Souris
Amendement projet 2019111322052993 : Développement préclinique chez le souriceau d’une thérapie par ARNm pour la leucinose
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
1 320 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès la naissance des injections intraveineuses sur animal vigile et des prélèvements d'urine quotidiens, puis des prélèvements de sang à la veine maxillaire, pour tester une thérapie par ARNm contre la leucinose. Le porteur indique qu'un quart des souris, porteuses de la maladie, ont un risque de mort de 50 % dans les trois premiers jours et de 100 % avant deux semaines, et que toutes sont tuées pour analyse des tissus. Il affirme que la démonstration ne peut se faire complètement que dans un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer des stratégies thérapeutiques pour traiter une maladie métabolique rare d’origine génétique, causée par la dysfonction d’une enzyme. La forme classique de cette maladie se caractérise par un coma en période néonatale pouvant conduire au décès en l’absence de traitement en urgence. Il existe également des formes moins sévères, chroniques, sans épisode aigu néonatal sévère et des formes se révélant par des troubles neurologiques lors d’épisodes aigus de stress métabolique (fièvre...). A ce jour, le principal traitement repose sur un régime alimentaire extrêmement strict, limité en protéines. Ce régime est très efficace mais il doit être poursuivi à vie et ne permet pas de prévenir le risque de complications graves, parfois mortelles. Un tel régime altère de façon significative la qualité de vie. Certains patients peuvent bénéficier d’une transplantation hépatique qui certes guérit la maladie, mais demeure associée à un risque propre de rejet et de décès. L’efficacité de la transplantation hépatique dans cette maladie nous a conduit à proposer le projet ici présenté. Notre objectif est de développer une stratégie de traitement de cette maladie métabolique par une approche de thérapie innovante basée sur l’utilisation d’ARN messagers, non-pathogènes, qui ont montré qu’ils pouvaient corriger de manière stable des maladies où d’autres protéines sont manquantes après une seule administration. La spécificité de cette étude est d’étudier l’efficacité à court terme de cette thérapie après injection unique dans des modèles murins de cette maladie métabolique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de faire la preuve de concept de l’efficacité de court terme de cette thérapie innovante chez la souris, ouvrant la voie du développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme.
Procédures
Tous les animaux de cette étude (N = 360 + 960 dans amendement) seront soumis à des injections par voie intraveineuse dans la veine temporale le jour de la naissance sur souris vigile et à des prélèvements d'urine quotidiens la première semaine de vie puis deux fois par semaine. Les animaux de l’étude de survie (N = 90 + 160 dans amendement) seront soumis à des prélèvements de sang au niveau de la veine maxillaire à partir d’une semaine de vie sur souris vigile. Les animaux de l’étude pharmacocinétique (N = 270 + 800 dans amendement) seront soumis à un prélèvement de sang unique au niveau de la veine maxillaire au moment de la mise à mort sur souris vigile. Ces différents actes seront le plus brefs possibles (1 min pour les injections néonatales, 1 min pour les prélèvements d’urine, 1 min pour les prélèvements de sang) et pratiqués par du personnel entrainé.
Impact sur les animaux
Les souris KO malades (25% des souris comptées dans le projet) présentent un phénotype grave : risque de 50% de décès au cours des 3 premiers jours et 100% au cours des 14 premiers jours. Les nuisances que subiront les souris seront : une douleur associée à une injection IV sur souris vigile (injection initiale unique sur souriceau), un stress lié à un prélèvement d’urine sur souris vigile réalisé quotidiennement la première semaine de vie puis deux fois par semaine et une douleur associée à un prélèvement sanguin sur souris vigile, à partir d’une semaine de vie, de façon hebdomadaire pour les souris de l’étude de survie ou au moment de la mise mort pour les souris de l’étude pharmacocinétique.
Devenir
Mise à mort pour analyse des tissus.
Remplacement
Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux dans ce projet, nos collaborateurs ont déjà testé différentes formulations d’ARNm in vitro. sur des cellules de foie cultivées en laboratoire. Ceci leur a permis de sélectionner des traitements candidats. Cependant la capacité des nanoparticules à franchir les défenses immunitaires ne peut être démontrée complètement que dans un organisme physiologique "entier".
Réduction
Toutefois, la seule utilisation de la souche « malade » pose certains inconvénients : en sachant qu’un animal sur 4 est affecté par cette maladie à la naissance et compte-tenu du nombre de souris nécessaires pour notre projet, le nombre de souris en élevage serait trop important pour répondre à l’ensemble des questions posées. Aussi, dans l’optique de réduire au maximum l’utilisation de ces souris malades, les meilleures formulations sélectionnées in vitro ont été testées par nos collaborateurs dans un organisme physiologique entier, chez des souris saines, afin de sélectionner les plus efficaces et la plus apte à franchir les défenses immunitaires. Le nombre d'animaux nécessaire par lot a été déterminé grâce aux études publiées précédemment développant une approche similaire. Nous étudierons les réponses à nos traitements à la fois pour les mâles et les femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’accouplements et aussi le nombre de souris atteintes non utilisées. Afin de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires à la détection de l’effet de nos traitements, nous avons établi le paramètre le plus important (concentration plasmatique de leucine) et nous avons utilisé un test bilatéral standard de comparaison des moyennes (t-test) afin d’avoir 90% de chance de détecter une diminution des concentrations de leucine dans le plasma de souris traitées avec l’ARNm comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 1%.
Raffinement
Nous allons utiliser des procédures de raffinement pour éviter la souffrance des souris lors de prélèvements sanguins et pendant l'injection du vecteur thérapeutique. Au moment de l’injection chez les nouveaux-nés ; la mère sera éloignée afin de minimiser son stress. Les souriceaux seront recouverts de sciure de la cage de la mère et replacés rapidement dans la cage. Au niveau expérimental, les quantités minimales de sang et d'urine seront prélevées par du personnel expérimenté en veillant à réaliser les prélèvements sur les zones les moins sensibles possibles. Une surveillance régulière sera mise en place et des points limites adaptés ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire. Les souris seront gardées dans des portoirs ventilées dans lesquels nous ajouterons du coton, une maisonnette et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la maladie humaine avec son phénotype clinique et biochimique sévère. Le modèle souris, facile à produire par comparaison aux autres modèles disponibles (bovins), permet d’étudier les différents organes, types cellulaires et mécanismes de défense immunitaire, pertinents pour notre étude et inaccessibles in vitro. Amendement : Deux modèles murins pertinents et complémentaires de la maladie seront utilisés. Nouveau-nés de 0 à 2 jours de vie car la maladie présente un phénotype très sévère entrainant un décès de la souris dans les 15 premiers jours de vie ; souriceaux et souris adultes jusqu’à 2 mois pour l’étude de survie.
Traitement de souris gestantes avec un activateur d’une voie de regulation de la production d’energie cellulaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
120 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Les femelles gestantes reçoivent une injection quotidienne pendant 28 jours, puis sont tuées à mi-gestation, leurs embryons et souriceaux étant tués pour étudier des malformations de la face et de l'intestin. Le projet, de recherche fondamentale, teste si un activateur d'une voie énergétique cellulaire limite ces malformations dans une lignée génétiquement modifiée. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de remplacer un modèle de gestation par un modèle in vitro et ne prévoit ni analgésie ni anesthésie.
