Souris
Efficacité de l’injection dans le liquide céphalo rachidien de cellules souches mésenchymateuses dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'étude de leurs organes et de leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après l'injection d'un peptide qui déclenche une encéphalomyélite auto-immune, c'est-à-dire une paralysie progressive notée de 0 à 5, elles reçoivent dans le liquide céphalo-rachidien des cellules souches ou une solution témoin, avec deux ponctions de ce liquide à quinze jours d'intervalle au moins et jusqu'à quatre prises de sang dans la veine sous-mandibulaire. Le seul bénéfice annoncé reste interne à l'expérience : le porteur écrit que le projet permettra "d'évaluer l'efficacité d'une thérapie cellulaire dans un modèle de neuroinflammation chez la souris mimant la sclérose en plaques". Il cite des études in vitro sur des cellules souches issues de tissu adipeux humain, et affirme que leurs effets en contexte inflammatoire "nécessitent le recours à un modèle murin d'EAE".
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) qui touche l’adulte jeune. Aucun traitement n’est actuellement disponible pour ralentir ou stopper la progression du handicap et le pronostic de la progression est très péjoratif sur le plan fonctionnel. Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) ont des capacités bien connues pour limiter l'action du système immunitaire et pour réparer des tissus endommagés. Dans ce projet nous souhaitons évaluer la diffusion de ces cellules dans le système nerveux lorsqu'elles sont injectées dans le liquide céphalo rachidien mais également leur efficacité dans un modèle murin de SEP.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d'une thérapie cellulaire dans un modèle de neuroinflammation chez la souris mimant la sclérose en plaques.
Procédures
Les animaux développeront une Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), c’est à dire une paralysie avec une phase d’aggravation avant une phase de rémission. Pour cela ils seront soumis à une injection du peptide capable de déclencher la maladie . La procédure dure 5 minutes par souris (temps d'anesthésie et d'injection). Deux injections sont réalisées à l'induction et 24/48h après . Une injection unique de cellules souches ou d’une solution contrôle sera réalisée dans le liquide céphalo rachidien (LCR) chez toutes les souris . La procédure sera couplée à un prélèvement de LCR et durera 15 minutes par souris (temps d’anesthésie, de prélèvement et d’injection). Des injections d'une molécule fluorescente seront également réalisées pour détecter la diffusion des cellules souches au bioimageur chez des souris anesthésiées. Des prélèvements sanguins sur ces animaux seront réalisés pour le suivi immunologique, maximum 4 prélèvements au niveau de la veine sous-mandibulaire par animal, distants au minimum de 7 jours. La procédure de prélèvement dure maximum 6 minutes par animal (1min de prélèvement, 5 min de compression du saignement). Deux prélèvements de LCR seront réalisés sur ces animaux anesthésiés, distants au minimum de 15 jours (15min) dont le premier qui sera couplé à l’injection de cellules ou de solution contrôle. Pour les deux prélèvements de LCR isolés, la procédure dure 10 minutes par souris (temps d’anesthésie et de prélèvement).
Impact sur les animaux
La procédure de déclenchement de l’EAE entraînera une paralysie progressive des animaux. Les animaux seront également soumis au stress lié aux multiples expérimentations. Les symptômes seront évalués et des actions adaptées seront mises en oeuvre pour soulager l'inconfort selon le score établi. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué . Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
La totalité des animaux expérimentés sera mise à mort afin de réaliser les études scientifiques sur les organes et sur le sang. La mise à mort sera réalisée par une personne autorisée et expérimentée .
Remplacement
Des études in vitro ont permis de caractériser l’effet immunosuppressif des CSM dérivés du tissu adipeux humain. Cependant leurs capacités immunosuppressives et leurs capacités de réparation par sécrétion de facteurs trophiques en contexte de neuroinflammation in vivo restent mal connues et nécessitent le recours à un modèle murin d’EAE.
Réduction
Un maximum d'informations et d'analyses seront réalisés sur les animaux (prélèvement de la rate, ganglions, sang, LCR, SNC) afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Nous travaillerons avec des groupes de 8 animaux par groupe pour obtenir des tests statistiques fiables. Le modèle EAE est déjà maitrisé au laboratoire, ce qui permettra donc d’utiliser moins d’animaux pour l’optimisation du protocole.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 3 à 5 animaux, dans un environnement enrichi, avec du coton cardé, l'accès à la nourriture sera facilité dès les premiers symptômes de paralysie : nourriture au sol dans la cage, gel pour l'hydratation. Le modèle EAE étant dépendant du stress, les souris ne seront manipulées que par un nombre réduit de personnes, les cages changées au moment du suivi des animaux. Une anesthésie légère est utilisée pour l'injection du peptide immunisant pour éviter stress et inconfort au moment de l'injection qui est réalisée à 2 endroits pour éviter une réaction locale importante en cas d'injection unique. La procédure de déclenchement de l’EAE entraînera une paralysie progressive des animaux. Les symptômes seront évalués sur une échelle de 0 à 5 et des actions adaptées seront mises en oeuvre pour soulager l'inconfort selon le score établi. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué . Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint , l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier les maladies auto-immunes et inflammatoires. L’efficacité de l’induction de l’EAE dans les souris a déjà été démontrée dans la littérature, et le modèle est maitrisé dans l’unité. L’acquisition des cellules effectrices du système immunitaire étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des expérimentations seront menées sur des animaux adultes (6-12 semaines). Une meilleure pénétrance est observée sur des souris à 8 semaines, cet âge sera privilégié afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires.
Effet sur le cortex moteur d’une lésion des neurones dopaminergiques de la substance noire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans le cerveau une injection de neurotoxine détruisant les neurones dopaminergiques pour reproduire des symptômes de la maladie de Parkinson, puis subit jusqu'à sept tests moteurs et cognitifs, de rotation, d'agilité, de mémoire ou de force de préhension. Le porteur indique que la neurotoxine provoque une réduction de mobilité et une forte perte de poids, et qu'environ 33 % des souris ne survivent pas aux trois jours suivant la chirurgie. Il affirme que ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles reposent sur un modèle murin de la maladie.
