Souris

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une myopathie rare, elles reçoivent dès un à trois jours de vie une injection de vecteur viral sous anesthésie par le froid, puis passent des tests de force musculaire jusqu'à douze fois et une mesure invasive de force sous anesthésie sans réveil à quatre mois, avant d'être tuées pour analyse des muscles. Le porteur indique que ces nouveau-nés peuvent souffrir d'une hypothermie non corrigée ou être rejetés par leur mère, et que la lignée développe une faiblesse musculaire progressive. Il juge "indispensable" de poursuivre chez la souris pour vérifier l'efficacité et la toxicité de la thérapie à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

La Myopathie CentroNucléaire Autosomique Dominante est une maladie rare du muscle. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine impliquée dans les processus d’entrée et de transports de vésicules dans la cellule. L'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie après administration à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs des essais de traitement de l’ensemble des muscles via une administration par voie sanguine se sont révélés infructueux y compris chez les souris d’1 mois. L’expression d’une molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral de type virus adéno-associé (AAV) est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau par des vésicules. Nos résultats antérieurs montrent que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec l’évolution de la maladie. Ainsi la maladie elle-même, semble compromettre l’administration du traitement. Le but de ce projet est d’intervenir le plus précocement possible dans le développement de la maladie (en période néonatale) afin de s’affranchir de son impact potentiel sur l’acheminent du vecteur thérapeutique et de tester différentes combinaisons de constructions de vecteur viral dans une optique d’amélioration de son administration dans ce contexte pathologique.

Bénéfices attendus

L’aboutissement de ce projet constituera une étape essentielle de l’étude préclinique de notre molécule et est nécessaire au développement de futurs traitements inexistants à ce jour pour les patients atteints de Myopathie Centronucléaire. Il participera également à la compréhension et l’optimisation des voix d’administration de ce type de molécule dans un modèle pathologique présentant une altération de la transduction virale

Procédures

Toutes les souris subiront une injection en intrapéritonéale (IP) ou dans le système sanguin d’un virus vecteur « inactivé » exprimant un gène luminescent ou un shRNA thérapeutique à l’âge de 1 ou 2 jours à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille ultrafine. Une seule injection sera réalisée par souris sous anesthésie. La durée de l’injection est d’environ 15 secondes par souris. La durée totale du geste par souris est d’environ 30 minutes incluant l’anesthésie de quelques minutes, l’injection et le réveil avec ses congénères avant d’être replacé dans la cage avec la mère. Ensuite, un premier lot de souris subira une injection intrapéritonéale (IP) d’un produit permettant de visualiser le gène luminescent à l’âge de 1 mois, 2 mois et 4 mois suivi d’un examen d’imagerie dans un appareil qui permet de lire la bioluminescence. Ce lot de souris sera anesthésié par anesthésie gazeuse au moment de l’examen qui dure quelques minutes. Ces souris seront euthanasiées à l’âge de 4 mois. Résumé des interventions subies par le lot1 : Injection d’AAV IP ou Veine temporale (J1 ou J2) -> (Injection IP de luciférine +Imagerie sous anesthésie gazeuse) *3 -> Euthanasie à 4 mois. Un second lot sera soumis à des tests de force musculaire non invasifs à partir de l’âge d’1mois. Ces évaluations sont la mesure de la force par test d’agrippement sur une grille et de maintien sur la grille après retournement. Ces 2 mesures durent environ 5 minutes par animal et seront répétées toutes les semaines entre 1 et 4 mois (soit 12 fois maximum pour chaque test). Une mesure de traction sur une barre sera réalisée à 2 reprises également pour chaque souris, 3 essais/souris avec 30 secondes entre chaque essai. Une mesure directe de la force du muscle de la patte après stimulation électrique sera réalisée chez ces souris à l’âge de 4 mois sous anesthésie générale gazeuse avec analgésie en procédure sans réveil par le personnel expert. Elle dure environ 20 mn par souris. Résumé des interventions subies par le lot 2 : Injection du vecteur viral en IP ou Veine temporal (J1 ou J2) -> Mesures non invasives de forces musculaire (hebdomadaire entre 1 et 4mois soit environ 12 fois)-> Mesure de Forces invasives sous anesthésie gazeuse puis euthanasie à 4 mois.