Objectifs
Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motrcité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée, nous allons donner un traitement aux mères gestantes pour compenser cette voie et voir si nous parvenons à limiter les malformations à la naissance..
Bénéfices attendus
Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.
Procédures
Les femelles gestantes recevront une injection rapide (2 secondes) pendant 28 jours sur l'ensemble de la procedure.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et à l'injection quotidienne des femelles gestantes. Le produit est injecté à des souris dans de nombreux articles de la littérature sans qu'il soit mention d'effet indésirable de la molécule à la dose envisagée.
Devenir
Les femelles seront euthanasiées après la campagne de production d'embryon à E15.5, les sourceaux et les embryons seront euthanasiés pour étudier les malformations de leur tête et de leur inestin.
Remplacement
Il est impossible de remplacer un modèle de gestation par un modèle in vitro à notre connaissance. Les études in vivo sur le comportement des cellules en l'absence de notre gène régulateur d'intérêt et en présence du traitement, nous permettent de poser une hypothèse forte quant au résultat attendu :"Le traitement améliore nettemment les malformations de nos animaux malades "
Réduction
Nous organisons nos croisements d'animaux afin de maximiser les chances (1/4) d'obtenir des souriceaux au génotype d'interêt dans nos portées afin de limiter le nombre de femelles gestantes necessaires. En outre l'ordre des expérimentations est choisi pour minimiser le nombre de femelle ( les souriceaux sont produits avant la cohorte d'embryon)
Raffinement
Les femelles seront hébergées en groupe avec de l'enrichissement. Aucune analgésie ou anesthésie n'est necessaire et donc prévu pour ce projet. cependant, les gestations sont surveillées Bien que au regard de la litterature scientifique disponible et de notre expertise, nous n'attendons aucun problème spécifique sur le déroulement de la gestation, l'opérateur pourra interrompre la mise bas en cas de souffrance anormale pour une mise bas.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Les femelles et les mâles seront adultes et en age de ce reproduire.
Analyse des effets de monocytes modifiés sur la croissance de tumeurs chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 496 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales et de monocytes génétiquement modifiés, des séances d'imagerie sous anesthésie deux fois par semaine et développent des tumeurs sous-cutanées mesurées régulièrement. Le porteur indique qu'une partie des protocoles provoque une réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids et perte de poils, et que tous les animaux sont tués pour analyse des organes. Il revendique des résultats in vitro "très encourageants" en coculture 3D mais conclut au "besoin" de passer par la souris, et renvoie les retombées cliniques au conditionnel.
Objectifs
Le développement constant des immunothérapies contribue fortement à l’amélioration et au progrès liés au traitement des cancers. Nous développons des approches cherchant à mobiliser les cellules myéloïdes (la lignée des cellules myéloïdes est produite dans la moelle osseuse et donne naissance à plusieurs types de cellules sanguines dont les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques) pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et ainsi contrôler le développement de la tumeur. Nous souhaitons modifier génétiquement les monocytes pour augmenter leur capacité à stimuler la réponse immunitaire et évaluer leur efficacité antitumorale dans des modèles de souris portant des tumeurs. Nos résultats in vitro dans des modèles de tumeurs en 3D sont très encourageants, il nous faut les confirmer in vivo au sein d’un organisme entier permettant les interactions avec tous les types cellulaires. Nous avons pour but 1) d’optimiser ce type de traitement en cherchant à déterminer quel est le devenir des monocytes modifiés in vivo (localisation, survie, état), 2) déterminer leur mode d’action contre les tumeurs et 3) leur capacité à modifier le microenvironnement tumoral qui est par nature inhibiteur du système immunitaire. Par la mise en place de différents modèles d’injection des cellules tumorales et des CAR monocytes, nous étudierons à la fois la capacité des CAR monocytes à contrôler directement la croissance tumorale en favorisant l’interaction entre les deux types de cellules mais aussi le recrutement des CAR monocytes au sein de la tumeur et leur action sur la progression tumorale en injectant les CAR monocytes de manière systémique. Nous pourrons distinguer donc si les CAR myéloides sont capables de passer d’un compartiment/organe à la tumeur via le système sanguin. De plus, ce projet ayant une visée clinique, il est essentiel d’évaluer certains critères tels que les toxicités, le dosage et l’efficacité grâce à un modèle in vivo. Nous voulons également comprendre davantage les mécanismes liés au contrôle tumoral et les interactions entre les différentes populations immunitaires permettant d’éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous voulons avant tout acquérir des connaissances importantes qui pourront ensuite être utilisées en clinique pour le traitement du cancer. Les possibilités de traitement d'une tumeur solide sont jusqu'à présent plutôt limitées et parfois moins efficaces. L'approche thérapeutique avec les CAR monocytes et autres monocytes génétiquement modifiés promet d'être plus efficace tout en s'accompagnant de moins d'effets secondaires et surtout de permettre le traitement de cancers qui étaient jusqu'à présent difficiles ou impossibles à traiter. En effet, nos approches pourraient permettre de réduire certaines toxicités liées à l’utilisation d’autres approches de l’immunothérapie comme des cellules CAR T (lymphocytes T modifiés génétiquement), telles que l’apparition d’une suractivation du système immunitaire appelée orage cytokinique. L'avantage des CAR monocytes est avant tout qu'ils seront recrutés plus facilement au sein de la tumeur et qu'ils peuvent ainsi interagir directement avec les cellules tumorales mais aussi avec les cellules immunitaires alentour. Les monocytes ont non seulement la capacité de tuer directement les cellules tumorales via la phagocytose, mais aussi de sécréter des facteurs solubles qui peuvent à leur tour attirer d'autres cellules immunitaires. Celles-ci peuvent à leur tour rendre l'environnement de la tumeur plus accessible aux cellules « Natural Killer « du système immunitaire. Une meilleure compréhension du mécanisme peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Pour évaluer la capacité des CAR myeloides à contrôler la croissance tumorale et en se basant sur des recherches publiées (Klichinsky et al, 2020), nous injecterons les cellules tumorales et les CAR monocytes directement dans l’abdomen des souris (voie intrapéritonéale) permettant de suivre via un système d’imagerie le contrôle de la croissance tumorale. Les cellules tumorales injectées exprimant la luciferase, de la luciferin sera injectée par voie intra-péritonéale (1,5mg par souris de 20g). Les souris seront anesthésiées avec de l’Isofluorane (entre 2,5 et 3%) puis imagées via IVIS. L’anesthésie aura une durée de 10 minutes. Les souris seront imagées 2 fois par semaine. Pour évaluer la localisation, la persistance et le recrutement des cellules utilisées comme traitement, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale, intraperitoneale ou intraveineuse. (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec). Pour évaluer l’effet du traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie intraveineuse aux animaux vigiles (1 fois - durée du geste inférieur à 10 sec) puis les animaux seront traités 1 fois avec des CAR myeloides injectées par voie intraveineuse. Pour évaluer le traitement dans d’autres modèles de tumeurs, les cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée (1 fois - durée du geste inf à 10 sec) puis nous injectons notre traitement cellulaire par voie intratumorale ou intraveineuse. Dans certaines expériences, nous utiliserons une chirurgie courte (20min) sous anesthésie (1h) pour implanter de manière orthotopique des cellules tumorales pancréatiques afin de mettre en place un modèle plus fidèle afin de valider notre thérapie cellulaire. Nous administrerons le traitement cellulaire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10 sec). Pour comprendre comment fonctionne notre traitement, les animaux seront injectés 1 fois avec les cellules tumorales par voie sous cutanée. Le traitement sera injectée 1 fois par voie intratumorale ou intraveineuse et les cellules effectrices 1 fois par voie intraveineuse (durée de chaque geste inf à 10 sec).