Objectifs
La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substantia nigra (SN) et une dérégulation de l'activité des interneurones dans le cortex moteur primaire. Ce projet vise à évaluer l'impact de cette dégénérescence sur l'expression des gènes, les marques épigénétiques, et le statut de maturation des interneurones du cortex moteur. Nous utiliserons un modèle de souris pour la maladie de Parkinson qui consiste en une ablation unilatérale des neurones dopaminergiques de la SN. Bien que ce modèle ne récapitule pas toutes les caractéristiques de la maladie de Parkinson, la perte importante de ces neurones entraîne plusieurs symptômes de la maladie de Parkinson, notamment des déficits moteurs, qui sont quantifiables. Les objectifs majeurs du projet sont d’analyser les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire suite aux lésions, de comparer les changements dû au sexe, et d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones afin de restaurer une activité normale des neurones moteurs. Ce projet impliquera 1680 animaux et ne peux pas être remplacé par d’autres modèles. Plusieurs analyses seront effectuées sur chaque animale afin de réduire leur nombre, et des mesures spécifiques assureront le minimum de nuisances sur le bien-être des animaux. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour son traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet analysera les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire de la souris adulte en réponse aux lésions de la substantia nigra comme modèle de la maladie de Parkinson. Ce projet permettra d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones pour restaurer une activité normale de neurones moteurs, et d’identifier les diffénces dû au sexe. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de cette maladie.
Procédures
Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront implantés avec une canule intracérébrale ; cette procédure chirurgicale stéréotaxique sera effectuée sur des animaux anesthésiés, dure environ 1 heure, et sera effectuée une seule fois. Les animaux seront soumis au test de tendance à la rotation qui durent 10 minutes et sera répété 4 fois. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de capacité motrice qui durent 3 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d'agilité qui dure 2 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test de mémoire spatiale qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de capacité sensorimotrice qui dure 5 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de force de saisie qui dure 3 fois 1 minute. Certains animaux seront soumis à un seul test de force neuromusculaire qui dure 3 fois 1 minute..
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. L’injection de la 6-OHDA (neurotoxine catécholaminergique) peut avoir des effets neurotoxiques qui durent plusieurs jours, entraînant une réduction de mobilité et une perte de poids importante ; le rétablissement complet est attendu au bout de 2 à 3 semaines. Environs 33% des souris ne survivent pas les 3 premiers jours suivant la chirurgie. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress et de la fatigue chez les animaux. Ils seront soumis à un maximum de 7 tests différents sur une période de 5 jours afin d'évaluer divers aspects de leur comportement locomoteur.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera collecté afin de permettre des analyses histochimiques et biochimiques.
Remplacement
Nos recherches sur les effets de la dégénérescence des neurones dopaminergiques nécessitent des souris pour comprendre comment cela impact les circuits cérébraux implicants notament les interneurones du cortex moteur. Nous utilisons la souris comme modèle pour s'appuyer sur les résultats de recherches antérieures. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent d’un modèle murin de la maladie de Parkinson.
Réduction
Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses (comportement, histologie, biochimie) sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.
Raffinement
Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec une lampe chauffante jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.
Choix des espèces
La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la maladie de Parkinson. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un modèl de la maladie de Parkinson qui nécessite des souris adultes. Les lesions de la subsantia nigra seront effectuées sur des souris agées de 60 jours, lorsques elles sont considérées comme jeunes adultes. Les injections stéréotaxiques sont effectuées 3 semaines après une lesion afin de respecter une période de récuperation. Le comportement sera évalué pendant 2 sessions : 1) vers 2 semaines après lesion et 2) vers 3 semaines après injections stéréotaxiques (entre 100 et 120 jours).
Suivi du développement du cancer chez le petit animal greffé en orthotopique par imagerie de bioluminescence
- Recherche fondamentale
- Oncologie
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie une greffe de cellules tumorales directement dans l'organe visé, prostate ou autre, puis passe deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie pendant six semaines, avant la mise à mort pour prélèvement des tissus. Le porteur indique que la chirurgie et la croissance des tumeurs peuvent provoquer des douleurs. Il justifie le choix de la souris par sa proximité génétique avec l'humain mais aussi par ses "faibles coûts", ses cycles de reproduction courts et sa "facilité de manipulation".
Objectifs
Le cancer touche 382000 personnes par an et avec 157400 décès annuel, soit environ 40 % du total, il représente la première cause de mortalité en France. C'est surtout la première cause de mortalité prématurée (avant 65 ans). Un homme sur deux et une femme sur trois sont concernés, avec des localisations différentes selon le sexe : le cancer de la prostate est de loin le cancer le plus fréquent chez l'homme avant le cancer du poumon et le cancer colorectal, et, chez la femme, le cancer du sein est le plus fréquent avant le cancer colorectal et le cancer du poumon. L'incidence globale du cancer augmente chaque année en raison du vieillissement de la population, de la généralisation des techniques d’exploration et de dépistage, et de causes environnementales. Grâce aux progrès de la prévention, du diagnostic précoce et de la prise en charge, le risque de mourir d'un cancer a diminué depuis 25 ans. Cependant, il n'en demeure pas moins un fléau déclaré priorité de santé publique. Les efforts de développement de nouvelles thérapeutiques doivent donc se poursuivre. Les deux premiers critères mis en jeu dans la sélection de nouveaux médicaments antitumoraux sont, d’une part, l’originalité du mécanisme d’action et, d’autre part, l’activité antitumorale expérimentale dans un modèle animal in vivo. Ce projet s'intéresse au suivi du développement tumoral par une approche d'imagerie non-invasive afin d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques chez le petit animal (souris). Il aura pour objectif (i) d'évaluer l'apport des modalités d'imagerie pour différents modèles pathologiques, et (ii) de d'évaluer l'efficacité thérapeutique des molécules thérapeutiques testées. Ce projet permettra également une détection précoce des tumeurs (avant qu'elles ne soient palpables), le suivi de la progression tumorale au cours du temps (croissance / invasion / dissémination), et la quantification 2D et/ou 3D des masses tumorales (tumeurs primaires et métastases).
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.
