Souris

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie et après une injection d'analgésique, elles reçoivent des cellules à l'interface de l'os et du muscle du fémur, dont la surface est grattée pour favoriser la prise de la tumeur, puis leur patte est mesurée au pied à coulisse avant une mise à mort au CO2. L'objectif est de vérifier si un type de cellules embryonnaires est à l'origine du sarcome d'Ewing, un cancer osseux de l'enfant. Le porteur affirme que la greffe dans des souris au système immunitaire actif reste un standard "indispensable" pour valider la transformation tumorale.

Objectifs

Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant l’âge de 15 ans. Malgré des essais cliniques internationaux, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 30 ans. Il est donc indispensable de mieux comprendre les particularités du développement des cancers pour développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet a pour objectif de déterminer si des cancers de l’os observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver d’une population des cellules étant à l’origine de différentes parties du corps (cellules embryonnaires). Cette question est importante, car la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. Il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés chez les patients atteints par ces cancers de l’os, dans les cellules embryonnaires, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il faut maintenant vérifier que les cellules embryonnaires transformées donnent des tumeurs dans les os. Ce projet permettra de fournir de nouvelles pistes pour comprendre l’origine de ces cancers et améliorer leur traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de déterminer si un type de cellules embryonnaires peut être à l’origine de certains cancers pédiatriques afin d'améliorer leur prise en charge thérapeutique.

Procédures

L'injection des cellules en interface de l'os et le muscle au niveau du fémur sera effectuée apès une administration de buprénorphine en sous-cutanée 30 min avant intervention. Les animaux seront sous anesthésie pendant l'injection des cellules (max 5 min par animal). Le fémur sera gratté afin de raviver l'os et ainsi d'optimier la prise tumorale. Les animaux en état vigile seront pesée et les pattes seront mésurées par le pied à coulise pour évaluer la prise tumorale.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter une réaction suite à l'injection des cellules ainsi qu'un problème de locomotion ou de mal être animal suite au développement tumoral. Cela n'a pas encore arrivé dans nos projets précédents. Par conséquent, les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux, toutefois les animaux seront surveillés 3x/semaine.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure par CO2.

Remplacement

Le modèle murin proposé est le plus adapté car les cellules utilisées sont issues de la crête neurale de la même souche ce qui fait limiter le rejet de greffe. Par ailleurs, l'utilisation de ce système intégré permet de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d’interagir avec les cellules greffées. Le test de greffe dans des souris avec le système immunitaire reste un standard indispensable pour valider la transformation tumorale, surtout avec les lignées de crêtes neurales utilisées, qui possèdent des capacités de croissance clonale in vitro. Cette croissance clonale in vitro de ces lignées ainsi que des lignées transformées pour le développement du sarcome d'Ewing a été bien établie in vitro avant de passer in vivo.

Réduction

Pour pouvoir détecter statistiquement la meilleure prise tumorale entre les différentes, il faut un minimum de 12 animaux en utilisant les deux sexes par condition. Ces données ont été prises en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité. De plus, une procédure de mise au point est prévue dans cette demande, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet et dans les projets à venir utilisant cette lignée murine et cellulaire. Dans le cas de la prise tumorale, les souris de la première procédure seront également utilisées pour la caractérisation des tumeurs prélevées. En effet, les tumeurs prélevées chez des souris atteignant le point final serviront pour une étude histologique et multi-omique afin de valider le type du sarcome d’Ewing développé chez ces souris.

Raffinement

Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage au maximum. Une période d’acclimatation sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d’analgésique, d'anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée et eau gélifiée seront ajoutées au fond de la cage si les animaux présentent des difficultés à se déplacer au réveil. Les tumeurs seront collectées pour d'autres analyses ou pour la mise en culture cellulaire.

