Souris
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes immunitaires, dont la rate et les ganglions, la déclaration en comptant 340 en souffrance modérée et 200 en souffrance sévère. Les souris immunocompétentes sont irradiées sur tout le corps, parfois à dose létale, avant une greffe de cellules souches du sang, les souris immunodéficientes BRGS reçoivent des cellules souches humaines, et toutes subissent une prise de sang toutes les quatre semaines. Après une irradiation létale, le porteur cite comme signes possibles un affaiblissement, une perte de poids, une léthargie et un dos courbé, et prévoit la mise à mort au-delà d'un score de grimace de 1,5 ou d'une perte de 20 % du poids. Le but est de repérer des gènes impliqués dans la prolifération des lymphocytes B et de tester l'insertion de gènes d'anticorps dans ces cellules. Pour limiter le nombre de souris, le porteur annonce des groupes de cinq, et prévoit de répéter une expérience quand une différence apparaît sans être significative, "afin d'obtenir une significativité".
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différents gènes dans le développement et la maturation des lymphocytes B. Cette partie sera réalisée grâce à des cellules souches hématopoïétiques (CSH) murines qui seront immortalisées in vitro. Ainsi, ces CSH murines pourront recevoir à façon des mutations génétiques avant d'être injectées aux souris. Ces dernières auront reçu une forte irradiation afin d'éliminer le système hématopoïétique de la souris. Les CSH ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les gènes impliqués dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec l'évaluation de l'efficacité de l'insertion de gènes d'immunoglobuline dans les lymphocytes B. Les lymphocytes B sont capables de produire des anticorps (appelés aussi immunoglobulines) qui seront spécifiques d'un pathogène ou d'un antigène tumoral donné. Nous voulons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les CSH humaines afin d'obtenir des lymphocytes B (après reconstitution hématopoïétique dans des souris dans les cas des CSH) qui produiront un anticorps spécifique donné. Pour cela, un gène codant pour une immunoglobuline définie sera inséré soit directement dans des CSH humaines soit dans des lymphocytes B purifiés à partir de souris reconstituées à partir de CSH humaines. Les cellules seront alors reinjectées dans des souris et la production de l'immunoglobuline sera alors monitorée. Les souris utilisées dans ce projet sur les CSH ou lymphocytes B humain sont des souris immunodéficientes (BRGS) qui ne peuvent pas détruire les cellules humaines injectées. Une fois que les CSH sont injectées dans ces souris, elles reconstituent un nouveau système immunitaire humain dans la souris.
Bénéfices attendus
Concernant le projet CSH souris, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle de différents gènes dans la survenue de syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes) et ainsi une évolution dans la compréhension des leucémies et lymphomes. Pour le projet CSH humain, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B une immunoglobuline (anticorps) thérapeutique.
Procédures
Notre modèle de greffe de CSH murines dans des souris immunocompétentes implique une irradiation (parfois à dose léthale) préalable à l'injection des cellules afin d'obtenir une hypoplasie complète. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine caudale. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection de cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation corps entier léthale. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation léthale peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées léthalement reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes des CSH, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations après CRISPR-Cas9). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Lorsque deux groupes de souris seront comparés, un test de Student (two-tailed) sera utilisé alors qu'un test One-Way ANOVA sera utilisé pour comparer plusieurs groupes ensemble. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » (MGS) (Langford et al. 2010, Nature Methods) correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Cinq paramètres sont évalués et un score allant de 0 (normal) à 2 (modification sévère) est attribué pour chaque paramètre : ouverture des yeux, gonflement du museau, gonflement des joues, position des oreilles, position des moustaches. Si le MGS excède 1.5, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration de buprénorphine (buprénorphine 0.1 mg/kg en sc, aiguille 30G) ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris BRGS (BALB/c_RAG2-/- IL2GammaC-/-_SIRPA.NOD) choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Caractérisation des lésions vasculaires induites par l’infection de SARS-CoV-2 dans un modèle murin humanisé et nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur humain ACE2, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou intraveineuse, reçoivent des injections intrapéritonéales et subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, pour étudier les atteintes vasculaires de la Covid-19. Le porteur indique que l'infection peut provoquer microthromboses, perte de poids de 10 à 20 pour cent et anomalies de comportement, les souris perdant plus de 20 pour cent de leur poids étant mises à mort. Il présente les retombées thérapeutiques comme des pistes et reconnaît utiliser en parallèle des cultures de cellules humaines, tout en affirmant que l'étude ne peut être menée sans administration du virus à l'animal vivant.
Objectifs
La COVID-19 est une maladie virale aiguë causée par le coronavirus de type 2 du syndrome aigu respiratoire sévère (SARS-CoV-2). Le premier site d'infection chez les patients atteints de la COVID-19 est l'appareil respiratoire. Le SARS-CoV-2 infecte les cellules de la muqueuse nasale en se liant à une enzyme appelée ACE2. Outre le poumon, une atteinte multi-organes a été décrite dans les formes graves de la COVID-19, témoignant d’une diffusion du virus dans l’ensemble de l’organisme. Les examens anatomiques après le décès des patients atteints de la COVID-19 ont mis en évidence une atteinte isolée ou prédominante des cellules endothéliales (cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux en contact avec le sang). Cette atteinte se caractérise par l’apparition de petits caillots sanguins, perturbant l’apport sanguin dans les tissus en aval. Bien que mal comprises, ces observations impliquent fortement les cellules endothéliales dans les atteintes multi-organes sévères de la COVID-19. Plusieurs études scientifiques attestent de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection SARS-CoV-2, la compréhension des mécanismes responsables de la COVID-19 et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. La souris n’est naturellement pas sensible à l’infection SARS-CoV-2 car l’ACE2 murine ne reconnait pas le SARS-CoV-2. Afin d’étudier l’infection SARS-CoV-2 chez la souris, un modèle murin de souris humanisée pour l’ACE2 humaine a été développé permettant d’exprimer l’ACE2 humaine en lieu et place de l’ACE2 murine dans un tissu que nous choisissons. Deux modèles de souris transgéniques ACE2 humanisées ont ainsi été générées : 1. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine dans toutes les cellules de l’organisme et 2. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine uniquement dans les cellules endothéliales vasculaires de la souris. En utilisant ces deux modèles, notre projet a pour objectifs : 1) d’établir les conditions expérimentales de l’infection au SARS-CoV-2 en utilisant des doses croissantes de virus à court terme, 2) de caractériser les atteintes des petits et gros vaisseaux par le SARS-CoV-2 à long terme, et 3) d’évaluer l’efficacité d’un traitement visant à diminuer les atteintes vasculaires liées à l’infection SARS-CoV-2 à long terme.
Bénéfices attendus
L’étude chez le rongeur des infections à SARS-CoV-2 est déterminante pour l’élaboration de stratégies de lutte contre la COVID-19 et de ses formes graves. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt d’urgence et de priorité nationale du gouvernement et des organismes publiques de recherche en regard de la pandémie mondiale de la COVID-19. Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’infection SARS-CoV-2 altère la fonction endothéliale, conduit à une atteinte vasculaire multi-organes et offrira de nouvelles pistes de traitements pour lutter contre les atteintes vasculaires graves de l’infection SARS-CoV-2.
Procédures
Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthesiés sous anesthesie générale et soumis à des injections intranasales ou intraveineuses du SARS-CoV-2. Les administrations des molécules pharmacologiques à visée thérapeutique seront réalisées par voie intrapéritonéale chez la souris vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétroorbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chaque intervention décrite est inférieure à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : 1. Anesthésie à l'isoflurane pour l'infection SARS-CoV2 (variant français du Wuah, D614G ou variant Omicron B.1.1.529) = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le reveil) 2. Administration du virus par voie intranasale = stress et inconfort légers de l'animal 3. Administration du virus par voie intraveineuse = stress et douleur légère de la piqure de l'aiguille 4. Prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital de l'animal anesthésié sous isoflurane = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le réveil), douleur légère possible au reveil 5. Atteintes macro- et micro-vasculaire du SARS-CoV-2 = douleur legère à modérée notamment en cas de microthrombose vasculaire et d'altérations locales de l'apport sanguin pouvant conduire à une perte de poids (de 10 à 20%), une altération de l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité) de l'animal.