Procédures
Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales en orthotopique c'est à dire sur le site d'intérêt de la pathologie (au niveau de la prostate dans le cas du cancer de la prostate par exemple). Cette procédure induit de la chirurgie et s'effectue sous anesthésie générale gazeuse (durée d'intervention
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales pour l'implantation des cellules tumorales en orthotopique pourront entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h, c'est pourquoi une analgésie de type buprénorphine sera systèmatiquement appliquée en post-chirurgical pour pallier à une éventuelle souffrance. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications au niveau des zones incisées, une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place et l'anial placé sous surveillance renforcée. En cas d'infection majeure, l'animal sera soumis à un traitement par antibiothérapie. Une observation clinique quotidienne sera également mise en place afin d'évaluer l'état général des animaux opérés. L'administration de traitements par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée et les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire un stress physique aux animaux. L’apparition des tumeurs induites pourra également induire un stress physique et de la douleur. Ces nuisances potentielles nous conduisent à classer ces procédures en classe modérée.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection orthotopique de cellules tumorales. Ils seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d'imagerie mises en œuvre afin de récupérer les différents tissus pour analyses.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer complètement la tumeur dans son microenvironnement et son évolution au sein d'un organisme vivant (prolifération, invasion, dissémination). Il existe cependant des modèles d'étude de clonogénicité, de migration et d'invasion cellulaires in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal
Réduction
Les molécules testées sur les animaux lors de ce projet ont déjà fait l'objet de tests sur des cellules en culture afin d'en vérifier l'efficacité sur les cellules cancéreuses implantées chez les animaux. L’exploration par imagerie permettra d’effectuer un suivi longitudinal des animaux (mesures répétées à intervalles réguliers) dans le but de diminuer le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation également d’autres approches scientifiques complémentaires après la mise à mort de l'animal permettra également d'optimiser au maximum les résultats obtenus. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63/UE). Nous veillerons à ce que chaque caged'hébergement bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel etc...). Les animaux seront anesthésiés pour chaque procédure d'imagerie et une attention particulière sera apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, l'utilisation d'analgésique sera mise en place ainsi que l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Les petits mammifères, notamment la souris, sont à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et se sont imposés comme modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules car, par la présence de gènes équivalents chez l'homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et apportent de nombreuses connaissances sur les relations entre les cellules tumorales et les tissus normaux, notamment le système immunitaire. Ils permettent également l'étude des phénomènes de vascularisation tumorale et de dissémination métastatique, et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique, notamment en chimio- et immunothérapie, ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4 à 8 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Au-delà de cet âge, les tumeurs se développent plus lentement. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Evaluation de traitements dans le cadre du sepsis
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 970
1 990 souris et 970 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un sepsis, une infection généralisée entraînant une défaillance des organes, par administration d'un réactif ou par chirurgie, après pose d'un implant de suivi de la température, puis on teste des candidats médicaments. Le porteur indique que les animaux développent une chute de température, un affaiblissement et une perte de poids sur quelques jours, et qu'ils sont tués parce que leur état rend impossible un maintien en vie dans de bonnes conditions. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la défaillance multiviscérale d'un "corps entier" et conclut au recours à la souris et au rat.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome de dysfonctionnement des organes provoqué par un dérèglement de la réponse aux infections, conséquence d’une infection grave qui débute généralement localement (péritonite, infection urinaire, infection nosocomiale...). Il comprend une phase précoce d'inflammation marquée qui induit des effets néfastes sur les organes vitaux, puis une phase immunosuppressive où le système immunitaire ne peut plus combattre les infections. Le choc septique (ou septicémie) est un sous-ensemble de ce syndrome, au cours duquel on observe une défaillance multiviscérale (incluant poumons, reins, foie) aiguë entrainant, faute de prise en charge suffisante, le décès du patient. Le sepsis touche souvent des patients dont le système immunitaire est affaibli ; aujourd'hui, il affecte principalement des patients nouveaux-nés ou âgés. Toutes les bactéries (dont celles présentes naturellement à la surface de la peau ou des muqueuses) peuvent être responsables de sepsis. Des infections fongiques ainsi que certains virus peuvent également induire une réponse semblable. Afin de lutter efficacement contre l'infection, une reconnaissance et un traitement précoce (très agressif notamment dans le cas du choc septique) sont essentiels. Le traitement consiste notamment en actes chirurgicaux et en la prescription d'antibiotiques en sus des soins permettant d'assurer le maintien des fonctions vitales. Cependant, il n'existe pas de traitement spécifique du sepsis (notamment, permettant de réduire la phase d'hyper-inflammation sans affaiblir le système immunitaire du patient, lui permettant de lutter contre l'infection), et même si la mortalité entraînée par ce syndrome a régressé, elle avoisine malgré tout toujours 30 à 40% des cas. De plus à l'heure actuelle, les patients survivant à un sepsis sont plus à risque de développer différents troubles tels que des maladies cardio-vasculaires, de l'insuffisance rénale ou des cancers. Aussi, afin de réduire la mortalité due au sepsis (ou à la septicémie) ou encore d'améliorer la qualité de vie des patients survivants, l'objectif de ce projet est de continuer la recherche et l'évaluation de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Le sepsis peut causer le décès ainsi que de nombreuses complications chez les survivants. Il n'existe à ce jour pas de traitement spécifique et satisfaisant de ce syndrome ; il apparait donc nécessaire de développer de nouveaux traitements qui permettraient d'augmenter le taux de survie des patients et d'améliorer leur qualité de vie. Ce projet permettra d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans des modèles murins de sepsis/septicémie.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 6 semaines en fonction de la spécificité du traitement). Les animaux seront implantés pour suivi de leur température corporelle (puces RFID ou implants télémétriques). En fonction du type d'implant, il s'agira d'une administration très rapide (de l'ordre de la minute) ou d'une chirurgie légère sous anesthésie (quelques minutes). L'induction sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie) ou par chirurgie (quelques minutes, sous anesthésie). Les animaux seront soumis à des prises de température corporelle (majoritairement par puce RFID, lecture de l'ordre de quelques secondes sans contention) et leur comportement général sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes). Ils seront répétés maximum toutes les 30 minutes pendant les heures suivant l'infection. Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les aniumaux dans ce projet développent un syndrome de type sepsis ou septicémie. Ceci se traduit par une baisse de la température corporelle et un affaiblissement de l'animal avec une perte de poids sur un laps de temps de l'ordre de quelques jours (pour les animaux gardés cette durée). Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. prise de température) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Dans le modèle chirurgical, malgré l'administration d'un analgésique il est possible que la chirurgie entraîne une douleur post-opératoire au site concerné.
Devenir
Euthanasie : les animaux auront été soumis à un sepsis voire à une septicémie, ce qui potentiellement peut affecter la fonction de leurs organes vitaux et rendre impossible leur maintien en vie dans de bonnes conditions.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ce syndrome qui est dû à une infection généralisée et entraîne une défaillance multiviscérale. Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement (plusieurs fois par jour pendant la phase critique d'infection, dans le cadre de ce projet) jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de permettre de réévaluer et d’adapter a posteriori les méthodes de raffinement, si pertinent. Pendant la phase chirurgicale (certaines procédures uniquement), les animaux sont anesthésiés et analgésiés selon un programme défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Pour le suivi rapproché de la température des animaux, il est prévu de favoriser l'utilisation d'implants de type puces RFID permettant une lecture externe des températures, évitant le risque de lésion par sonde rectale et limitant le stress des animaux.