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à un stress et à une douleur minimale au moment des injections, mais nous nous efforçons de les maintenir à un niveau aussi bas que possible grâce à une manipulation professionnelle. L'un des effets attendus de ces essais est l'apparition de GvHD au cours de certains protocoles. La "Graft versus Host Disease" est une maladie dans laquelle les cellules immunitaires transplantées attaquent le corps du receveur, ce qui entraîne des symptômes tels que la perte de poids et la perte de poils. Comme nous avons déjà réalisé ce type d’expérience dans notre laboratoire, nous pouvons bien nous préparer et nous connaissons les signes pour éviter la douleur et la souffrance. Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules par voie intraveineuse ou sous cutanée seront celles liées à l’injection.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet avec des monocytes modifiés ont déjà été évaluées in vitro à l’aide de méthodes alternatives telles que la coculture en 2D et la coculture 3D formant des sphéroides qui nous ont permis de sélectionner les meilleurs candidats prometteurs pour une efficacité contre les cellules tumorales. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action des monocytes modifiés. Néanmoins, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (coculture en 2D, coculture en 3D) l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet car il est important de considérer l'interaction des monocytes CAR avec les cellules tumorales dans un organisme entier et d’évaluer les éventuelles toxicités.
Réduction
En nous basant sur notre expérience dans le domaine de l'immunothérapie, nous pouvons déjà nous appuyer sur quelques résultats. Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 ou 8 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous observons la croissance des tumeurs dans l'abdomen à l'aide d'un système d'imagerie in vivo, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Néanmoins, nous allons travailler avec des cellules sanguines humaines primaires, ce qui entraîne souvent une grande variabilité. C'est pourquoi il est indispensable de répéter les expériences au moins trois fois avec des donneurs différents afin de pouvoir prouver les résultats de manière statistique. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. Les tumeurs sous-cutanées seront mesurées minimum 2 fois par semaine afin de s’assurer qu’elles ne dépassent pas la taille maximale entrainant le mal-être des animaux. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. L'intervention chirurgicale est réalisée dans des conditions aussi stériles que possible et par un personnel spécialement formé à cet effet. Un traitement anti-douleur standardisé et un contrôle régulier des animaux après l'intervention sont effectués. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score définie pour le projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques ou des compléments alimentaires.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 6 semaines afin que les souris aient atteint la maturité sexuelle, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Caractérisation multimodale des interneurones ventraux de la moelle épinière souris et humaine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un prélèvement de l'extrémité de la queue et un tatouage des phalanges pour génotypage, les animaux sans le bon phénotype étant euthanasiés après cette étape et les autres à l'âge adulte pour prélever leur moelle épinière. Le projet vise à caractériser des interneurones spinaux, avec l'objectif à long terme de développer des stratégies pour les patients traumatisés médullaires. Le porteur décrit ce modèle translationnel comme "crucial" et affirme que l'absence de données transcriptomiques publiées rend l'utilisation de nouveaux animaux "indispensable".
Objectifs
L'objectif principal du projet est la caractérisation moléculaire des neurones impliqués dans l'intégration sensorimotrice au sein de la moelle épinière chez l'homme. A plus long terme, l'objectif de cette caractérisation est de permettre la mise en œuvre de stratégies de neuromodulation ciblée afin d'améliorer le pronostic neurologique des patients traumatisés médullaires.
Bénéfices attendus
Chaque année et en France seulement, ce sont 1500 à 2000 nouveaux patients, d'un âge moyen est de 28 ans, qui viennent s'ajouter aux 40 000 para ou tétraplégiques recensés. Dans ce contexte, le développement d'un nouveau modèle translationnel est crucial afin de tester chez l'animal de nouvelles stratégies ciblées dont la transposition potentielle chez l'homme sera le préalable et non plus l'aléa.
Procédures
Prélèvement de l'extrêmité caudale de la queue de l'animal et tatouage de phalanges (prélèvement au niveau de l'oreille en cas de nécessité d'un nouveau prélèvement). Les animaux sont tatoués et prélevés entre le 7 et 10e jour. Cette procédure unique dure moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Seul le prélèvement de la queue (ou des phalanges en seconde intention) sera réalisé à des fins de génotypage.
Devenir
Les animaux n'ayant pas le bon phénotype seront euthanasiés à l'issue du génotypage. Les autres animaux seront euthanasiés une fois adulte (entre 2 et 4 mois) en vue du prélèvement post-mortem de la moelle épinière.
Remplacement
Afin de diminuer le nombre d'animaux utilisés, les données souris wild type seront issus de publications antérieures ayant mis en ligne les données de séquençage (snRNA-seq). Il n'y a toutefois aucune donnée transcriptomique publiée issues de souris En1-Cre permettant d'obtenir un profil spécifique pour les interneurones V1, ce qui rend indispensable l'utilisation de nouveaux animaux de la même espèce pour comparer les profils transcriptomiques.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum nécessaire à l'obtention d'un nombre statistiquement suffisant pour l'analyse transcriptomique robuste, soit 40 000 neurones analysés. D'après nos résultats préliminaires, chaque moelle épinière souris extraite permet l'analyse d'environ 2000 neurones. Nous prévoyons donc d'analyser les moelles épinières issues d'environ 20 souris En1-Cre;Sun1-sfGFP ce qui est le nombre minimal d'animaux permettant un profiling transcriptomique statistiquement robuste.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une animalerie agrée, en groupe sociaux, dans des conditions de températures et hygrométrie controlées. Elles ont accès ad libitum à la nourriture et l'eau: au sevrage, des croquettes humides sont placées au fond de la cage pendant le 1e semaine et leur consommation effective vérifiée. Les cages présentent un enrichissement du milieu donc la présence d'un "nid" sera le signe de souris calmes, regroupées et sociables. Les animaux sont quotidiennement surveillés, en tenant compte leur comportement (pas de prostration, de difficulté de déplacement, pas de stéréotypie) et de l'absence de lésions. Une surveillance quotidienne sera mise en place pour surveiller l'allaitement des souriceaux par la femelle ayant mise bas. Des points limites pour les souriceaux de moins de 10 jours et conduisant à une euthanasie immédiate du nouveau-né ont été établis. Pour les animaux adultes vivants (dont ceux utilisés en accouplement), la surveillance quotidienne permettra d'euthanasier tout animal présentant des lésions graves ou des signes de souffrance, ayant atteint un point limite ou présentant un comportement stéréotypique.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris du fait de l'existence de lignées transgéniques permettant de cibler l'expression de protéines fluorescentes spécifiquement dans les neurones spinaux V1. L'objectif du présent projet étant la caractérisation des neurones adultes, les souris utilisées seront euthanasiés à l'âge adulte, soit entre 2 et 4 mois.