Impact sur les animaux

La lignée de souris modèle présente un phénotype dommageable. Les hétérozygotes développent une faiblesse et une atrophie musculaire progressive dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient jusqu’à environ 8 mois avec une perte de force musculaire l’ordre de 40% par rapport à des souris sauvages. Ce phénotype est comparable à celui observé dans la myopathie humaine. Ces souris hétérozygotes sont par ailleurs viables et fertiles avec une courbe de poids comparable à des souris sauvage. Les souris homozygotes meurent dans les premières 24h après la naissance mais ne seront pas produite dans ce projet. L’élevage de la lignée pour les projets fait l’objet d’une autorisation spécifique. Les différentes procédures que vont subir les animaux (tests de forces non-invasives, contention pour les injections intrapéritonéale, préhension des animaux pour les anesthésier) entrainent un stress de l’animal. Les animaux pourraient également souffrir d’hypothermie non-reversée suite à l’anesthésie par le froid ou être rejeté par leur mère. L’utilisation des vecteurs viraux de ce projet n’entraîne pas de douleurs et aucune pathologie ni effets indésirables ne sont induits chez les animaux traités avec des ARN interférence ou les AAV. Cependant une inflammation au site d’injection pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de l’approche thérapeutique par ARN interférence allèle spécifique a été démontré au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de la stratégie thérapeutique en injection ciblée dans le muscle de souris du modèle de la maladie par l’intermédiaire du vecteur viral utilisé dans le projet. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant des modifications du vecteur viral et de son contenu afin d’améliorer l’expression de la molécule thérapeutique. Il nous apparait indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier

Réduction

Des études précédentes sur nos différents projets nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés (entre 6 à 8 souris par groupes expérimentaux). Une première étude correspond à une étude pilote sur le sérotype et la voie d’administration systémique afin de réduire le nombre d’animaux utilisé pour la deuxième étude avec le vecteur exprimant la molécule thérapeutique. Les mâles et femelles sauvages et hétérozygotes seront analysés mais les comparaisons seront réalisées entre souris de même genre dans les 2 études. En effet des différences d’efficacité de transduction et de forces sont connues entre mâles et femelles. Ainsi cette étude pourra aussi permettre de révéler ou non des différences de phénotypes ou de réponse au traitement entre les sexes. Nous injecterons le nombre de portées nécessaire à obtenir au moins 8 souris de chaque génotype d’un même sexe pour les 2 études. Des analyses statistiques dédiées à l’analyse sur petit groupe seront utilisées pour une interprétation la plus fiable possible des résultats. Les constructions de la 2ème étude seront testées de manières successives et si une option s’avère parfaitement efficace les autres ne seront pas testées. Aussi, l’ensemble de ces projets nécessite au maximum l’utilisation de 720 souris (sauvages et hétérozygotes) dans les 2 études expérimentales pour les 5 ans du projet.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h/jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés 6 par cage maximum et l'isolement est évité au maximum. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Les animaux sont observés quotidiennement par l’animalier en charge de la lignée ou par les personnes en charge des protocoles. L’utilisation de vecteurs viraux de type virus adéno-associé n’entraine a priori pas de douleurs et donc de mise en place de traitement particulier pour y palier mais une surveillance renforcée sera exercée dans les jours suivants l’injection des souris. La procédure d’injection dure moins d’une minute par souris et est réalisée après anesthésie par le froid chez les nouveaux nés. L’imagerie est réalisée après anesthésie gazeuse et les mesures de forces de type Grip, Hanging et string test sont non invasives. Pour les mesures de forces invasives elles sont réalisées sous anesthésie et sans réveil. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant une lampe ou un tapis chauffant. Les animaux anesthesiés par le froid dont réchauffés progressivement dans une cage placée sur tapis chauffant. Les nouveaux nés ne sont replacés avec leur mère qu’une fois réchauffés et complètement réveillés (respiration normale et mouvements spontanés). Ils sont également frottés avec la litière de la cage maternelle afin de limiter le risque de rejet et remis tous en même temps dans la cage.Le comportement de la mère envers les petits est ensuite surveillé pendant 15 minutes puis fréquemment pendant les heures suivantes. Pour tous les projets, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour l’optimisation du traitement, car la molécule testée ici est un outil génétique qui cible spécifiquement la mutation du gène portée par ce modèle. Le modèle de souris utilisé est le plus petit modèle mammifère pour cette myopathie et est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons précédemment démontré l’innocuité et l’efficacité du vecteur viral thérapeutique utilisé dans le muscle de souris de ce modèle. A ce stade il apparait donc indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude chez la souris afin d’en optimiser l’efficacité et vérifier la toxicité à l’échelle de l’organisme entier (injection dans le système sanguin). Les souris développent un phénotype musculaire progressif dont les premiers signes apparaissent à 1 mois et s’amplifient ensuite. Nos études préliminaires montrent que le défaut qui permet le bon acheminement du vecteur thérapeutique apparait entre 1 et 2 mois et s’aggrave avec la progression de la maladie. L’objectif de ce projet thérapeutique étant d’intervenir au plus tôt dans le développement de la maladie, les souris seront injectées en période néonatale entre 1 et 3 jours de vie. Nous nous limiterons à des injections entre J1 et J3 car après la veine temporale n’est plus visible du fait de l’apparition de la pigmentation de la peau et pour l’injection intra-péritonéale il s’agit de la fenêtre permettant une diffusion optimale en systémique (perméabilité maximale). Les souris sont par la suite évaluées à 1, 2, 3 et 4 mois après l’injection 1 c’est-à-dire après le début des symptômes jusqu’à ce que la maladie soit bien développée.