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
L’étude de l’infection SARS-CoV-2 ne peut être menée sans avoir recours à l’administration du virus à l’animal vivant. De plus notre projet s’intéresse à l'évolution des atteintes tissulaires sur le long terme (2 mois post-infection) de la COVID-19 et aux variations de sensibilité de l’infection SARS-CoV-2 avec l’âge (souris jeunes vs âgées) qui ne peuvent être mimées in vitro. En revanche, des résultats préliminaires de notre laboratoire montrent que le récepteur ACE2 (porte d'entrée du virus dans l'organisme) est fortement exprimé à la surface des cellules endothéliales qui bordent l'intérieur des vaisseaux à l'échelle des petits et des gros vaisseaux chez la souris. La culture cellulaire de cellules endothéliales humaines restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests viraux et fonctionnels préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.
Réduction
Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et de protocoles publiés. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériels biologiques pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Dans notre expérience, des groupes infectés de 6 animaux pour les études virologiques à court terme et de 10 animaux pour les études histologiques et moléculaires à long terme sont suffisants pour répondre à nos questions scientifiques. De le même façon, un nombre d’animaux de n=4 est amplement suffisant pour les groupes non infectés contrôles.
Raffinement
Pour minimiser le stress des animaux, l'inoculation intranasale ou intraveineuse du virus sera réalisée sur des souris anesthésiées. Après l'infection, une surveillance quotidienne effectuée par une personne compétente sur le projet nous permet de savoir si un animal souffre et ainsi de pouvoir envisager une mort anticipée. La mort anticipée sera envisagée sur l'animal a une perte de poids de plus de 20% et présente également une altération de son apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) et/ou un comportement anomal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h post-infection, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation de lignées génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes responsables des effets délétères de l’infection SARS-CoV-2. Elle constitue également un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille et ses cycles de reproduction courts. Les souris transgéniques humanisées pour l'ACE2 humaine développées pour ce projet seront sensibles à l’infection SARS-CoV-2 du fait de l’expression du récepteur humain du SARS-CoV-2 et permettront de mieux comprendre les atteintes vasculaires multi-organes de l’infection SARS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris mâles agées de 6 semaines ou de 8 mois pour répondre à la question de l’influence de l’âge sur le risque accru d’atteintes vasculaires de l’infection SARS-CoV-2.
Exploration chez la souris des mécanismes cellulaires impliqués dans le déconditionnement musculaire, le vieillissement et les mécanismes de protection induits par l’activité physique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un anti-inflammatoire et d'un inducteur de mutation, sont soumises à des tests d'effort sur tapis roulant jusqu'à l'épuisement et à des périodes d'isolement en cage métabolique pouvant provoquer perte de poids et détresse, pour étudier la fonte musculaire liée aux traitements anti-inflammatoires et au vieillissement. Le porteur reconnaît que l'isolement est stressant mais le juge obligatoire pour mesurer l'activité de chaque souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut créer des fibres musculaires adultes et conclut que l'étude ne peut être conduite qu'in vivo.
Objectifs
Le projet se propose de mettre en évidence les mécanismes cellulaires impliqués dans les pertes de masse et de fonctions musculaires induites par les traitements aux antiinflammatoires et le vieillissement ainsi que les mécanismes de protection induit par l’activité physique (endurance et résistance). Le muscle squelettique est composé de fibres à contraction lente, peu fortes et résistantes à la fatigue et des fibres de types rapide, très forte et très fatigables. Basés sur la littérature nous faisons l’hypothèse que : i) les fibres rapides sont plus sensibles à l’atrophie et résistantes à l’hypertrophie , ii) que la sédentarité est un facteur aggravant la perte de masse musculaire, iii) inversement, l’entraînement d’endurance protégerait le muscle de la perte de masse musculairet et favoriserait l’hypertrophie , iiii) une souris génétiquement modifiée qui possède des caractéristiques de souris entraînées va être moins vulnérable face à la perte de masse musculaire et plus sensible à l’hypertrophie induite par les efforts de force et de résistance. Nous proposons ensuite de décrire les mécanismes moléculaires . Nous étudierons également l’effet de l’activité et de la sédentarité exacerbée sur l’atrophie des fibres rapides et la mort des neurones moteurs au cours de la perte de masse musculaire liée à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet aura pour but de mettre en évidence les mécanismes mis en jeu dans la prévention du déconditionnement musculaire induit par un traitement anti-inflammatoire très utilisé chez l’homme. En effet il est connu que le déconditionnement musculaire peut être un facteur d’aggravation de certaines pathologies, ainsi la compréhension des mécanismes de déconditionnement musculaire est de nos jours d’un intérêt socio-économique très important. C'est la raison pour laquelle ce projet est financé en partie par L'Assication Française contre les myopathies. D’autres parts ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes expliquant la mort spécifique des fibres musculaire de type II (permettant les contractions rapides) lors du vieillissement.
Procédures
Les souris subiront les injections de l'inducteur de la mutation génétique et de l'antiinflammatoire. Une contention courte sera effectuée lors de la mise en évidence du rapport de masse maigre/masse grasse par IRM. Les animaux seront soumis à un isolement durant leur entraînement et lors de l’analyse métabolique. L'analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Les animaux seront monitorés et pesés: 3 fois/ semaine (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition corporelle analysée (3 minutes/animal) de manière non invasive 1 fois au début de l'individualisation puis à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances vont être : le test de capacités fonctionnelles sur les tapis et l’isolement dans les cages métaboliques qui pourraient engendrer du stress chez les animaux, l’injection intra-péritonéale de l'anti-inflammatoire. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables de l’isolement peuvent être: la perte de poids et la détresse. Les effets indésirables du traitement avec l'anti-inflammatoire sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement à l'antiinflammatoire qui sera arrèté si un changement important de comportement est observé. Les animaux seront soumis à un isolement. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne nécessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélèvement n'auront lieu sur animal vigile.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences dans un modèle de souris où un gène d’intérêt pour le contrôle génétique de l'expression des différents types de fibres musculaires a été invalidé. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibre musculaire. En effet aucun modèle in vitro à ce jour peut créer des fibres musculaires adultes compte tenu que la formations fibres sont dépendantes des autres cellules de l'organiqme.
Réduction
Les tests statistiques utilisés dans ce projet seront choisis afin de mettre en évidence les effets de l'activité par rapport à la sédentarité ou bien les effets de la modification génétique du type de fibres afin de contrer les effets des anti-inflammatoires. Ensuite chacun des sous groupes seront comparés deux à deux. Les différences seront considérées comme significatives pour une valeur de p
Raffinement
Les animaux isolés en cages métaboliques ou durant la période de 8 semaines d'entraînement auront pour enrichissement la présence de roues dans les cages. L'isolement est obligatoire pour notre expérience car nous devons être sûrs de mesurer l'activité de chaque souris. La période de familiarisation au tapis de course permettra réduire le stress des animaux lors des tests. Lors de l'exercice les souris seront en permanence sous la surveillance de l'expérimentateur qui arrêtera le tapis lorsque la souris se laisse emporter par le tapis trois fois de suite et ne peut plus le remonter. Le tapis sera arrêter si la souris semble gênée dans sa course et qu'elle semble s'être blessée à la patte. Par expérience avec ce tapis de course nous n'avons jamais vu de blessure, cependant dans le cas où cela arriverait elle sera soignée avec de la bétadine et recommencera le test une fois la blessure cicatrisée ou bien retirée du protocole. La déxaméthasone induit une perte de masse musculaire et donc une perte de poids qui est l'effet escompté. Les souris seront réunies par cages de 4 après l'activité pour le traitement à l'anti-inflammatoire afin de ne plus subir l'isolement car il n'est plus nécessaire pour ces expériences. L’enrichissement consistera à placer des nids végétaux, des maisonnettes et bâtonnets à ronger dans les cages. Le comportement général des animaux sera suivi.
Choix des espèces
L’atrophie musculaire induite par les antiinflammatoires et l'adaptation à l'exercice d'endurance (présentes chez l’homme) sont bien démontrées dans le modèle souris. La souris modifiée génétiquement , choisie pour cette étude, est connue pour mimer naturellement en partie les caractéristiques musculaires liées à un entraînement d'endurance. Leur utilisation nous permettra de mieux comprendre les effets de l'activité physique sur la réponse aux traitements aux antiinflammatoires. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. En effet, il a été démontré que chez la souris la structure musculaire adulte est observée dans les 7 à 8 semaines après la naissance. D'autre part, des souris âgées (24 mois) seront utilisées dans un deuxième temps. Il a été montré qu’à cet âge les mécanismes induisant le dysfonctionnement musculaire.