Choix des espèces
Différents modèles de sepsis et septicémie sont bien décrits et caractérisés dans la littérature chez la souris et le rat, permettant d'étudier l'efficacité de candidats médicaments dans ces espèces. Majoritairement jeunes adultes pour étudier des animaux dont le système immunitaire est mature ; cependant, étant donné que le sepsis touche plutôt des sujets aux âges extrêmes de la vie chez l'être humain, des jeunes animaux (âgés de 3 semaines, au moment du sevrage) ou des animaux âgés pouraient être dans certaines indications utilisés.
Rôle des additifs alimentaires dans le maintien de l’homéostasie intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 140 étant classées au niveau sévère. Elles subissent des gavages, des prélèvements de sang répétés, dont un dans le cœur, et l'administration d'un composé provoquant une colite avec perte de poids, diarrhées et sang dans les selles. Le projet vise à mesurer l'effet d'additifs alimentaires, édulcorants et émulsifiants, sur l'intestin de deux générations de souris. Le porteur affirme que les interactions entre microbiote, intestin et système immunitaire ne peuvent être étudiées in vitro et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L’utilisation d’édulcorants est largement répandue dans l’industrie alimentaire et des études récentes suggèrent un rôle néfaste sur la santé comme un risque accru de développer des cancers ou le développement de troubles métaboliques. Les effets des émulsifiants, dont l’utilisation dans l’industrie alimentaire est en constante progression, sont un peu moins étudiés mais ces additifs affectent l’équilibre du microbiote (flore) et sont suspectés d’altérer l’intégrité de la barrière intestinale. Les étapes précoces de la vie comme la gestation et la lactation constituent une fenêtre cruciale pour le bon fonctionnement de l’organisme chez l’adulte : des perturbations du microbiote et du métabolisme durant ces périodes critiques du développement peuvent augmenter le risque de développer des pathologies plus tard au cours de la vie. L’alimentation maternelle au cours de la gestation et de la lactation joue un rôle important dans la susceptibilité accrue à développer diverses pathologies chez les descendants. L’objectif principal de ce projet est de comprendre le rôle d’un type de cellules intestinales dans la mise en place des défauts intestinaux suite à l’exposition à des additifs alimentaires (édulcorants, émulsifiants). Nous étudierons les conséquences d’une exposition indirecte à ces composés durant la gestation/lactation sur le fonctionnement de l’intestin sur deux générations (parents et descendants). Nous examinerons aussi l’influence d’un régime alimentaire riche en gras sur les désordres intestinaux consécutifs à l’exposition aux additifs alimentaires. Enfin, nous analyserons la susceptibilité des descendants à développer des pathologies intestinales à l’âge adulte. Compte tenu de nos précédents résultats, qui ont montré un rôle clé de ce type cellulaire dans le maintien de l’équilibre de la composition du microbiote intestinal, nous anticipons une implication de ces cellules dans les dérégulations intestinales observées suite à l’administration de ces composés. L’impact des additifs alimentaires sera étudié dans la lignée déficiente pour ce type cellulaire en comparaison avec des souris contrôles. Ce projet sera abordé in-vivo chez la souris afin de tenir compte des interactions entre le microbiote, l’épithélium intestinal et le système immunitaire, trois acteurs requis pour le bon fonctionnement de l’intestin.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet en santé humaine seront à court terme sur le plan des connaissances fondamentales des effets potentiellement néfastes d’une exposition indirecte aux additifs alimentaires comme les édulcorants et les émulsifiants sur le fonctionnement de l’intestin et des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Ces bénéfices pourront s’appliquer à large échelle puisque ces produits sont ajoutés à des centaines de produits alimentaires et sont utilisés par des millions de personnes dans le monde.
Procédures
- Gavage gastrique sur animal vigile (1 fois, 3 minutes) - Prélèvement de sang dans le cœur sur animal sédaté (1 fois, 10 minutes) - Tests d’intolérance au glucose : Prélèvements sanguins à la queue sur animal vigile (7 fois pendant 2h45 minutes), et prélèvements sanguins dans la veine de la mandibule sur animal vigile (2 fois, 3 minutes). 2 injections dans le péritoine sur animal vigile (3 minutes) - Administration dans l’eau de boisson d’un composé chimique induisant une colite intestinale (inflammation de l’intestin), sur animal vigile, pendant 5 à 7 jours.
Impact sur les animaux
Les dommages/effets indésirables causés pendant les actes expérimentaux prévus sont les suivants : douleur (piqûre, gavage, prélèvements sanguins répétés), mise à jeun, administration de composés. Les dommages/effets indésirables prévus sur les animaux suite au traitement induit par le Dextran Sulfate de Sodium sont les suivants : perte de poids, diarrhées et traces de sang dans les selles, comportement anormal, stress. Ces effets seront compris entre 3 et 5 jours.
Devenir
Les animaux du projet sont mis à mort à l’issue de chaque procédure, différents organes prélevès pour des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Ce projet doit être abordé de manière intégrée et ne peut être mené in-vitro puisqu’il met en jeu des interactions entre le microbiote, les cellules épithéliales et les cellules du système immunitaire. Il n’existe pas à ce jour d’alternatives non animales disponibles permettant d’être utilisées dans ce projet pour traiter ces questions.
Réduction
Des cohortes de 10 individus de chaque génotype, en tenant compte du risque de perte d’individus au cours du protocole, nous ont montré que cet effectif était adéquat pour obtenir des résultats satisfaisants statistiquement. Les paramètres mesurés seront analysés statistiquement. Si possible, les individus sont inclus dans divers protocoles et les prélèvements de tissus sont inclus dans différentes expériences. Afin d’éviter les biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux, dans la mesure du possible, l’acquisition des résultats est réalisée « en aveugle ». Enfin, nous disposons du modèle d’organoides intestinaux qui permet de disséquer des mécanismes moléculaires et cellulaires ex-vivo en s’affranchissant de toute contribution du microbiote et du système immunitaire, et permet aussi de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, des points limites ont été définis. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, l’apparition d’hémorragies rectales ou d’un prolapsus (descente du rectum) seront considérés comme des points limites. En cas de signe de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés. Afin de réduire la douleur pendant certaines procédures expérimentales, les animaux seront anesthésiés à l’aide d’un analgésique et un anesthésique local.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Les animaux seront utilisés après le sevrage (4 semaines) afin d’évaluer les effets d’une exposition indirecte aux édulcorants/émulsifiants et/ou un régime riche en gras pendant la gestation et lactation, car le début de la vie est une fenêtre critique au cours de laquelle des déséquilibres de la composition du microbiote ou des désordres métaboliques sont susceptibles d’impacter à plus long terme l’équilibre physiologique. Nous utiliserons aussi des animaux à l’âge adulte (2 mois) afin d’étudier les conséquences à long terme d’une exposition précoce à ces différents composés.
