Souris
Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une partie des souris porte un gène de l'autophagie invalidé, et des souriceaux reçoivent dans leurs deux premières semaines de vie, sous anesthésie et séparés de leur mère, des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires. 1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 60 sans réveil et 1 080 en souffrance modérée. Le protocole comprend des tests de comportement : vocalisations ultrasoniques enregistrées pendant une séparation d'avec la mère puis en interaction sociale, actimétrie, nidification, et, avant le test social de trois mois, trois semaines d'isolement "afin de stimuler les comportements d'interactions". Une chirurgie sans réveil, suivie de la mise à mort, termine le protocole pour prélever les tissus. Le porteur annonce à court terme une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie, et renvoie à "plus long terme" des tests de molécules contre des troubles du neurodéveloppement.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Un lot de 60 animaux sera soumis uniquement à une procédure sans réveil.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1140 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Notre étude a pour but l’analyse des atteintes comportementales induites par une déficience de l’autophagie combinée à une exposition environnementale précoce (composés pro-inflammatoires). Ces explorations fonctionnelles ne peuvent être réalisées à l’échelle cellulaire et nécessitent une évaluation sur l’individu. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle animal, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1140 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent + ou – 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification et d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 56 dans des procédures classées sévères. Ces souris hémophiles reçoivent deux ponctions du genou provoquant des saignements articulaires, des injections, une IRM du genou de deux heures sous anesthésie, puis une exsanguination par la veine cave incompatible avec la survie. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'une gêne locomotrice et écrit n'attendre aucun autre effet secondaire ou douleur, alors que la moitié des procédures sont classées sévères. Il indique mettre au point les techniques in vitro au maximum avant d'utiliser les souris, tout en conservant ce modèle qu'il juge éprouvé et fiable.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car l’exsanguination par la veine cave n’est pas compatible avec la survie de l’animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Contrôle neural de la réponse autoimmune dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'ablation du nerf vague, d'ablation ou de dénervation de la rate, puis, après trois semaines, des injections déclenchant une inflammation auto-immune de l'œil, suivie d'une imagerie quotidienne du fond d'œil sous anesthésie. Le porteur indique attendre une douleur post-opératoire et une inflammation oculaire réversible en 24 à 48 heures. Il affirme que ces mécanismes auto-immuns impliquent une interaction complexe de types cellulaires qui ne peut être étudiée qu'au sein d'un organisme entier.
Objectifs
Les maladies auto-immunes sont liées à l’activation du système immunitaire. De récentes avancées en neurosciences et en immunologie ont révélé que les réflexes neuronaux régulent le système immunitaire. L'activation du nerf vague atténue les maladies auto-immunes. Notre projet vise à étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la réponse autoimmune par le système nerveux via le nerf vague, en particulier dans l’uvéite une pathologie inflammatoire intraocculaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre le rôle du système nerveux dans le contrôle de la réponse autoimmune et permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme pour réguler l’inflammation en particulier dans l’œil.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie une seule fois : vagotomie (ablation du nerf vague) ou splénectomie (ablation de la rate) ou dénervation de la rate ou contrôle. Chacune des interventions dure 15 à 20 minutes par animal. Les animaux recevront des injections d’anesthésique et d’analgésie en pré et post opératoire. Après 3 semaines de récupération, les souris recevront sous anesthésie 1 fois 3 injections sous-cutanées pour induire une uvéite autoimmune expérimentale (EAU) (inflammation dans l’œil) active ou bien une injection intraveineuse de lymphocytes T pour induire une EAU passive. Chaque injection se fait sous anesthésie en moins d’une minute. La rétine sera évaluée par imagerie du fond d’œil tous les jours pendant 1 à 2 semaines et par Tomographie à Cohérence Optique 1 ou 2 fois par animal (actes non invasifs mais sous anesthésie volatile pour éviter tout mouvement de l’animal, durant environ 5 minute par animal). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de parcours.
Impact sur les animaux
Pour les chirurgies : -Risque de mauvaise réaction à l’anesthésie (stress physique) -Stress thermique lié à l’anesthésie -Problème post-opératoire : lésion comme réouverture de la plaie (rare) et saignement (rare) -Douleur Pour les injections intraoculaires : -Risque d’inflammation localisée de l’œil réversible au bout de 24 à 48h après injection
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes autoimmuns qui impliquent une interaction complexe de nombreux types cellulaires ne pouvant être étudiée qu’au sein d’un organisme entier car ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus. Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.
Réduction
Nous prévoyons 1500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux en provenance de l’extérieur auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Pour les expériences d’EAU (uvéite autoimmune expérimentale), des anesthésies gazeuses par inhalation seront établies pour chaque acte. La respiration de la souris sera surveillée et en cas de début de détresse respiratoire, le pourcentage d’anesthésique sera largement diminué jusqu’à la reprise d’une respiration normale. Il sera ensuite ajusté afin de n’être ni trop faible (réveil de la souris) ni trop fort (détresse respiratoire). Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie. En prévention de la douleur, nous administrerons un analgésique le jour de la chirurgie ainsi que le lendemain. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Application d’un antiseptique au niveau du champ opératoire. Pour éviter une hypothermie, l’opération se fait sur tapis chauffant à 37°C. Réveil en chambre thermostatée à 30°C. Les animaux ayant subi une chirurgie sont observés avec attention particulièrement les 3 premiers jours qui suivent la chirurgie par l’expérimentateur et par le personnel qualifié de l’animalerie. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Les animaux auront une période de récupération de 3 semaines entre la chirurgie et l’entrée en procédure d’induction d’uvéite.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. De plus, ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie.
Comprendre le role des lymphocytes T résidents mémoires dans l’encephalomyélite autoimmune expérimentale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
3 318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 120 dans des procédures classées sévères. Une encéphalomyélite auto-immune, modèle de la sclérose en plaques, leur est induite et provoque une paralysie ascendante progressive, évaluée sur une échelle de 0 à 5 dont le dernier stade entraîne l'euthanasie, après des injections, des gavages, des prélèvements de sang et une irradiation. Le porteur écrit que le projet ne prévoit pas l'utilisation d'analgésiques ou anti-inflammatoires, au motif qu'ils risqueraient d'interférer avec les processus inflammatoires étudiés. Il affirme que le remplacement n'est pas applicable car les études in vitro ne reproduiraient pas la pathologie.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique qui affecte le système nerveux central (SNC) qui touche 2,5 millions de personnes dans le monde, environ 80 000 patients en France et représente ainsi la première cause de handicap chez les jeunes adultes. Les traitements de fond de la SEP reposent sur des molécules immunosuppressives, qui restent incomplètement efficaces sur le long terme en particulier contre les formes progressives de la maladie. Il est donc urgent de trouver de nouvelles options thérapeutiques permettant d'enrayer le caractère chronique et progressif de la SEP. Dans ce projet nous utiliserons un modèle expérimental de SEP chez la souris appélé encéphalite autoimmune expérimentale ou EAE, pour identifier les mécanismes sous-tendant la chronicité de la maladie et en particulier nous cherchons à comprendre le rôle d'un sous-type de cellules immunitaires résidant stablement dans le SNC appelé lymphocytes T résident memoires ou TRM. Notre objectif central est de definir le rôle des TRM dans la progression de l'EAE chez la souris et identifier les mécanismes moléculaires par lesquels les TRM soutiennent l'inflammation chronique et potentiellement d'identifier des stratégie thérapeutiques visant à cibler les TRM.