Choix des espèces

L’utilisation de ce modèle murin est nécessaire pour étudier le potentiel tumoral de ces cellules modifiées car ces dernières sont issues du même modèle murin, permettant de limiter le risque de rejet de greffe par le système immunitaire. Les sarcomes d’Ewing sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio garçon/fille légèrement supérieur à 1 a été rapporté. Toutefois, selon les études, le sexe ratio rapporté peut varier. Par conséquent, nous utiliserons des souris mâles et femelles dans cette procédure afin de ne pas introduire de biais lié au sexe. Les greffes seront réalisées sur des souris de 4 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après notre expertise et de la littérature, la prise de greffe est optimale en se rapprochant de l’âge de la survenue du sarcome d’Ewing.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent deux tests de comportement mesurant la préférence et la reconnaissance sociales, à quatre mois puis à vingt mois après un isolement d'une semaine avant chaque test, puis sont tuées avec ou sans prélèvement d'organes. L'objectif est de savoir si la délétion d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau reproduit des troubles proches de la démence associée à la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur affirme que l'effet sur le comportement ne peut s'observer que chez l'animal et justifie le vieillissement de la cohorte par le lien de la maladie avec l'âge.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), On appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire ou d'interaction social, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT.

Procédures

Des souris d'une lignée transgénique d’intérêt et des souris contrôlés (non-transgéniques), subiront 2 tests de comportement consécutifs, une fois à 4 mois (jeune), et, 16 mois plus tard, une fois à 20 mois (âgées). Le premier test nécessite 25 minutes par souris et le deuxième nécessite 5 minutes par souris. Les deux tests sont faits sur deux jours consécutifs. Ces 2 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer la préférence sociale ainsi que la reconnaissance sociale. A la fin de la procédure (des 2 tests de comportement à l'âge vieille et/ou jeune), toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).

Impact sur les animaux

Pour les tests de comportements : Car l'animal à tester doit être isolé pendant une semaine avant ce type de test, cet isolement pourrait produire un stress. Aussi, avec ce type de test il y a un risque d'agression entre les animaux à testés, et ces tests de comportement peuvent eux-mêmes induire un stress/angoisse chez l'animal. Le vieillissement de la cohorte peut aussi augmenter le risque de pathologies générales liées à l'âge. A l’issue de la période de maintien, les animaux pourront subir deux types d’euthanasies réglementaires dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes.

Devenir

Parce qu’il s'agit d'une étude comportementale, les résultats des tests comportementaux sont collectés tout au long de la procédure. Toutes les souris sont donc utilisées pour ces tests de comportement. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocole, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (la prolifération et activation après stimulation, la phagocytose). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtil in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible dans un animal.

Réduction

Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour les deux tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype (avec 3 génotypes) et par sexe. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Pour tout test de comportement, les deux sexes sont nécessaires. En plus, car la SLA et la SLA-DFT sont liées à l'âge (l’âge est un facteur de risque majeur), nous allons réaliser ces tests sur des souris jeunes (4 mois) et des souris âgées (20 mois). Comme les deux différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous ré-utiliserons les mêmes souris pour ces deux tests consécutifs pour en utiliser le moins d'animaux possible. En plus, afin de réduire le nombre de souris utilisées, nous ferons vieillir la cohorte jeune (4 mois) pendant 16 mois pour obtenir la cohorte âgée (20 mois). Donc, 120 souris transgéniques (sans phénotype) sont nécessaires, plus des souris de contrôles non-transgéniques (90). Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 210

Raffinement

(Hébergement) Pour la stimulation environnementale, nous utilisons toujours des petites maisons en carton, et des fibres en carton, permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage, maximum 6), et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible avant les expériences, mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. (Présence de points limites) L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent. Toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance (plaies, ulcères, tumeurs, fractures etc.), est considérée comme un point limite, et la souris sera euthanasiée. (Tests de comportements) Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant la semaine suivant les tests comportementaux. Pendant l'isolation nécessaire d'une semaine avant les tests de comportementaux, la stimulation environnementale reste présente (maison et fibres en carton), mais est renforcé en ajoutant aussi des carrés de coton compact (pour faire des nids). En cas de stress trop important suivant un test (souris prostrée, ne se déplaçant plus), l’individu sera euthanasié. Le test sera aussi suspendu en cas de comportement agressif. En cas de blessure, l’individu sera euthanasié. (Euthanasie pour prélèvement d'organes) A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés. Deux types d’euthanasies réglementaires sont utilisées, dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes. Le seul risque dans ce cas (défini comme un point limite), est le réveil pendant la chirurgie, mais c'est très peu probable en vue de l'anesthésie profonde (surdose d'anesthésique).

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie peut influencer le comportement chez la souris. De plus, des souris ont été utilisées avec succès pour modéliser les phénotypes moteurs de SLA-DFT. Par conséquent, nous pensons que la souris est le bon modèle pour notre question de l'effet de la modulation des microglies sur les défauts de comportements liée à la SLA-DFT. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois) et à l'âge vieille (à 20 mois).