Étude du rôle de Tigd4 en tant que régulateur de la fonction de la jonction myotendineuse à l’aide d’un modèle de souris génétiquement modifié.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
720 souris génétiquement modifiées vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à des tests de force musculaire, à deux programmes d'exercice dont une course jusqu'à épuisement d'environ une heure, puis à une mesure de la force de contraction sous anesthésie avant d'être tuées sans réveil pour biopsie. Le projet vise à comprendre le rôle du gène Tigd4 dans la jonction myotendineuse, un objectif de recherche fondamentale sur la biologie du muscle et de l'exercice. Le porteur affirme que ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro et que la souris est le "modèle le plus approprié", tout en indiquant que les animaux mutants n'ont montré jusqu'ici qu'un phénotype léger.
Objectifs
Le rôle principal des cellules musculaires squelettiques est de se contracter générant une force énorme. Si cette force n'est pas correctement amortie, les cellules musculaires se rompent et la fonction musculaire échoue. Les cellules musculaires gèrent ce problème en dissipant la force vers les tendons qui sont situés à ses deux extrémités. Elles forment une jonction spécialisée avec le tendon, appelée jonction myotendineuse (JMT). La JMT est donc le principal site de blessure lorsque nous faisons de l'exercice. Cependant, nous savons très peu de choses sur la façon dont elle est régulée et sur les gènes qui sont importants à sa fonction. Habituellement, les cellules du corps humain ont un noyau par cellule. En revanche, les cellules musculaires squelettiques possèdent des centaines de noyaux à l'intérieur d'une seule cellule. Il est important de noter qu'un sous-ensemble de ces nombreux noyaux remplit des fonctions spécialisées, par exemple celles de la JMT. Notre équipe a récemment identifié un gène non étudié, appelé Tigd4, qui est fortement exprimé uniquement dans les noyaux musculaires de cette jonction, mais pas dans les autres noyaux musculaires éloignés de la JMT. Cette découverte fait de Tigd4 un gène candidat intéressant à étudier plus précisément. Pour ce faire, un service de notre institut génère des souris génétiquement modifiées portant une mutation dans le gène Tigd4. Notre équipe étudiera le résultat de la mutation de Tigd4 dans la JMT et la fonction musculaire.
Bénéfices attendus
Notre étude établira que Tigd4 est un régulateur important de la JMT, qui est avec les cellules musculaires essentielle au bon fonctionnement des muscles. Par conséquent, ce projet aura de nombreux avantages dans les domaines de la biologie musculaire, de la biologie de l'exercice physique, et des maladies qui provoquent des défaillances au niveau de la JMT.
Procédures
1.Les 3 tests de mesure de la force musculaire sont des procédures non invasives durant lesquelles les souris ne souffrent pas. Ils ne prennent qu’1 à 2 min par souris avec 10 min entre chacun des 3 essais/test et 20 min entre 2 tests. Les souris retourneront ensuite dans leur cage d'origine. 2.Les 2 programmes d’exercices sont des procédures non invasives mais qui provoque un niveau d’inconfort musculaire important comme tout exercice physique intense. Le 1er exercice comprend 4 jours d’habituation progressive de 20 min puis le 5e jour les animaux débutent par 15 min d’échauffement et courent ensuite de plus en plus vite jusqu’à épuisement, environ 1h, pour déterminer leur Vmax (vitesse maximale). Le 2é exercice comprend 3 jours de 15 à 20 min d’habituation suivi d’un jour d’exercice de 60 min comparable à un exercice physique intense. 3.La mesure de la force de contraction musculaire est une procédure invasive qui est réalisée sous anesthésie générale. La durée d’une stimulation est de 0,5 sec, elle est réalisée 8 fois avec un intervalle de 30 secondes entre chaque stimulation. Avec l'anesthésie, ce test dure 1h et 30 min par souris. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les animaux mutants pourraient avoir des effets indésirables en raison d’une faible musculature attendue mais ce n’est pour l’instant pas le cas. Ces animaux ne présentent pas, depuis le démarrage du projet autorisé il y a un an, de phénotype dommageable sévère ou même modéré. S’ils ont un phénotype dommageable, celui-ci est léger. Les tests de mesure de la force musculaire sont non invasifs et ne provoquent pas de douleur. Les 2 programmes d’exercice sont des procédures non invasives comparables à une activité physique intense et qui provoquent un niveau d’inconfort musculaire important. La mesure de la force de contraction musculaire sera réalisée sous anesthésie et sous antalgiques et les animaux seront mis à mort avant leur réveil.
Devenir
Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux après euthanasie à la fin de la procédure.
Remplacement
Les souris sont nécessaires pour ces expériences dans le but de nous permettre de comprendre les propriétés physiologiques des cellules musculaires. Les modifications génétiques qui ne sont possibles que chez la souris nous permettent d'étudier la fonction des gènes dans des conditions biologiques appropriées et donc la physiopathologie. Ces expériences ne peuvent pas être réalisées in vitro.
Réduction
Nous prenons plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Mesure 1 : De multiples essais fonctionnels seront réalisés chez la même souris. Mesure 2 : Les animaux utilisés pour vérifier la viabilité des mutants seront utilisés pour les expériences histologiques et fonctionnelles, ce qui réduira également le nombre d'animaux utilisés. Mesure 3 : La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris minimum nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes.
Raffinement
Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère, dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente, dans ce cas un analgésique sera administré à la souris et elle sera sous surveillance. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré et les animaux seront surveillés régulièrement. Ils seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de la paralysie des membres postérieurs. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. La mesure de la force contractile in situ sera effectuée sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur qui pourrait en résulter puis les animaux seront sacrifiés avant leur réveil pour le prélèvement des tissus musculaires.
Choix des espèces
Pour caractériser la physiologie du muscle, nous devons réaliser des expériences in vivo chez la souris car les modifications génétiques sont mieux établies dans ce modèle. Le projet est basé sur nos récents travaux chez la souris qui ont permis de découvrir un gène fortement et spécifiquement exprimé dans la JMT. Par conséquent, la souris est le modèle le plus approprié pour ce projet. Le moment où la mutation Tigd4 montre le phénotype est une question ouverte pour le moment et nous n’avons observé aucun phénotype spontané visible depuis le début du projet autorisé il y a un an. Nous espérons pouvoir observer un phénotype lors des analyses histologiques, biologiques et moléculaires qui seront réalisées dans ce projet.
Toxicité aiguë – Méthode par classe de toxicité aiguë (OCDE 423)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 360
480 animaux non-humains, 120 souris et 360 rats, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une administration unique d'une substance par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou endotrachéale, dans le cadre d'un test réglementaire de toxicité aiguë suivant la ligne directrice OCDE 423. Le porteur indique que les animaux montrant des signes cliniques intenses ou perdant plus de 20 % de leur poids sont mis à mort, et observe tremblements, convulsions, salivation, diarrhée, léthargie et coma. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode in vitro capable de générer ces données et présente l'étude comme obligatoire pour compléter les dossiers de mise sur le marché.
Objectifs
Des études in vivo chez le rat ou la souris sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Il s'agit d'études reglementaires suivant les recommandation des lignes directrices de l'OCDE. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités compétentes pour leur mise sur le marché.
Bénéfices attendus
Ces études réglementaires sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Elles permettent de fournir des résultats destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation de mise sur le marché à fournir aux autorités compétentes .
Procédures
Les animaux subissent une administration unique d'une substance par voie orale dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Cependant pour le besoin de certaines molécules (pour lesquelles la voie orale ne convient pas), le protocole est adapté pour une administration par voies intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou endotrachéale. Le temps d'intervention sur chaque animal est de 5 minutes. Il n'y a qu'une intervention par animal.