Bénéfices attendus
Les traitements de fond de la SEP sont incomplètement efficaces sur le long terme et sont associés à de nombreux effets secondaires. Ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelle voies thérapeutiques via la compréhension du role joué par un sous-type de lymphocytes T (LT) sur l’environnement inflammatoire cérébéral et ses conséquences sur la sévérité et le chronicité de la maladie. Il permettra aussi de mieux comprendre les voies moléculaires impliquées qui pourraient constituter de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (intraveineuse, intrapéritonéale et sous-cutanée) et à des gavages, d'une durée de quelques secondes. Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisés sur animaux anesthésiés tandis que les injections intrapéritonéales et les gavages sont réalisées sur animaux vigiles. Les animaux subiront aussi des prélèvements de sang (3 maximun d'une durée de quelques secondes) sur animaux anesthésiés. Enfin certains groupes d'animaux subiront une irradiation qui sera realisée sur animaux vigiles et d'une durée de 6min57s.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière transitoire. L'EAE induit une paralysie ascendante progressive. La douleur est absente ou faible jusqu’au stade de paralysie du train arrière et modérée au stade de paralysie des trains arrière et avant. Les souris peuvent aussi connaître une perte de poids à ce stade avancé de l'EAE.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Nous analyserons aussi le nombre de LT par organes et leurs niveaux d'expression de marqueurs spécifiques.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux qui évaluera leur état général (suivi du poids, prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le modèle de l’EAE est classiquement utilisé comme le modèle murin de la SEP. La douleur est absente ou faible jusqu’au stade 3 et modérée voire sévère au stade 4 et 5. A partir du stade 3, de la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée sont placées quotidiennement dans la cage pour éviter la déshydratation. L’incidence et la sévérité de la maladie seront suivies quotidiennement. Les signes cliniques de l’EAE seront évalués sur une échelle de 0 à 5 en fonction du handicap moteur. 0 : aucun signe ; 1 : faiblesse de la queue ; 2 : faiblesse de la queue et difficulté à se remettre sur ses pattes après retournement ; 3 : paralysie du train arrière ; 4 : paralysie du train arrière et perte de tonus du train avant ; 5 : paralysie du train arrière et avant, euthanasie. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection ip ou iv, un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera euthanasié. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris de 7 à 8 semaines, 23-25g au début de l'expérience) offre la possibilité unique d’étudier une pathologie d’inflammation du SNC (l’EAE) mimant la pathologie humaine de la SEP, comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques publiées utilisant ce modèle d’expérimentation animal. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. La complexité des systèmes immunitaires et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences en culture cellulaire) la ‘connectique’ des populations cellulaires mises en jeu. Il n’est donc actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal. Des souris adultes seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système nerveux central et immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation. Dans le cas de la production de souris chimères la reconstitution du système immunitaire par la moelle osseuse injectée prend 8-10 semaines, puis les souris subiront la procédure d'EAE et seront suivies jusqu’à 50-70 jours (7-10 semaines) après induction de la maladie, donc l’âge maximal d’utilisation des souris sera de : 8 (âge des souris receveuses)+1 (semaine d’acclimatation)+10 (temps necessaire à la reconstitution du système immunitaire) +10 (temps de suivi de la procédure d’EAE)=29 semaines.
Etude de la tolérance de nouveaux agents anticancéreux à visée thérapeutique dans le cancer du poumon
- Recherche appliquée
- Cancers
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Immunodéprimées, elles reçoivent des injections dans la veine de la queue ou des gavages pour tester la tolérance de neuf composés anticancéreux, puis sont mises à mort au plus tard 28 jours après le début, y compris en l'absence d'atteinte d'un point limite, pour des analyses post-mortem. Le porteur indique que ces composés peuvent provoquer perte de poids, choc immunitaire, convulsions et lésions des muqueuses de la bouche. Il présente les bénéfices comme relevant de la santé humaine à moyen terme et affirme que l'évaluation de la tolérance sur un organisme entier est nécessaire avant tout essai clinique.
Objectifs
Le cancer du poumon à petites cellules (CPPC) représente environ 15 % de l'ensemble des cancers du poumon. Malgré des taux élevés de réponse à la chimiothérapie et à la radiothérapie de première intention, les patients atteints d'une maladie à un stade avancé finissent par rechuter, et très peu de patients survivent plus de 5 ans après le diagnostic. Les options thérapeutiques pour les maladies récurrentes ou réfractaires sont limitées, et les thérapies existantes sont associés à d'importantes toxicités liées au traitement. Le présent projet vise à évaluer la tolérance et la toxicité chez la souris de plusieurs composés avec une visée thérapeutique finale dans le cancer du poumon à petites cellules. Avant de pouvoir tester ces composés pour des études d’efficacité dans des modèles murins de cancer du poumon, il nous faut nous assurer de la bonne tolérance de ces molécules sur un petit nombre de souris. La tolérance des médicaments désigne la mesure dans laquelle les effets indésirables manifestes des médicaments peuvent être tolérés par l’organisme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteintes de cancer du poumon à petites cellules réfractaires aux traitements. L’étude va permettre de développer en phase préclinique de nouvelles molécules qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.
Procédures
Lors du traitement, les animaux vont subir une contention de quelques minutes et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors à l'injection à la seringue dans la veine caudale. Les animaux vont subir une contention pour la pesée d'une durée de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors à l'injection à la seringue dans la veine caudale. Les pesées génèrent un stress lors de la contention. Les effets les plus graves retrouvés dans la littérature pour cette catégorie de composés incluent une perte de poids, un choc immunitaire ou des problèmes neurologiques (convulsions) comme effets secondaires à court-terme. Les traitements pourront éventuellement également entrainer des effets à long-terme comme des lésions dans la bouche et les muqueuses (saignements). Les composés parents n’ont montré aucun signe de toxicité particulière lors de leur administration chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 28 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, même en l'absence d'atteinte de point limite afin de pouvoir effectuer les évaluations post-mortem prévues.