Mise en place et caractérisation d’un modèle inflammatoire aigu de l’intestin chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
3 470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit dans le rectum, sous anesthésie, une substance chimique destinée à provoquer une inflammation de l'intestin proche de la maladie de Crohn, puis un candidat médicament par injection ou par gavage. Le porteur indique que l'inflammation provoque une perte de poids, des diarrhées et du sang dans les selles, et que le gavage peut entraîner ulcération ou saignement. Il justifie l'usage de la souris par la nécessité d'étudier l'intestin dans un "organisme entier" et reste bref sur le choix de l'espèce, présentée comme "communément utilisée".
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l’intestin et notamment la maladie de Crohn se caractérisent par une inflammation discontinue de la muqueuse intestinale et restent présentes chez les personnes atteintes, sans guérison complète. Les traitements existants permettent d’atténuer les effets secondaires mais sont insuffisants pour un traitement de fond de ces pathologies et peuvent entraîner des complications comme des maladies infectieuses et augmenter les tumeurs malignes. Ce projet a pour but de provoquer une inflammation similaire chez la souris afin de mimer certains symptômes caractéristiques de la maladie chez l’homme et évaluer l’efficacité d’un nouveau composé thérapeutique dans le traitement de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’identifier et reproduire chez le petit animal, les mécanismes impliqués au cours de la maladie chez l’homme. Il s’agit d’une étape préliminaire au développement d’une nouvelle thérapie dans le traitement de l’inflammation afin d’améliorer la prise en charge et la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration d’une substance chimique par le rectum sur une minute pour provoquer l’inflammation de l’intestin. Cette administration se fera de façon unique. L’administration de la substance chimique dans le rectum sera conduite sous anesthésie générale. Les animaux recevront un seul traitement de candidats médicaments soit par injection unique dans le péritoine soit par gavage mais de façon vigile dans les deux cas, chacun de ces deux gestes étant réalisé en moins de vingt secondes.
Impact sur les animaux
L’utilisation d’agent chimique pour provoquer l’inflammation entraîne une perte de poids, ainsi qu’une modification de l’aspect et de la consistance des selles. Les candidats médicaments ont été testés au préalable sur des cellules pour s’assurer de la non toxicité de ces produits et de leur efficacité pour bloquer la réponse inflammatoire. Cependant il s’agit de premières études menées chez les animaux et nous ne pouvons exclure le fait que ces candidats puissent entraîner une toxicité chez l’animal au moment de l’injection se traduisant par les symptômes cutanés suivants : irritation, démangeaison, piloérection, gonflement ou rougeur passagère. Des nuisances telles que rougeur, induration, crampes abdominales, ulcération, fausse route, ou encore présence de sang lors du retrait de la sonde de gavage sont à prendre en compte comme effets indésirables liés aux gestes techniques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses post-mortem.
Remplacement
Les modèles cellulaires existants permettent de mimer l’architecture du tissu intestinal et l’interaction entre les cellules. Si ces outils sont efficaces pour étudier les mécanismes simples entre les cellules, ils sont toutefois insuffisants pour modéliser le microenvironnement de l’organe d’intérêt et son interaction dans un organisme entier. Le recours aux animaux permet de modéliser cette interaction à l’échelle de l’organisme de façon plus pertinente. De plus, les symptômes liés aux maladies inflammatoires et l’impact thérapeutique sur l’amélioration de ces symptômes ne peuvent être mesurés que sur des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été calculé pour collecter suffisamment de données qui seront analysées à l’aide d’outils statistiques permettant de répondre aux hypothèses et objectifs scientifiques définis dans ce projet. Cette estimation a été déterminée à partir d’études décrites dans la littérature scientifique faisant référence à ce modèle inflammatoire. Néanmoins les paramètres expérimentaux varient d’une étude à l’autre. Nous avons donc envisagé une étude pilote pour déterminer les conditions expérimentales optimales afin d’obtenir un modèle d’étude stable sur lequel s’appuyer pour évaluer les propriétés anti-inflammatoires de nos candidats médicaments. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe a été estimé afin d’évaluer la réponse inflammatoire au cours du temps selon des analyses statistiques et selon la dose de substance inflammatoire injectée. Le nombre d’animaux est défini selon deux critères : la dose et le temps. 4 doses et six points de temps ont été déterminés à partir de données issues de la littérature. Suite à cette étude pilote, le modèle sera reproduit pour évaluer le potentiel thérapeutique anti-inflammatoire des candidats médicaments. Le nombre d'animaux a été estimé selon les groupes nécessaires à la réalisation de l’étude. Ces groupes sont définis selon le type de candidats et la dose à laquelle ils seront administrés. Les candidats seront évalués selon deux doses chacun. Les résultats attendus à l’issue de ces études sont une atténuation de la réponse inflammatoire et une amélioration des symptômes chez l’animal. Ce projet prévoit une répartition équivalente de mâles et de femelles dans chaque groupe pour vérifier un effet sexe potentiel sur la réponse inflammatoire.
Raffinement
L’environnement des animaux sera enrichi de coton, d'abris et d’objet afin de subvenir au bien-être animal. Une période d’acclimatation de sept jours est prévue à l’arrivée des animaux avant le début de la procédure. Une phase d’habituation à la contention sera également faite sur cinq jours consécutifs afin de limiter le stress de l’animal avant une injection. L’administration de la substance inflammatoire sera réalisée sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle de l’animal. Un suivi quotidien sera effectué et une médication adaptée sera également proposée dans le cas d’effets indésirables. Une grille d’évaluation basée sur l’aspect et le bien-être animal permettra si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal. Les points limites définis dans chaque procédure, permettront si nécessaire l’arrêt de la procédure en cours pour éviter toute douleur ou souffrance à l’animal.
