang sur 14 jours (suivi glycémique) via la veine submandibulaire (contrainte de courte durée). Pour avoir des naissances ou des embryons à une date/stade précis, des injections d’hormones sont réalisées (contention, injection).
Impact sur les animaux
Stress ou douleur légère de courte durée liée à la biopsie de queue .Stress ou douleur légère de courte durée liée aux injections unique ou répétées (maximum sur 5 jours) intra-péritonéale ou intraveineuse . Inconfort lié à l'inappétence du produit dans l'eau de boisson et/ou la nourriture pendant 5 semaines maximum -Stress ou douleur légère de courte durée liée au prélèvement sanguin. La suppression de la protéine A peut entrainer un phénotype dommageable dont la gravité pourra potentiellement aboutir à un phénotype sévère, tel qu’une encephalomyopathie incluant retard de croissance, léthargie, perte des fonctions motrices, ataxie à évolution progressive entrainant la mort à ~7 semaines d’âge. La suppression de la protéine B entraine un phénotype dommageable de gravité modérée se traduisant par un stress accru, une diminution de la fertilité, une mortalité avant sevrage de 10% .
Devenir
Les animaux d’intérêt sont maintenus en vie et expédiés aux chercheurs pour être intégrés dans des projets de recherche en utilisation continue. Par ailleurs, certains animaux seront euthanasiés soit pour permettre le prélèvement de tissus nécessaire à la caractérisation du modèle, soit parce qu’ils ne présentent pas la modification génétique d’intérêt, ou ayant atteint un point limite. Enfin, certains animaux seront réutilisés pour la formation du personnel manipulant des animaux.
Remplacement
La validation, la caractérisation et la production de rongeurs répondent aux besoins de certains projets scientifiques de disposer d'animaux homogènes en poids et en âge selon des critères génétiques définis et en nombre suffisant. Les modèles génétiquement modifiés permettent de reproduire le contexte physiologique d’un organisme entier, cette étape est difficilement substituable puisque seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche). Chaque fois que des méthodes in silico ou méthodes in vitro (cultures de cellules, organoïdes…) suffisent à couvrir les besoins des chercheurs celles-ci sont privilégiées sans recours ultérieur à l'animal.
Réduction
La caractérisation moléculaire et l’immunophénotypage visent à déterminer la viabilité du modèle selon la cible analysée. Ce phénotypage est réalisé en amont de l’élevage afin de réduire la production inutile d’animaux en cas d’obsolescence du modèle. Le nombre d’animaux produit est optimisé par les pratiques d’élevage et le relevé d’indicateurs de production propres à chaque souche. Les objectifs de production sont réévalués régulièrement (maximum tous les 6 mois) avec les utilisateurs, et ajustés chaque fois que nécessaire. Les demandes sont calculées sur la base des évaluations statistiques propres à chaque projet utilisateur, afin de limiter le nombre d’animaux produits aux stricts besoins des procédures en place dans chaque projet de recherche, selon les justifications statistiques de chaque test.