Évaluation de l’efficacité de candidats vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, basés sur le vaccin vivant contre la rougeole
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 930 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou intracérébrales de candidats vaccins ou de virus d'épreuve, dont la grippe et la rage qui peuvent provoquer une pneumonie et une perte de poids jusqu'à 25 %, voire la mort. Le projet évalue chez la souris des vaccins recombinants contre le COVID-19, la grippe et la rage, dérivés du vaccin contre la rougeole. Le porteur indique qu'aucun animal ne peut être réutilisé ou sorti de l'animalerie confinée, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'interaction hôte-pathogène.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser l’évaluation préclinique chez la souris de candidats vaccins élaborés dans notre laboratoire. Ces candidats vaccins sont dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole, qui est l’un des vaccins humains les plus sûrs et efficaces. Pour bénéficier des grands avantages de ce vaccin, nous développons des nouveaux vaccins recombinants ou chimériques construits à partir du génome de la souche Schwarz du virus vaccinal de la rougeole (MV) qui est modifiée pour exprimer un ou plusieurs antigènes des agents pathogènes ciblés. Ces antigènes sont exprimés à partir d’unités additionnelles de transcription (stratégie vaccin recombinant) ou à la place d’antigènes du vaccin contre la rougeole (stratégie vaccin chimère). Ces stratégies ont déjà fait l’objet de nombreuses publications scientifiques par notre équipe et par d’autres. Plusieurs programmes sont poursuivis en parallèle dans le laboratoire. Dans ce projet, nous développons des vaccins recombinants ou chimériques MV-COVID, MV-grippe et MV-rage. Pour chacun des agents pathogènes ciblées, une série de plusieurs candidats vaccins sont construits, produits et caractérisés en faisant varier le choix et la forme des antigènes vaccinaux, la conception du/des transgènes et leur insertion dans le génome de la souche Schwarz avant l’étude in vivo. Les candidats vaccins sont évalués pour leurs capacités immunogènes et protectrice chez des souris de laboratoire ou des souris génétiquement modifiées qui présentent une meilleure susceptibilité aux faibles doses à l’infection par les souches atténuées du virus de la rougeole. En fonction des résultats obtenus chez la souris, des séries successives de candidats vaccins sont produites afin d’aboutir à la sélection d’un ou deux candidats par pathogène ciblé. Cette sélection réduite fera l’objet d’une validation préclinique complémentaire chez le primate non humain puis d’études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins prophylactiques efficaces et améliorés contre plusieurs pathologies infectieuses graves.
Procédures
Une identification par marquage à l’oreille (quelques secondes) en début d’expérimentation. Une à trois administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) ou instillation intranasale (60 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Alternativement, une à deux administrations de substance par injection intrapéritonéale / intramusculaire sur animaux vigiles (20 secondes) puis une seule injection intracérébrale (20 secondes) sur animaux préalablement anesthésiés par injection intrapéritonéale (20 secondes), avec des intervalles de 1 mois. Une à trois prises de sang (10 secondes), avec des intervalles de 1 mois.
Impact sur les animaux
Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du vecteur Ad5-hACE2 suivie de celle du SARS-CoV-2. A l’opposé, l’inoculation de virus grippaux H1N1/H3N2 adaptés à la souris, du virus H1N1 pandémique (2009) ou du virus de la rage (souche CVS) peuvent provoquer une maladie symptomatique, entraînant potentiellement la souffrance. Les virus grippaux induisent une pneumonie virale primaire de symptômes modérés à sévères selon la souche et la dose d’épreuve utilisée, dont les manifestations cliniques vont d’une gêne respiratoire / mobilité réduite / perte de poids transitoire à la mort. La perte de poids peut être importante, jusqu’à 25% du poids d’une souris mâle adulte, tout en restant transitoire et en l’absence de toute autre manifestation clinique chez des souris vaccinées. Le virus de la rage est fortement neurotrope et induit une encéphalite létale après inoculation intracérébrale à la souris, dont les premières manifestations cliniques peuvent être la perte de poids, l’ataxie, un comportement agité et rotatoire, un manque de coordination des pattes et la paralysie. L’inoculation intramusculaire périphérique (membre inférieur) peut provoquer une neuropathie et/ou une paralysie progressive à mesure que le virus progresse vers le système nerveux central (SNC), puis une encéphalite ultimement létale. Pour éviter que les animaux souffrent, des points limites seront établis préalablement à la réalisation des expériences et les animaux seront mis à mort immédiatement après avoir atteint ces points.
Devenir
Une grande partie des animaux seront mis à mort afin d’être prélevés de multiples organes nécessaires pour l’évaluation de l’efficacité des candidats vaccins. Tous les autres animaux survivants seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils auront été immunisés par des vaccins vivants recombinants ou infectés par des virus d’épreuve pathogènes pour l’homme dans une animalerie confinée (A3) : il n’est donc pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ou de les transférer en dehors de l’animalerie.
Remplacement
Ce programme préclinique est au centre de l’activité de notre équipe. Il est primordial car il produit les premières preuves de concept de l’immunogénicité et de l’efficacité des candidats vaccins qui déterminent les phases ultérieures du développement, susceptibles de produire des nouveaux vaccins humains. Aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à l’induction d’une réponse immunitaire par les candidats vaccins vivants puis à la protection contre l’infection pulmonaire par les coronavirus ou les virus grippaux ou contre l’infection du système nerveux central par le virus rabique. En particulier, l'évaluation de l'impact vaccinal sur le contrôle de la charge virale et l’appréciation de l’histopathologie des organes cibles ne peuvent se réaliser que dans des modèles in vivo pertinents qu’il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer par des essais in vitro. Par ailleurs, avant d’entreprendre des études cliniques de phase 1 permettant de cerner l’éventuelle toxicité d’un produit vaccinal administré à l’homme ou de phase 2 permettant d’évaluer son efficacité, c’est une obligation des agences règlementaires de procéder à des études précliniques chez l’animal. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme.
Réduction
Sur la base de discussion avec un biostatisticien, et des tests statistiques appropriés, nous avons planifié d’inclure le nombre minimal d’individus par groupe expérimental qui permette une analyse statistique pertinente et concluante. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les candidats vaccins, nous avons utilisé les moyennes et écart-types géométriques d’expériences antérieures obtenues dans un projet précédent. Les tests considérés sont un test de comparaison de deux moyennes indépendantes pour comparer 2 groupes et un test Anova à un facteur suivis de tests multi-comparaisons pour comparer plusieurs groupes. Grâce à ces données, un logiciel statistique a déterminé la taille optimale des groupes pour un risque alpha de 5% et une puissance de 80-90% : le nombre d’animaux sera ainsi réduit à 6 pour les études d’immunogénicité et 7 pour les études de protection. Par ailleurs, nous utiliserons un modèle d’épreuve par le SARS-CoV-2 déjà mis au point qui ne nécessitera pas de mise au point supplémentaire pour le choix des doses.
Raffinement
Les opérations de vaccination, d’infection, de prélèvement de sang, ainsi que la mise à mort et le prélèvement d’organes seront réalisés par des expérimentateurs formés. La cage des animaux comportera, comme élément d’enrichissement, du coton dentaire, pour que les animaux puissent construire un nid et, dans le cas des animaux infectés, du Diet Gel pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation. La température dans la cage d’animaux infectés sera améliorée au début des symptômes cliniques. Une évaluation clinique sera mise en place à raison de 2 fois par semaine dans le cas des animaux immunisés avec les vaccins rougeole recombinants et une évaluation quotidienne dans le cas des animaux infectés. Si les animaux deviennent cliniquement malades, leur souffrance sera abrégée par leur mise à mort. Selon notre expérience antérieure, l'injection de vecteurs dérivés du vaccin vivant atténué contre la rougeole n’induit aucun signe clinique chez les souris. Il en est de même pour l’inoculation par voie intranasale du SARS-CoV-2 jusqu’au 4ème jour après l’épreuve où les animaux seront mis à mort pour le prélèvement des organes. Pour les procédures d’épreuve de classe sévère (virus grippaux, virus de la rage), nous prendrons soin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux : tout en respectant les conditions qui permettent au projet de recherche d’atteindre ses objectifs, nous définirons à l’avance des points limites spécifiques de chaque agent infectieux et les animaux seront mis à mort dès que les points limites seront atteints.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte efficacement que les primates. Un modèle rongeur pertinent a donc été développé. Les souris déficientes pour le gène du récepteur d’un médiateur de l’inflammation, les interférons de type I (IFNAR) sont susceptibles à l’infection par les souches vaccinales du virus de la rougeole. Elles peuvent également exprimer le récepteur humain de ce virus, améliorant encore leur susceptibilité aux faibles doses. Nous pensons que certains candidats vaccins basés sur le vaccin contre la rougeole seront capables de se multiplier chez la souris non génétiquement modifiée . Dans ce cas, nous aurons principalement recours à plusieurs lignées de souris de laboratoires qui sont des modèles reconnus pour le SARS-CoV-2, les virus grippaux et le virus rabique. Des souris de 5-7 semaines d’âge seront commandées. Après une semaine de stabulation, les souris seront immunisées pour l’étude de l’immunogénicité des vecteurs vaccinaux ou immunisées et infectées pour l’évaluation de l’efficacité vaccinale. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire de ces petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant leur vie d’adulte.