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour deux gènes de l'horloge biologique, elles sont gavées cinq jours par semaine pendant trois semaines et placées dans des caissons appauvris en oxygène, en continu ou par cycles reproduisant l'apnée du sommeil, avant une mesure de pression cardiaque et la mort pour prélever les organes. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une perte de poids et que les caissons génèrent stress, bruit et fatigue par mauvais sommeil. Il cherche à savoir si le rythme circadien protège de la sénescence pulmonaire et reconnaît que ce rythme s'étudie difficilement in vitro.

Objectifs

L’impact de la sénescence sur le fonctionnement du rythme circadien, et inversement, commence à être mis en évidence dans plusieurs travaux montrant des altérations de l’horloge circadienne avec l’âge, chez l’homme et chez la souris. La sénescence cellulaire correspond à l’arrêt de la prolifération et à la perte des fonctions initiales de la cellule. C’est un phénomène qui peut survenir après différents stress ou bien naturellement au cours des divisions successives. La sénescence cellulaire est aujourd’hui considéré comme un processus important dans de nombreuses maladies liées à l’âge. Les protéines p21 et p16, régulateurs du cycle cellulaire, sont deux des principaux marqueurs de la sénescence. D’autre part, le rythme circadien chez les mammifères est généré par des oscillations de l’expression de gènes spécifiques au niveau cellulaire (gènes circadiens). Rev-Erb alpha et Bmal -1, deux composants clés de l’horloge circadienne, sont capables d’interagir avec p21, indiquant un lien avec le cycle cellulaire, et potentiellement avec la sénescence. Des résultats obtenus dans un modèle d’apnée du sommeil chez la souris montrent une dérégulation de ces gènes circadiens, ainsi qu’une altération de l’expression de p21 dans le poumon. D’autre part, l’exposition de souris à l’hypoxie chronique (pour modéliser l’hypertension artérielle pulmonaire) induit une accumulation de cellules sénescentes dans le poumon. Nous cherchons à déterminer si le rythme circadien joue un rôle protecteur contre la sénescence, dans des conditions normales ou pathologiques. Nous utiliserons pour cela deux modèles de souris dans lesquels les gènes Rev-Erb alpha ou Bmal-1 sont non-fonctionnels. Ces souris seront exposées à l’hypoxie chronique, ou à l’hypoxie intermittente (modèle d’apnée du sommeil) afin de reproduire des conditions similaire à celles observées dans deux pathologies humaines affectant le poumon. Nous traiterons les souris avec une molécule permettant d’éliminer spécifiquement les cellules sénescentes (molécule sénolytique). Cette étude permettra finalement de comprendre : 1) comment est impacté le processus de sénescence cellulaire chez des souris génétiquement modifiées présentant un rythme circadien altéré. 2) comment l'élimination des cellules sénescentes par un traitement pharmacologique corrige les altérations induites par l’exposition au stress hypoxique et par le défaut des gènes circadiens.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront de décrire plus précisément le lien suspecté entre rythme circadien et sénescence, suggéré dans plusieurs travaux récents, ainsi que d’explorer les mécanismes d’interaction entre les deux processus. A terme, cette étude permettra d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques pour agir indirectement sur la sénescence en ciblant le rythme circadien. Comprendre les différents facteurs pouvant impacter la sénescence est important pour pouvoir envisager des traitements et/ou déterminer des facteurs de risques, dans le contexte d’une population vieillissante.