1 992 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vecteurs viraux sous anesthésie, subissent un stress de contention d'une heure que le porteur déclare ne pas pouvoir limiter, et passent des tests évaluant leurs capacités motrices et sensorielles avant la mise à mort pour prélever leurs structures cérébrales. L'objectif est de valider in vivo une approche censée protéger les neurones dans la maladie de Huntington, déjà testée sur cellules. Le porteur affirme que la souris est un modèle approprié du fait de sa similitude avec le cerveau humain.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d'origine génétique (18 000 personnes atteintes en France et environ 300 000 dans le monde). Elle se caractérise par l'apparition de symptômes moteurs et psychiques, conduisant à une dégradation de l'état général des patients (amaigrissement, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires, puis inexorablement à la mort). Aujourd'hui, il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou retarder l'évolution de cette maladie. L'objectif de ce projet est d'étudier in vivo une approche thérapeutique validée in vitro contre la maladie de Huntington. Cette approche thérapeutique vise à protéger les neurones contre des perturbations métaboliques.

Bénéfices attendus

Actuellement, aucun traitement n'est efficace pour prévenir ou retarder la progression de la maladie de Huntington. L'objectif du projet est d'étudier une nouvelle approche thérapeutique axée sur une perturbation métabolique, qui pourrait retarder la progression de la maladie. Un outil a récemment été développé pour tester cette approche sur des cellules et valider son effet bénéfique. Ces résultats prometteurs doivent maintenant être validés sur des animaux en vue de proposer de nouveaux traitements aux patients atteints de cette maladie.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés une seule fois pendant 5 minutes le temps d'injecter les vecteurs viraux (durée de l'injection 30 secondes). Les souris seront soumises à un stress de contention de 1heure pour induire une perturbation métabolique. Les souris participeront également à des tests comportementaux afin d'évaluer leurs capacités motrices et sensorielles impactées par le modèle de la maladie de Huntington. Ces tests dureront de 1 à 30 minutes et ne seront effectués qu'une seule fois.

Impact sur les animaux

Nous pouvons identifier un seul effet indésirable attendu sur les animaux: l'induction du stress de contention d'une heure. Ce stress est modéré et nous ne pouvons pas le limiter. Immédiatement après le stress, les animaux seront soit mises à mort pour des études métaboliques, soit utilisés pour des tests comportementaux. Nous n'attendons pas d'effets indésirables pour les tests comportementaux, ni pour les injections avec les vecteurs viraux.

Devenir

Tous les animaux seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de récupérer les structures cérébrales d'intérêt. Les animaux ne peuvent donc pas être réutilisés.

Remplacement

Nous avons identifié in vitro une approche thérapeutique de la maladie de Huntington qui vise à protéger les neurones des perturbations métaboliques, et nous devons maintenant valider ces résultats in vivo. La souris est un modèle approprié pour l'étude in vivo de l'organisation du cerveau, compte tenu de sa similitude avec celle de l'homme et de l'existence chez cette espèce de données préalables sur le fonctionnement des voies métaboliques.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

- Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ainsi, les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et présence d’enrichissements dans les cages. Les conditions d'hébergement vont être identiques et homogènes pour tous les groupes (y compris les mettre dans la même pièce). - L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des procedures. Des échelles de cotation de la souffrance basées sur des signes indicatifs de gêne et de douleur seront utilisées afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir les points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Compte tenu de la similitude de son anatomie avec celle de l'homme, la souris est un modèle de choix pour l'étude de la maladie de Huntington. L'étude se concentre sur les réseaux matures, ce qui implique le stade adulte des individus. L'objectif du projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique pour retarder la progression de la maladie. Les injections seront effectuées à l'âge de 4 à 8 semaines, un stade précoce avant le développement de la maladie, et après 3 à 4 mois, nous effectuerons des tests comportementaux pour suivre l'évolution de cette pathologie.