Choix des espèces
La souris utilisée dans le cadre de ce projet est une espèce communément utilisée car favorable au développement de l’inflammation. Il s’agit d’une espèce particulièrement adaptée au développement du modèle de maladie digestive inflammatoire.
Mise en place et caractérisation d’un modèle de neuropathie induite par le paclitaxel avec tumeur ectopique de cancer du sein murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
61 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-huit reçoivent une greffe de tumeur mammaire, puis des injections de paclitaxel qui provoque une hypersensibilité au toucher et au froid, mesurée par des tests répétés pendant trois semaines, et toutes subissent une chirurgie cutanée avant la mise à mort. Le porteur affirme qu'en dehors des tests les souris ne montrent aucun signe de souffrance ni de perte de poids, tout en reconnaissant que la croissance de la tumeur peut endommager les tissus et provoquer des douleurs. Le projet vise à ajouter une tumeur aux modèles existants de neuropathie chimio-induite, un outil destiné à de futurs tests de molécules.
Objectifs
Les neuropathies périphériques associées de douleurs neuropathiques induites par les agents anticancéreux neurotoxiques représentent une des causes principales de l’altération de la qualité de vie des patients survivant à un cancer. Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie (NPIC) sont très fréquentes, plus de 60 % des patients sous chimiothérapie anticancéreuse, et impactent fortement la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie, pouvant conduire à une diminution des chances de survie des patients. A ce jour, il n’existe aucun traitement preventif contre les NPIC. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques spécifiques des NPIC représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge des patients traités par chimiothérapie anticancéreuse. Un modèle de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux communément utilisé dans la prise en charge du cancer du sein triple négatif, a déjà été développé et caractérisé, et a permis de mettre en évidence les propriétés neuroprotectrices de plusieurs molécules. In vitro, l’effet de l’interaction bénéfiques des molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique des chimiothérapies, ainsi que leur potentiel anticancéreux propre a été mis en évidence sur des lignées cancéreuses humaines. Fort de ces résultats, nous souhaiterions poursuivre dans un modèle animal plus intégratif impliquant les phénomènes de douleur et d’inflammation. Aucun modèle animal de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel et associée à un cancer n’a encore été développé. Un tel modèle permettrait de mieux comprendre le lien entre le cancer et le développement des neuropathies associées à la chimiothérapie neurotoxique et d’évaluer l’effet de molécules candidates neuroprotectrices sur les douleurs induites par la chimiothérapie, ainsi que sur l’activité antitumorale de la chimiothérapie. L’objectif est de mettre en place et caractériser un modèle syngénique de cancer de sein sensible au paclitaxel, et dévellopant une neuropathie induite par le paclitaxel. Le modèle syngénique (greffe de même fond génétique que l'hôte), contrairement au modèle de cancer humain xénogreffé, permet de conserver une immunocompétence. L’intérêt est de pouvoir mettre en évidence l’implication du système immunitaire et de l’inflammation dans le développement des neuropathies chimio-induites en présence d’un cancer.
Bénéfices attendus
L’intérêt principal de ce modèle de neuropathie chimio-induite est la présence de la tumeur. Ce modèle fournira un outil pour la mise en place de nouvelles thérapeutiques neuroprotectrices dans un contexte de chimiothérapie néoadjuvante neurotoxique associé à une chirurgie. Les modèles murins actuels de neuropathie chimio-induite sont exempts de tumeur. Le modèle proposé permettra d’évaluer l’impact de la présence d'une tumeur sur l'évolution de la neuropathie chimio-induite. Ce modèle permettra également, dans des porjets futurs, de valider si nos molécules neuroprotectrices, interagissent avec l’activité anti-tumorale du paclitaxel dans un modèle intégré.
Procédures
Trente huit souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de cellules cancéreuses murines. Ving-trois souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de 200 µL de sérum physiologique. Cette étape sera réalisée sous anesthésie légère à l'isoflurane pour l'ensemble des animaux. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisée à l'aide de la mesure au pied à coulisse de la tumeur 3 fois par semaine, sous anesthésie légère à l'isoflurane, seuls les animaux ayant reçu des cellules cancéreuses subiront cette intervention. Ving-neuf animaux recevront 4 injections intrapéritonéales de chimiothérapie (1 injection tous les deux jours pendant 7 jours), et les animaux contrôles recevront 4 injections intrapéritonéales de sérum physiologique selon le même shéma. L'ensemble des animaux (soit 61) subiront une chirurgie cutanée, avec résection de la tumeur sous-cutanée pour les animaux ayant une tumeur et ouverture des plans cutanés pour les animaux sans tumeur. Durant la procédure chirurgicale, les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane et recevront une injection sous cutanée de lidocaïne en pré-médication et une injection sous cutanée de buprénorphine en post-médication. L'ensemble des animaux sera soumis à deux test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et l'autre la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 21 jours environ.
Impact sur les animaux
La neuropathie périphérique induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux, se manifeste chez l'Homme par des troubles de la sensibilité, des douleurs neuropathiques ou des faiblesses. Notre équipe a développé et caractérisé chez la souris un modèle de neuropathie induite par le paclitaxel dans lequel nous observons l'apparition d'une hypersensibilité tactile et d’une hypersensibilité au froid en réponse à un stimulus. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluées). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ont un comportement similaire aux animaux contrôles et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. La croissance de la tumeur peut générer des nuisances telles que des dommages aux tissus environnants, induissant des douleurs et de l’inconfort, le développement potentiel de métastases. Les souris peuvent souffrir de faiblesse et de déficience physique en raison de la croissance tumorale et de la propagation de la maladie. Les points limites permettront de limiter au maximum ces nuisances.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées au paclitaxel et au développement de la tumeur seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.
Remplacement
Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle qui suit le protocole d'injection des agents anticancéreux le plus proche de celui utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des molécules neuroprotectrices sur les neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par le paclitaxel (utilisé en chimiothérapie) ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse. De même, l’effet de nos molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique du paclitaxel a été évalué in vitro sur des lignées cancéreuses humaines.