Procédures

Les animaux seront gavés 5 jours par semaine pour les traitements par la molécule sénolytique ou le placebo pendant une durée de 21 jours. Pendant cette durée, ils seront placés dans des caissons à hypoxie et hypoxie intermittente, dans lesquels est injectée de l’azote afin de réduire la concentration en oxygène soit : en continu pour l’hypoxie chronique, afin d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patient atteint de broncho-pneumopathie obstructive chronique ; de façon cyclique pour reproduire les cycles d’hypoxie/réoxygénation observés chez les patients atteints d’apnée du sommeil. A la fin de la procédure, les animaux seront profondément anesthésiés et analgésiés pour la prise de la pression ventriculaire, suite à quoi ils seront euthanasiés pour le prélèvement des organes.

Impact sur les animaux

Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie et l'hypoxie intermittente en début de procédure. Les caissons d'hypoxie intermittente peuvent créer un stress dû au bruit généré par la machine et à l'hypoxie au début de l'expérimentation, ainsi qu'une fatigue chez les souris dû à une faible qualité de sommeil. Le gavage est aussi une source de stress pour les souris.

Devenir

L'étude nécessite le prélèvement des organes (poumons, cœur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologique (quantification des marqueurs de sénescence, expression des gènes circadiens) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon) les animaux seront donc mis a mort à la fin des procédures.

Remplacement

Le rythme circadien peut difficilement être étudié in vitro. En effet une fois mise en culture, les cellules ont tendance à perdre l’expression rythmique des gènes circadiens et à se désynchroniser entre elles, ce qui est problématique pour étudier des effets à moyen et long terme. De plus, les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire fidèlement les concentrations d’oxygène qui varient de manière complexe en fonction des organes, tissus et du métabolisme, ce qui est problématique pour étudier un modèle impliquant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente, où les changements de la concentration d’oxygène sont récurrents. Cependant, nous utiliserons en parallèle un modèle de culture cellulaire pour étudier l’interaction entre Rev-Erb alpha et p21.

Réduction

Nous choisissons de réaliser des groupes de taille suffisante pour atteindre une puissance statistique satisfaisante, ce qui nous évitera d’avoir à recommencer l’expérience pour cette raison. Par ailleurs, les groupes ont été pensés afin de réduire le nombre d’animaux tout en ayant les contrôles nécessaires à l’analyse correcte des résultats. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même portées pour réduire au maximum la variabilité des données. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.

Raffinement

Les zootechniciens et les investigateurs du projet seront en communication concernant le bien-être et la santé des animaux qui seront surveillés quotidiennement. L'environnement des souris sera enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier kraft et du coton. Le gavage sera effectué par un même expérimentateur afin de réduire le stress des souris. Les souris recevront une anesthésie et analgésie adaptée avant la mise à mort. Pendant la durée des procédures, des critères d’évaluation et des points limites adaptés seront utilisés afin de détecter des signes de souffrance, et de procéder si nécessaire à la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

Les modèles d'hypoxie intermittente et d'hypoxie chronique que nous souhaitons utiliser sont bien décrits dans la littérature, ils ont fait l'objet de plusieurs publications notamment dans le domaine des maladies vasculaires et pulmonaires. On utilisera des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et on considère que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour évaluer dans quelle mesure l'accumulation de cellules sénescentes altère le rythme circadien.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie des injections d'ADN dans un muscle suivies d'une électroporation, puis sept prises de sang en un mois sur animal vigile, pour mettre au point une méthode faisant produire une protéine par les cellules musculaires. Le porteur indique que les injections et les prélèvements peuvent provoquer des douleurs et des hématomes, et prévoit la mort de toutes les souris pour analyser leurs muscles. Il présente cette mise au point comme une étape vers des biomédicaments destinés aux animaux domestiques.

Objectifs

Le présent projet vise à développer une méthode permettant de faire exprimer par un muscle une protéine d’intérêt à partir d’un plasmide contenant sa séquence codante. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace. Le projet se focalisera sur des protéines de types anticorps, à longue durée de vie, puis un peptide, la kisspeptine, à plus courte durée de vie, impliqué dans le contrôle de la reproduction. L’objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression de protéines par les cellules musculaires et 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques.

Bénéfices attendus

Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires d’un muscle de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques intéressantes et notamment, dans notre cas, pour les animaux domestiques.

Procédures

Les animaux de cette étude seront soumis à des injections intramusculaires et de l'éléctroporation sous anesthésie générale (d'une durée inférieure à 10 minutes). Afin de réaliser un suivi de l'expression des protéines exprimées suite à l'injection, 7 prélèvements de sang de quelques secondes seront réalisés sur animaux vigiles sur une période de 28 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures employées dans notre projet emploient des injections intramusculaires, d’ADN complexé ou non à un transfectant pouvant potentiellement induire des douleurs. Des prises de sang seront également réalisées et peuvent provoquer des douleurs, ou encore des hématomes aux lieux de ponctions.

Devenir

Afin de réaliser des marquages et des études poussées sur les muscles de nos animaux, ceux ci seront euthanasiés suite à l'injection d'un mélange anesthésique à l'issu de chaque procédure

Remplacement

Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont sur des modèles de cultures cellulaires. L’étude de la production de nos protéines d’intérêt par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a, à l’heure actuelle, pas de méthode de remplacement qui permet de suivre l’effet des silençage épigénétique et immunitaire.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. La première mesure de réduction a été d’utiliser des vecteurs exprimant des protéines qui sont détectables dans la circulation sanguine et pouvant être dosées. De cette façon, les animaux ne seront pas euthanasiés à chaque temps d’observation pour étudier l’expression du vecteur et celle-ci pourra être suivie au cours du temps sur un seul et même animal. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. La seconde mesure de réduction consistera à effectuer un premier tri de notre collection de vecteurs plasmidiques sur des systèmes cellulaires, ce qui a permis de réduire de façon significative le nombre de tests sur animaux.

Raffinement

Les animaux utilisés dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique, dans des cages en présence d'enrichissement. De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Une attention toute particulière sera portée au comportement et l'apparence des souris et celles ci seront pesées tous les jours pendant 3 jours après les injections intramusculaires, injections ou prises de sang puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements sanguins. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). Afin de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies, des traitements anesthésiques et analgésiques seront apportés aux animaux pour réduire leur douleur au maximum.

Choix des espèces

Le projet emploie la souris qui est un modèle de petite taille possédant donc de petits muscles. Pour une mise au point comme c’est le cas dans notre projet, l’approche est ainsi facilitée. Enfin, la souris est un modèle très largement employé dans la littérature pour ce genre d’étude, les connaissances associées sont donc très nombreuses et nous permettent donc d’être plus précis sur certains aspects techniques, réduisant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire nos protéines d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc post pubères et adultes.

420 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses colorectales puis jusqu'à dix-huit injections dans l'abdomen sur deux semaines, pour tester si la nortriptyline ou le blocage de l'interleukine-23 rend la tumeur plus sensible à une chimiothérapie et à une immunothérapie. Le porteur précise que les souris sont maintenues sans traitement antidouleur pour ne pas fausser la réponse inflammatoire, tout signe de souffrance entraînant leur mise à mort. Il présente une régression complète de la tumeur comme un résultat probable et affirme que l'effet sur le microenvironnement tumoral ne peut être modélisé in vitro.

Objectifs

Ce projet vise à démontrer le rôle de l’accumulation de lipides et de son inhibition par la nortriptyline ou par le blocage de l’IL-23 dans la sensibilisation à la chimiothérapie 5-Fluorouracil et à l’immunothérapie anti-PD-L1 dans le cancer colorectal.

Bénéfices attendus

L’agent anti-cancéreux 5-FU perd de son efficacité avec l’accumulation induite de gouttelettes lipidiques intracellulaires et pourrait limiter également l’action favorable de l’immunothérapie anti-PD-L1 par l’induction de ces gouttelettes lipidiques limitant l’action du système immunitaire anti-tumoral. La prévention de l’accumulation des gouttelettes lipidiques par l’inhibition de la capture de lipides extracellulaires à l’aide de la nortriptyline ou l’anti-IL23 améliorerait l’efficacité du traitement 5-FU et de l’immunothérapie anti-PD-L1 conduisant probablement à une régression tumorale complète avec un traitement combinant ces trois molécules.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales tous les 3 jours pendant 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les injections IP répétées (avec au maximum 18 injections sur deux semaines) peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation en sous-cutanée des cellules se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids (deux fois par semaine) sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront traitées pendant deux semaines et maintenues en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du blocage de la capture de lipides extracellulaires pourrait moduler l’activité de l’ensemble du microenvironnement tumoral et notamment celle du système immunitaire qui ne peut être modélisée in vitro. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 420 souris mâles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 ou Balb-C a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. Des souris mâles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un traceur radioactif, par voie intrapéritonéale à l'état vigile et par voie intraveineuse sous anesthésie, suivies de séances d'imagerie jusqu'à huit fois par animal. L'objet du projet n'est pas thérapeutique mais consiste à comparer deux appareils d'imagerie, dont un prototype de TEP haute résolution dédié à la souris. Le porteur affirme qu'un tel appareil doit être testé sur l'"organisme entier" et que la modélisation mathématique ne peut remplacer la "vérité terrain" sur le cerveau.

Objectifs

Le projet vise à comparer 2 systèmes d’imagerie : le système d’imagerie actuellement utilisé au sein du département d’imagerie préclinique dédié rats et souris versus un prototype d’imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons), Haute résolution dédié exclusivement à la souris. Le prototype est en développement et des études in vitro ont été réalisées. Les résultats sont très encourageants, il est donc nécessaire de le tester sur l’animal vivant (organisme entier) pour objectiver l’impact du gain en résolution et en sensibilité des images. En effet, l’optimisation de la qualité des images est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes sains et pathologiques associés au système nerveux central. Un système d’imagerie plus performant nous permettra de raffiner nos connaissances sur l'étiologie de certaines pathologies cérébrales et ainsi d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans la prise en charge de ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet qui consiste en la validation d’un nouveau système d’imagerie haute résolution chez la souris nous permettra d’obtenir des résolutions optimales dans le cadre de nos activités de recherche relative à l’exploration cérébrale. En effet, nos thématiques de recherche ciblent en majeur partie des études portant sur le système nerveux central des rongeurs. Actuellement, nous travaillons sur des modèles rats et souris avec un système d’imagerie dont la résolution est autour du millimètre, il est donc plus aisé de travailler sur des modèles rats de par la taille. Cependant, une grande partie des modèles animaux de pathologie du système nerveux central sont des modèles souris. L’optimisation de la résolution mais aussi de la sensibilité et de la qualité des images fournies par nos systèmes d’imagerie est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes impliqués dans les différentes pathologies du système nerveux central. En effet, un système d’imagerie plus performant nous permettrait de raffiner nos connaissances sur l'étiologie de certaines pathologies cérébrales. Nous espérons que ce système nous apportera des informations complémentaires pour mieux comprendre le métabolisme cérébral basal (animal sain), les mécanismes pathologiques impliqués dans la neuroinflammation et appréhender la sensibilité de ce nouveau système en terme de quantification des images. Ceci, nous permettra de raffiner nos connaissances sur ces pathologies cérébrales et, potentiellement, d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans la prise en charge des pathologies du système nerveux central.

Procédures

Etape 1: Injection intrapéritonéale en vigile: 8 fois en tout, 2 min/souris – injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse: 6 fois – Imagerie 30 min sous anesthésie gazeuse, 8 fois/animal Etape 2: Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse: suivi d’une imagerie de 60 min, 8 fois/animal Etape 3: Injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse suivi d’une imagerie de 60 min, 3 fois/animal injection intrapéritoneale, vigile, 1 fois/par animal.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute un stress supplémentaire. Une douleur au point d’injection du traceur radioactif ou des traitements pharmacologiques en intrapéritonéal peut être ressentie quelques heures. Un hématome associé avec une douleur au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue du projet et les cerveaux seront prélevés pour des analyses immunohistochimie et métabolomiques.

Remplacement

Les études réalisées in vitro sont très encourageants. A ce stade, il est impératif d’étudier ce nouveau système d’imagerie sur l’organisme vivant entier. Ce type d’étude ne peut être substitué par une modélisation mathématique car l’objectif final est d’obtenir la vérité terrain sur le cerveau qui intègre l’environnement vasculaire cérébral et ainsi la distribution systémique du radiotraceur au sein du système nerveux central.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux, les animaux seront imagés plusieurs fois. A partir des images individuelles acquises pour chaque radiotraceur, les images seront générées afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques appropriées pour ce projet pour comparer les différents groupes. Le nombre d’animaux dans cette étude est dictée par des études antérieures menées au sein de notre laboratoire qui ont montré qu’un effectif de n=12 par groupe et par imageur est nécessaire pour répondre à nos objectifs. Nous prévoyons d’inclure un effectif de 15 animaux/groupe de chaque sexe (afin d’assurer un minimum de 12 animaux à exploiter).

Raffinement

Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimentation pour diminuer leur stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal chaque jour d’expérimentation jusqu’au réveil complet.

Choix des espèces

L’objectif étant de caractériser un système d’imagerie haute résolution, la souris est l’espèce adaptée pour cette étude. De plus, la taille du cerveau de la souris est compatible avec la sensibilité et la résolution spatiale des 2 imageurs qui seront utilisés. Nous utiliserons des souris adultes afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.

1 080 rongeurs, 864 souris et 216 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète de type 1 est induit par injection de streptozocine, puis les animaux reçoivent des candidats médicaments, parfois par pompe osmotique implantée, et subissent des tests de glycémie avec prises de sang répétées. Le porteur indique que les administrations et la contention peuvent provoquer stress et douleur. Il présente ces molécules comme sélectionnées après des tests in vitro et destinées à d'éventuels essais cliniques, et prévoit la mort de tous les animaux en fin de procédure.

Objectifs

Le glucose est décrit comme étant le principal carburant de l’organisme, et son taux plasmatique est régulé par l’insuline, une hormone secrétée par les cellules bêta du pancréas. Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose, appelé aussi hyperglycémie, dans le sang. On distingue principalement 2 types de diabète : le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). Le DT1 est due à la détérioration des cellules bêta du pancréas entraînant une carence en insuline, tandis que le DT 2 est causé par une baisse de la production d’insuline ou l’apparition d’une résistance à l’insuline produite. Le DT 1 est une maladie auto-immune, en effet, il fait suite au dysfonctionnement des cellules immunitaires (lymphocytes T), qui se mettent à identifier les cellules bêta du pancréas comme des cellules étrangères et à les éliminer. Le DT1 représente environ 10 pour cent des cas de diabètes, dont la moitié se déclare avant l’âge de 20 ans. Il a une incidence d’environ 15 cas pour 100 000 enfants de moins de 15 ans. L’insulinothérapie est le traitement de référence du DT1, qui consiste à des injections sous-cutanées d’insuline plusieurs fois par jour. Un traitement bien suivi permet le plus souvent de réguler la glycémie, néanmoins, c’est un traitement lourd et chronique, nécessitant en même temps une mesure de la glycémie par le patient plusieurs fois par jour. A noter que c’est un traitement qui permet une prise en charge, et non une guérison, et donc à prendre à vie. Par ailleurs, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter au rythme de 3 à 4 % par an. Ainsi, la recherche continue, soit à décrypter les mécanismes de la maladie pour mieux la prévenir, soit en améliorant les traitements. Ce projet a donc pour objectif de tester des nouveaux candidats médicaments pour le traitement du DT1 chez le rat ou chez la souris.

Bénéfices attendus

Depuis une vingtaine d’année, le nombre de personnes atteintes de DT1 ne cesse d’augmenter tous les ans, tandis que le traitement de référence reste l’insulinothérapie, un traitement lourd et à vie. Ce projet vise à rechercher et sélectionner les candidats médicaments efficaces pour traiter le DT1 chez l’animal, afin d’obtenir une preuve d’efficacité pour d’éventuels essais cliniques chez l’homme par la suite.

Procédures

Les interventions que vont avoir les animaux sont : - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à tester, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. Tout type d’administration sur animal vigil, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute. L’administration à l’aide d’une pompe osmotique dure moins d’un quart d’heure. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour, pendant 1 à 48 semaines). - Une administration intrapéritonéale de streptozocine si le modèle animal requiert l’induction du diabète de type 1. Ce traitement durera 5 jours au maximum avec une administration par jour, réalisé par des personnels tutorés, et dure moins d’une minute. - Un test de supplémentation au glucose ou en insuline (comme réalisé chez l’homme). Ce test consiste à une administration de glucose ou d’insuline, puis à des prélèvements sanguins permettant le dosage de glucose et ou d’insuline dans le sang. Le test est réalisé une seule fois pour chaque animal, et les prélèvements sont réalisés au maximum 5 fois chez la souris et 7 fois chez le rat, dans les 2 heures qui suivent la supplémentation. Chaque prélèvement sanguin par des personnels tutorés dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induit par l’administration du composé à tester, qui nécessitera une contention, et l’implantation de pompe osmotique si besoin - Stress potentiellement dû à l’isolation pour les prélèvements d’urine en cage à métabolisme (moins de 24 heures) ou dû aux prélèvements sanguins.

Devenir

Tous les animaux vont avoir un diabète de type 1 et ou vont recevoir un traitement contre cette maladie. Ainsi, au vu des traitements réalisés sur les animaux, ils seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

Les composés testés dans ce projet sont ceux ayant montré au préalable des effets positifs dans des tests in vitro (screening).

Réduction

Tout d’abord, seuls les composés ayant montré des effets positifs lors des sélections in vitro seront étudiés dans ce projet, limitant le nombre d’animaux à utiliser. Ensuite, selon la littérature et notre expérience, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Et en prenant en compte les exclusions ou pertes potentielles tout au long de l’étude (environ 20 pour cent), 12 animaux par groupe seront étudiés. En considérant que pour l’étude d’un composé pharmacologique, 6 groupes seront nécessaires, et que l’analyse des résultats sera réalisée en 4 mois, 3 sélections sont prévues par an sur 5 ans. Ainsi, le nombre estimé d’animaux est de : 6 groupes d'animaux x 12 animaux par groupe x 3 sélections par an x 5 ans. Soit un total de 1080 animaux, rats et souris confondus. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les animaux sont hébergés à au moins 2 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Une anesthésie, anesthésie et un traitement antibiotique prophylactique sont réalisées si la procédure d’implantation de pompes osmotiques est réalisée.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du diabète. Les rats et les souris sont bien décrites sur le plan physiologique et comportemental, et pour lesquels il existe de nombreux modèles répondants à l’approche thérapeutique envisagé (diabète de type 1). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. L’étude du diabète nécessite l’apparition des caractéristiques qui sont stables et établies au-delà du stade juvénile.