Remplacement
Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation des différents composés créés ont été réalisées afin de sélectionner les neufs candidats les plus efficaces. Le passage chez l'animal est maintenant nécessaire pour l’évaluation de leur tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour cette raison nous devons effectuer ces études de toxicité sur la souris.
Réduction
Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude pilote. Une décision de continuer ou non l'étude sera mise en place à l’issu de l’injection de chaque dose : si une dose a provoqué des effets secondaires entrainant une dégradation de l’état des souris, les doses suivantes ne seront pas administrées et l’escalade de dose s’arrêtera. Un test statistique fiable a été utilisé pour nous permettre de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour la comparaison des poids. Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire au autant que possible le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 28 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Les animaux étant immunodéprimés, ils seront hébergés en portoirs ventilés et manipulés exclusivement sous hotte à flux laminaire, y compris pour le change. Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées. L'état des animaux est évalué avec une grille de score et des points limites précis sont décrits. Si jugé nécessaire, un traitement analgésique sera immédiatement mise en place. Ce traitement sera renouvelé autant de fois que nécessaire sur une durée de 24h au maximum.
Choix des espèces
Afin de développer ces thérapeutiques sous une forme cliniquement applicable, nous devons évaluer leur tolérabilité et leur toxicité chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées. Pour ce faire, nous souhaitons vérifier leur innocuité dans des souris non-consanguines. Ces souris sont utilisées pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments, elles possèdent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressantes pour les études de tolérabilité. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.
Evaluation des effets de différents candidats médicaments dans un modèle de résignation induite chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 900
1 800 rongeurs, 900 souris et 900 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées sévères. Les animaux reçoivent les composés à tester puis sont placés dans une situation dont ils ne peuvent s'échapper jusqu'à ce qu'ils cessent de tenter de fuir, un état que le porteur assimile à la dépression humaine, avant des prélèvements terminaux de sang, d'organes et de fluides. Il décrit ce test de résignation induite comme pouvant provoquer un stress émotionnel majeur. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution in vitro ou in silico et que l'animal reste un passage obligatoire avant l'humain.
Objectifs
La dépression est une pathologie complexe qui induit chez l’Homme des symptômes à la fois psychologiques (effets sur l’humeur), comportementaux (troubles du sommeil, comportements suicidaires) et physiologiques (effet sur l’appétit, sur l’attention). La résignation est un symptôme caractéristique de la dépression. Elle entraine une diminution de la motivation, une augmentation de la passivité et une diminution de la capacité à prendre des décisions et à résoudre des problèmes. Le test de résignation induite est un modèle animal de la dépression chez l'Homme. Dans ce modèle animal de résignation induite, les animaux sont rendus résignés en les soumettant à une situation à laquelle ils ne peuvent échapper. Après une première phase pendant laquelle les animaux vont essayer de s’échapper, les animaux vont entrer dans une phase de résignation et ne vont plus présenter de comportement d’échappement. Leur comportement est alors assimilé à un état dépressif. Ce projet a pour but d'évaluer les effets antidépresseurs potentiels d'un candidat médicament chez le rongeur en évaluant s’il permet de diminuer le comportement de résignation.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter la dépression, une pathologie humaine touchant 3.8% de la population mondiale. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par différentes voies (-2 min par administration) puis effectueront le test de resignation 1 à 2 fois avec une durée de 6 à 20 minutes maximum par test (soit 12 min maximum pour la souris et 40 min maximum pour le rat si 2 tests). Des prélèvements de sang sur animal vigile pourront être effectués (2 minutes par prélèvement). Et l'animal pourra être anesthésié en fin d'expérience pour les prélèvements terminaux de fluides corporels et tissus.
Impact sur les animaux
Les contentions des animaux vigiles pour administrer le produit, induire une anesthésie ou pour effectuer des prélèvements sanguins peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Le test (d'une durée de 6 à 20 minutes, répété une fois) qui induira un caractère résigné chez les animaux est une intervention pouvant conduire à un stress émotionnel majeur. Les prélèvements sanguins induisent un stress léger et une douleur légère.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s) chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule à effet antidepresseur. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 / par groupe (5 groupes/étude* 6 études/an). L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse. Après chaque test les animaux seront séchés et placés dans un environnement chaud.
Choix des espèces
Le rat et la souris font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale. En effet, le rat ou la souris et l'Homme partagent de nombreuses similarités anatomiques, physiologiques et génétiques avec l'Homme (les êtres humains et le rat ont plus de 90% de gènes en communs). De plus, les rats et les souris sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec des cycles reproductifs et de vie courts. Par conséquent, le rat et la souris sont des espèces de rongeurs les plus couramment utilisées dans les tests comportementaux relatifs à la dépression dont, le modèle de résignation induite. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Rôle pathogène des auto-anticorps dans les dermatoses bulleuses auto-immunes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
838 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 615 dans des procédures menées sans réveil et 223 en gravité modérée. Elles reçoivent des injections de protéines pour rompre la tolérance immunitaire, subissent jusqu'à neuf prélèvements de sang sur 56 jours, et certaines, gestantes ou nouveau-nées, reçoivent des anticorps destinés à provoquer un décollement de la peau. Le porteur indique que les animaux développent des érosions cutanées ou orales et une image comparable à celle des patients, une échelle de gravité servant à fixer un point limite. Il précise avoir observé la pathogénicité in vitro mais affirme que sa confirmation ne peut être envisagée que chez l'animal.
Objectifs
L'objectif général de notre programme de recherche est d'améliorer la compréhension de la physiopathologie des DBAI. Plus spécifiquement, nous viserons à : i) évaluer les nouveux antigènes cibles identifiés dans les DBAI dans le déclenchement d’une DBAI par des immunisations chez la souris. ii) établir si des auto-anticorps exercent un rôle pathogène direct par transfert passif, chez la souris grestante ou néonatale, d’immunoglobulines de patients atteints de DBAI ou de souris (avec des anticops monoclonaux d'hybrdiomes générés issus des souris immunisées) . L’étude des animaux se fera donc par (i) une observation clinique de la peau, (ii) une analyse sanguine et iii) une étude histologique des tissus cutanés prélevés post-mortem
Bénéfices attendus
La méconnaissance des processus physiopathologiques conduisant à la survenue des DBAI est un frein au diagnostic et à la mise en place d’une thérapeutique adaptée. Des études récentes suggèrent fortement que la diversité des antigènes cibles au cours des DBAI est plus hétérogène. L’évaluation du rôle de ces auto-anticorps dans les processus physiopathologiques permettra un diagnostic plus précis et la mise en place d’outils thérapeutiques plus adaptés et de potentiellement réduire les effets secondaires des thérapies actuellement utilisées.