Réduction
Le nombre de 10 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un test statistique spécifique qui estime un nombre total de 32 animaux (avec 9 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes (en estimant une prise de tumeur de 100 %). L'analyse statistique sera réalisée à l'aide d'un logiciel dédié. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus seront effectués sur chaque animal mort. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote (n = 3) pourront être utilisés pour l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seuls des test d'évitements seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la molécule de chimiothérapie doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal. Les animaux seront anesthésiés légèrement pendant l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses et à chaque contrôle de la croissance tumorale au pied à coulisse. Pendant la chirurgie, les animaux seront profondément endormis par anesthésie gazeuse. Une anesthésie local sera réalisée au niveau du site de la tumeur avant résection. Un onguent ophtalmique sera appliqué durant l’anesthésie afin d’éviter un dessèchement oculaire. Une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée avant le réveil, afin de diminuer les douleurs post-opératoires et faciliter la récupération. La température corporelle sera maintenue tout au long de la chirurgie à l’aide d’un tapis chauffant, puis à l’aide d’une lampe chauffante durant la phase de réveil.
Choix des espèces
Ces modèles murins de neuropathie induites ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Le choix de la lignée de cellule cancéreuse murine et de la souche de souris a été déterminé pour limiter les risques de réaction immunitaire et de rejet. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.
Etude de la plasticité fonctionelle de fibres motrices descendantes suite à une lésion médullaire et d’une stimulation magnétique trans-spinale régénérative chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 069 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et une vingtaine réutilisées dans d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère, 785 souris étant classées à ce niveau. Elles subissent une lésion chirurgicale de la moelle épinière par hémisection ou contusion, des injections de traceurs neuronaux et des tests moteurs sur une échelle horizontale et en libre déplacement, certaines recevant en plus une stimulation magnétique répétée sous anesthésie. Le porteur indique que la lésion provoque une paralysie et une perte d'appui des membres postérieurs du côté lésé, effet qu'il qualifie d'inhérent au modèle. Les retombées annoncées pour les personnes paralysées, des thérapies ciblées, restent formulées comme un espoir à terme.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de comprendre comment la moelle épinière peut se réparer après une blessure grave à la colonne vertébrale. Une blessure à la moelle épinière peut entrainer une perte totale ou partielle des fonctions motrices et sensorielles en-dessous de la blessure, ce qui peut inclure la perte de capacité de marcher. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour cette condition. La raison de ces pertes est que les voies de communication entre le cerveau et la moelle épinière, appelées voies descendantes, sont endommagées ou affaiblies. Cependant, les circuits de la moelle épinière situés en dessous de la blessure conservent souvent une grande partie de leur fonctionnalité, même après la blessure. Une piste prometteuse consiste donc à encourager la repousse des voies neurales descendantes pour rétablir le contrôle moteur de la moelle épinière. Cependant, il existe de nombreuses voies neurales descendantes, et elles ne sont pas toutes équivalentes en termes de fonctionnalité. De plus, certaines voies pourraient être plus aptes que d'autres à se régénérer. Il est donc important d'étudier la capacité de repousse de chaque voie neurale descendante et d'évaluer comment cela peut améliorer les capacités motrices. Récemment, des chercheurs ont identifié différentes voies neurales descendantes qui jouent un rôle crucial dans le contrôle des mouvements des membres supérieurs chez la souris. Ces voies ont leur origine dans le tronc cérébral et se distinguent par leur fonction et leur composition moléculaire. D'autre part, des études ont montré les bienfaits d'une stimulation magnétique trans-spinale répétée (rTSMS). Cette méthode non invasive, qui peut être appliquée chez l'homme, améliore la motricité après une blessure expérimentale de la moelle épinière et pourrait favoriser la repousse des axones (les prolongements des cellules nerveuses). Sur la base de ces découvertes, ce projet a les objectifs suivants : 1. Etudier anatomiquement la capacité des voies neuronales descendantes du tronc cérébral à survivre et à se régénérer spontanément après une blessure expérimentale de la moelle épinière. 2. Examiner la possibilité que la rTSMS puisse favoriser la repousse et la survie des voies neurales descendantes, ou certaines d'entre elles. 3. Evaluer la contribution fonctionnelle de chaque voie neurale descendante à l'amélioration des capacités motrices induites par la rTSMS.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé publique majeur, avec plus de 180 000 nouveaux cas chaque année, et malheureusement, il n'existe actuellement aucun remède. C'est pourquoi il est essentiel de mener des expérimentations animales afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués et d'évaluer l'efficacité de différentes méthodes thérapeutiques. Ce projet a pour objectif d'identifier les populations de neurones pour lesquelles favoriser la connectivité avec les zones situées sous la lésion permet une certaine récupération de la motricité. Nous nous concentrons sur une voie nerveuse spécifique, qui est la plus ancienne du point de vue de l'évolution et donc la plus conservée entre les espèces. Nos résultats obtenus chez la souris nous permettront ensuite de rechercher des cellules similaires chez l'homme et d'étudier leur altération chez les patients atteints de lésions médullaires. À terme, nous espérons pouvoir adapter des thérapies ciblées aux neurones dont nous aurons démontré la fonctionnalité et la capacité de plasticité. Par ailleurs, la méthode de stimulation magnétique que nous utilisons pour favoriser la récupération est non invasive et indolore, ce qui la rend applicable à l'homme. La stimulation magnétique transcrânienne est déjà utilisée dans le traitement de certaines maladies neurodégénératives, et des essais de stimulation trans-spinale sont en cours. Cependant, les mécanismes directement impactés par ce type de stimulation ne sont pas encore entièrement connus. C'est pourquoi il est essentiel de caractériser, chez la souris, les changements dans l'organisation des circuits nerveux induits par la stimulation magnétique trans-spinale, afin de mieux adapter cette technique à une utilisation chez l'homme. En résumé, ce projet vise à améliorer notre compréhension des mécanismes de récupération après une lésion de la moelle épinière en identifiant les neurones clés et en évaluant l'efficacité d'une stimulation magnétique non invasive. Les résultats de cette recherche pourraient permettre de développer des thérapies ciblées pour les patients atteints de lésions médullaires, améliorant ainsi leur qualité de vie.
Procédures
Des tests de comportements moteurs seront réalisés chez tous les animaux. Ils recevront au préalable une injection d’un ligand pharmacologique ou d’une solution contrôle. Puis, ils seront placés dans une enceinte dans laquelle ils pourront se déplacer librement ou sur une échelle horizontale. Ces animaux referont ces tests une deuxième fois environ 15 jours après les premiers tests. Selon les groupes d’animaux, certains le referont une troisième fois 20 ou 65 jours après les premiers tests. La quasi-totalité des animaux recevront une injection de traceur de neurones au niveau de la moelle épinière et/ou dans le tronc cérébral lors d’une procédure chirurgicale. La plupart d’entre eux auront la moelle épinière lésée par hémi-section ou par contusion lors de cette même procédure chirurgicale. Certains groupes d’animaux recevront une stimulation magnétique trans-spinale répétée, ce qui est une procédure sans douleur pour l’animal, réalisée sous anesthésie pour que l’animal reste immobile, pendant une durée maximale de 15 minutes. Cette stimulation sera répétée pendant 14 jours successifs.