Impact sur les animaux
Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis des observations sont faites sur diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) sont msis à mort.
Devenir
Les animaux ont été traités par des substances. En fin de procédure ils sont donc mis à mort. En effet, ces traitements pourraient avoir une incidence sur l'effet d'autres substances testées ultérieurement.
Remplacement
Ces protocoles sont des études réglementaires qui permettent de générer des données sur un produit à étudier avant d’entreprendre des études de toxicologie (plus longues et nécessitant plus d’animaux). Elles sont obligatoires d'un point de vue réglementaire et permettent de générer des résultats pour l'établissement des dossiers de demande d’autorisation de mise sur le marché à fournir aux autorités d’enregistrement. Il n'existe pas de méthode in vitro permettant de générer de telles données.
Réduction
Les études sont faites de façon séquentielle : on observe les effets sur les animaux avant de décider d'administrer une nouvelle dose ou un autre niveau de dose (inférieur ou supérieur). Chaque étape n'utilise que 3 animaux.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés et manipulés dans le calme, à distance des autres animaux (y compris lors de la mise à mort). Les animaux sont placés en cages sur portoirs ventilés : chaque cage est composée d’un bac (en polysulfone) fixé à un couvercle (en polyéthérimide) doté d’un plénum connecté au plénum d’air d’extraction du portoir. Le bac est équipé d’un couvercle en acier inoxydable muni d’une mangeoire et de poche d'eau. Nourriture et eau sont fournies ad libitum. Les cages sont dépression par rapport à l’animalerie elle-même ventilée. La ventilation dans le portoir renouvelle l'air environ 100 fois par heure et l’air dans l’animalerie est renouvelé 20 fois par heure. Une minuterie permet d'éclairage 12 heures par jour (8 heures-20 heures). La température est de 22 ± 3 °C et l'humidité de 55 ± 15%, selon les recommendations. Les animaux sont placés dans les cages par groupes de 3 maximum. chaque cage contrient une litière composée de granulés de résineux irradiés. Les cages contiennent un enrichissement. Les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Une fois traités, les animaux sont observés fréquemment: pendant les 30 premières minutes après administration et régulièrement pendant les premières 24 heures, particulièrement au cours des 4 premières heures. il y a ensuite des observations quotidiennes pendant 14 jours. La durée totale d'observation est variable en fonction des réactions de toxicité, du moment où elles apparaissent et de la durée de la période de récupération. Elle peut donc être prolongée à 21 ou 28 jours. Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) fait l'objet d'une mise à mort.
Choix des espèces
L’étude est réalisée selon les recommandations de la ligne directrice de l’OCDE spécifique à ce test qui stipulent qu'elle doit être menée sur des rongeurs. RAT Par étude : 3 animaux par groupe, maximum 8 groupes = 24 animaux maximum. 3 études par an. Soit 72 animaux par an Donc 360 animaux sur les 5 années d’autorisation de projet. 8 à 12 semaines (soit 200 à 250 g environ) selon les recommandations de la ligne directrice. SOURIS Par étude : 3 animaux par groupe, maximum 8 groupes = 24 animaux maximum. 1 études par an. Soit 24 animaux par an Donc 120 animaux sur les 5 années d’autorisation de projet. 8 à 12 semaines (soit 25 à 35 g pour la souris) selon les recommandations de la ligne directrice.
Etude d’efficacité d’agents anti-cancéreux sur trois modèles de cancers gastriques humains greffés en sous cutané chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent en sous-cutané une greffe de trois cancers gastriques humains, puis neuf injections intrapéritonéales ou vingt-huit gavages, avec suivi de la tumeur au pied à coulisse jusqu'à un volume limite. L'objectif est de tester quatre molécules et une technologie brevetée de ciblage tumoral, avant d'éventuels essais cliniques. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation exige de travailler sur "un organisme entier et complexe".
Objectifs
Ce projet vise à tester l’efficacité anti-cancéreuse de quatre molécules novatrices dans trois modèles de cancer de l’estomac. Le diagnostic des cancers gastriques est souvent tardif, où le cancer de l'estomac est foudroyant. Malgré l’arrivée de nouveaux traitements, le besoin médical non couvert demeure très important. Le but des candidats médicaments testés est d'apporter un nouveau traitement novateur qui pourrait également en combinaison améliorer les chimiothérapies actuelles en diminuant leurs effets secondaires indésirables et en boostant leur efficacité. Afin de soigner les patients atteints de cancers de l’estomac qui résistent aux traitements actuels, une technologie brevetée permettant de cibler spécifiquement la tumeur, sans toucher les autres organes, et, ce faisant, de réduire la toxicité des traitements anticancéreux et augmenter leur efficacité, a été mise au point et sera testée ici.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration que de nouvelles molécules thérapeutiques sont actives dans le traitement du cancer de l’estomac. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancers gastriques, sinon de ralentir la progression tumorale. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ces molécules dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme.
Procédures
Suite à l’implantation sous cutanée des cellules cancéreuses (injection de quelques secondes maximum), les souris seront observées et palpées 3 fois/semaine. Dès que les tumeurs seront palpables, le suivi des animaux sera fait comme suit : mesure de la taille des tumeurs au pied à coulisse 3 fois/semaine et pesée des souris 3 fois/semaine (geste de quelque secondes maximum). L’observation des animaux sera réalisée 3 fois /semaine par le(s) expérimentateur(s) en même temps que la palpation et la pesée. Les souris vont subir 9 injections intrapéritonéales (3x/semaine pendant 3 semaines) ou 28 gavages au total (2x/jour pendant 2 semaines). Les injections et gavages durent 10 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir des injections sous cutanée qui vont générer du stress à la contention ainsi qu’une douleur de courte durée à l’injection. La pousse tumorale peut engendrer une perte de poids et des douleurs au niveau de la tumeur. Les injections intrapéritonéales et les gavages peuvent générer une douleur lors de l’injection. Les chimiothérapies peuvent entrainer des effets néfastes sur l’état général des souris, mais les drogues utilisées ici ont été testée précédemment et n'ont présenté aucun effet secondaire délétère. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress lors de la contention et éventuellement de la douleur au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour cause d'atteinte du volume tumoral maximal tel que défini dans les points limites et pour prélèvement des tumeurs pour analyse.
Remplacement
Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis d'affiner le design de l'étude, mais la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux est fortement dépendante du microenvironnement tumoral. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et complexe. Pour cette raison nous devons effectuer ces études d’efficacité chez la souris.
Réduction
Les études seront faites séquentiellement et une évaluation de l’efficacité des 4 composés sera effectuée après la réalisation des expériences sur le premier modèle, ce qui donnera lieu à une décision d’arrêter ou de continuer les expériences pour les modèles suivants. Cette décision sera prise par le comité scientifique. Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'un outil statistique et les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, les études statistiques nous ont permis de déterminer qu'il nous faudra 720 animaux au total pour cette étude.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures, les animaux seront habitués à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort au plus tard 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées. Les animaux seront observés de manière qualitative par les zootechniciennes de l'animalerie qui remplissent tous les jours une grille de suivi, basée sur des scores de critères comportementaux. Les animaux ainsi repérés sont inspectés le jour même par un membre de l’équipe de recherche qui procédera à l’évaluation des points limites selon une grille de scoring. Cette procédure sous forme d'arbre décisionnel ainsi que la définition de points limites adaptés à l'étude permettent une évaluation objective des critères d'arrêt des souffrances.