Identification des réseaux neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne grâce à l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
260 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. On leur induit une douleur cornéenne chronique, soit par excision des glandes lacrymales sous anesthésie, soit par dépôt répété de chlorure de benzalkonium, avant imagerie fonctionnelle du cerveau et prélèvement. Le projet vise à identifier les réseaux neuronaux de la douleur cornéenne, que le porteur décrit lui-même comme provenant du "générateur de douleur le plus puissant" de l'organisme. Il affirme que cette douleur chronique ne peut être modélisée qu'au niveau de l'animal entier.
Objectifs
La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires sub-aigües et chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux impliqués sont encore très mal identifiés en raison des difficultés techniques en recherche préclinique où l’étude des réseaux neuronaux chez le petit animal reste complexe. Ce projet a pour but de mettre en évidence et mieux comprendre les réseaux de neurones et leurs dysfonctionnements en lien avec une douleur cornéenne chronique et sub-aigüe. A cette fin, nous enregistrerons les activités cérébrales suite à des stimulations cornéennes, dans des modèles murins d’une douleur oculaire sub-aigüe ou d’une douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
La prise est charge de la douleur oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces notamment dans le cadre de douleurs sub-aigües ou chroniques. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.
Procédures
Les animaux subiront soit une chirurgie pour le modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes soit le dépôt d’une goutte de chlorure de benzalkonium pour le modèle de douleur oculaire inflammatoire. Ils seront ensuite passés en imagerie fonctionnelle ultrasonore puis les cerveaux seront prélevés. Deux modèles animaux seront utilisés dans ce projet : 1) Modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes Les animaux développant une sécheresse oculaire sont des modèles d’une maladie humaine. Elle sera induite chez l’animal par excision des glandes lacrymales. Il s’agit d’une douleur cornéenne difficile à soigner. Les animaux sham subiront la chirurgie sans excision et donc ne développeront pas la maladie. Les animaux « naïfs » ne subiront aucune chirurgie. La chirurgie se fait sous anesthésie générale avec une analgésie appliquée en pré-, per- et post-opératoire. La chirurgie ne se fait que sur un des deux yeux. Elle dure 15 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Les animaux seront suivis régulièrement après la chirurgie pour vérifier leur état général (poids) et l’état de la plaie. 2) Modèle de douleur oculaire inflammatoire par instillation du chlorure de benzalkonium Les animaux contrôles de ce modèle recevront une goutte deux fois par jour de tampon phosphate salin (solution neutre) dans l’œil droit durant 7 jours. Les animaux modèles recevront une goutte de chlorure de benzalkonium deux fois par jour dans l’œil droit durant 7 jours. Le dépôt de la goutte se fait sur un animal vigile en contention manuelle et le temps pour réaliser le dépôt et la contention de l’animal est de 20 secondes. Ces animaux modèles développeront une douleur oculaire. - IMAGERIE fUS : L’ensemble des animaux auront une session d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui durera 2h par animal et qui se fera sous anesthésie générale. L’ensemble des tests réalisés durant l’imagerie seront donc fait sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
- Dans le modèle de sécheresse oculaire, Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. La chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post-opératoire qui disparaitra en quelques jours. La douleur post-opératoire sera prise en charge par un traitement adapté. - L’instillation topique bi-quotidienne du chlorure de Benzalkonium durant 7 jours correspondent classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. C’est un conservateur. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritations : sensation de corps étranger, de picotement ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. - Imagerie fUS : l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal : température, fréquences cardiaques et respiratoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable. Notre projet de recherche porte sur les l’étude de réseaux neuronaux complexes présents dans un cerveau entier. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur traitement, une première étape nécessite l’utilisation de rongeurs.
Réduction
Nous utiliserons 260 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22+/-2 degrésCelsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour et 12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites (grille de suivi). Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié (chirurgie ou imagerie fonctionnelle ultrasonore fUS) présente une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement l’euthanasie de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique.
Choix des espèces
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Ce projet de recherche portant sur la douleur oculaire nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines dont les circuits neuronaux sont établis. Les animaux arriverons donc à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.
Modélisation de comportements complexes de type autistique chez la souris et impact de l’obésité induite pendant la grossesse en utilisant la vision par ordinateur et des approches d’apprentissage en profondeur
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
676 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Certaines subissent un tatouage, une amputation de la queue et l'implantation d'une puce radiofréquence, et un groupe de femelles reproductrices est soumis à un régime riche en graisses, avant enregistrement des comportements sociaux dans un dispositif de suivi vidéo. Le projet, de recherche fondamentale, modélise des comportements de type autistique et l'effet de l'obésité gestationnelle. Le porteur classe l'amputation de la queue parmi les gestes légers tout en reconnaissant qu'elle provoque stress et douleur, et affirme que le comportement ne peut s'étudier qu'in vivo.
Objectifs
Le trouble du spectre de l’autisme (TSA) désigne un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par : 1) des déficits de la communication sociale et 2) la présence de comportements répétitifs et des intérêts restreints. L'étiologie des TSA serait déterminée par la combinaison de plusieurs facteurs : génétiques et environnementaux. Parmi ces facteurs environnementaux, l’obésité maternelle représente un facteur de risque important. Le diagnostic des TSA repose essentiellement sur l’observation d’un comportement « anormal » durant les deux premières années de vie et notamment le comportement social. Ce dernier est un comportement très complexe dont l’étude requiert un niveau de détails élevé et l’accès à l’observation de plus de 2 animaux interagissant de manière libre pendant une longue période de temps. Pour étudier ce comportement et répondre à ces critères, nous proposons d’utiliser un système qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de 4 souris pendant plusieurs jours. Dans ce projet, nous souhaiterions modéliser des comportements complexes de type autistique sur 5 modèles de souris portant chacun l’inactivation d’un gène impliqué dans des pathologies avec TSA. Ce projet s’articule autour de 4 objectifs : Objectif 1 : Modélisation de comportements complexes de type autistique chez 2 modèles murins de TSA à différents stades du développement. Objectif 2 : Etudier l’effet de l’inactivation du gène associé au TSA dans certains types de neurones sur les interactions sociales et les comportements répétitifs respectivement. Objectif 3 : Etudier l’effet de la réexpression du gène cité précédemment sur les comportements complexes de type autistique. Objectif 4 : Etudier l’impact d’un surpoids gestationnel sur des comportements complexes de type autistique chez la descendance du modèle murin de TSA. En effet, la variabilité des symptômes autistiques pour une même mutation peut être expliquée par la contribution de facteurs environnementaux. Dans ce projet, nous proposons de tester l'hypothèse que le surpoids gestationnel pourrait être un facteur aggravant.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, l'identification de nouveaux comportements complexes associés aux troubles du spectre de l'autisme observés chez des souris en « semi-liberté » sur des modèles génétiques de l’autisme, sur un modèle avec obésité gestationnelle (connue pour être un facteur de risque), et sur des modèles combinant les facteurs génétiques et obésité gestationnelle. L'obésité représente un enjeu majeur de santé publique dont l'incidence est en nette augmentation en France depuis 1997 avec des conséquences graves sur la santé cardiovasculaire, métabolique et neurologique. Plus précisément, le taux de surpoids et d'obésité atteint 32% chez les femmes en âge de procréer ou enceintes. Par conséquent, la mesure de l'impact d'un surpoids/obésité gestationnel, est importante car elle peut démasquer ou aggraver l’effet des mutations génétiques. Il est nécessaire de mettre en évidence ces conséquences sur les symptômes de type autistique qui sont de plus en plus fréquents chez les enfants.