31 souris porteuses de tumeurs du côlon vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intratumorale d'un composé, pour douze d'entre elles une prodrogue par voie intraveineuse et un prélèvement de sang à la jugulaire, puis jusqu'à quatre séances d'imagerie sous anesthésie avant la mise à mort et le prélèvement des organes. L'objectif est de vérifier que deux produits se concentrent bien dans la tumeur, une étape de pharmacocinétique préalable au test de leur effet anticancéreux dans d'autres travaux. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut pas être prédite in vitro, faute de circulation sanguine et de système excréteur.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer et de comparer les propriétés pharmacocinétiques des nouveaux agents thérapeutiques dans le domaine de l'oncologie préclinique. Ces agents se composent de deux produits : l’un qui sera administré par voie intratumorale et un second contenant une pro-drogue (chimiothérapie rendue inactive) qui ne sera activé qu’en présence du premier. L’objectif de ce travail est de valider que les produits se localisent bien au niveau tumoral et y restent suffisamment de temps pour exercer leurs actions. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le traitement du cancer (i.e. optimiser le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables). Dans un premier temps, les composés seront évalués in vitro pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, notamment sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs. Après cette étape, leurs propriétés anticancéreuses pourront être évaluées dans d’autres travaux

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Ce projet permettra de réaliser la preuve de concept qu’il est possible d’activer une chimiothérapie au niveau de son site d’action en optimisant son efficacité et limitant ses effets secondaires dans le reste de l’organisme.

Procédures

- Observation des souris (poids, volume tumoral, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection intratumorale d’un composé : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Injection intraveineuse d’une prodrogue inactive : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Prélèvement sanguin par veine jugulaire : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes. - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum 4 points d'imagerie sur une période de six jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées et euthanasiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie très régulièrement et l'étude sera terminée arrêtée lorsque les tumeurs auront atteint la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les nuisances. Les procédures (injection intraveineuse ou intratumorale, prélèvements sanguin et imagerie) sont réalisées sous anesthésie sur lit ou plaque chauffante réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l’injection des différents produits sont attendus : l'injection intratumorale du produit 1 a déjà été réalisée chez l’animal sans effet secondaire, la dose de radioactivité qui y sera ajoutée est très faible et ne causera pas d’effet sur l’animal. Si la molécule de chimiothérapie active peut avoir des effets secondaires se caractérisant surtout par une perte de poids, la prodrogue a été testée chez l’animal et ne possède aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules qui seront évaluées dans ce projet ont été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de tests statistiques. Cela donne un total de 24 souris nécessaires, soit 6 souris par groupe. Pour garantir qu'un nombre suffisant d'animaux puisse être inclus (taille homogène des tumeurs), 7 animaux résiduels seront également ajoutés pour un total final de n=31 souris.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux pour lesquels le volume de la tumeur n’excède pas 1000-1200 mm3 (plus rarement, il est toutefois possible d’inclure des animaux dont le volume de la tumeur est supérieur à 1000-1200 mm3, mais sans dépassement de point limite). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris sont l’espèce de référence pour les études en oncologie. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines minimum à la date de début d’étude d’imagerie) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

1 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent chaque matin pendant six jours une injection d'alcool, et le cerveau de leur descendance est examiné par imagerie sous anesthésie sans analgésie, à trois semaines puis à six mois, avant la mort pour prélèvement du cerveau. Le porteur décrit un stress modéré et passager chez les mères et reconnaît que les nuisances fines chez les petits ne sont pas connues. Il vise à comprendre les effets de l'alcoolisation fœtale et affirme qu'un cerveau entier et en fonctionnement ne se reproduit ni in vitro ni in silico.

Objectifs

L'exposition prénatale à l'alcool (éthanol-EtOH) peut modifier les trajectoires de développement du cerveau et des déficits cognitifs, de la mémoire et du comportement. Ces symptômes induits par la consommation d'alcool de la mère pendant la grossesse sont regroupés sous le terme de troubles du spectre de l'alcoolisation fœtale (TSAF). Les TSAF sont la principale cause de retard mental non génétique dans le monde occidental. En France, 7 000 à 10 000 enfants naissent chaque année avec un TSAF, repésentant un coût sociétal estimé à 10 milliards d'euros par an. Bien que des efforts considérables aient été faits pour mieux comprendre les effets de l'exposition à l'alcool sur le développement, des questions restent en suspens. Ce projet à pour objectif de mieux comprendre les effets de l'alcool sur le développement et le fonctionnement du cerveau.

Bénéfices attendus

En comprenant mieux les effets de l'alcool sur le développement du cerveau, ce projet pourriat permettre d'envisager des traitements à plus long terme chez les enfants souffrants de troubles du spectre de l'alcoolisation fœtale .