Raffinement
Les conditions d’utilisation des animaux sont conformes à toutes les législations en vigueur, encadrées par des procédures et mises en place sur la base des meilleurs standards internationaux. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, un enrichissement est placé dans les cages (cellulose de nidification, dômes en carton) et un enrichissement sonore est présent dans chaque pièce d’hébergement afin de couvrir les sons liés au travail zootechnique. L’observation des animaux est faite quotidiennement par du personnel formé et compétent. Le responsable de l’étude est informé de toute anomalie, de même que le vétérinaire désigné si des signes cliniques sont relevés. Chaque observation est consignée, permettant ainsi de suivre le bien-être de l’animal et d’ajuster au besoin les conditions environnementales. Dans le cas où la modification génétique altère le bien-être de l'animal nous mettons en place les mesures nécessaires pour y remédier (environnement, nourriture à disposition dans les cages, critères d’arrêt spécifiques) et une surveillance quotidienne des animaux par du personnel formé et compétent. Les biopsies sont réalisées à la queue et font au maximum 2mm sur des animauxde 10 à 21 jours( absence d'innervation et de ossification à cet âge) afin de limiter l'impact de ce geste. Cette intervention ne concerne que les animaux dont le schéma d’accouplement ne permet pas 100% d'animaux porteurs de la modification génétique d'interêt. Dans le cas contraire, seuls les géniteurs sont biopsiés afin de garantir le génotype de la descendance sans avoir recours à la biopsie. Une seconde biopsie est réalisée si et seulement si les résultats de génotypage ne sont pas concluants.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des modèles pharmacologiques de choix pour les études scientifiques. En effet, leur génome facilement modifiable et à 90% similaire à celui de l’homme permet d’utiliser ce modèle pour mimer les pathologies humaines afin d’en comprendre l’origine et de tester des molécules dans les phases préliminaires de recherche. De plus, sa rapidité de production et d’hébergement permettent de réaliser des modèles en un temps et un espace restreint. Les animaux commandés sont le plus souvent des adultes (jeunes ou matures), permettant de garantir la pleine expression physiologique des cibles thérapeutiques visées. Le génotypage est effectué sur des animaux âgés de 10 à 21 jours afin de sélectionner les animaux d’intérêts aux études et aux renouvellements de géniteurs. Le phénotypage est effectué généralement sur des animaux âgés de 3 à 10 semaines. Des animaux plus âgés peuvent être également phénotypés dans le cadre d’études de vieillissement. Les animaux sont expédiés généralement entre 5 et 8 semaines d’âge selon les besoins des chercheurs.
Effet cardioprotecteur de la clusterine dans l’ischémie/reperfusion myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
189 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 165 dans des procédures de gravité sévère et 24 opérées puis tuées sans reprise de conscience. Elles subissent une chirurgie d'infarctus par ligature d'une artère coronaire, avec des douleurs post-opératoires possibles pendant plusieurs jours, puis des injections et des prélèvements de sang répétés. Le projet teste l'effet protecteur de la clusterine après un infarctus, sur des souris génétiquement modifiées et leurs congénères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'ischémie-reperfusion et que seul un système intégré in vivo reproduit la pathologie.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'étudier l'effet protecteur de la clusterine au cours de l'infarctus. La clusterine est une molécule capable de neutraliser les signaux de danger libérés par les cellules mortes au cours de l'infarctus. Nous utiliserons pour cela un modèle de souris déficientes en clusterine et leurs congénères contrôles. Nous utiliserons un modèle d'infarctus chez la souris, nous permettant d'étudier l'effet de la clusterine sur la taille d'infarctus après 7 jours. Nous étudierons également la cinétique de libération dans le sang de la clusterine et des signaux de dangers qu'elle neutralise, les niveaux d'expression de clusterine et des marqueurs de l'inflammation dans le tissu cardiaque ainsi que le rôle protecteur de la clusterine in vitro sur des cellules isolées de coeur de souris.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde.. Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge précoce de l’infarctus du myocarde, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité aigue grace à la revascularisation, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer une insuffisance cardiaque dans le long terme. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la morbi-mortalité reste élevée (50 % de mortalité à 5 ans) et les traitements ne sont pas curatifs. A ce jour, le remodelage du myocarde après un infarctus constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Cela nécessite de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’altération de la fonction cardiaque post-infarctus à partir de modèles expérimentaux qui reproduisent les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent. Le but du présent projet est de démontrer que la clusterine pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse et originale pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'infarctus du myocarde par ligature coronaire. La durée totale de l’intervention est d'environ 60 min, dont 15 min entre l’intubation oro-trachéale et l’accès au coeur, 30 min de ligature coronaire et 15 min pour la fermeture du thorax. 3 injections iv (dans la veine caudale) de clusterine (avant la ligature coronaire, à J2 et à J3) et/ou 1 injection de molécules neutralisées par la clusterine (avant la ligature coronaire) seront réalisées. 4 prélèvements de sang seront réalisés (avant l’occlusion, à H4, H24 et J7).