Choix des espèces
L'objectif est de travailler sur des animaux présentant des tumeurs et éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif est un modèle qui permet une prise tumorale avec de nombreuses lignées humaines. En effet cette souris immunodéprimée est une souche reconnue pour l’implantation de tumeurs humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.
Analyse des conséquences de mutations dans des gènes impliqués dans la stabilité du génome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
404 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour des défauts de réparation de l'ADN, elles reçoivent des injections d'un agent myéloablatif, le 5-fluoro-uracile, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le projet étudie les conséquences de ces mutations sur l'instabilité du génome et le développement de cancers, avec des pistes annoncées pour les téloméropathies. Le porteur indique réaliser une partie des analyses sur fibroblastes prélevés, et affirme que le reste ne peut s'étudier qu'in vivo sur "le mammifère in toto".
Objectifs
L’information génétique nécessaire au bon fonctionnement des organismes vivants est contenue dans les molécules d’ADN qui forment les chromosomes. Les télomères représentent des structures particulières situées aux extrémités des chromosomes qui protègent ces derniers de la dégradation et de la fusion, source d'instabilité génomique. De nombreux facteurs participent à la protection des télomères. Par ailleurs l’ADN fait constamment l’objet de dommages introduits soit secondairement à des fonctions physiologiques telles que la réplication, soit à la suite d’exposition à des agents génotoxiques de l’environnement tels que les rayonnements. Ces dommages sont très efficacement réparés pour éviter l’altération de l’intégrité du génome. Les défauts de réparation de l’ADN et de protection des télomères, notamment dans certaines maladies génétiques, conduisent à diverses pathologies telles que les déficits immunitaires, les téloméropathies ou les cancers. Nous générons des modèles murins d’altération des processus de protection des télomères et de réparation de l’ADN afin d’apprécier les conséquences du défaut de ces processus dans certaines maladies génétiques et dans le développement des cancers afin d’entrevoir de nouvelles solutions thérapeutiques pour ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de certaines de ces mutations dans la stabilité des télomères, l'intégrité du génome, et leurs implications dans les téloméropathies. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients atteints de téloméropathies causées par ces mutations.
Procédures
Des injections intrapéritonéales contenant du 5 fluoro-uracile (5FU), un produit myéolablatif, seront effectuées. A la dose utilisée de 5FU, il n'y a pas d'effet indésirable globale de cette drogue. Une létalité embryonnaire peut exister lors de la gestation des animaux homozygotes.
Impact sur les animaux
Les animaux, du fait d'un défaut potentiel de la stabilité du génome peuvent présenter un défaut immunohématologique. Cependant leur maintien dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. Par ailleurs l'injection de l'agent myéloablatif génère une légère douleur lors de l'injection intrapéritonéale et provoque un stress et réduit le nombre de cellules souches hématopoiétiques.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques
Remplacement
Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des organes prélevés sur des souris. Il s’agit ici d’études sur le développement du système hématopoïétique qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du système hématopoiétique des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. Les organoïdes permettant d'étudier l'hématopoïèse et en particulier la lymphopoïèse ne sont pas actuellement disponibles. De même les approches in silico ne permettent pas d'étudier m'impact de mutations sur l'hématopoïèse et la lymphopoïèse. En revanche l'analyse de la réparation de l'ADN et de la stabilité des télomères sera en grande partie réalisée dans des fibroblastes embryonnaires des différentes lignées murines ce qui permettra d'utiliser un nombre limité d'animaux.
Réduction
En se basant sur des test statistiques, nous réduiront au maximum le nombre d'animaux utilisés pour obtenir les résultats escomptés. Les tests statistiques faits a priori utiliserons le calcul de puissance. Les tests statistiques faits a posterori seront réalisés à l'aide d'un test non-paramétrique . Par ailleurs, de nombreux tests seront réalisés sur des fibroblastes obtenus de souris, permettant une étude in vitro de nombreux paramètres et ainsi réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel compétent de l'animalerie. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés). Le maintien des animaux dans une zone EOPS devrait les préserver d'infections opportunistes. La mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Le scoring hebdomadaire est réalisé en plus de l'observatin quotitidenne règlementaire des animaux. Les injections intrapéritonélaes sont peu douloureuses et ne nécessitent pas d'analgésie.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines), le phénotype du système immunitaires sera réalisé à 8-10 semaines (période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel), l'apparition de tumeur sera évaluée à 3 mois (les tumeurs surviennent généralement vers 6 mois, puisque nous voulons savoir s'il y a une accélération de l'apparition des tumeurs dans les modèles de souris double mutantes par un effet de synergie nous analyserons ces souris à 3 mois).
Entretien d’une lignée de souris dont le gène de la chromogranine A est floxé (ChgA-loxP); Génération et entretien d’une lignée de souris dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26Rfa (26RFa-iCre/+)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce projet se limite à produire et entretenir des lignées génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage et pose d'une puce sous-cutanée. Les souris de génotype "inadéquat" sont tuées après génotypage, et les couples reproducteurs le sont quand ils cessent de donner des portées. Le porteur relie cet élevage à l'étude d'une protéine liée à l'obésité et au diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity".
Objectifs
L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi exprimés dans les îlots pancréatiques, suggérant que les neuropeptides hypothalamiques pourraient servir de lien entre l’homéostasie énergétique et glucidique. C’est le cas du 26RFa, neuropeptide hypothalamique identifié au sein de l'Unité comme le ligand endogène d’un récepteur humain orphelin, le GPR103. Des études récentes menées au sein du laboratoire révèlent que le 26RFa est un nouvel acteur de la régulation de la glycémie. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel d'une protéine de la famille des chromogranines, la chromogranine A (CgA), dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Or la CgA est exprimée par de nombreuses populations de cellules nerveuses, et de récentes études préliminaires nous ont permis d'observer que les neurones 26RFa expriment également la CgA. Ainsi, la compréhension du rôle de cette chromogranine dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neuropeptides tels que le 26RFa pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Dans ce contexte, nous souhaitons héberger et reproduire des souris CgA-loxP obtenues de "GemPharmatech". L'entretien de cette lignée nous permettra d'invalider de manière ciblée le gène exprimant la CgA en la croisant avec la lignée 26RFa-iCRE/+ pour invalider la CgA dans les cellules exprimant le 26RFa. Ce croisement devrait nous permettre de caractériser l'impact de l'altération de la sécrétion de neuropeptides sur la régulation de l'homéostasie du glucose dans l'organisme.
Bénéfices attendus
L'expression de la CgA étant ubiquiste, l'invalidation globale du gène exprimant la CgA ne nous permet pas de discriminer le rôle central des rôles périphériques de la CgA quant au contrôle de l'homéostasie glucidique. Par ailleurs, la caractérisation du phénotype des souris issues des croisements (prise alimentaire, poids, glycémie, morphologie et capacité sécrétoire des neurones hypothalamiques) concourra à la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion du 26RFa et son rôle dans l’homéostasie glucidique.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie. L’induction de l'anesthésie profonde se fait par voie aérienne dans une cage dite "à induction". Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide de puces stériles dédiées. La puce est placée en sous-cutané entre les omoplates de façon tangentielle à la courbe du dos et à l'aide de l'injecteur stérile à usage unique fourni avec la puce.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris dont le gène ChgA a été invalidé de manière globale sont viables, mais présentent une hypertension et une obésité. L'invalidation ciblée du gène ChgA ne devrait pas induire de nuisance ou d’effet indésirable accentués chez les animaux. Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale sous anesthésie par voie aérienne dans une cage dite "à induction" (isoflurane). Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide d'une puce placée en sous-cutané. L’élevage et la reproduction devraient induire peu de stress et de souffrance.