Procédures
Injections de protèines recombinantes (immunisation) : injection en sous-cutanée entre les 2 omoplates. Les souris seront injectées au moins une fois voire 3 fois, à 15 jours d'intervalle. Chaque injection dure moins de 10 secondes. Prélèvement de sang sur animal anesthésié (suivi longitudinal ). Les souris seront prélevées 9 fois sur une période de 56 jours. Les prélevements de sang durent moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
L'objectif de l'immunisation est de promouvoir une rupture de la tolérance immunitaire comme un auto-antigène chez les patients atteints de DBAI afin d’évaluer la pathogénicité des anticorps. L’injection de la protéine chez les animaux entrainera l’apparition d'anticorps pouvant être à l'origine de signes d'érosions cutanés ou orales . Les tests de tansfert passsif ont pour objectif de confirmer le rôle pathogène des différents auto-anticorps par l’induction de l’acantholyse. Les animaux développeront des signes cutanés et l’image histologique devrait être caractéristique du phénomène d’acantholyse observé chez les patients. L’apparition d’éventuelles érosions cutanées ou orales autour du museau mesurée par un examen visuel effectué par deux observateurs indépendants permettra d’évaluer l’évolution de la maladie et le niveau de souffrance des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever en post mortem la peau pour une analyse histologique ou de réaliser des analyses biologiques permettant d'évaluer la pathogènicité des anticoprs.
Remplacement
Nous avons réalisé une étude préalable in vitro de l'activité des auto-anticorps sur les kératinocytes par un test dispase et par des tests d’immunofluorescence sur de la peau. La pathogénicité, in vitro, est observée de ces nouveaux auto-anticorps. Cependant, la pathogénicité réelle de chaque auto-anticorps ne peut être envisagée que chez l'animal car ils pourraient agir en synergie avec des cellules du système immunitaire in vivo et contribuer ainsi au phénotype complexe des DBAI.
Réduction
Le recours au modèle murin étant absolument nécessaire, le modèle murin de DBAI par transfert des auto-anticorps chez la souris néonatale est déjà connu et a déjà permis de confirmer la pathogénicité de certains auto-anticorps. Ainsi, l’utilisation du même modèle permet de réduire le nombre de souris pour la mise au point pour tester rapidement l’implication de ces nouveaux auto-anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité de l’induction de l’acantholyse. Le nombre d’animaux à inclure par lot, ne peut pas faire l’objet d'une justification par une étude statistique. En effet, il va s'agir d'une part, d’un protocole d’immunisation, la quantité de souris est le juste nombre défini d’après l’expérience du laboratoire sur ce type de procédure et dont on sait qu’il permettra de tester et de produire des hybridomes en aval. D'autre part, pour les autres procédures, pas de test statistique puisqu’il s’agit d’une observation qui doit répondre à un effet pathologique ou non des Ac. Le nombre juste de souris permet de pallier aux fluctuations expérimentales inhérentes à la variabilité des réponses, notamment immunologiques, entre les animaux et pour pallier la variabilité du nombre de petits par portée.
Raffinement
Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie (perte ou hérissement des poils, lésions du museau, posture inhabituelle pour les souris immunisées et uniquement la peau pour les souris néonatales) et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. Enfin, l’ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées dans des cages enrichies avec du papier, du coton (cell-nest) et un abri de cellulose. Une crème anesthésique sera appliquée sur les souris néonatales avant l’injection des immunoglobulines et elles seront immédiatement remises en présence de leur mère après l’injection afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés permettant d’étudier les mécanismes immunologiques mise en œuvre lors des pathologies auto-immunes. Animaux âgés de 6-8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature pour l’immunisation des auto-antigènes des DBAI. Femelles gestantes datées à 15 jours de gestation pour permettre l'accueil et l'injection soit des mères à la fin de la gestion (étude du transfert transplacentaire ) ou des petits âgés de 1 jour ( âge requis) pour suivre le phénomène d’acantholyse cutanée suite à l’injection des auto-anticorps.
Caractérisation de la lignée Pde2a2 +/-
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 dans des procédures classées sévères. Cette lignée modifiée pour réduire une protéine liée à l'autisme et à la déficience intellectuelle subit des tests sociaux et cognitifs, dont certains précédés de deux heures d'isolement, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau, de la moelle épinière, des surrénales, des testicules et des ovaires, 120 animaux mourant au cours d'une perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie les tests comportementaux de classiques et indolores et signale une anxiété possible liée au nouvel environnement et à l'isolement. Il indique avoir d'abord travaillé sur des lignées cellulaires et poursuivre directement chez la souris pour étudier les comportements.
Objectifs
Des mutations du gène PDE2A ont été découvertes chez des patients atteints d’autisme et de déficience intellectuelle, qui sont des maladies du développement du cerveau . La protéine PDE2A est très fortement présente dans le cerveau et a un rôle clé dans le développement des neurones, leur morphologie et fonctionnement. Ceci explique que des altérations de sa quantité puissent avoir un impact négatif sur le fonctionnement neuronal et induire des maladies du cerveau. La PDE2A regroupe trois protéines variantes qui se retrouvent à des emplacements distincts dans les neurones, dont la PDE2A2 que l’on retrouve spécifiquement dans la mitochondrie. Les mitochondries sont des petites unités présentes dans les cellules qui produisent de l'énergie sous forme d'ATP grâce au processus de respiration cellulaire. Des altérations de la mitochondrie sont d’ailleurs retrouvés chez les patients ayant des mutations sur le gène PDE2A ainsi que chez d'autres patients atteints de trouble du spectre de l'autisme. Nous avons récemment étudié la souris Pde2a+/- qui, comme les patients, a une quantité diminuée de tout les variants PDE2A. Nos récentes données montrent que cette souris est un bon modèle de maladie du cerveau, et qui présente des troubles socio-cognitifs similaires aux patients. Nous voulons à présent commencer l’étude de la souris Pde2a2+/- qui aura uniquement une quantité diminuée de PDE2A2, donc seulement au niveau de la mitochondrie. En effet, cela nous permettra de savoir si une atteinte unique au niveau de la mitochondrie est suffisante pour induire des troubles comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle spécifique de la PDE2A2 au cours du développement du cerveau, et le lien entre la dérégulation de l'activité de cette enzyme au niveau de la mitochondrie et les troubles du neuro-développement comme la déficience intellectuelle, l'autisme et les troubles moteurs. Finalement, l'évaluation de la pertinence de ce modèle par rapport aux patients atteints d'une mutation permettra de mettre à disposition de la communauté scientifique un potentiel nouveau modèle de maladie du neurodeveloppement.