Procédures
Dans ce projet, certains animaux subiront différentes interventions légère unique pour les identifier (tatouage, caudectomie, implantation d'une puce radiofréquence en sous-cutanée) permettant de les identifier et un lot de femelles reproductrices sera soumis à un régime riche en graisses sur une période 6 semaines. Dans tous les cas, des mesures adaptées ont été prévues pour pallier aux nuisances éventuelles occasionnées par ces procédures.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, certaines expérimentations sont susceptibles d'induire du stress (tatouage, anesthésie, implantation de la puce radio fréquence) ou du stress et de la douleur (caudectomie). Les enregistrements vidéo dans le système Live Mouse Tracker (LMT) qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de plusieurs souris pourrait induire un stress lié au changement d’environnement. Le régime riche en graisses pourrait produire de l'anxiété mais ce n'est pas évident sur une période courte de 6 semaines.
Devenir
Les animaux enregistrés dans le système Live Mouse Tracker (LMT) et les animaux soumis au régime riche en graisses seront sacrifiés pour réaliser des prélèvements pour des analyses immunohistochimiques et histologiques.
Remplacement
Dans ce projet, nous nous intéresserons essentiellement à l'étude du comportement social. Le comportement est un ensemble d'actions réalisés par un être vivant, les modèles in vitro (culture cellulaire par exemple) ne permettant pas d'étudier le comportement, le modèle animal reste donc notre seule alternative. De plus, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite une validation sur des modèles précliniques (modèles animaux). Par conséquent, l'utilisation d'un modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs de notre étude. Il est à noter que l'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisé.
Réduction
Ce projet sera réalisé sur plusieurs étapes successives. Le nombre de souris générées pour cette étude (20 souris par groupe, par sexe et par génotype) a été établi à partir d'études comportementales réalisées précédemment se basant sur des tests de puissance statistiques (http://powerandsamplesize.com/Calculators/) ainsi que sur les données de la littérature utilisant ce système. Etant donné que l’utilisation du Live Mouse Tracker (LMT) est une procédure non-invasive, les mêmes souris seront utilisées aux différents âges pour l’étude comportementale. Ces mêmes animaux seront utilisés pour les études immunohistochimiques. De plus, l'utilisation d'animaux dans certaines expérimentations sera conditionnée par les résultats obtenus dans d'autres expérimentations. En effet, si les résultats de cette dernière sont positifs (altérations comportementales), alors nous réaliserons les expérimentations suivantes et le nombre de souris utilisé sera alors établi grâce à l'utilisation de tests de puissance statistiques.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification, un accès illimité à l'eau et la nourriture, la présence d'objets (tunnel) et un nombre limité de souris par cage (4 souris par cage). Pour notre étude, il est nécessaire de constituer des groupes de 4 souris de même sexe et de même âge par cage pour l'étude comportementale. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur. Les expérimentations induisant une douleur seront toutes réalisées sous anesthésie (locale et générale). Les animaux seront surveillés quotidiennement (poils, posture, activité dans la cage ...) et le poids pris régulièrement. Une grille de score (jointe en annexe) sera mise en place pour la surveillance des animaux. Si un animal montre un score classé comme bénin à modéré, il sera surveillé plusieurs fois par jour et l'administration d’un AINS (anti-inflammatoire non stéroidien) en sous-cutanée et/ou d’un morphinique en sous-cutanée sera envisagée. L'arrêt de la nourriture riche en graisse sera également considéré pour les animaux avec surpoids gestationnel. Si aucune amélioration n'est observée et que l'état de l'animal se détériore, une mise à mort sera alors réalisée.
Choix des espèces
Les souris représentent des modèles robustes pour étudier différentes pathologies dont les TSA. Tout d'abord, les souris sont des animaux très prolifiques avec des temps de génération courts et des portées assez conséquentes facilitant l'étude de cohortes de plusieurs animaux. De plus, l'espérance de vie des souris est courte permettant d'étudier différents stades de développement en moins d'un an. Et enfin, les outils génétiques utilisés chez la souris permettent de générer les mêmes mutations génétiques retrouvées chez l'Homme mimant ainsi un certain nombre de symptômes et motivant la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, les animaux seront utilisés à 3 stades de développement différents : 1) Stade juvénile (entre le 35ème jour de vie postnatale (P35) et le 40ème jour de vie postnatale (P40)) : Pour identifier des altérations précoces du comportement (de type autistique). En effet, les TSA apparaissent durant les 2 premières années de vie chez l'Homme. 2) Stade adulte (3 à 4 mois) : Pour évaluer la progression des altérations comportementales présentes au stade juvénile et/ou l'apparition de nouvelles altérations comportementales. 3) Stade de vieillissement (>18 mois) : Pour identifier des altérations comportementales similaires à celles observées dans certaines maladies neurodégénératives telle que la maladie d'Alzheimer. En effet, les patients atteints de certains syndromes autistiques (syndrome de Down ou le syndrome de Prader-Willi) développent une démence ou un déclin cognitif après 40 ans.
EU1/2: Evaluation immunopathologique de l’impact de la comorbidité cardiovasculaire sur le développement d’une forme grave de la Covid-19.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe qui induit une hypertension et une insuffisance cardiaque, puis une infection au SARS-CoV-2 par voie intranasale, avec échographies et prélèvements sanguins. Le porteur indique que les souris sont transférées vivantes à des partenaires avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Il présente ce modèle comme une future plateforme d'évaluation préclinique à proposer aux laboratoires académiques et industriels.
Objectifs
Les coronavirus constituent une grande famille de virus à l'origine de maladies allant du simple rhume à des maladies plus graves comme le MERS ou le SRAS. La pandémie du coronavirus 2019 (COVID-19), causée par le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a touché des millions de personnes dans le monde entier, déclenchant un effort sans précédent de la part de la communauté scientifique pour comprendre le fondement biologique de la physiopathologie du SARS-CoV-2. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France étaient âgées de 75 ans ou plus. Dans le contexte d'une infection au SARS-CoV-2, une association d'une maladie grave avec l'âge et/ou les comorbidités préexistantes comme l'hypertension, les maladies cardiaques mais aussi le diabète/obésité et les maladies respiratoires chroniques associée peut entraîner le décès. En outre, près d'un quart des personnes décédées du COVID-19 souffraient d'hypertension artérielle, et un tiers de maladies cardiovasculaires, parmi lesquelles l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de profiter de la complémentarité des centres de recherches nationaux pour évaluer les effets des comorbidités liées aux maladies cardiovasculaires (MCV) sur la sévérité de l'infection par COVID-19 et l'efficacité des thérapies antivirales dans ces condition en utilisant un modèle préclinique de souris humanisé par le récepteur aux virus du COVID-19. Ce modèle animal de souris humanisés sera fourni par nos partenaires à Marseille et ils nous aidera à mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et les facteurs influençant sa gravité du point de vue des réponses immunitaires innées et adaptatives suscitées par l'infection par le SARS-CoV-2 afin de connaitre les réponses conduisant à une amélioration des symptômes mais aussi celles susceptibles de contribuer à la maladie, la gravité et la mort.
Bénéfices attendus
Les modèles de souris fourniront non seulement des informations clés sur les mécanismes pathogènes de la maladie COVID-19 chez les malades atteints de maladies cardiovasculaires et d'hypertension, mais pourront également servir de plateformes d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Ces modèles seront proposés aux laboratoires académiques et industriels comme modèle d’étude préclinique en vue de mise en place de prestation de service.