Devenir
Une partie des animaux générés dans ce projet sera destinée à la reproduction et à l'entretien de la lignée CgA-loxP, et une autre partie des animaux sera destinée à la génération et à l'entretien d'une lignée dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26RFa. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
L’étude de l'impact de l'invalidation ciblée du gène ChgA sur l'homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction CgA-loxP, plutôt qu'hétérozygotes. En effet, les règles de la génétique mendélienne indiquent que la probabilité d'obtenir des animaux de génotype adéquat est de 1/4 dans le cas de croisements d'animaux double hétérozygotes CgA-loxP. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à cinq par cage (deux femelles et un mâle par cage pour les accouplements) pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de boules de coton pour construire un nid + dôme en plastique rouge sous lequel se réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise-bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise-bas dure en moyenne 2 heures chez la souris) et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise-bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…).
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes, ce qui n'est pas le cas d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique CgA-floxP provenant de GemPharmatech (B6/JGpt-Chgaem1Cflox/Gpt). Cette dernière lignée (utilisation de souris à partir de 8 semaines de vie, âge de maturité sexuelle) sera alors croisée avec une lignée transgénique 26RFa-iCRE (même stade de développement et également obtenue à partir de souris de la lignée C57Bl/6J), détenue au sein de l'animalerie, soumise à un « Material Transfert Agreement » convenu entre le laboratoire d’origine et l’Inserm U1239.
Etude de la cinétique de la dégénérescence rétinienne d’un modèle murin du syndrome de Bardet-Biedl : Bbs10 KO
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
56 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle du syndrome de Bardet-Biedl qui les rend progressivement aveugles et obèses, elles subissent un prélèvement de queue pour génotypage puis un électrorétinogramme sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever les yeux. Le porteur signale que l'examen peut lui-même provoquer une cataracte. L'objectif est de dater le début de la dégénérescence rétinienne pour cibler une fenêtre thérapeutique dans d'autres projets.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de déterminer si, dans un modèle murin du syndrome de Bardet-Biedl, une maladie génétique rare qui mène à la cécité, la dégénérescence rétinienne caractéristique de ce syndrome est déjà présente dès l'âge de 14 jours et comment elle évolue jusqu’à l’âge de 3 mois. Pour cela, nous effectuerons des enregistrements de l’activité électrique de la rétine, qui traduit la fonctionnalité des cellules rétiniennes suite à une exposition à de la lumière, à différents âges et nous étudierons l'état de l'avancement de la dégénérescence de la rétine au niveau moléculaire.
Bénéfices attendus
Nous espérons mieux cerner le moment du début de la dégénérescence rétinienne afin de pouvoir cibler la fenêtre thérapeutique idéale dans d’autres projets que nous menons et qui visent à préserver la fonction visuelle chez ce modèle murin et à terme chez les patients.
Procédures
Lorsque les animaux seront âgés de 7 jours, un petit bout de queue sera prélevé pour le génotypage. Les animaux seront soumis, une seule fois et sous anesthésie générale, à l'enregistrement d'un ERG (électrorétinogramme), une méthode non invasive et non douloureuse qui dure au maximum 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris atteintes du syndrome de Bardet-Biedl que nous allons étudier deviennent progressivement aveugles. Elles naissent plus petites que les souris saines et deviennent plus tard obèses. De plus, l’ERG peut parfois entraîner l’apparition d’une cataracte.
Devenir
Tous les animaux utilisés pour ce projet seront mis à mort après l'enregistrement de l'ERG pour prélever les globes oculaires et étudier l'état d'avancement de la pathologie au niveau moléculaire.
Remplacement
L’animal permet des études fonctionnelles et offre un contexte physiologique qui ne sont à l’heure actuelle pas possibles avec les modèles cellulaires et in silico.
Réduction
Un total de 56 souris sera nécessaire pour ce projet, un effectif déterminé d’après la littérature pour obtenir des résultats fiables et robustes.
Raffinement
Les souris seront maintenues en portoir ventilé et en cycle d’éclairement de 12h de jour / 12h d'obscurité. Elles évolueront en groupes sociaux dans un milieu enrichi en matériaux de nidification (bâtons de coton), dôme et bâtons de bois. Elles auront accès à l’eau et la nourriture à volonté. Elles seront surveillées de manière quotidienne pas le personnel zootechnique. Un suivi hebdomadaire plus approfondi avec scoring permettra de détecter, soulager et éventuellement mettre à mort un animal présentant des signes de souffrance ou de détresse. Suite à l’enregistrement de l’ERG, des animaux dont un œil ne s’ouvrirait pas correctement ou qui présenteraient des écoulements suite à l’ERG seraient mis à mort. De l’ocrygel pourra être appliqué pour prévenir/résorber une éventuelle cataracte.
Choix des espèces
De nombreux modèles murins du syndrome de Bardet-Biedl ont été générés et caractérisés dans le cadre d’études précédentes, dont le modèle que nous allons utiliser dans ce projet, qui récapitule le phénotype des patients et qui permet donc d’obtenir des informations essentielles sur l’évolution de la pathologie, et en particulier sur les stades précoces auxquels il est difficile d’avoir accès chez les patients. Les outils qui permettent d’évaluer la fonction visuelle (ERG) et de caractériser la rétine au niveau moléculaire sont disponibles et bien standardisés chez la souris. Nous comparerons des souris saines et malades âgées de 14 jours (âge de l’ouverture des yeux à partir duquel la rétine est fonctionnelle), 1 mois, 2 mois et 3 mois.
Dymorphisme sexuel associé à la maladie des petits vaisseaux et à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection preservée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
2 650 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En surpoids ou diabétiques, elles subissent des injections intrapéritonéales répétées, une à deux chirurgies pour les castrer ou leur implanter une pompe, un test d'effort et une échocardiographie sous anesthésie. Le projet étudie le rôle des hormones sexuelles dans une insuffisance cardiaque touchant surtout les femmes ménopausées, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que cette pathologie complexe ne peut s'étudier in vitro et requiert "un organisme vivant proche de l'homme".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque dite « à fraction d’éjection préservée » représente la moitié des insuffisances cardiaques et sa prévalence est en constante augmentation compte tenu du vieillissement de la population et de l’explosion des facteurs de risques cardiovasculaires. Il s’agit d’une pathologie associée à une mortalité élevée et pour laquelle il n’existe pas de traitement efficace. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie ce qui est primordial pour identifier des cibles thérapeutiques. Plus précisément nous nous attacherons à mieux comprendre, d’une part le rôle de la maladie des petits vaisseaux qui est souvent associée à cette maladie et d’autre part le dimorphisme sexuel associé à cette maladie. En effet cette maladie touche surtout les femmes ménopausées suggérant un rôle des hormones sexuelles.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les hormones sexuelles interagissent avec les facteurs de risque cardiovasculaire pour protéger ou altérer le phénotype des petits vaisseaux et la fonction cardiaque. A plus long terme, il devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. En effet, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée est une maladie hétérogène possiblement induite par des mécanismes multiples.