Procédures
Différents tests sociaux et cognitifs seront réalisés ponctuellement et qui dureront, selon les tests, de 3 minutes à 2 heures. Ces tests se feront chez les souriceaux, à l'adolescence (un mois) et à l'âge adulte (dès deux mois). Certains animaux seront soumis à une perfusion intra-cardiaque, et une injection d'anesthésique et une d'antalgique seront effectuées sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une contention plusieurs fois au cours de leur vie, que ce soit pour des pesées ou pendant les différents tests. Les tests comportementaux réalisés sont classiques et indolores. De l'anxiété peut être attendue lors des différents tests liée à un nouvel environnement notamment pour les tests d'anxiété ou lors de l'isolement dans l'actimètre ou pendant le test d'interaction sociale avec 2h d'isolement auparavant.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Nous récupérerons différents organes (cerveau, moelle épinière, surrénales, testicules et ovaires) afin de réaliser des études moléculaires. 120 de ces animaux subiront une perfusion intra-cardiaque, sous anesthésie générale, au cours de laquelle ils décèderont afin de pouvoir réaliser une étude sur les coupes de cerveau.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude, nous avons préalablement travaillé sur des lignées cellulaires, ce qui nous a permis de confirmer le rôle de PDE2A2. Notre étude portant globalement sur des maladies du neurodéveloppement et sur le déficit intellectuel et les troubles du spectre de l'autisme, nous devons poursuivre ce projet directement chez la souris pour étudier les différents comportements associés à ces maladies afin de valider le rôle de la forme mitochondriale de PDE2A.
Réduction
Dans un objectif de réduction, nous analyserons nos résultats après chaque groupe expérimental. Si les résultats des 2 premiers groupes expérimentaux sont significatifs et identiques, nous n'utiliserons pas le 3ème groupe. De plus, les organes de tous les animaux utilisés au cours de ce projet seront récupérés pour réaliser des études moléculaires, ce qui évitera l'emploi d'animaux supplémentaires. Pour garantir une puissance statistique (t test) suffisante à cette étude tout en minimisant le nombre d’animaux à utiliser, nous prévoyons un minimum de n=10 animaux par groupe, avec 3 expériences indépendantes. Chaque expérience sera réalisée 3 fois afin de garantir la reproductibilité des résultats, et pour chaque répétition, nous avons besoin d'un minimum de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un résultat significatif.
Raffinement
Lors des procédures chirurgicales, les animaux seront au préalable anesthésiés, accompagné d'un analgésique et d'un antalgique afin de réduire la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer un phénotype "sauvage" avec des modèles transgéniques disponibles, comme les souris Pde2a+/-. De plus, le modèle murin permet d'étudier à la fois les comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensorimoteurs que l'on peut retrouver chez les patients atteints de troubles du neuro-développement. Des tests seront réalisés au 7ème, 10ème et 14ème jour après la naissance, ce qui correspond à l'enfance chez l'humain. Puis nous réaliserons d'autres tests à 1 mois, ce qui correspond à l'adolescence. Enfin, nous réaliserons des tests à l'âge adulte d'une souris (à partir de 8 semaines). Cela permettra d'évaluer l'impact de l'extinction partielle du gène Pde2a2 au cours du développement, et d'identifier les moments clefs où la protéine PDE2A2 est impliquée dans la pathologie.
Evaluation pharmacologique de composés naturels ou de synthèse pour le traitement des maladies infectieuses
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
8 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 7 300 dans des procédures classées sévères. Elles sont infectées par diverses voies, nasale, intrapéritonéale, urétrale, intradermique et intramusculaire, puis traitées avec des composés candidats, la plupart des études se terminant par un prélèvement d'organes après mise à mort. Le porteur indique que les animaux peuvent perdre du poids et présenter posture voûtée, difficultés respiratoires et prostration, une perte de plus de 20 pour cent du poids servant de point limite. Il affirme qu'il n'existe aucun modèle in vitro reproduisant les interactions entre agent pathogène et système immunitaire, et revendique un besoin de santé publique majeur.
Objectifs
Nous avons pour objectif le développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est la résistance aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Le nombre croissant d’antibiorésistances et d’infections nosocomiales sont clairement identifiés comme un besoin de santé public majeur. Il est indispensable de combattre la résistance aux antimicrobiens et de préserver la capacité de prévenir et traiter les maladies infectieuses à l’aide de nouveaux médicaments sûrs et efficaces
Procédures
Voie d’administration (traitement) : - Per os : 5 secondes, Sous cutané : 5 secondes , Intrapéritonéal : 5 secondes, Intramusculaire : 5 secondes, Intraveineuse : 5 secondes Voie d’administration (infection): - Intra-nasale: 5 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-urétrale: 30 secondes, Intra-peritoneale : 5 secondes, Intra-dermique: 5 secondes, Intramusculaire: 5 secondes. Le nombre d'interventions est spécifique de chaque étude et est dépendant du régime de traitement qui lui même est corrélé à la pharmacocinétique de chaque molécule en développement. Néanmoins les fréquences d'intervention (traitement uniquement) peuvent etre uid ou bid.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une potentielle perte de poids (qui sera considérée comme un point limite si excédant 20%). D'autres effets potentiels sont une apparition de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration difficile, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus.
Devenir
Le sort prévu de tous les animaux à l'issue de chaque procédure est la mise à mort. En effet les études se finissent pour la plupart par des prélèvements d'organes qui sont réalisés après mise à mort des animaux. Les animaux survivants ne peuvent resservir à d'autres expérimentations en raison du développement de défenses immunitaires au cours de l'établissement des pathologies infectieuses.