Procédures
Les animaux subiront 2 échographies de 10 à 15 minutes, une avant et une après challenge pharmacologique sous anesthésie gazeux pour étudier leurs fonctions cardiaques. Des prélèvements sanguins de 2 minutes seront réalisés à la veine temporale superficielle sur animaux vigiles après chaque echographie. Une implantation de mini pompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical pour diffuser le traitement pharmacologique, cette procédure peut prendre jusqu'à 20 minutes par animal. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris. Après l'envoie des animaux à Marseille, ils subiront une infection au SARS-CoV-2 par injection intra-nasal pour chaque animal, c'est une procédure qui peut prendre jusqu'à 30 min car elle sera couplé à l'utilisation de l'anesthésie et la manipulation dans la plateforme BSL3 dédié à l'utilisation des virus de ce type. A la fin du protocole, le sang et les organes des animaux seront perfusés et prélevés pour réaliser un immunophenotypage complet.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections intrapéritonéales et des incisions sur la peau pour l'implantation de mini pompes en sous cutanée. Ce traitement induira de l'hypertension artérielle et une insuffisance cardiaque et peut causer des symptômes d'hyperthermie et de gêne respiratoire. Les souris subiront par la suite une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie peuvent apparaitre. En fin d'expérimentation et selon les protocoles mis en place, elles peuvent subir une perfusion intracardiaque afin de récupérer des tissus sans globules rouges (poumons, cœur, cerveau) pour réaliser des immunomarquages et visualiser spécifiquement dans la cellule en microscopie optique.
Devenir
Toutes les souris seront transférées en vie à nos partenaires, les souris seront mises à mort après pour prélèvements d'organes et de tissus afin d'étudier le profil de leur système immunitaire.
Remplacement
Outre la production d'un modèle préclinique de souris pour le Sars-CoV-2, nous voulons tester l'impact de la comorbidité cardiovasculaire sur la gravité de la maladie après infection. Ce modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du COVID19 et l'impact de la comorbidité, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immunitaire. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles animaux.
Réduction
Dans la mesure du possible les témoins infectés sans traitement seront utilisés pour plusieurs prestations. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 45 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 40 et 50 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 180 animaux (90 souris hétérozygote K18-hACE2 et 90 WT) dans chaque groupe on aura 45 souris mâles et 45 souris femelles, recevant une mini pompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments : un dôme en carton pour leur procurer un abri, de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Comme notre objectif final est d'étudier la réponse immunitaire, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris. En effet, ces molécules pourraient interférer avec nos résultats et masquer l’expression des marqueurs d’intérêt. Avant l'expérimentations les souris seront traités avec un morphinique antidouleur et les expérimentations seront réalisée sous anesthésie. Après la mise en place des mini pompes et tout au long de l'expérience, un antalgique sera mis dans l'eau de boisson et les animaux seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation et selon les recommandations vétérinaires. Chaque semaine, les souris seront pesées et évaluées pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique et une grille de score serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 10% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, et/ou un score à partir de 12 sur la grille de score entrainera une mise à mort immédiate de l'animale.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront âgés de 9 semaines, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente sur le même modèle
Impact d’un complexe organométallique à base de fer sur la réponse immunitaire antitumorale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
42 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses au flanc, puis des injections intraveineuses d'un complexe à base de fer, la croissance de la tumeur étant suivie au pied à coulisse quatre fois par semaine et limitée à 1 000 mm3. Le projet vise à évaluer l'effet de ce composé sur la réponse immunitaire face à un cancer du sein. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'étudier le microenvironnement tumoral et retient un modèle de souris à système immunitaire fonctionnel.
Objectifs
Les cancers du sein représentent la première cause de mortalité induite par cancer chez la femme (INCA, 2022). Malgré les progrès dans leur diagnostic et leur traitement, certains ont encore un pronostic défavorable notamment lié à l’apparition de résistances aux thérapies associées à une baisse de l’efficacité du système immunitaire antitumoral. Parmi les cellules immunitaires, les macrophages infiltrent rapidement la tumeur. A l’issue de leur activation, les macrophages peuvent acquérir soit des capacités antitumorales, soit propriétés pro- tumorales. Au sein d’une tumeur, le microenvironnement tumoral favorise les propriétés pro-tumorale des macrophages et ces derniers sont donc associés à un mauvais pronostic. C’est pourquoi, trouver de nouvelles pistes thérapeutiques favorisant les propriétés antitumorales de macrophages constitue un enjeu majeur en cancérologie. Dans ce contexte, nos travaux actuels sur de nouveaux complexes organométalliques à base de fer montrent une activité anticancéreuse intéressante. Parmi ces composés, un entraîne un arrêt de la prolifération cellulaire et favorise les capacités des macrophages à éliminer les cellules cancéreuses. C’est pourquoi, il est désormais fondamental de faire la preuve de concept de l’efficacité de ce composé sur organisme vivant (souris) afin d’évaluer son impact sur la réponse immunitaire antitumorale, notamment des macrophages, mais également des autres cellules du système immunitaire.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de ce composé sur le système immunitaire et plus particulièrement sur les macrophages lors de la mise en place d’une réponse immunitaire antitumorale permettra, en parallèle, d’appréhender l’action de ce composé sur le microenvironnement tumoral, avec une potentialisation du système immunitaire, pouvant conduire à une résorption de la tumeur.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection unique de cellules cancéreuses au niveau du flanc pour développer le modèle. Une fois que les tumeurs auront atteint un volume d’environ 200 mm3, les souris recevront une injection unique (0,5 mg/kg) ou trois injections à 4 jours d’intervalle (0,15mg/kg) en intraveineuses de notre composé à base de fer. Les souris contrôles recevront trois injections intraveineuses, à 4 jours d’intervalle, de sérum physiologique. Cette expérience durera soit 14-17 jours à compter de l’injection des cellules cancéreuses (pour étudier les effets précoces du composé sur la réponse immunitaire antitumorale), soit 22-25 jours (pour étudier les effets plus tardifs du composé sur la réponse immunitaire antitumorale). Au cours de cette expérience, un suivi de la croissance tumoral sera réalisé à l’aide d’un pied à coulisse 4 fois par semaine. Donc, dans le cadre de cette expérience, les 42 souris utilisées seront utilisées pour une durée totale de 14-17 jours pour 21 souris et 22-25 jours pour 21 souris. Le temps de chaque intervention, injection des cellules cancéreuses, injection du composé et mesure de la taille des tumeurs se fera en moins de 5 minutes par souris (soit 4 interventions pour chaque souris concernant les injections, plus les mesures de la taille des tumeurs 4 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Les injections (sous-cutanée et intraveineuses), ainsi que la contention des souris nécessaire pour réaliser ces injections, nécessaire pour l’ensemble de la procédure (développement tumoral et injections du composé) peuvent entrainer un état de stress chez ces dernières. C’est pourquoi nous avons choisi d’effectuer ces gestes sur souris anesthésiées. Un suivi quotidien des animaux (évaluation du comportement, alimentation, hydratation) et l’évaluation 4 fois par semaine de la courbe de poids ainsi que de la croissance tumorale (à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile) ne provoquera pas de nuisance et permettra la surveillance d’apparition des points limites définis Le développement de la tumeur sur le flanc (qui sera limité à un volume maximal de 1000 mm3) pourrait provoquer une gêne légère de la souris – c’est pourquoi déplacements et activité seront particulièrement observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et les ganglions lymphatique drainant ou non le site tumoral
Remplacement
Aucune méthode alternative de remplacement ne permet de satisfaire l’objectif de Remplacement à notre connaissance. Afin d’étudier les régulations du système immunitaire en condition tumorale, nous avons besoin d’un modèle prenant en considération l’environnement des cellules immunitaires (à savoir les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire) ou encore le microenvironnement tumoral qui module de façon très spécifique la réponse immunitaire antitumorale. A ce jour, seules les expériences in vivo permettent de prendre en considération l’ensemble de ces paramètres.
Réduction
Grâce aux injections sous-cutanées de cellules tumorales dans un flanc de la souris, nous pouvons utiliser les ganglions lymphatiques qui ne drainent pas le site tumoral comme contrôle (cellules immunitaires non activées par les cellules cancéreuses), en comparaison avec les cellules immunitaires des organes lymphoïdes drainant le site tumoral (donc cellules activées). Cela permet de réduire le nombre de souris en évitant d’ajouter un groupe de souris « contrôle » (sans tumeur). L'effectif du nombre d'animaux requis par groupe expérimental a été calculé par une approche statistique, en nous basant sur des études similaires menées au sein de notre laboratoire. Ainsi, ce projetrequerra 7 souris / groupe expérimental (dont 3 groupes pour le temps précoce et 3 groupes pour le temps « tardif »), soit un total de 42 animaux.