Impact sur les animaux
Au cours de la procédure chirurgicale, les nuisances ou effets indésirables (qui seront surveillés) sont l’hypotension et le refroidissement corporel pouvant causer un stress modéré. Après la chirurgie thoracique (thoracotomie), d’éventuelles douleurs post-opératoires modérées pendant plusieurs jours au niveau des nerfs intercostaux pourront avoir une incidence sur le bien être des animaux. Ces douleurs pourront être réduites par injection d’analgésiques.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, les lesions d'ischémie-reperfusion myocardique mettent en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, neuro-humoraux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénal, central si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. Ainsi, le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude car actuellement, il n’existe pas de méthode alternative ni de modélisation possible pour l’ischémie-reperfusion myocardique. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux le rôle de protéines dans l'ischémie-reperfusion myocardique , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. Une analyse statistique des résultats sera ainsi réalisée. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris: prélèvement sanguin, histologie, expression génique et protéique.
Raffinement
Nous raffinerons cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l'état général). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique avant la chirurgie et d’analgésique à différents temps (avant la chirurgie, après la chirurgie et si l'animal montre des signes de douleurs). Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabannes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les souris sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle d’infarctus du myocarde chez la souris est parfaitement maitrisé au laboratoire et mime le développement de la pathologie humaine. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques nécessaires à l'évaluation de la cardioprotection. La souris est ainsi un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, une partie du projet utilisera des souris génétiquement modifiées (CLU). C'est le seul modèle animal disponible qui présente une déficience en CLU. Les souris génétiquement modifiées sont des outils précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permettent d'étudier des mécanismes cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris de 3-4 mois (jeunes adultes) pour réaliser les interventions chirurgicales de manière optimale chez des animaux matures et pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie-reperfusion liée au vieillissement.
MOTORHEAD
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la pose d'un implant sous anesthésie, elles subissent une restriction d'eau à un millilitre par jour et une contention tête fixée trente minutes par jour pendant environ trente jours, avant d'être tuées pour un contrôle du cerveau. Le projet étudie les bases cérébrales du choix entre exploration et exploitation, le porteur mettant surtout en avant la visibilité internationale attendue. Il affirme que ces mécanismes ne s'étudient que chez l'animal vigile en situation de choix, sans modèle in vitro possible.
Objectifs
La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à-dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un nœud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet vise donc à éclairer le rôle du M2 pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.
Bénéfices attendus
Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants. Ce champ de recherche est en effet devenu un domaine extrêmement compétitif au niveau international, et pourtant n'est que faiblement représenté en France. Ce projet améliorera significativement la visibilité internationale de la recherche académique française et placera le porteur en position de force pour réévaluer les rôles complexes des régions motrices et leur connexions aux régions corticales. Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux.
Procédures
1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1 d'implantation. Elle sera realisée une seule fois par souris, pour une durée maximale d'une heure. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs. Ces nuisances sont indispensables pour l’imagerie biphotonique et motiver les souris à la tâche expérimentale.
Devenir
A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.
Remplacement
L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.
Réduction
La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certains tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques pairés sur la base des données préliminaires déjà obtenues (moyenne et ecart-type) afin de satisfaire les conditions statistiques de puissance et de significativité (puissance (beta) de 0.8 et un seuil de significativité (alpha) de 0.05).
Raffinement
Les compétences techniques et expérimentales du porteur du projet sont reconnues internationalement, comme prouvé par la qualité élevée des financements obtenus faisant suite à une évaluation exhaustive du projet par de multiples comités d’expert scientifique du domaine scientifique, et garantissent la qualité des procédures expérimentales et de leur raffinement (habituation des animaux, optimisation du comportement et des techniques d’enregistrement, points limites, …). Le projet ne comprend pas de chirurgies. Cependant, la procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après la restriction hydrique. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux : 1) Déshydratation (persistance au test de pli) et/ou perte de poids supérieur à 25 % du poids mesuré au jour 1 avant restriction ; 2) Infection de l’implant (plaie purulente, rougeur, tuméfaction, abcès) ; 3) Qualité de l'implant (perte ou dégradation) ; 4) Neurologie (tremblements, ataxie marquée, tête penchée, crises convulsives). Ces points sont vérifiés deux fois par jour selon un tableau de suivi simplifié (absence/présence) permettant la mise en place de mesures rapides et ciblées (et d’arrêt si nécessaire) si ces points sont observés, respectivement : 1) arrêt immédiat de la restriction hydrique et sortie du protocole le temps nécessaire pour une prise de poids ; 2) analgésie générale (Buprenorphine) pendant 3 jours ; 3 et 4) euthanasie immédiate.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.
Cancer de la peau et environnement tumoral – traitement du mélanome par combinaison d’anticorps thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées pour la collecte de leurs tissus, 320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit sous anesthésie une injection de cellules de mélanome sous la peau, et certaines reçoivent un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines, en injections faites sans anesthésie. Selon le porteur, la tumeur peut s'ulcérer et les injections répétées dans l'abdomen causer une douleur. Il écrit que l'anticorps a déjà freiné en partie le mélanome chez des souris dépourvues de système immunitaire, qu'il a passé des tests de toxicité et vient d'entrer en essai clinique pour d'autres pathologies. Il affirme que l'approche, validée in vitro, appelle maintenant "une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l'humain".
Objectifs
Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du mélanome. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du mélanome dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer de la peau. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer de la peau de type mélanome est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses de mélanomes. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8-10 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement
Pharmacocinétique et étude de toxicité d’une prodrogue cytotoxique de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Ayant reçu sous anesthésie gazeuse une prodrogue de vinblastine sous la peau du dos, ou de la vinblastine dans la veine de la queue, des souris BALB/c sont ensuite tuées pour l'analyse de leurs organes ou de leur sang, certaines après une ponction cardiaque sous dose létale de pentobarbital. 108 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Il s'agit de fixer la dose maximale tolérée de la prodrogue, en testant jusqu'à quatre doses croissantes sur des groupes de quatre souris, soit la dose "la plus élevée qui produira l'effet souhaité sans entrainer d'effets indésirables inacceptables". Parmi les nuisances attendues, le porteur ne cite que le stress de l'anesthésie et des pesées et une gêne ou une inflammation au point d'injection, sans rien dire des effets des doses les plus fortes.
Objectifs
L’administration de médicaments anticancéreux par voie sous-cutanée est actuellement limitée par leur faible solubilité, leur viscosité et leur toxicité au niveau du site d’injection (irritations voire nécroses cutanées). Nous proposons dans ce projet une nouvelle approche permettant d’administrer efficacement par voie sous-cutanée des chimiothérapies anticancéreuses déjà présentes sur le marché. Nous avons en effet développé une technologie innovante qui consiste à coupler un agent de chimiothérapie existant, la Vinblastine, à une succession de molécules pour le rendre soluble et injectable par voie sous-cutané. L’objectif de cette étude est d’étudier la toxicité et la distribution dans l'organisme de cette prodrogue de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC), comparativement à la Vinblastine seule, administrée en intraveineuse (IV). L’étude de toxicité a pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT, dose la plus élevée qui produira l’effet souhaité sans entrainer d’effets indésirables inacceptables) par voie SC de la prodrogue de Vinblastine, et de vérifier qu’elle n’induit pas de toxicité au niveau du site d’injection. L’étude de pharmacocinétique permettra de vérifier qu’il est possible d’avoir une exposition au principe actif comparable à la voie intraveineuse, et donc une efficacité thérapeutique similaire.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de démontrer l’innocuité de la prodrogue polymère de Vinblastine administrée par voie sous-cutanée (SC) et de comparer son profil pharmacocinétique à celui de la Vinblastine libre administrée en intraveineuse (IV). De tels résultats permettraient d’envisager la délivrance des principes actifs anticancéreux par voie sous-cutanée, qui seraient à la fois efficace, confortable pour le patient et bien moins couteuse dans son utilisation que les chimiothérapies actuelles.
Procédures
Chaque souris recevra une seule injection de la prodrogue polymère par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%) dans la région dorsale préalablement rasée ou de la Vinblastine libre en intraveineuse sous anesthésie gazeuse (sévofluorane 3%). Cette intervention durera environ 10 minutes, anesthésie comprise. Certaines souris subiront également un prélèvement sanguin terminal effectué par ponction cardiaque après injection d’une dose léthale d'anesthésique de pentobarbital, un anesthésique puissant, et la mise à mort de l'animak sera confirmée par élongation cervicale. Cette intervention durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : - L'anesthésie par cage à induction qui pourrait entrainer un stress de l'animal avant endormissement. - Les injections de la vinblastine en intraveineuse dans la veine de la queue et de la prodrogue en sous-cutané, qui pourraient causer une gène ou une inflammation au niveau du site d'injection - Les pesées qui peuvent entrainer un stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de prélever les organes et la zone d'injection pour des études histologiques afin de vérifier l’absence de toxicité systémique et de toxicité locale aigue (procédire 1) ou pour effectuer des prélèvements sanguins terminaux (procédure 2).
Remplacement
Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisée ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang.
Réduction
Les études préliminaires in vitro ont permis le criblage de différentes formulations dont une seule sera testée in vivo, permettant ainsi une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans cette étude. Une planification statistique minutieuse permet aussi de réduire le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l’étude. La DMT de la prodrogue sera déterminée en testant des doses croissantes de prodrogue à partir de la dose équivalente à la DMT par voie IV de la molécule libre (connu dans la littérature) car la prodrogue polymère est censée avoir une DMT supérieure à celle de la molécule libre. Quatre doses seront testées au maximum, nous nous arrêterons avant si la DMT de la prodrogue est atteinte. Le dimensionnement des groupes a été déterminé par un test de puissance (erreur de 5% et puissance de 80%) qui permet de mettre en évidence une perte de poids de 10% avec une variabilité de 10% avec 4 animaux par groupe. La DMT du principe actif libre, bien décrite dans la littérature, ne sera testée qu’à deux doses maximum pour tenir compte de la variabilité inter-souche. Pour la pharmacocinétique de libération du principe actif, une seule dose sera testée pour déterminer quelle est la prodrogue qui permet une libération optimale du principe actif dans le sang. La prodrogue polymère et la molécule libre seront administrées à une dose équivalente permettant leur détection pendant 48 à 72 heures, afin de pouvoir comparer la cinétique de la molécule libre et de la prodrogue. Nous cherchons à mettre en évidence une augmentation du temps de présence de la molécule dans l'organisme. Le nombre d’animaux nécessaire (erreur 5%, puissance 90%) a été évalué à 4 animaux par groupe. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non-paramétrique.
Raffinement
Dans notre laboratoire, les animaux en provenance des centres d'élevage sont pris en charge dès leur arrivée (environ 8 jours avant le début de l'expérimentation), jusqu'à l'euthanasie. Le bien-être animal sera respecté : -Conditions d’hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d’un cycle jour/nuit inversé par période de 12 heures. -Temps d’acclimatation de 8 jours avant toute procédure -Souris hébergées en groupes (6 par cage) -Enrichissement des cages : dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques (Cell Nest) -Définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (difficultés respiratoires, prostration, atonie, défaut d’alimentation, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). La définition exacte des points limites se trouve dans une grille des scores de la douleur, qui évalue le bien-être animal sur chacun de ces points et décrit la conduite à tenir en fonction de l’état de l’animal (par exemple augmentation de la fréquence du suivi, utilisation d’analgésique…). De plus, toutes les procédures se feront sous anesthésie pour éviter toute forme de douleur.
Choix des espèces
Pour la réalisation de nos études, nous utiliserons des souris BALB/c. Les souris BALB/c sont un bon modèle car elles sont blanches et permettent de suivre plus facilement les apparitions de nécroses ou d’irritations au niveau cutané. Les premières études ayant été réalisées sur cette souche, cela nous permettra aussi de comparer les résultats. Nous utiliserons des souris jeunes adultes de 7-10 semaines qui ont un système immunitaire mature et des fonctions physiologiques bien établies.