Procédures

L'alcoolisation des mères gestantes est réalisé en fin de gestation. Pratiquement, une injection sous cutanée d'éthanol ou de solution saline (contrôle) est administrée chaque matin à des femelles gestantes pendant 6 jours de suite. Celle-ci est réalisée sous la peau dans la base du cou durant une seconde, chez des animaux vigiles. la durée de l'acte est de moins d'une minute. Le volume d’alcool injecté est quotidiennement calculé selon le poids de chaque souris gestante. Afin de mieux comprendre l'impact de l'alcool sur les développement et la physiologie du cerveau, le cerveau des souriceaux issues des mères alcoolisées sont étudiés, sous anesthésie, par une technique d'imagerie biomédicale non invasive d'une durée de 1H30 maximum. Nous ne pouvons pas réaliser l'injection d'une molécule d’analgésie car cela interfère avec les paramètres d’imagerie. Cette procédure d'imagerie est réalisée qu'une seule fois aux stades P21 et 6 mois.

Impact sur les animaux

L'injection d'alcool chez les mères par une simple piqure provoque un stress modéré et passager. Les effets de l'acool sont égalements passsagers et ne durent qu'une dizaine de minutes. L'etude du cerveau par imagerie biomédicale chez les souriceaux et réalisé sous anesthésie générale et n'induit donc aucun effet indésirable chez les animaux. Concernant les souriceaux issus de mères alcoolisées, aucun effet indésirable (stress, perte de poids, alimentation) n'est percevable ou mesurable. Aux doses utilisées, les nuisances subtiles ne sont pas connues. C’est au niveau du cerveau que nous nous attendons éventuellement à des modifications très fines qui pourraient être révélées par imagerie.

Devenir

Pour l'ensemble des analyses, tous les animaux seront euthanasiés par des procédures adéquates et réalisées par du personnel compétent. Les prélèvements de cerveaux, réalisés après euthanasie des souris, permettront d'étudier de manière approfondie plusieurs mécanismes physiologiques qui sont importants pour le développement du cerveau. L'ensemble des études permettra de mieux comprendre les effets de l'alcoolisation sur la physiologie cérébale de la descendance et de trouver des pistes thérapeutiques pour la protection du cerveau en développement suite à l'alcoolisation maternelle.

Remplacement

Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique

Raffinement

Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. Pendant les protocoles nécessaires pour étudier le cerveau, les animaux seront anesthésiés et surveillés. Nous ne pouvons pas réaliser l'injection d'une molécule d’analgésie car cela interfère avec les paramètres d’imagerie. Les animaux sont suivis avec une grille d'évaluation du score clinique. Des points limites prédictifs bien définis permettent d'éviter toute souffrance animale. Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Le modèle souris est modèle de choix pour ces études car il possède beaucoup de caratéristiques communes avec le développement humain. Le cerveau des souris présente également de nombreuses caratéristiques communes avec la physiologie du cerveau humain. Les stades de développement choisis dans cette étude chez la souris à E17/E19 correspondent au stade gestationnel de 20 semaines chez l'humain, à P0 au stade gestationnel de 23 semaines chez l'humain, à P21 à l'âge de 15 ans chez l'humain et à P180 à l'âge de 35 ans chez l'homme. L'étude de l'exposition périnatale à l'alcool sur l'animal nouveau-né et au cours du développement cérébral jusqu'à l'âge adulte est nécessaire pour optimiser la recherche de nouveaux outils thérapeutiques. Les âges de développement choisis dans cette étude chez la souris correspondent à différents stades de développement chez l'homme (foetus, adolescent, adulte).

Greffées de cellules leucémiques humaines par voie intraveineuse ou dans le fémur, les souris reçoivent ensuite, selon les études, des molécules par injection jusqu'à deux fois par semaine ou par gavage quotidien pendant quatre semaines, avec jusqu'à douze prises de sang et trois prélèvements de moelle chacune. 3 000 souris immunodéficientes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Beaucoup développent une leucémie qui, à un stade avancé, les amaigrit et les affaiblit. Des greffes peuvent aussi se faire sur des souriceaux nouveau-nés, pour étudier les leucémies de l'enfant. Le porteur annonce des points limites et des "critères d'arrêt précoces de souffrance" sans en préciser aucun.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvments de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.