Raffinement
Les souris femelles seront hébergées par 5 en cages filtrées, à une température de 22±2°C et une humidité relative de 50±20%. Les souris seront soumises à un cycle lumière-obscurité inversé de 12h. Elles auront accès ad libitum a eau et nourriture et disposeront d’un enrichissement adapté à leur besoin. Les expérimentations débuteront après une période d’acclimatation de 7 jours aux conditions de l’animalerie. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés afin de limiter le stress engendré par la contention. Des critères d'arrêt anticipé de l'experimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifies. Dès qu’un des points limites est atteint la souris en question sera écartée du protocole et des anti-inflammatoires ou analgésiques seront administrés à l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
Au cours de ce projet, il est indispensable de travailler avec des souris possédant un système immunitaire fonctionnel pour étudier la régulation de ce système. Le modele de souris Balb/c, est le modele animal le plus approprie pour éviter un rejet de greffe des cellules cancéreuses 7 semaines : adulte, poids d’environ 18-20 g. La veille bibliographique réalisée sur les études in vivo établies à partir de modèle de cancer mammaire démontrent l’utilisation de souris femelles Balb/c âgées de 6-8 semaines
Alternative d’immunisation avec pistolet à gène (gene gun) chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 400
800 animaux non-humains, 400 souris et 400 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des immunisations par pistolet à gènes deux fois par semaine pendant jusqu'à 25 semaines, avec des prélèvements sanguins réguliers, les souris prélevées vigiles à la veine maxillaire et les rats sous anesthésie. Le porteur indique que le pistolet à gènes provoque une rétraction de la peau, une irritation et une douleur locale, et qu'aucun animal ne sera gardé en vie. Il affirme qu'un modèle in vitro ne reproduirait pas la complexité de la réponse immunitaire.
Objectifs
La préparation aux pandémies est un bien public mondial. Les menaces de maladies infectieuses ne connaissent pas de frontières. De même, des maladies telles que le cancer, les maladies auto-immunes et la résistance aux antibiotiques constituent un risque mondial. Des efforts sont donc en cours pour développer des vaccins plus efficaces et plus spécifiques. L'enjeu est de taille car les progrès scientifiques et la maîtrise des procédés de génie génétique ont permis de concevoir des molécules de plus en plus efficaces à des coûts avantageux. Les anticorps monoclonaux produits in vitro étaient coûteux et échouaient lors des essais cliniques. Ainsi, le développement des vaccins plus efficaces et plus spécifiques, tels que les vaccins à ADN sont donc mis en avant. Ces vaccins produisent, in vivo, une immunité spécifique à l'antigène et font l'objet d'intenses recherches. Alors que les vaccins traditionnels reposent sur la production d'anticorps par l'injection de virus atténués, de particules virales mortes ou de protéines recombinantes, les vaccins à ADN peuvent être construits pour fonctionner de manière fiable tout en conservant la spécificité du vaccin. Les vaccins à ADN sont non vivants, non réplicatifs et présentent un faible risque de réversion pour provoquer une forme de la maladie en question ou une infection secondaire. En outre, les vaccins à ADN sont très flexibles et peuvent coder de multiples gènes (virus, bactéries et protéines). L'objectif de cette étude est de comparer l'efficacité de différentes méthodologies d'immunisation chez le rat et la souris par la production d'anticorps neutralisants.
Bénéfices attendus
Le principal avantage de ce projet est le développement de vaccins plus efficaces et plus sûrs grâce à la validation de la méthode d'immunisation par le "gene gun".
Procédures
Les animaux seront soumis aux protocoles d’immunisation avec l’utilisation du pistoler à gènes sous pression qui envoie des molécules d'ADN à travers la barrière épidermique et/ou muqueuse. Ce type d’immunisation est réalisé sous anesthésie. Lors de ce protocole, les animaux contrôles recevront les injections des éléments d’essais par une des voies dites classique, à savoir : sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou orale. Afin que les résultats puissent être comparables, les animaux contrôles seront également anesthésiés. Les immunisations seront réalisées 2 fois/semaine. La durée maximale du protocole d’immunisation et des injections est 25 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus avant immunisation et toutes les 2 semaines pendant le protocole d’immunisation dont la durée maximale est de 25 semaines. Les rats seront prélevés en veine sublinguale sous l’anesthésie générale. Les souris seront prélevées en veine maxillaire en vigile. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes circulants et à ne pas dépasser 15% du volume circulant. A la fin du protocole les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie pour le prélèvement d’organes.
Impact sur les animaux
L'anesthésie induit une baisse de la température corporelle. Le traitement par pistolet à gènes induit une rétraction temporaire du pis, une irritation temporaire de la peau et une douleur locale (légère et temporaire). Les voies d'immunisation conventionnelles, telles que les voies sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, orale et intraveineuse, peuvent induire une irritation et une douleur cutanées (locales et temporaires). La prise de sang chez la souris par la veine mandibulaire est effectuée avec l'animal éveillé. La contention peut générer un stress momentané, contrôlé par les opérateurs. La douleur locale est minime et temporaire, et les animaux ne montrent généralement pas de signes de souffrance (ils recommencent rapidement à explorer la cage, à manger et à boire). La prise de sang chez le rat est réalisée sous anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude, des organes tels que la rate, la moelle osseuse et les lymphonodes peuvent être prélevés après sacrifice par dislocation cervicale sous anesthésie. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.
Remplacement
La vaccination permet de développer une réponse immunitaire de mémoire qui est à ce fin protectrice. La réponse immunitaire est complexe, mettant en jeux plusieurs types cellulaires : les cellules présentatrices d’antigènes, les cellules T, les cellules B, entre autres avec des activités biologiques différentes. Un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire ces mécanismes complexes, et ne permettrait pas de montrer le potentiel et la puissance du vaccin ainsi que les effets indésirables.
Réduction
Le nombre total d'animaux (800) utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre ses objectifs, c'est à dire avoir une production de anticorps neutralisants et protecteurs après le protocole d'immunisation. Le nombre d'animaux par groupe, un échantillon minimum de 10 animaux/groupe, a été choisi pour cet essai préclinique de vaccin sur la base d'études antérieures, en raison de l'efficacité accrue des vaccins ADN avec le protocole d'immunisation par pistolet à gènes.
Raffinement
Nous réalisons le protocole sur des animaux anesthésiés. Afin d'éviter tout impact négatif de l'anesthésie sur l'animal, la durée de la procédure n'excède pas 10 minutes, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les concentrations anesthésiques sont adaptées à chaque espèce. Le personnel est formé à l'utilisation du pistolet à gènes, afin d'assurer un contrôle adéquat de la technique et de la procédure. Pour les voies d'immunisation conventionnelles, les volumes d'administration et le type d'aiguille ou de canule sont adaptés à l'espèce et au site d'injection ou d'administration. Toutes les voies d'administration conventionnelles chez les rats et les souris seront effectuées sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux et de garantir des conditions égales entre les groupes. Les mesures de raffinement pour les prélèvements répétés concernent le respect du volume circulant total et une période de récupération de 2 semaines. Les prélèvements dans les veines sublinguales des rats sont réalisés sous anesthésie, avec une pression sur le site de prélèvement en fin de procédure pour prévenir le risque de saignement. Chez la souris, la veine maxillaire est choisie et les prélèvements sont effectués tous les quinze jours, de manière à ne pas anesthésier les animaux et à prélever un volume suffisant, en alternant les deux côtés pour permettre un temps de récupération. La surveillance quotidienne des animaux, le contrôle de leur poids et l'observation clinique permettront d'identifier le plus tôt possible tout signe de douleur, de souffrance ou de stress. Les animaux seront hébergés en groupes et des enrichissements spécifiques à l'espèce seront systématiquement fournis et/ou ajoutés si nécessaire (par exemple, en cas de comportement agressif). La nourriture sera placée au fond de la cage pour faciliter l'alimentation.
Choix des espèces
Les rats et les souris peuvent bénéficier d'un protocole de vaccination destiné à stimuler largement le système immunitaire humoral. Une étude a montré que les anticorps naturels issus des sérums de rats immunisés ont produit une grande variété de production et une liaison totale supérieure à celle des anticorps naturels provenant des sérums de rats non immunisés. Cela indique que chez les rats de laboratoire, l'immunisation est associée à un plus grand répertoire d'anticorps naturels et à une liaison plus forte des anticorps. D'autres études plus récentes montrent chez la souris et le hamster et même chez l'humain le grand répertoire d'anticorps neutralisants produits par immunisation. Les animaux arrivent dans nos locaux à partir de 8 semaines d'âge. Après 1 ou 2 semaines d’acclimatation, en fonction de leur origine ils seront donc au stade adulte, et leur système immunitaire aura atteint sa pleine maturité.