Remplacement
L’apparition de résistance aux traitements antibiotiques de référence rend urgente la découverte de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de la résistance de certains agents pathogènes aux antibiotiques. En effet l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies telles que la septicémie, les infections pulmonaires, les infections urinaires etc… sont utilisés. De plus les mécanismes de réaction de l’hôte peuvent être mis en évidence en utilisant ces modèles sur animaux immunocompétents versus immunodéprimés. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Le nombre estimé est entre 1000 et 1600 animaux / an sur 5 ans. 12 procédures expérimentales sont prévues dans ce projet et le nombre d'étude varie en fonction de la demande client. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de souches bactériennes différentes à tester, nombre de molécules antibactériennes à tester, doses différentes de la molécule antibactérienne). Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre à l’année. . Des études in vitro sont réalisées si possible en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur des animaux. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats robustes sont effectués. Des études pilotes sont conduites afin de s'assurer de la fiabilité du modèle.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal Pour les protocoles où la douleur ne peut pas être prise en charge par des analgésiques, une observation accrue et des critères d’arrêt stricts sont mis en place. Les points limites utilisés sont: Le suivi du poids (le critère d'arret est une perte de plus de 20%), L'accumulation de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration laborieuse, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Pour le confort de l'animal la prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) au préalable des gestes douleureux (injection intraveineuse, injection intra-uretrale, injection intra-musculaire,...).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie
Etude d’un gène protecteur de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris Tau22, modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer, subissent une biopsie de la queue pour génotypage, une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique sous anesthésie, puis des tests de mémoire de reconnaissance d'objet et de labyrinthe en Y avant l'euthanasie et le prélèvement des tissus. Le porteur nomme les tests comportementaux et les qualifie de non invasifs, et indique que la chirurgie peut provoquer, rarement, infection ou convulsions. Il justifie l'euthanasie par le fait que ces animaux transgéniques ne peuvent être replacés ou relâchés.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie qui se caractérise par des troubles de la mémoire et par une perte progressive des facultés cognitives. Le processus de la maladie débute avec l’accumulation d’agrégats toxiques dans le cerveau. En particulier, la mort des cellules nerveuses est due à une accumulation de protéines toxiques. À ce jour, les traitements sont donnés aux patients à des stades trop avancés de la maladie. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques qui peuvent agir plus tôt dans le processus de la pathogenèse et en particulier qui peuvent favoriser l’élimination de ces agrégats toxiques. En ce sens, le projet vise à étudier l'action de la protéine «protectrice» dans la maladie d'Alzheimer. Des résultats préliminaires indiquent qu’un variant naturel de cette protéine en question s'est avérée très efficace pour éliminer les agrégats toxiques dans les cellules neuronales. Avec ce projet nous envisageons de démontrer que ce variant présent dans une partie de la population ralentit l’avancée de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra démontrer pour le première fois, l'efficacité d’une protéine à dégrader des agrégats toxiques dans le cerveau de souris utilisé comme modèle de la maladie d’Alzheimer. Il pourra déboucher à terme sur des avancées thérapeutiques utiles pour l’homme.
Procédures
Les animaux Tau22 hétérozygotes auront été génotypés par PCR suite à une biopsie de la queue. Les animaux seront soumis à des anesthésies (1 fois pendant 30 min) puis à une procédure chirurgicale d’injection intracérébrale d’un vecteur de thérapie génique (1 fois, durée d’environ 25-30 minutes). A l’âge de 9 mois, ils seront soumis à des tests de comportements non invasifs afin de tester leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une fois par animal et seront réalisés les uns à la suite des autres (test de reconnaissance de l’objet puis le Y-Maze), avec un temps de pause entre chaque d'au moins une semaine afin de limiter le stress éventuel des animaux. Aucun test comportemental réalisé ne peut être considéré comme invasif. Toutefois, une attention particulière sera accordée à chaque animal lors de chaque expérimentation. Les males seront testés en premier (ex en matinée) afin d’éviter toute attirance par le passage des femelles dans le support de test, ce qui pourrait biaiser l’interprétation. Les femelles du groupe seront ensuite testées dans l’après-midi qui suit le test des males. Il faudra compter 30 minutes / individu par test.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux développera selon leur génotype des lésions histologiques qui entraînent des perturbations de la mémoire à partir de 6 à 9 mois. Les animaux de génotype mutant auront une moins bonne performance d’apprentissage. Les animaux subiront une chirurgie qui peut dans de très rare cas et malgré les mesures d’asepsie entraîner une infection au site chirurgical, avec des complications telles que douleur et inflammation. Il n’est pas attendu de problèmes neurologiques liés au modèle, ni aux injections dans le cerveau, néanmoins des troubles neurologiques (ataxie et convulsion) pourraient survenir de façon accidentelle suite à l’injection dans le cerveau. La manipulation des animaux pour les tests de comportement peut engendrer un stress. Les biopsies pour le génotypage entraîneront une douleur.
Devenir
Mort (tous les animaux). Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. En effet, ces animaux Tau22 hétérozygotes souffrent de la pathologie d’Alzheimer, une maladie qui est accompagnée de déficits de mémoire qui pourraient s’aggraver davantage avec l’âge. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure (âgés de 9 mois) pour prélèvement des tissus désirés.
Remplacement
A l’heure actuelle il n’est pas possible de reproduire les déficits d’apprentissage retrouvés chez les patients Alzheimer sans recourir à l’expérimentation in vivo. Des premières expériences sur cultures cellulaires de type neuronales ont permis de démontrer l'effet bénéfique de la protéine étudiée sur la réduction des agrégats toxiques. Les expériences chez la souris seront le complément nécessaire de ce travail. Cette évaluation garantira l'efficacité et la sécurité avant de passer aux essais sur l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production du génotype utile. Le nombre d'animaux qui sera utilisé pour évaluer le rôle de la protéine étudiée en tant que stimulateur de d’agrégats toxiques dans les neurones est un nombre utile pour cette tâche. Les procédures expérimentales ont été choisies pour obtenir des résultats statistiquement valides avec le plus petit nombre d'animaux, sans pour autant sacrifier la portée scientifique du projet. Pour atteindre cet objectif, nous travaillerons à augmenter la puissance statistique de nos expériences et en même temps à réduire au minimum les animaux utilisés au cours de l'étude en : 1) lorsque l'animal sera mis à mort, nous prélèverons le cerveau afin d'extrapoler toutes les informations et données possibles à partir du nombre minimum d'animaux. Bien que l'étude in vitro soit une stratégie valable pour réduire le nombre d'animaux, il est important de ne pas oublier les limites de cette approche. Si l'utilisation de cultures cellulaires peut donner des informations utiles d'un point de vue mécaniste, l'étude in vivo implique un animal dans son intégralité et peut donc fournir des informations imprévisibles (effets indésirables/inattendus) en ce qui concerne à une étude impliquant uniquement l'utilisation de cultures cellulaires. Toutes les procédures expérimentales seront menées par du personnel hautement qualifié dans un environnement contrôlé afin de minimiser les erreurs aléatoires. Le nombre d'animaux qui seront inclus dans chaque groupe a été défini sur la base de l'analyse statistique décrite dans la littérature et le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été déterminé avec des outils statistiques. Enfin, notre collaborateur a procédé à la cryoconservation de cette lignée transgénique, ce qui permettra de ne pas maintenir les animaux qui n’entreront plus dans le cadre des expériences en cours pendant plus de 12 mois.
Raffinement
Les animaux seront mis à mort selon des méthodes conformes à la recommandation de la Commission européenne chaque fois que des souffrances sont visibles chez l'animal (déshydratation, impossibilité de mouvement). Afin d’éviter que l’animal se blesse, avant qu’il ne se réveille, nous couperons la pointe des griffes avec un petit ciseau ou coupe-griffe. À la fin de la chirurgie, les animaux seront réchauffés selon une méthode appropriée dans l’animalerie Ils seront surveillés périodiquement jusqu'à leur réveil. Dans les jours suivant l'intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés afin de vérifier la récupération complète des fonctions physiologiques de base (urine et nutrition). Au réveil complet et pendant les 12-20 heures suivantes (dans la mesure du possible dès leur réveil, dès que les animaux auront repris leur activitées physiologiques (urine, alimentation), afin d'éviter des dommages accidentels par les congénères, l'animal sera logé individuellement avec de la nourriture humide répartie uniformément dans la cage pour faciliter son accès. Apres cela, les souris seront remises dans leur cage pré-chirurgie.
Choix des espèces
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie qui apparaît tardivement, insidieusement, mais progressivement et irréversiblement. Elle va détruire petit à petit les neurones de l’hippocampe qui gèrent la mémoire. La lignée de souris utilisée dans cette étude reproduit ces caractéristiques de la maladie humaine. En particulier ces animaux, à 9 mois, subissent une perte de mémoire qui est accompagnée de la mort neuronale dans une région ciblée du cerveau. L’injection du vecteur pour l’expression de notre protéine d’intérêt sera réalisée à 3 mois, avant le développement des symptômes liés à l’âge, pour tester un effet protecteur de cette protéine. Choix de l’espèce : l’introduction de la protéine Tau mutée chez la souris constitue une approche directe afin de mimer la maladie d’Alzheimer et notamment la parte de mémoire liée à cette pathologie. Les génomes murins et humains étant relativement proches dans leur structure, la souris est l’animal de choix pour ce type d’approche.
Etude de l’effet du Givinostat et du Bortezomib sur des modèles de myopathies chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles transgéniques de myopathies, elles subissent jusqu'à quatre prélèvements sanguins, des gavages quotidiens pendant quinze semaines et des tests d'effort et d'agrippement, pour évaluer deux molécules candidates. Le porteur indique que ces modèles développent faiblesse et lésions musculaires dès les premières semaines de vie, et que les gavages et tests peuvent provoquer inconfort et fatigue. Il décrit des essais préalables sur cellules et affirme que l'étape animale reste indispensable pour confirmer les résultats sur des organismes entiers.
Objectifs
Les myopathies des ceintures se caractérisent par une dégénérescence progressive des muscles du bassin et des muscles des épaules conduisant à une perte de motricité des membres supérieurs et inférieurs. Elles évoluent de façon extrêmement variable. L'atteinte musculaire s'étend progressivement vers les muscles du tronc et les muscles distaux qui s'affaiblissent. Une atteinte cardiaque et/ou respiratoire affecte l'espérance de vie. Il n’existe aucun traitement spécifique. Ces pathologies sont dues à des anomalies sur certaines protéines qui assurent la contraction du muscle. Chez des souris modélisant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), un traitement pharmacologique (molécule 1) a réduit les symptômes. Ici, nous souhaitons évaluer l’efficacité de ce traitement sur des modèles murins de myopathies des ceintures, car les patients ont un tableau clinique similaire aux patients DMD. Le but étant que cette molécule réduise l’atteinte musculaire chez les patients. Dans un second temps, nous allons évaluer la possibilité de stopper la dégradation des protéines anormales présentes dans ces modèles. Nous souhaitons ici sélectionner la dose efficace d'un traitement (molécule 2) engendrant le moins d’effets toxiques/secondaires. L’étape suivante sera de combiner les deux molécules (molécules 1 et 2) pour restaurer les protéines fonctionnelles dans le muscle dans les modèles de myopathies (demande d’autorisation de projet à part).
Bénéfices attendus
Nous pensons que le traitement avec la molécule 1 aura un effet bénéfique sur les souris atteintes de myopathies des ceintures, en améliorant l’état des muscles squelettiques, aussi bien au niveau de l’architecture des muscles que de la force musculaire. La combinaison avec la molécule 2 pourrait plus tard permettre la restauration des protéines dans le muscle. De tels résultats ouvriraient la porte à des essais cliniques sur des patients souffrant de ces maladies, pour lesquelles il n’existe actuellement aucun traitement.
Procédures
Les animaux subiront : - au maximum 4 prélèvements sanguins chacun durant environ 20 minutes - des gavages 1 fois par jour pendant 15 semaines (durée : quelques minutes) - 2 tests d'effort (durée cumulée maximale 110 min) et 2 tests d'agrippement (durée : 3x 60 secondes)
Impact sur les animaux
Le test d'effort peut entrainer une fatigue de l'animal (musculaire et/ou cardiaque). Les gavages quotidiens avec la molécule 1 peuvent entrainer un inconfort. A partir de trois semaines d’âge les souris MDX (modèle DMD) présentent une faiblesse musculaire et des lésions musculaires. Concernant les souris alpha sarcoglygane, les muscles squelettiques sont fonctionnellement altérés à partir de l'âge de 2 mois et un schéma dystrophique modéré est présent à partir de l'âge de 6 mois. Les souris gamma sarcoglygane développent une dégénérescence et régénération du muscle squelettique dès 4 semaines et une fibrose précoce.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront euthanasiés et les muscles seront prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Des premières études avec les deux molécules ont été préalablement réalisées sur des modèles cellulaires. Cela a permis d’étudier leurs effets et leur mécanisme d’action. Néanmoins, notre étude préclinique est indispensable pour confirmer les résultats préalablement observés et les confirmer sur des organismes entiers (mammifères comme la souris). Cela permettra d’ouvrir la porte à des essais cliniques chez l’humain.
Réduction
Pour la première étude avec la moléculé 1 nous utiliserons 8 souris par groupe. Ce nombre nous confère une force statistique suffisante afin de comparer les résultats obtenus dans chaque groupe et condition de traitement. Par ailleurs, dans la suite de notre stratégie de réduction, les groupes témoins (non porteurs du gène de la maladie) ne seront pas exposés aux doses croissantes du traitement expérimental. Pour la deuxième étude avec la molécule 2, nous utiliserons 6 souris saines par dose. Les résultats des études sur les groupes d’animaux traités ou non avec la molécule d’intérêt seront analysés au moyen de tests statistiques paramétriques ou non en fonction de la distribution des données. Ceci permettra de déterminer si le traitement induit des différences significatives.
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel.
Choix des espèces
Dans le cadre des 2 études, le choix s’est porté sur la souris principalement car il s’agit d’une part d’un modèle mammifère vivant qui présente beaucoup de similitudes avec l’être humain notamment au niveau de la composition et la structure du muscle squelettique. D’autre part, la disponibilité de certains modèles murins de maladies musculaires commerciaux particulièrement d’intérêt dans cette étude ont participé à orienter le choix sur la souris pour ces études précliniques. Par ailleurs, les modèles utilisés sont des modèles transgénique et la souris est un modèle de choix pour la génération de ces derniers. Les animaux seront reçus à l’âge de 4 semaines, ils seront habitués au nouvel environnement pendant une semaine et les premiers tests (comportementaux) commenceront à 5 semaines d’âge. Le traitement quant à lui sera initié à 6 semaines d’âge. Au vue de la physiopathologie étudiée et des études préliminaires avec ces modèles et les drogues choisies, il est important de faire ces études à un âge ou les symptômes sont réversibles et sur des animaux qui sont dans un développement qui sera proche des populations ciblés chez l’humain (adolescent/adulte).
Etude des lésions inflammatoires du cervelet après traumatisme crânien chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 182 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures classées sévères et l'autre modérées. Des souriceaux de 7 jours subissent un traumatisme crânien par lâcher de poids sous anesthésie, puis certains une chirurgie crânienne pour imagerie, avant une perfusion intracardiaque mortelle et le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit un modèle de traumatisme crânien pédiatrique visant à comprendre l'atteinte du cervelet, et indique que les effets sur la croissance des souriceaux ne sont pas encore décrits ni connus. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro les interactions entre cellules du cerveau.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) correspond aux lésions cérébrales traumatiques et aux altérations des fonctions cérébrales qui en résultent. Les TC sont fréquents chez les enfants et sous-diagnostiqués. Le traumatisme crânien pédiatrique est pourtant un enjeu de santé publique et social majeur. En effet, il est potentiellement responsable de troubles cognitifs et comportementaux, d’échecs scolaires puis de désinsertion sociale à l’âge adulte. Alors que le cervelet est rarement touché directement (3,3% des TC), des lésions indirectes provenant de la zone lésée dans le reste du cerveau peuvent être observées, notamment chez l’enfant. Ces atteintes participent aux handicaps moteur et cognitif. En revanche, les mécanismes mis en cause dans la génération de ces lésions sont mal connus et semblent reposer sur l’inflammation qui survient dans le cerveau lors du TC. Notre hypothèse est que le TC, même isolé, peut être à l’origine de lésions du cervelet, à cause de l’inflammation. Nous utiliserons un modèle de TC modéré par lâcher de poids d'une faible hauteur chez le souriceau 7 jours, sous anesthésie générale, pour étudier les phénomènes inflammatoires potentiellement impliqués dans les lésions du cervelet dans les suites de l'impact.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de compendre de manière plus précise comment le traumatisme crânien chez l’enfant peut conduire à des troubles à long terme, et quel rôle le cervelet joue dans ce phénomène. La fonction du cervelet est de plus en plus étudiée, mais la manière dont il participe à certaines maladies neurologiques, ou neurodégénératives, n’est pas encore totalement élucidée.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien sous anesthésie générale. Après ce traumatisme, un groupe d’animaux de 10 jours de vie sera anesthésié, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post-mortem pour éliminer le sang des vaisseaux des organes qui seront prélevés et étudiés post-mortem. Cette perfusion sera également réalisée chez des animaux à 45 jours de vie et à 6 mois, sous anesthésie générale et avec analgésie. Deux groupes de souris, l’un à 45 jours de vie et l’autre à 6 mois subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie pour réaliser des mesures d’imagerie sur le cerveau (durée : une heure maximum). Ces animaux seront ensuite euthanasiés sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets de cette procédure de traumatisme crânien sont partiellement connus . On rapporte ainsi une mortalité́ estimée à moins de 4%, principalement due à un éventuel rejet du souriceau par la mère, ainsi que dans quelques cas par le traumatisme lui-même. La chirurgie crânienne pour l’imagerie peut entraîner dans de rares cas la mort de l’animal. Les effets sur la croissance et le développement des souriceau ne sont pas encore décrits ni connus.
Devenir
L'euthanasie des animaux après imagerie répond à une nécessité d'ordre éthique puisque celle-ci impose une chirurgie au niveau du crane de l'animal, et rend l’utilisation du cerveau impossible pour toute autre analyse. Tous les autres animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication du cervelet dans l’inflammation du cerveau après traumatisme, et dans le développement de lésions plus tardives. Cela suppose des interactions complexes entre les différents types de cellules qui constituent le cerveau, à savoir les neurones (qui transmettent les informations nerveuses), les microglies (cellules immunitaires du cerveau), les astrocytes (qui contrôlent le métabolisme), et les oligodendrocytes (qui produisent une gaine de protéine autour des neurones). Il y a également une rupture de la barrière hémato-encéphalique, qui filtre habituellement le sang avant qu’il entre dans le cerveau. Cette lésion secondaire au traumatisme est à l’origine d’une communication entre le système immunitaire périphérique (c’est-à-dire les globules blancs qui circulent dans le sang) et le système immunitaire du cerveau. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions in vitro, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un cerveau fonctionnel, dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ce système.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter plus ou moins d'animaux en fonction du type d’analyse réalisé. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, si une différence assez importante pour conclure à un effet réel est observée avant la fin de toutes les séries, les expérimentations seront interrompues.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en plexiglas) pour minimiser leur stress. Dans les jours suivant le traumatisme crânien, on veillera quotidiennement au bien-être des animaux et on surveillera que leur retour au sein du nid se fait bien. Des arbres décisionnels cliniques seront proposés en fonction de l'âge des animaux. Avant sevrage, sur les très jeunes animaux, les soins maternels constituent la meilleure prise en charge de la souffrance chez le souriceau. Après le 15ème jour de vie, une réhydratation sera réalisée si l’animal présente des signes d’inconfort ou de douleur. A partir du sevrage, les douleurs éventuelles seront traitées à l’aide d’un analgésique. En cas d’atteinte des points limites l’animal sera euthanasié. Tous les gestes invasifs (trauma et imagerie) seront réalisés sous anesthésie générale. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les cellules du cerveau sur un modèle de traumatisme, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Le modèle de traumatisme crânien utilisé est bien connu développé et étudié au sein de notre laboratoire. Notre objectif étant l'étude du rôle du cervelet dans les lésions induites par un trauma crânien, nous nous intéresserons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 10 jours (petit enfant), 45 jours (jeune adulte) et 6 mois de vie (adulte).