Procédures
Les souris subiront 1 à 2 séries de 4 à 5 injections intrapéritonéales (chaque injection incluant la contention ne dure que quelques secondes), une à deux chirurgies de 10 minutes visant à les castrer ou à implanter une micro-pompe en sous cutané et un prélèvement sanguin inférieur à 50 µL dans la veine caudale. Finalement ces souris seront soumises à un test d'effort (12 minutes par jours pendant 3 jours habituation) puis 5 à 30 minutes pour le test à proprepemnt dit) et une anesthésie de 15 minutes pour subir une échocardiographie.
Impact sur les animaux
Ce projet utilisera des souris en surpoids ou diabétiques dont les nuisances sont comme chez l'homme, un surpoids, une polyurie et une polydipsie. D'autre part les animaux ressentiront des douleurs post-chirurgicales et un stress occasionné par des administrations intrapéritonéales répétées.
Devenir
Toutes les souris seront sacrifiées pour pouvoir faire des prélévements d'organes. Les géniteurs seront sacrifiés lorsque le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations aura été produit.
Remplacement
L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types cellulaires locaux (cardiomyocytes, cellules endothéliales, péricytes notamment) et circulants (cellules hématopoïétiques diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc necessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes (concernant, la pression télédiastolique du ventricule gauche notamment), le nombre de souris par groupe et par analyse doit être 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris, il nous faudra donc 2 souris. Le nombre de souris par groupe sera donc 20. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la fonction cardiaque et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Des souris adultes âgées d'au moins 6 semaines seront utilisées, En effet, notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anticancéreux sur un modèle de tumeur mammaire humaine développée chez la souris immunodéprimée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dont 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéprimées, elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, puis jusqu'à dix-huit injections d'une molécule inhibitrice sur six semaines, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins. L'objectif est de confirmer l'efficacité de ces molécules contre le cancer du sein triple négatif, avec un bénéfice pour les patientes annoncé à long terme. Le porteur affirme qu'après des tests sur cellules, la validation sur "organisme entier" est nécessaire.
Objectifs
Ce projet concerne l'inhibition d'une enzyme qui intervient dans le mécanisme de détoxification des cellules. Cette voie de détoxification est particulièrement utilisée par les cellules des tumeurs. L’augmentation de l’expression de cet enzyme a été reportée dans de nombreux cancers et est associée à la résistance aux traitements habituelles lors de rechutes. Le pourcentage du cancer du sein représente 33.5% de l’ensemble des nouveaux cas de cancer chez la femme. La grande diversité retrouvée dans le cancer du sein rend les traitements plus difficiles que sur d’autres formes de cancer du sein. Il constitue un problème clinique en raison de son pronostic relativement mauvais, de son comportement agressif, de sa capacité à métastaser et de l'absence de thérapies ciblées. Un nouveau traitement anticancéreux contre les cancers a été développé. Une première molécule a montré son efficacité sur la leucémie , le mélanome, le cancer du poumon ainsi que le cancer du sein. L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité des molécules sur des souris greffées avec des cellules tumorales humaines au niveau des glandes mammaires afin de reproduire un modèle de cancer du sein in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet à court terme sont de confirmer l’efficacité de nos molécules inhibitrices sur la progression d’une tumeur de cancer du sein implantée chez la souris. Les bénéfices attendus, à long terme, sur la santé humaine sont d’améliorer la prise en charge des patientes et d’améliorer le pronostic lors de rechutes. Ce traitement, permettra d’envisager une thérapie ciblée plus efficace que les thérapies conventionnelles actuellement utilisées contre le cancer du sein triple négatif.
Procédures
injection de cellules tumorales dans la glande mammaire de la souris par chirurgie courte sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) Traitement des souris des molécules inhibitrices (3 fois par semaine pendant 6 semaines maximum / 18 injections maximum / 5 secondes par injection) Contention des souris lors de la mesure des tumeurs (2 fois par semaine). Un prélèvement de sang en cours d'étude dans la veine mandibulaire de la souris (1 fois). Un prélèvement final de sang réalisé sous anesthésie (1 fois).
Impact sur les animaux
Douleur liée à la chirurgie. Développement de la tumeurs. Gène liée à la tumeur .Douleur légère liée à l'injection. Douleur liée à la prise de sang (piqure d'aiguille). Stress lors de la contention. Douleur liée à l'apparition de métastase.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements dans le but de la analyser.
Remplacement
Avant de réaliser des études sur la souris, l’efficacité des molécules a été démontrée sur les cultures cellulaire de tumeur séléctionnées pour ce projet. Il est dorénavant nécessaire de confirmer ces résultats sur une tumeur développée dans un mammifère. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement de son environnement. Par ailleurs, plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du traitement dans la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons, nous devons effectuer les études d’efficacité chez la souris.
Réduction
La prise tumorale ayant un taux de réussite de 80%, nous avons réduit le nombre d'animaux à implanter en prenant en compte ce paramètre. L’étude pilote sera réalisée avec le minimum nous permettant d’apprécier la croissance tumorale. Pour les procédure où le traitement sera administré aux souris, la comparaison entre les différents groupes sera réalisée par un test statistique. le nombre d'animaux par groupe a été déterminé car il nous permet un compromis entre une puissance statistique suffisante et l’éthique animale. Une réduction du nombre d’animaux sera possible en fonction des résultats obtenus lors des premières études : - Suppression des doses non tolérées dans les études suivantes pour chacune des souches de souris. - Suppression des témoins négatif s’ils ne démontrent pas d’activité dans les premières études.
Raffinement
Après leur réception, les souris disposeront d’une période d’acclimatation de 7 jours. Lors de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés maximum 70 jours (10 semaines) après leur réception si aucun point limite n’a été atteint. Ce délai correspond à la durée maximale possible des études (1 semaine d’acclimatation + 3 semaines de prise de greffe + 6 semaines de traitement). Lors de la chirurgie, des antidouleurs sont donnés avant l'opération. l'animal a une anesthésie générale et locales. Un antidouleur est apporté dans l'eau de boisson pendant les 3 jours qui suivent l'opération. Les animaux étant identifiés, toute anomalie observée permettra de faire un suivi individuel. Ils seront pesés le jour de la première intervention (J7) puis au moins une fois par semaine (3 fois lors des traitements). En cas de perte de poids >10%, de la nourriture humide sera ajouté dans la cage. En cas de tumeur invalidante, de l'eau gélifiée et des croquettes seront ajoutées dans la cage pour faciliter l'accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux seront répartis à raison de 5 ou 6 par cage (dépendant de la prise de la tumeur) afin de maintenir la sociabilité de l’animal. Une observation, 3 fois par semaine lors des traitements, permettra de détecter une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
La souris est l'un des seuls modèles d'animaux adaptés pour la réalisation de greffe de tumeur d'origine humaine. C'est un modèle reconnu dans la recherche contre le cancer. Les animaux seront utilisés à partir de 6 à 10 semaines jusqu’à 15-20 semaines. Ce choix est basé sur la bibliographie afin de favoriser la prise tumorale.