Impact du développement d’une tumeur du pancréas sur le système musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
648 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent jusqu'à cinq injections intrapéritonéales et jusqu'à six mesures de force musculaire sous anesthésie, tandis qu'une tumeur du pancréas se développe et peut entraîner une perte de poids. Le projet, de recherche fondamentale, vise à comprendre comment la tumeur affaiblit le muscle. Le porteur indique avoir déjà mené des cultures cellulaires et affirme que l'analyse des tissus rend le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
Le développement d’une tumeur au sein du corps humain a des répercussions sur l’organisme entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur réduit la force et la masse musculaire mais les mécanismes biologiques sont encore mal connus. L’objectif du projet est d’évaluer l’impact du développement d’une tumeur du pancréas sur le système musculaire chez un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Le développement d’une tumeur dans l’organisme a pour conséquence d’induire une fonte et une faiblesse du tissu musculaire qui réduit la qualité et la durée de vie des patients et diminue l’efficacité des traitements. Le projet vise à améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans ces dysfonctionnements musculaires, et éventuellement, d’identifier de nouveaux processus biologiques comme cibles thérapeutiques potentielles
Procédures
Les souris sont soumises à des injections intrapéritonéales (5 maximum) et à un protocole de mesure de force musculaire (6 au maximum, anesthésie générale de 5-10 minutes)
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables légers à modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections, anesthésies, mesure de force musculaire), qui induisent du stress. Le développement de la tumeur peut induire une perte de poids de corps et diminuer les défenses immunitaires
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant
Remplacement
Des analyses in vitro, utilisant des cultures cellulaires ont déjà été réalisées afin d’établir une évidence des processus biologiques. Afin de démontrer la pertinence des résultats, l'analyse des tissus ou des cellules de l’animal est indispensable
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des mesures de la force musculaire sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de la mesure de la force musculaire. Des fibres de peuplier, du coton et un igloo seront placés dans les cages d’hébergement pour favoriser la nidification des souris et leur bien-être. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture avec le développement de la tumeur. Une grille de score est utilisée pour déterminer les points limites. Notre expérience montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que l’ensemble des animaux soit inclus dans l’étude
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.
Thérapie ciblant le récepteur de haute affinité pour l’immunoglobuline E pour traiter l’asthme allergique chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
768 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur induit un asthme par inhalation d'acariens, on leur administre une molécule antisens par voie sous-cutanée ou par inhalation, puis on ouvre leur trachée sous anesthésie pour mesurer leur capacité pulmonaire avant un lavage bronchoalvéolaire. Le projet vise à tester une stratégie ciblant un récepteur de l'immunoglobuline E pour traiter l'asthme allergique. Le porteur indique avoir validé ces molécules in vitro sur des mastocytes, et retient la souris parce que le modèle d'asthme induit par les acariens y est bien décrit.
Objectifs
Les manifestations allergiques, qui peuvent être cutanées (dermatite), respiratoire (asthme), digestives (allergies alimentaires) ou généralisées (anaphylaxie), sont causées par l’activation d’un certain type de cellules appelées « mastocytes » qui relarguent des médiateurs de l’inflammation responsable de ces pathologies. Cette activation du mastocyte nécessite l’agrégation du récepteur récepteur immunitaire allergique. Notre objectif est de tester une nouvelle stratégie thérapeutique qui utilise une petite séquence d’ADN modifiée ciblant ce récepteur pour diminuer son expression et traiter les réactions allergiques. Une fois le mode d’administration et leur modification chimique choisis, l’efficacité de ces molécules sera testée sur un modèle d’asthme allergique induit par les acariens en prophylactique et en thérapeutique. Ce projet sera réalisé dans deux établissements.
Bénéfices attendus
Les allergies touchent actuellement plus de 13% de la population mondiale et 20 à 30% de la population des pays développés. Au cours des trente prochaines années, les allergies devraient toucher jusqu’à quatre milliards de personnes. Au vu de ces chiffres astronomiques, le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes dont fait partie la stratégie antisens permettra de développer une médecine de précision en diversifiant les modes d’action des médicaments utilisés pour réduire l’inflammation causées par les allergies conduisant à une meilleure prise en charge des patients. Notre stratégie thérapeutique propose de cibler le récepteur des cellules impliquées dans les allergies. Ce travail permettra de comprendre si la stratégie antisens ciblant ce récepteur peut être utilisée pour traiter l’asthme sévère allergique chez la souris constituant une première preuve de concept pour la mise en place de futurs essais cliniques chez l’homme.
Procédures
Les animaux subissent une administration du médicament en sous cutanée (240 souris) ou par inhalation (240 souris) d’une durée de 30 secondes. L’asthme est induit par inhalation d’acariens (288 souris). Un abord et ouverture de la trachée est réalisé pour mesurer la capacité pulmonaire grace à un appareil scientifique sur souris anesthésiées (d’une durée de 20 minutes), suivi d’un lavage bronchoalvéolaire (d’une durée de 50 secondes) (288 souris).
Impact sur les animaux
Les injections du médicament ou des acariens sont réalisées sous anesthésie. Des nuisances suite aux injections peuvent être envisagées entrainant une variation du poids corporel, un changement dans le comportement et/ou une modification de la ventillation.
Devenir
La mise à mort à la fin de la procédure est nécessaire pour réaliser le prélèvement des organes et leurs analyses.
Remplacement
Des approches alternatives ont été réalisées dans la première partie de ce projet. Elles ont consisté à valider in vitro sur des mastocytes primaires murins et humains l’efficacité de ces molécules sur la diminution d’expression du récepteur à la surface cellulaire, la diminution de l’activation mastocytaire suite à l’engagement du récepteur et la diminution de la dégranulation mastocytaire. Afin de comprendre si cette stratégie peut être proposée comme nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter l’asthme sévère allergique chez l’homme, il nous faut démontrer son efficaté sur un modèle d’asthme allergique induit par les acariens chez la souris très bien décrit dans la littérature. Cette étude réalisée chez la souris constitue une étude pré-clinique nécessaire à la validation d’une preuve de concept qui pourrait par la suite déboucher sur des essais cliniques chez l’homme. .
Réduction
La première partie de ce projet va nous permettre de comprendre la biodistribution (diffusion et persistance dans l’organisme, effet sur la diminution de l’expression de la cible, immunogénécité des antisens) des 3 stratégies antisens utlilisés suite à une administration cutanée ou par inhalation. Les meilleures combinaisons (mode d’administration et antisens utilisé en fonction de ses modifications chimiques) seront utilisées pour le modèle d’asthme permettant ainsi de réduire le nombre de souris qui seront utilisées dans cette étude.
Raffinement
Toutes les souris incluent dans ces différentes procédures seront suivies quotidiennement par les animaliers pour des signes de souffrance, de toxicités ou de difficultées respiratoires. La surveillance de la perte de poids et le scoring sera fait 2 à 3 fois/semaine par l’expérimentateur. Si au cours de l’expérience une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort par dislocation cervicale. Les animaux ne sont pas gardés en isolement. Des groupes de 5 souris sont regroupés dans une cage. Un enrichissement des cages composé de maisonettes en carton et de cotons d’enrichissement est prévu afin de diminuer le stress des animaux. Des seringues adaptées sont utilisées pour les injections sous cutanées et intrapéritonéales pour l’anesthésie. Pour des raisons sanitaires et expérimentales, les animaux seront transférés d'un établissement à un autre après passage à l'IVIS Spectrum. Les animaux seront transférés avec des boites de transport adaptées contenant des croquettes et de l'hydrogel.
Choix des espèces
Les modèles d’asthme induit par les acariens chez la souris sont très bien décrits dans la littérature et miment certains symptômes de la pathologie humaine. L’approche in vivo ne peut donc être considérée que chez la souris. Des femelles de 8 à 10 semaines seront utilisées dans ces protocoles.
Cancer du foie et environnement tumoral – efficacité d’une approche thérapeutique par combinaison d’anticorps dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau ou directement dans le foie sous échographie, un traitement par anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des échographies répétées sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée ou des douleurs, et que tous les animaux sont tués pour prélever tumeurs et foies. Il décrit des travaux in vitro et ex vivo déjà menés mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.
Procédures
Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement