Souris

2 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est greffée, puis elles reçoivent un anticorps couplé à un métal radioactif, avec imagerie nucléaire et hébergement individuel après l'injection, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour compter la radioactivité organe par organe. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales, une déplétion des cellules sanguines lors de la recherche de la dose radioactive maximale tolérée, ainsi qu'un "sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression" liés à l'isolement en cage. Il conclut que l'expérimentation animale est "requise", les données précliniques étant imposées par les autorités.

Objectifs

Malgré les efforts de la recherche et les nombreux traitements développés dans le cadre de la lutte contre le cancer, les cellules cancéreuses parviennent parfois à échapper aux thérapies de différentes façons. Afin de contourner ce problème, la mise au point de nouveaux outils ciblant des vulnérabilités tumorales clés couplés à la radioactivité est actuellement en plein essor. Cette technologie est appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV). Elle consiste à lier un métal radioactif à un anticorps spécifique d'une cible biologique fortement exprimée dans la tumeur afin que l'anticorps puisse diriger et concentrer le métal dans les cellules cancéreuses. En fonction du métal choisi, il sera alors possible d'effectuer la détection de la tumeur ou bien de traiter les cellules tumorales via des rayonnements fortement énergétiques. Il a été démontré que la protéine N est fortement exprimée dans de nombreux cancers. Un anticorps spécifique de cette protéine a donc été développé afin de bloquer sa liaison avec ses récepteurs dans la cellule et ainsi conduire à leur mort. Cet anticorps est actuellement en cours d'investigation dans le cadre d'un essai clinique chez l'Homme. Dans le but de mieux sélectionner les patients exprimant fortement la protéine N, cet anticorps a été modifié par couplage à un métal radioactif émetteur de particules lumineuses afin de détecter sa présence par imagerie nucléaire. Ce nouvel outil devrait permettre d'inclure les patients sur la haute expression de la cible afin de les traiter avec l'anticorps seul (non radioactif) et ainsi déclencher la mort des cellules tumorales. Par ailleurs, les mécanismes d'échappement de la cellule tumorale concernant la protéine N étant déjà décrits, l'efficacité de l'anticorps non radioactif est donc limitée. C'est pourquoi l'ajout de la radioactivité est alors nécessaire afin de détruire les cellules cibles. Ce projet se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs agréés (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les patients pris en charge en clinique ne sont généralement pas testés pour l'expression de la cible, limitant ainsi les chances de réponse aux traitements. Dans ce présent projet, il est proposé de valider l'utilisation d'un test compagnon basé sur l'imagerie chez différents modèles tumoraux hautement représentatifs de la pathologie humaine afin de n'inclure que des patients exprimant un fort taux de la cible et d'augmenter l'effet anti tumoral des thérapies ciblées. Le but final est de réaliser une phase I clinique chez l'Homme à la fin de l'étude.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Interventions chirurgicales : greffe de tissu tumoral humain (1 ou 2 par animal en fonction de la greffe unilatérale ou bilatérale, durée : 5 minutes maximum). -Injection de produit en intraveineuse dans la veine caudale : 2 injections chez les souris incluses lors des expérimentations d'imagerie et de traitement. -Injection de produit en sous-cutanée : 2 injections prévues au moment de la greffe (peropératoire et post-opératoire). Des injections supplémentaires de produit analgésiant pourront être réalisées en cas de nécessité seulement et selon les conditions définies dans chacune des manipulations expérimentales. -Anesthésie gazeuse à l'isoflurane réalisée lors de la greffe, lors de chaque injection ou au moment de la mise à mort. -Imagerie Nucléaire : imagerie SPECT/CT dans les procédures d'imagerie. -Mesures du poids ainsi que du volume tumoral dans toutes les procédures (deux fois par semaine). La greffe de tissu tumoral humain sera réalisée dans l'EU1 tandis que tous les autres actes (injections de produit non radioactif, radioactif, imagerie nucléaire) seront effectués dans l'EU2. Les anesthésies gazeuses ainsi que les merures de poids et de volume tumoral pourront être effectuées dans les deux établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, plusieurs nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus et cités ci-dessous : -douleurs générées post-intervention chirurgicale (incision réalisée sur la peau pour la mise en place du greffon), lors de la prise du greffon, lors de l'injection ou de l'application de produit d'analgésie ou d'antiseptsie, lors de l'injection des anticorps. -fatigue provoquée par la déplétion légère à modérée de cellules sanguines dans les jours suivants l'injection de l'anticorps radioactif, notamment lors de la détermination de la dose radioactive maximale tolérée par l'animal préalable à l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de notre composé. -stress généré par les contentions lors des pesées, lors des mesures de la taille de la tumeur à l'aide du pied à coulisse ou encore lors de l'anesthésie générale effectuée pour la greffe, les injections ou avant la mise à mort de l'animal. -sentiment d'isolement et absence de liberté d'expression causés par l'hébergement individuel des animaux à partir de l'injection radioactive lors des expérimentations d'imagerie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l'issue de l'ensemble des manipulations expérimentales qui constituent le présent projet. Cette méthode se justifie par la présence d'une greffe de tissu tumoral humain sur chacun des animaux ainsi que la réalisation d'une injection radioactive sur chaque souris inclue dans les expérimentations d'imagerie ou de thérapie. Les organes ainsi que le cadavre devront également être récupérés à la fin des procédures d'imagerie pour permettre un comptage de la radioactivité organe par organe. Un suivi de la courbe d'atteinte de points limites sera également nécessaire lors des études de l'efficicacité thérapeutique.

Remplacement

Les expérimentations in vitro sur cellules permettent de réaliser beaucoup d'études de mise au point de nouveaux traitements. Cependant, elles n'offrent pas la possibilité de prédire l'influence de l'environnement tumoral, l'éventuelle toxicité de la molécule sur l'organisme ou encore le devenir du candidat médicament après administration. Un remplacement par une approche entièrement réalisée sans animaux vivants n'est donc pas envisageable car il serait alors impossible d'évaluer l'ensemble de ces paramètres. De plus, l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments. L'expérimentation animale est donc requise pour le présent projet.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum. Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de la greffe est réduit au minimum tout en prenant en compte le taux de reprise des modèles de tumeurs humaines lors de la décongélation. Lors de l'étape d'amplification du modèle tumoral humain, une greffe bilatérale sera effectuée sur les animaux afin de réduire leur effectif. Pour la détermination de l'efficacité thérapeutique de la molécule, les effectifs des animaux ont été calculés à partir d'un logiciel afin de tenir compte des analyses statistiques appliquées aux résultats expérimentaux. Les effectifs des animaux des autres procédures ne reposent sur aucune considération statistique mais seulement sur la prise en compte de la variabilité biologique possible entre les souris. Les expériences de ce présent projet ne seront pas répétées et chaque étape devra montrer de bons résultats avant le passage à l’étape suivante afin de limiter le nombre d'animaux strictement nécessaire.

Raffinement

Méthode utilisée pour réduire la douleur : -Anesthésie générale gazeuse. 1 anesthésie/animal lors de la greffe (5min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque injection sous la peau ou dans la veine de la queue (5 min). 1 anesthésie/ animal lors de chaque acquisition d'imagerie nucléaire (45min) et 1 anesthésie lors de la mise à mort de l'animal. -Analgésie mise en place en cas de douleur chez l'animal, possibilité de renouvellement toutes les 24h. -Antisepsie : application cutanée en cas de blessure observée en zone d'hébergement ou en amont de l'incision de la peau lors de la greffe. Raffinement des conditions d'hébergement : afin d'atténuer l'effet de l'isolement causé par l'hébergement individuel suite à l'injection de la molécule d'imagerie, les cages seront obligatoirement transparentes et mises côte à côte dans le but de permettre un contact visuel des animaux et en enrichissement de la cage (jouet) sera ajouté.

Choix des espèces

Le taux de réussite du développement des modèles tumoraux établis à partir du tissu cancéreux de patients (PDX) est fortement lié au type de souris utilisé pour implanter le tissu tumoral. Les souris immunodéprimées sont couramment utilisées pour développer des modèles de PDX car celles-ci se caractérisent par l'absence de thymus, ce qui se traduit par un nombre considérablement réduit de cellules immunitaires fonctionnelles afin d'éviter que leur système immunitaire empêche le développement des cellules cancéreuses. Ces animaux présentent le meilleur taux de réussite pour la prise tumorale de tissu humain et seront donc utilisés dans ce projet. Les animaux ont entre 6 et 8 semaines lorsqu'ils sont inclus dans chacune des procédures car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de mélanome humain leur sont greffées sous anesthésie, chaque souris recevant une greffe sur les deux flancs, puis la tumeur est mesurée deux fois par semaine jusqu'à la mise à mort et le prélèvement. Le porteur reconnaît que les souris développeront une pathologie tumorale potentiellement grave, mais qualifie le suivi de non invasif. Il présente le passage à l'animal comme une "étape indispensable" après des travaux in vitro, seul un organisme entier permettant selon lui de conclure sur la fonction des gènes étudiés.

Objectifs

Le mélanome est le cancer de la peau le moins fréquent mais le plus agressif qui ne cesse d’augmenter depuis ces dernières années. Il est dû à une transformation et à une croissance anormale des cellules de la peau. Malgré l’apparition de nouveaux traitements augmentant de façon significative la survie chez certains patients, en particulier les thérapies ciblées et les immunothérapies, ces cancers demeurent un défi majeur pour la recherche du fait de l’apparition de résistances suite à ces traitements. C’est pour cela qu’un retour aux questions fondamentales concernant la compréhension du développement de la maladie est nécessaire en vue d’envisager d’autres angles d’attaque thérapeutiques. Nos études préalables in vitro sur des modèles simplifiés de cellules en culture montrent que la protéine, que nous étudions dans notre laboratoire, a un rôle de suppresseur de tumeur dans les mélanocytes et que son expression empêche ainsi la transformation tumorale. De plus, nous avons identifié l’interacteur principal de cette protéine, qui est nécessaire à sa fonction suppresseur de tumeur. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur. L’objectif de notre projet est donc de valider l’implication de ces protéines au niveau de la transformation tumorale dans le contexte d’un organisme entier, avec toute la complexité inhérente des interactions cellulaires et moléculaires des organismes. De façon plus globale, cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les processus cellulaires mis en place dans le mélanome. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode satisfaisante qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale.

Bénéfices attendus

La transformation cellulaire est un phénomène complexe. Elle fait appel à des processus cellulaires autonomes et non cellulaires autonomes, c’est-à-dire qui impliquent des interactions avec l’environnement cellulaire proche et distal, ainsi que des interactions complexes avec les cellules immunitaires. Dans ces conditions, seules des expériences réalisées dans un organisme auront une relevance pour conclure sur la fonction in vivo des gènes/protéines étudiées. De façon plus globale, cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les processus cellulaires mis en place dans le mélanome.

Procédures

Une transplantation de cellules cancéreuses nécessitant une anesthésie (15 minutes/souris) sera réalisée une fois au début de l’expérimentation. Les mesures du volume de la tumeur et les pesées (5 minutes/souris) seront effectuées 2 fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie sans geste invasif. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien pour estimer au mieux leur état physiologique global. Ce suivi prendra maximum 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les souris transplantées avec des cellules cancéreuses développeront une pathologie tumorale potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux à l'issue de la procédure seront euthanasiés. Après la mise à mort des souris, les tumeurs seront prélevées et pesées. Une partie sera analysée pour mieux cerner les acteurs impliqués dans la tumeur grâce à des expériences de biologie moléculaire et de biochimie et une autre partie sera mise en présence d’un fixateur pour faire des coupes dans le tissu tumoral et réaliser des analyses immuno-histochimiques : différents marquages pour étudier la prolifération, la mort cellulaire et la différenciation mélanocytaire.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité des études que nous avons réalisées in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable pour reproduire d’un point de vue phénoménologique tout ce qu’implique le développement tumoral. Seules des expériences réalisées dans un organisme auront une relevance pour conclure sur la fonction in vivo des gènes/protéines étudiées. Nous choisirons des modèles chez la souris, simples et exhaustivement décrits dans la littérature.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux génétiquement modifiés issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés. Le sexe sera choisi en fonction du nombre d'animaux nécessaires et disponibles par cohorte. De plus, lorsque cela est possible, la mutualisation de groupes contrôles sera réalisé. Pour minimiser le nombre d’animaux et pour diminuer la variabilité inter-individu, chaque souris subira une transplantation bilatérale (sur chacun des flancs) de cellules tumorales, le nombre d’animaux étant limité au minimum nécessaire pour permettre de fournir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). De plus, ils seront hébergés en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton pour nidification), et maintien des animaux en groupes de 3-5 afin de respecter leur instinct grégaire. De même, les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. Les greffes de cellules seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le suivi du développement tumoral se fera au cours du temps de manière non invasive à l’aide d’un pied à coulisse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Dès l’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance, nous choisirons l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d’un individu d’une espèce donnée chez un individu hôte d’une espèce différente. Ainsi, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise de greffe de cellules tumorales humaines et éviter la réaction de l’hôte vis-à-vis du greffon. Dans ce contexte, les lignées de souris immunodéprimées sont les modèles les plus couramment utilisés et très bien documentés dans la littérature dans le cadre d’études réalisées à partir de xénogreffes de cellules tumorales humaines. . Concernant les stades de développement, nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

15 600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau sous anesthésie, puis ils reçoivent des traitements pouvant aller jusqu'à deux administrations par jour pendant plusieurs semaines, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine jusqu'à un diamètre de 20 mm chez la souris et 40 mm chez le rat. Ce dispositif sert au criblage in vivo de molécules anticancéreuses candidates, sur l'un des effectifs les plus élevés du lot. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit ces procédures et qualifie le recours à un "organisme entier" d'"indispensable".

Objectifs

Le cancer affecte des millions de personnes chaque année. Cette pathologie a donc des impacts sociaux et économiques majeurs sur les patients et le système de santé. Les thérapies actuellement disponibles pour traiter le cancer ont une efficacité limitée pour certaines indications comme le cancer du pancréas ou le cancer du poumon et les effets secondaires des traitements limitent considérablement leur utilisation. Il y a donc un besoin urgent de trouver des molécules efficaces nouvelles ou en repositionnement ayant un effet anti-cancéreux démontré. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte du cancer avec la mise en place de modèles avec greffe de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de nouvelles molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement de nouveaux médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes. Ce projet a déjà été déposé en 2018.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur la croissance tumorale. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments anticancer sur différents types de tumeurs dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pendant 3 minutes afin d’injecter, en sous-cutanée, les cellules cancéreuses (excepté le groupe 1 qui reçoit du PBS) au niveau du flan. Au cours de l’expérience, les animaux recevront des traitements (véhicule, molécule à tester ou molécule de référence). La voie d’administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, par voie orale ou par voie sous-cutanée, sur animaux vigile. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée Cela pourra être une à sept fois par semaine, jusqu’à 2 fois par jour pendant plusieurs semaines. Sur animal vigile pris en contention, la taille des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse jusqu’à la fin de l’étude. La technique non invasive du laser doppler pourra être utilisée une fois par semaine pour une vingtaine de minutes par animal, après une anesthésie par isoflurane. Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.

Impact sur les animaux

Du fait de l’implantation de cellules cancéreuses, l’animal va développer une tumeur solide en sous-cutanée qui va grossir au cours du temps. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

Euthanasie pour récupérer les tumeurs et différents organes pour analyses

Remplacement

Ce projet se focalise sur un modèle intégré d’étude du développement tumoral et/ou de l’angiogenèse (mesure du flux sanguin intra-tumoral) nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier permettant la formation de la tumeur. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant ces procédures expérimentales. Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour pouvoir tester l’effet du traitement sur la croissance tumorale dans un contexte physiologique.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique. Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des lignées cancéreuses qui auront répondu au traitement lors d’études in vitro préliminaires afin de limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

La procédure d’implantation en sous-cutanée des cellules cancéreuses se fera sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et que la tumeur soit placée à un endroit qui ne gêne pas l’animal. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude. Ainsi, les animaux seront surveillés au moins une fois par semaine puis au moins deux fois par semaine une fois que les tumeurs seront palpables. Une surveillance plus fréquente peut être nécessaire lorsqu'une croissance tumorale rapide est attendue, lorsque les tumeurs approchent du point final ou si l'état de l'animal commence à se détériorer. De nombreux paramètres seront enregistrés, au niveau physique et comportemental. Les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse (dyspnée, convulsions, plégie…) seront mis à mort immédiatement. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : une perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau/anorexie prolongée, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou ulcération de la peau etc. De plus, la taille de la tumeur sera mesurée 2 fois par semaine et est limitée un diamètre maximal de 20 mm pour la souris adulte et de 40 mm pour le rat adulte, sous réserve d’euthanasier pour raison éthique. L’état et l’emplacement de la tumeur seront également inspectés régulièrement pour déceler par exemple la présence de nécrose ou ulcération importante au sein de celle-ci ou si la tumeur est mal placée pouvant gêner les mouvements de l’animal. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés (voir annexe 2). Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >7 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques. Lors des prélèvement de sang terminaux, une analgésie de l’animal sera effectuée (buprénorphine ou lidocaïne respectivement pour un prélèvement intra-cardiaque ou rétro-orbital).

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, du fait de leurs tailles et leurs spécificités, ils permettent l’étude et le suivi du développement tumoral d’un point de vue morphologique, histologique et moléculaire. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études en cancérologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches pourront être utilisées en fonction des espèces (voir tableau récapitulatif en annexe 1). Un animal immunodéficient (comme la souris ou le rat Nude ou la souris SCID) sont classiquement utilisés pour ce type d’étude, ce qui permet l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Il s’agit d’un modèle non dommageable à l’état basal. Si les cellules greffées sont d’origine murine, des animaux immunocompétents seront utilisés. Ce sont des modèles de laboratoire bien connus avec suffisamment de données historiques. Ces projets permettront le suivi de l’impact de traitement sur le développement tumoral de cellules greffées. Les animaux seront âgés de 5 à 8 semaines au moment de l’injection des cellules tumorales, à un stade de jeune adulte où le pouvoir prolifératif des cellules reste important sans avoir à toucher au développement normal de l’animal.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour y injecter des virus, d'autres un jeûne de 24 heures, des injections répétées et un régime gras destiné à les rendre obèses, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la prise alimentaire. Le porteur décrit la découverte récente d'un gène jusque-là inconnu et renvoie les applications contre l'obésité et le diabète à un horizon lointain. Il affirme avoir déjà validé son approche in vitro mais conclut au "besoin" de la souris, seule à réunir les organes en jeu dans la régulation énergétique.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Nous avons récemment mis en évidence une fonction inattendue d’une protéine dans la régulation de l’appétit. Nos données mettent en évidence le rôle d’un variant génétique associé au diabète de type 2. Toutefois le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette découverte reste incomplet. Nous avons récemment identifié un nouveau gène jusqu’alors inconnu qui pourrait contribuer à la régulation de l’appétit chez la souris. Nos données préliminaires confirment que cette nouvelle cible pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant l'obésité. Par conséquent, ce projet vise à comprendre comment cette protéine est impliquée dans l’homéostasie énergétique.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une nouvelle protéine clé dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Nous avons déjà montré le rôle spécifique de cette voie de signalisation dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'avait jamais été mise en avant jusqu’à présent. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage le mécanisme moléculaire impliqué dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine jusqu'alors inconnue est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.

Procédures

320 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Les 320 animaux (+160 pas de stéréotaxie) seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 2 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou shRNA. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim). Une habituation des animaux sera nécessaire. Pour ce faire, une injection IP de NaCl 0.9% sera réalisée quotidiennement pendant 3 jours. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mis en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les chirurgies stéréotaxiques potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Pour l'étude du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées. Les chirurgies stéréotaxiques pour l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgés de 18 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-nasales répétées, jusqu'à 44 par animal sur cinq mois, puis passent des tests de locomotion, de mémoire de reconnaissance et de localisation d'objets et de mémoire spatiale, pour mesurer si un dérivé de plastique, le DEHP, aggrave une maladie du cerveau. Le porteur qualifie l'inconfort de bref, limité au stress de la contention, tout en admettant que les animaux pourraient présenter des signes de détresse en cas de forte toxicité. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et présente la souris comme un "outil unique" pour cette étude.

Objectifs

Les molécules comme le DEHP (phtalate) sont des produits chimiques synthétiques largement utilisés dans de nombreux produits plastiques de consommation courante. Ils ne sont pas chimiquement liés aux polymères plastiques et sont facilement libérés dans l'environnement. Des études récentes rapportent pour la première fois une contribution potentielle du DEHP à une maladie du cerveau chez l’Homme (la maladie à corps de Lewy). L’objectif de ce projet est de déterminer si les dérivés de plastiques (comme le DEHP) représentent un facteur de risque d’une maladie du cerveau, en tant que polluants environnementaux. Cette maladie est modélisée chez le rongeur (souris), et ce projet vise à tester l’effet du DEHP sur le comportement des animaux et d’étudier les mécanismes mis en jeu. Nous avons choisi le mode d'administration intra-nasal car nous pensons que l'entrée par la voie respiratoire imitera mieux l'influence environnementale de la toxicité du DEHP chez les humains. De plus, il a été démontré que ce mode d'administration permet d'obtenir une délivrance rapide et concentrée au cerveau. Une étude pilote visera tout d’abord à définir la dose de phtalate qui sera administrée aux souris saines ou modèles de la maladie, permettant la détection cérébrale de ces produits (et dérivés) dans le cerveau après injection. Un phénotypage comportemental et un phénotypage moléculaire et cellulaire seront ensuite réalisés suite à l’administration chronique de DEHP. Les objectifs sont de comprendre si le DEHP aggrave la maladie en touchant des paramètres impliqués dans la progression de la pathologie, ainsi que les fonctions de mémoire.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux de pathologies humaines, cette étude permettra de mettre en évidence si l’administration d’une molécule dérivée de plastique présent dans de nombreux produits usuels, le DEHP, représente un facteur de risque dans une maladie du cerveau (maladie à Corps de Lewy). De plus, nos études montreront également si cette molécule affecte le cerveau de l’animal sain. La mise en évidence d’un lien de cause à effet permettra de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles permettront d’adapter de nouvelles thérapeutiques chez l’Homme. En apportant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet toxique de ces molécules sur le cerveau. Ainsi, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes pour la mise en garde contre certaines toxicités environnementales. Elles permettront de mettre en place des politiques de prévention. Enfin, ce projet comprend les analyses sur les souris mâles et femelles. Le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets différents sur les deux sexes, avec notamment une baisse de la testostérone chez le mâle. En apportant une analyse complète des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes spécifiquement liés au sexe, dans la toxicité cérébrale de DEHP, mais aussi dans les facteurs de risque de la maladie.

Procédures

72 souris vigiles adultes (6 mois) recevront des injections (5 secondes) à raison de 1X/jour pendant 6 jours. 216 animaux vigiles recevront des injections (5 secondes) à raison de 2X/semaine pendant 5 mois (22 semaines), soient 44 injections par animal. Comportement réalisé sur 72 animaux vigiles sur une période de 41 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester leur locomotion (2 nuits et 3 jours), leur mémoire de reconnaissance et de localisation d’objets (15 minutes par essais, 2 essais/jours, 5 jours) et enfin test de mémoire spatiale à long terme (1 minute/essai, 4 essais/jours, 6 jours) suivis d’1 test après 24h (1 minute/animal) et 21 jours (1 minute/animal). Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 12 mois.

Impact sur les animaux

Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger liées au stress de la contention des souris au moment de l’administration de molécule. L’inconfort ne durera que très peu de temps, juste pendant et après l’injection. Selon notre hypothèse que le DEHP représente un facteur de risque de la MCL, nous attendons une aggravation de la pathologie. Les animaux pourraient présenter des signes de détresse si une forte toxicité du DEHP devait se répercuter au niveau systémique. Cependant, la littérature ne documente pas ce type d’effet aux doses testées dans ce projet chez des souris adultes..

Devenir

Tous les animaux (288) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un traitement pharmacologique, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 18 souris/groupe (9 mâles et 9 femelles) pour le comportement et 12 souris/groupe (soit 6 mâles et 6 femelles) pour les approches moléculaires et 24 souris/groupe (soit 12 mâles et 12 femelles) pour l’imagerie cérébrale. L’efficacité de chaque traitement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux, sauf pour la durée des tests de comportement où ils seront isolés (1/cage). Dans ce cas, plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Les souris seront manipulées à l’aide de tubes spécifiques pour réduire le stress lors des changes (permet de nettoyer les cages sans toucher la souris). Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après l’administration de molécule DEHP: la surveillance des souris se fait à chaque instillation, soit 2X par semaine (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et elles sont pesées avant chaque administration de molécule, permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors de l’administration des molécules. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront utilisés à l'âge de 7 mois au début du projet et seront analysés à l'âge adulte de 12 mois, ce qui correspond environ à la moitié de la vie d’une souris en laboratoire. Nos études antérieures ont montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ces modèles. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse, reçoivent des cellules tumorales ou un agent favorisant les tumeurs suivi d'un irritant de l'intestin dans l'eau de boisson, la croissance des tumeurs étant mesurée jusqu'à la fin. L'objet est de comprendre l'épuisement des défenses immunitaires face au cancer, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro, ce qui l'oblige à recourir aux souris.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.