Souris

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale d'un ou plusieurs dépôts de graisse (lipectomie) sous anesthésie et deux prises de sang, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur fixe comme point limite une perte de poids rapide de 20 %, seuil déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau souscutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années dans l'équipe. Pour cette étude, nous utiliserons des souris C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

54 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de gel sous anesthésie puis jusqu'à 35 séances d'imagerie sous anesthésie en 28 jours, pour suivre la libération d'un anticorps et la dégradation du gel. Le porteur indique que l'accumulation de contentions, d'anesthésies et d'injections entraîne une nuisance globale modérée. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace le modèle animal pour reproduire la complexité de l'environnement sous-cutané, l'objectif restant une preuve de concept à visée de confort des patients.

Objectifs

L'utilisation pharmaceutique de protéines thérapeutiques telles que les anticorps a augmenté au cours des dernières années. Ces actifs sont principalement administrés par voie intraveineuse (i.v.) conduisant fréquemment à une élimination trop rapide. Ceci entraine le besoin d’administrations régulières qui limitent la qualité de vie des patients et augmentent le coût global des traitements. Ces dernières années, l'administration sous-cutanée (SC) a attiré beaucoup d’attention car elle présente de nombreux avantages. Elle est en effet plus pratique, plus rapide, plus économique et plus facile à administrer que l'administration intraveineuse (i.v.). D’autre part, afin de limiter le nombre d’administrations, les efforts se sont tournés vers le développement de formulations permettant la libération prolongée des actifs thérapeutiques. Au cours des dernières décennies, les gels injectables sont apparus comme des matériaux prometteurs offrant une capacité de chargement élevée d'une large gamme d'agents thérapeutiques. Différents gels ont été développés dans la littérature mais certains présentent des limites. Il existe donc toujours un besoin de développer de nouveaux systèmes de délivrance de protéines thérapeutiques. Nous avons récemment formulé une famille de gels qui peut être chargé avec différents actifs thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’établir une preuve de concept de l’intérêt de ces gels pour la délivrance prolongée d’anticorps après administration sous-cutanée. Le but est d’évaluer sur souris saine la biodégradation des gels après implantation ainsi que la libération prolongée de l’anticorps par imagerie en fluorescence.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’établir une preuve de concept de l’intérêt des gels développés et de sélectionner des formulations prometteuses pour une libération contrôlée et prolongée d’un anticorps thérapeutique. L’objectif à long terme de ce projet est de proposer un système de délivrance de protéines thérapeutiques implantable en sous-cutané afin d’améliorer le confort de vie des patients tout en réduisant le coût global des traitements.

Procédures

Contention lors des déplacements (

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir plusieurs gestes tel que des contentions, des anesthésies, des injections sous-cutanées qui vont engendrer des douleurs et du stress et dont l’accumulation entraînera une nuisance globale modérée sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour permettre des analyses ex vivo nécessaires.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Des études in vitro ont déjà été réalisées mais ne permettent pas de reproduire toutes les conditions représentant la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour évaluer la libération sous-cutanée des actifs piégés dans les gels ainsi que la biodistribution des gels dans le temps. Ces études auront lieu uniquement sur souris saines.

Réduction

L’emploi d'un système d'imagerie du petit animal permet un suivi dans le temps pour chaque animal et permet ainsi de réduire le nombre d’animal pour le projet. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe pour maintenir une interaction entre individus dans des cages enrichies. Les souris ont accès librement à la nourriture et à l'eau. Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur le stress et la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance et stress animal. Les imageries , administrations sous-cutanée et la mise à mort sont réalisées sous anesthésie pour réduire le stress. Après administration : suivi quotidien des animaux, avec mesure du poids lors des séances d’imagerie afin de minimiser le stress et la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec des souris pour lesquelles de nombreux protocoles sont bien établis et pour lesquelles, des études concernant l’administration d’hydrogels ou d’anticorps ont été décrites. Les souris utilisées n'auront pas de pelage qui interfèrerait avec les mesures d’imagerie optique in vivo. Seules des souris femelles (9-11 semaine en début de procédure) seront utilisées dans cette étude.

170 souris et 170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une séance à l'autre puis destinés à d'autres travaux pratiques, dont des procédures sans réveil. Des étudiants novices leur infligent à répétition des contentions, des injections sous-cutanées et des sondages gastriques, chaque animal pouvant être manipulé jusqu'à quatre fois. Le porteur classe ces gestes comme individuellement légers mais reconnaît que leur répétition par des débutants peut les porter à un niveau modéré. Il justifie l'usage d'animaux vivants par la formation réglementaire de futurs techniciens en expérimentation animale, qualification décrite comme recherchée dans son bassin d'emploi.

Objectifs

Durant leurs études, nos étudiants suivent une formation qui qualifie le personnel appliquant des procédures expérimentales aux animaux (niveau II/A), spécifique aux modèles rongeurs. Cette formation réglementaire nous permet de former des techniciens qualifiés en expérimentation animale, qualification très appréciée et recherchée dans notre bassin d’emploi. Le programme de la formation inclut l’acquisition de diverses compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation de rongeurs dans le respect de leur bien-être. La réalisation de la contention ainsi que l'exécution de quelques injections figurent parmi les toutes premières compétences à acquérir. Pour y parvenir, les travaux pratiques que nous souhaitons mettre en place permettront une familiarisation progressive des étudiants aux rongeurs et à ces techniques, en multipliant les supports pédagogiques. Les objectifs pédagogiques de ces séances sont multiples: -familiarisation des étudiants avec les rongeurs -sensibilisation au respect du bien-etre animal -apprentissage des règles d'hygiène et de sécurité propres à la pratique de l'expérimentation animale -connaissance du matériel nécessaire aux injections, préparation de ce matériel, notions d'asepsie -acquisition des compétences techniques de préhension, contention, injection sous-cutanée, sondage gastrique, injection intra-péritonéale.

Bénéfices attendus

Au cours d’une procédure expérimentale, le technicien doit être en mesure de limiter le degré de mal-être généréà l’animal, en apportant des réponses adéquates afin de restreindre celui-ci. Ceci nécessite un apprentissage rigoureux et méthode, réalisé durant des séances d'entrainement. Ce projet permettra à nos étudiants et futurs techniciens, par sa progressivité et la multiplicité des supports à nos étudiants, futurs techniciens d'acquérir les compétences de contention et d'injections courantes chez le rat et la souris tout en veillant à respecter leur bien-être.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections répétées. Par séance, chaque animal pourra être soumis à une injection sous-cutanée et un sondage gastrique. Cet animal sera réutilisé au minimum 48-72h après pour la même intervention mais nous veillerons alors à alterner les sites d'injection sous-cutanée. Le plus fréquemment, il s'écoulera au moins une semaine entre deux injections. Il pourra ainsi être réutilisé jusqu'à 4 fois mais, plusieurs promotions d'étudiants étant concernées, les périodes de travaux pratiques seront espacées parfois de plusieurs semaines avant que l'animal soit soumis à une nouvelle injection. Nous veillerons au suivi attentif des animaux et ne les réutiliserons qu'en absence de mal-être. Ainsi un meme animal sera soumis à, 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique sur 4h, ceci répété au maximum 3 fois espacées de 48 à 72h minimum courant novembre de chaque année puis 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique sur 4h, ceci répété au maximum 1 fois espacée de 48 à 72h minimum courant janvier et enfin 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique, ceci répété au maximum 1 fois espacée de 48 à 72h minimum courant mars (que ce soit 1 rat ou 1 souris)

Impact sur les animaux

Les actes pratiqués ici sont individuellement d’un degré de sévérité léger mais leur répétition (réutilisation des lots à plusieurs jours/semaines d'inrervalle pour réduire le nombre d'animaux utilisés), leur réalisation par des étudiants novices pourraient les classer dans un degré de sévérité modéré. Les effets indésirables possibles, qui seront recherchés et évalués à l'aide d'une grille de scoring et conduiront à la réalisation d'un traitement antalgique adapté, sont : - une perte de poids (évaluée en % et par jour), - un comportement inadapté (comportement des animaux sans intervention du manipulateur – contractions, boiteries des pattes antérieures, position antalgique, prostration - et en réponse au geste du manipulateur : agressivité ou passivité, retrait après toucher du point d'injection) - une déshydratation (détectée par l’apparence physique telle que yeux plissés, enfoncés, pli de peau moins élastique …), -un aspect physique altéré (aspect du site d'injection, poil hérissé, sale), -une hyperventilation

Devenir

L'ensemble des animaux du projet sera réutilisé dans des TP ayant fait l'objet d'une DAP.

Remplacement

Nous commençons l’apprentissage en visionnant des vidéos afin d'etre en mesure de mentaliser les procédures. Puis nous passons sur support non vivant (modèles plastiques et /ou cadavres de souris congelées le cas échéant, qui sont des souris de réforme euthanasiées au sein de laboratoires pharmaceutiques ou plateformes partenaires). Néanmoins les gestes doivent cependant être pratiqués sur rongeurs vigiles pour ces futurs techniciens en expérimentation animale. Nous utilisons un animal par étudiant lors des TP mais les animaux sont réemployés grace à une rotation espacant les séances et en veillant à leur bon rétablissement.

Réduction

.Nous recourons à une souris et un rat par étudiant, par séance. Nous estimons que l'emploi d'un animal pour 2 étudiants au cours d'une même séance serait préjudiciable à l'animal qui serait alors manipulé 6 fois au cours du TP soit 2 fois plus (pour mémoire un même animal est manipulé 3 fois lors du TP n° 2 : révision contention - injection sous cutanée - sondage gastrique). Par ailleurs il nous faudra former 9 groupes de 16 étudiants, mais nous n’aurons recours qu’à deux lots de 17 souris et 17 rats (dans chaque lot, un animal par étudiant + un animal pour l'enseignant faisant démonstration). La formation de ces 9 groupes n'aura pas lieu en meme temps : 3 groupes seront formés courant novembre, 3 autres groupes seront formés courant janvier et les 3 derniers seront formés courant mars. Ainsi les 2 lots de 17 animaux benéficieront de plusieurs semaines de repos complet à l'animalerie entre chaque formation. Après ces séances, les animaux pourront être réutilisés dans d’autres TP de notre établissement, correspondant à des procédures sans réveil (autres projets autorisés).

Raffinement

Les animaux sont systématiquement amenés en salle de TP une heure avant le début de la séance, afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Des recommandations sont données, rappelées aux étudiants à chaque séance afin que la manipulation ait lieu dans le calme. Après retour à l'animalerie, les zootechniciens surveilleront les animaux et leur bien-être quotidiennement à l’animalerie. Il est important qu’ils soient informés des actes réalisés sur les animaux durant les TP, de façon à connaître les douleurs potentiellement occasionnées. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux est couramment employée pour ce type d’acte. Prenant en compte des critères objectifs, elle servira à adapter un traitement antalgique. Si le traitement n’aboutit à aucune amélioration (suite à évaluations plus fréquentes si une douleur a été détectée), l’euthanasie de l’animal sera réalisée après anesthésie (injection létale après anesthésie gazeuse).

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation, il est donc logique que nous formions nos étudiants à la manipulation de ces animaux. Les actes de contention, sondage gastriques, sous-cutanées sont fréquemment réalisés chez ces espèces. Nous démarrerons avec de jeunes adultes plus faciles à manipuler pour des étudiants en phase d'apprentissage.

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses au flanc puis sept à vingt-huit injections dans la tumeur sur trois semaines, la tumeur pouvant croître jusqu'à un volume limite de 2 000 mm3 avec perte de poids et diarrhée possibles, avant la mise à mort et l'analyse. L'objectif est d'évaluer une cible thérapeutique censée renforcer l'immunothérapie du cancer colorectal. Le porteur affirme que ni les modèles mathématiques ni les systèmes in vitro ne reproduisent l'environnement d'une tumeur, et présente l'animal comme "indispensable".

Objectifs

L’immunothérapie a suscité un grand intérêt ces dernières années dans le traitement du cancer. La majorité des patients atteints de cancer colorectal ne tirent qu'un bénéfice limité d'un traitement par l’immunothérapie. L’identification de nouvelles pistes ou cibles pour augmenter la population qui répond à la thérapie et améliorer le potentiel de guérison sont deux objectifs urgents et importants pour optimiser l'efficacité antitumorale. L'objectif de cette recherche est d’évaluer le rôle d’une cible thérapeutique potentielle sur la croissance des tumeurs colorectales et sur des traitements par immunothérapie en combinaison avec une chimiothérapie classique ou d'autres éléments qui peuvent augmenter l’efficacité des traitements du cancer colorectal.

Bénéfices attendus

L'immunothérapie représente une approche révolutionnaire dans le traitement du cancer. Le bénéfice principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques optimisant l'efficacité de l’immunothérapie sur le cancer colorectal. Ce projet permet aussi de répondre à des questions fondamentales pour mieux comprendre l’interaction immunitaire entre des cellules cancéreuses et des cellulaires immunitaires.

Procédures

Procédure 1 : L’injection des cellules sur animaux par voie sous-cutanée au niveau du flanc de la souris sera effectuée une fois en quelques secondes pour chaque expérience. L’injection des médicaments par voie intra-tumorale de la souris sera effectuée entre 2 à 9 fois par semaine en quelques secondes selon des traitements pour maximum 3 semaines. Une souris subit entre 7 à 28 injections pendant toute l’expérience (durée totale entre 1 à 4 minutes). Un suivi de croissance tumorale sera effectué tous les 2-3 jours au pied à coulisse en quelque secondes pour maximum 3 semaines. Au total, une souris sera mesurée au maximum 9 fois (durée totale : moins de 1 minute). Les souris seront pesées 2 fois par semaine en quelque secondes pour maximum 3 semaines. Au total, une souris sera pesée au maximum 6 fois (durée totale : moins de 1 minute).

Impact sur les animaux

Les souris vont développer des cancers colorectaux sous cutanés et vont recevoir des traitements par des injections par voie sous-cutanée au niveau du flanc. Ces procédures peuvent provoquer une perte de poids, une baisse d'activité, un pelage ébouriffé et de la diarrhée, etc. Les injections sous-cutanées peuvent induire un certain stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des analyses post-mort seront fait sur des tumeurs ou des organes d'intérêt.

Remplacement

Des études réalisées in vitro ont permis de choisir la lignée cellulaire tumorale et un médicalement chimio-thérapeutique efficient pour les manipulations in vivo. Cependant, ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement physiologique auquel est soumis un cancer in vivo. L’emploi du modèle animal est indispensable afin d’évaluer l’influence d’une cible thérapeutique potentielle sur la croissance des tumeurs ou des traitements en présence d’un système immunitaire ainsi que d’un microenvironnement complet.

Réduction

Nous pratiquerons le minimum d'expériences sur le nombre minimal d'animaux pour chaque expérience, qui permettent à la fois d'être assuré de la reproductibilité des phénomènes observés et d’avoir la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. Nous allons effectuer des tests statistiques pour analyser la croissance tumorale. Après chaque expérience, un logiciel spécial sera utilisé pour calculer la taille de l'échantillon d’après les données obtenues pour optimiser le nombre de souris à la puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Une expérience pilote sera lancée d’abord pour maitriser les techniques et décider le nombre de cellules à injecter à chaque souris en fonction des conditions de l’animalerie de l’institut. Pour réduire le stress et l’angoisse des souris, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton). Une surveillance sera effectuée 1 à 2 fois par jour par les membres de ce projet ou le cas échéant par le personnel qualifié de l'animalerie afin de détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance de l’animal. La prise de greffe sera surveillée par des observations, des mesures de tumeur avec un pied à coulisse et des pesées régulières (tous les 2/3 jours). Lorsque la tumeur atteindra un volume estimé de 100mm3, la souris subira une injection de véhicule (PBS) ou des médicaments par injection intra-tumorale pour au maximum 3 semaines. Pour limiter au maximum la douleur et la souffrance associée au sepsis sévère et notamment lors de la fin de vie, Les souris seront mises à mort : 1) lorsque la tumeur atteindra la taille limite éthique (2000mm3) selon la formule volume = (Longueur x largeur^2)/2. 2) si la perte de poids dépasse 20% ou si les points limites sont >ou=6. Le poids de la tumeur sera calculé en fonction du volume : poids en kg = volume en m^3 x densité du tissu (1,04 pour colon) x 1000. La perte de poids sera calculée en prenant en compte le poids de la tumeur selon la formule : perte de poids relative = 1 - (poids actuel de la souris - poids de tumeur)/(poids de la souris avant le traitement). Les tumeurs ou certains organes peuvent être prélevés pour des analyses plus avancées.

Choix des espèces

La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, la disponibilité des lignées cellulaire du cancer colorectal murin, des souches congéniques et transgéniques parfaitement définies faisant la souris un modèle de référence pour étudier des tumeurs consanguines ou des tumeurs se développent dans des animaux avec même contenu génétique et immunocompétents. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6 à 12 semaines après la naissance) possédant un système immunitaire mature.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ablation des ovaires sous anesthésie pour reproduire la ménopause, toutes reçoivent une alimentation alternant régime standard et régime riche en gras, avec mesures de pression, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par prélèvements à la queue et IRM, avant la mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est d'étudier l'effet des estrogènes sur le développement d'un syndrome métabolique lors de variations cycliques de poids. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'évaluer l'interaction entre les différents organes concernés.

Objectifs

Le surpoids et l’obésité sont des problèmes de santé majeurs. Seules 20% des personnes en surpoids parviennent à une perte de poids durable, avec un risque de cycles répétés de perte et de reprise de poids. Ces variations cycliques du poids sont associées à des modifications de la pression artérielle, du rythme cardiaque et des fonctions rénales, responsables notamment du développement de diabète et de maladies rénales ou cardiovasculaires et induisant une augmentation de la mortalité, en particulier chez les femmes. Le surpoids et l’obésité chez les femmes post-ménopausées constituent des problèmes de santé publics importants. La carence en estrogène renforce le mauvais fonctionnement du métabolisme, prédisposant au développement d’un syndrome métabolique avec notamment le développement d’une obésité, d’une hypertension, d’un diabète de type 2… Récemment il est apparu le concept que notre organisme pourrait garder une mémoire de ces changements que l’on appelle « mémoire métabolique » et pourrait expliquer par exemple la difficulté plus grande de perte de poids après la ménopause. Ce projet a pour but d’évaluer l’impact de variations cycliques de poids sur le développement d’un syndrome métabolique et d’une mémoire métabolique dans des conditions pré et post-ménopauses.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra d’identifier les mécanismes responsables des complications observées chez la femme ménopausée en réponse à des variations cycliques de poids et ouvrira des perspectives pour la mise en place de traitements ciblés.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes environ. Pour la moitié des animaux au cours de cette intervention les ovaires seront retirés, pour l’autre moitié l’intervention sera la même mais les ovaires ne seront pas retirés. Les animaux recevront une alimentation standard ou une alternance d’alimentation standard et d’alimentation riche en gras. Pour cette intervention chirurgicale, deux injections sous-cutanées d’analgésiques (d’une durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, une en préopératoire (1h avant la chirurgie) et une en post-opératoires (24 heures après la chirurgie). Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées à la fin de chaque phase de chaque cycle uniquement pour un lot d’animaux (celui soumis à trois cycles de variations cycliques de régime alimentaire). Ces mesures, réalisées sur animal vigil dure environ 15 minutes. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline. La réalisation de ces tests nécessite que les animaux soient à jeun pour une durée de 6 heures. Durant cette période ils auront accès à l’eau en continu. Une injection intra-péritonéale de glucose ou d’insuline sera réalisée (d’une durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection). Une petite incision sera réalisée au niveau de la queue afin de collecter le sang à différents temps après l’injection (15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, 90 minutes et 120 minutes). Chaque collecte de sang prend moins de 10 secondes. Une IRM non invasive sera réalisée, sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 20 minutes. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. L’injection du mélange anesthésique durera moins de 30 secondes. Le prélèvement de sang dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Il peut exister une douleur post-opératoire qui sera soulagée par des anti-douleurs ; un inconfort au point d’injection lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline ; un stress lié à la mesure de la pression artérielle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour mener à bien ce projet. Il n’existe pas de modèle alternatif nous permettant d’évaluer l’interaction entre différents organes ou tissus comme le cœur, la glande surrénale et le tissu adipeux en réponse à des variations de l’apport en gras dans l’alimentation dans un contexte pré et post-ménopause.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste, L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d’animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence une différence entre les groupes. Nous utiliserons des approches statistiques adaptée à la comparaison de quatre groupes de petite taille.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cage enrichies avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d’hébergement et d’élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris (hébergement dans des cages de 2 à 5 maximum ; enrichissement des cages avec des maisonnettes, des batônnets en bois et du coton ; nourriture et eau ad libitum, température contrôlée…). Une stratégie antalgique pré et post-opératoire sera mise en place. En pré-opératoire un anti-inflammatoire non stéroïdien (sera injecté 1h avant le début de la chirurgie. En post-opératoire les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil complet et recevront une nouvelle injection d’anti-inflammatoire non-stéroïdien 24h après la chirurgie. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 8 jours suivant la chirurgie, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier l’effet de modifications de l’apport en gras dans l’alimentation. C’est également un modèle de choix qui est couramment utilisé pour étudier les effets de modifications hormonales telles que l’absence d’œstrogène, reproduisant des conditions post-ménopauses. Les animaux utilisés auront 8 semaines au début de la procédure. Il s’agit de jeunes adultes ayant atteint une maturité sexuelle. A la fin de l’expérimentation qui peut durer jusque 33 semaines, certains des animaux auront 41 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des animaux jeunes au début du protocole afin d’essayer de s’affranchir au maximum de l’effet vieillissement des animaux. Nous pourrons ainsi étudier indépendamment de l’effet vieillissement l’effet de la présence ou non des œstrogènes.