Impact sur les animaux
Les tests de comportement moteur décrits dans ce projet sont des tests réalisés en routine dans notre laboratoire, nous savons qu’ils n’auront pas d’effets indésirable. Il en est de même pour les injections de traceurs neuronaux. Le modèle de lésion par hémi-section est connu chez différentes espèces dont la souris pour engendrer des déficits moteurs – c’est inhérent au modèle, puisque le but de ces recherches est de tenter de compenser ces déficits. En particulier, les animaux présenteront, de manière transitoire, une mobilité réduite causée par une paralysie complète et une perte de capacité portante des membres postérieurs du côté lésé. Nous optimiserons la méthode de lésion pour que les déficits moteurs soient parfaitement latéralisés.
Devenir
Les animaux qui n'auront pas reçu d'injections de traceurs neuronaux ni de lésions médullaires seront utilisés dans d'autres projets. Les autres animaux seront mis à mort en vue du prélèvement du cerveau et de la moelle épinières pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet.
Remplacement
Le but de cette étude est de caractériser finement la repousse axonale à la suite d’une lésion de la moelle épinière, étudier les changements d’organisation des voies axonales au sein de l’ensemble de la moelle épinière et de corréler cette plasticité à la récupération fonctionnelle. A ce jour, aucune alternative non animale n'est disponible pour ces questions. En effet, même si les bases neurales de l'activité locomotrices ont beaucoup progressé, et sont encore étudiées, sur des préparations in vitro (tronc cérébral et moelle épinière attachées), ces préparations ne sont pas adaptées à l'étude d'une lésion et de la plasticité neuronale qui en découle. En effet, ces préparations ne peuvent être maintenues actives que quelques heures au mieux, ce qui ne permet pas l'étude des changements d'activité neuronale et de connectivité qui s'installent dès les premiers jours après la lésion et qui continuent à s'opérer plusieurs semaines après. L'enjeu de ce projet est en d'étudier la corrélation entre plasticité anatomique et autonomie motrice, qui est le critère à restaurer chez les sujets humains. La motricité, donc l'exécution d'un mouvement bien donné, et dont l'efficacité est quantifiable et mesurable, ne peut être étudié que sur l'animal adulte et intègre. Enfin, des modèles computationnels existent et sont utilisés par certains laboratoires. Nous avons nous-même un projet sur la modélisation des réseaux locomoteurs, mais dans un contexte sain. Ces modèles sont intégralement construits sur des moelles épinières intactes, et les conséquences anatomiques et fonctionnelles des lésions médullaires ne peuvent pas être simulées.
Réduction
Nous ferons une double utilisation de la plupart des animaux (étude fonctionnelle et anatomique). L’étude anatomique reposera sur des observations de neurones et leurs quantifications par animal, puis moyennées entre animaux. L’étude fonctionnelle reposera sur des comparaisons de mobilité et d’intégrité des mouvements entre animaux lésés et non lésés, et entre animaux lésés ayant ou non subi un traitement par stimulation trans-spinale. Par expérience, nous estimons que 10 animaux par groupe seront nécessaires par type de comparaison afin des résultats significatifs.
Raffinement
Toutes les expériences invasives seront réalisées sous anesthésie générale, combinées à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une chambre chauffante ventilée, conçue spécialement pour le réveil post-opératoire, et ce jusqu’au réveil complet. Ils retourneront ensuite dans leur cage d’origine afin d’éviter un stress lié à l’isolement. Ils seront soumis à un suivi post-opératoire quotidien pendant 7 jours pendant l’expérimentateur suivants la chirurgie. Nous contrôlerons le poids, l’aspect général (respiration, pelage, propreté de la zone anogénitale, déplacement, sutures), le comportement dans la cage et pendant les manipulations. Si les animaux montrent des signes de douleur, ils recevront un traitement adapté. Hors suivi post-opératoire, les animaux seront suivis quotidiennement par les personnels de l’animalerie.
Choix des espèces
La compréhension des bases neurales de la locomotion, de son contrôle par le tronc cérébral en condition sain ou lésé chez l’humain nécessite le recours à un modèle animal mammifère. La petite taille, la facilité d’élevage et la vitesse de reproduction de la souris a fait de cette espèce un modèle de choix pour les expériences de génétique depuis plus d’un siècle. Surtout, c’est actuellement le seul mammifère permettant un accès facile à la modification des gènes par la technologie du génie génétique sur cellules souches. De nombreuses lignées génétiquement modifiées sont donc disponibles chez cette espèce. Dans le cadre de ce projet, ces lignées génétiquement modifiées, qui ne présentent pas en elles-mêmes de phénotype dommageable, permettent de marquer par un traceur une seule population de neurones descendants. C’est la seule manière d’étudier une population neuronale de manière isolée. De plus, l’anatomie du cerveau et de la moelle épinière de la souris est très bien cartographiée. L’étude ne comporte pas d’aspects liés au développement. Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 1mois et demi à 6 mois.
Rôle de l’exportine 7 associée à la schizophrénie dans la fonction et la maturation des cellules du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle de l'exportine 7, associée à la schizophrénie, dans la maturation des cellules du cerveau, 1 911 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements. Des femelles gestantes sont opérées pendant 45 minutes sous anesthésie générale pour une électroporation in utero, puis les souris transgéniques ou issues des embryons électroporés passent 6 h 40 de tests de comportement répartis sur un mois. L'anesthésie peut entraîner dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire, et la chirurgie un risque d'infection. Le porteur attend des effets sur la mémoire de travail, l'anxiété et la mémoire sociale, sans nommer les tests qui doivent les mesurer.
Objectifs
Des études récentes montrent que les mutations de certains gènes augmentent considérablement le risque de schizophrénie, une pathologie invalidante qui touche environ un pour cent de la population adulte et se caractérise notamment par des idées délirantes, un retrait social, des difficultés de concentration et de planification. L’ensemble de ces symptômes de la schizophrénie sont mal traités par les médicaments actuellement disponibles, et les effets secondaires de ces traitements sont importants. L’impératif de trouver des traitements efficaces implique de mieux comprendre les fondements neurobiologiques de la schizophrénie. Bien que rares, les mutations génétiques qui confèrent un risque fortement accru de développer la schizophrénie permettent d’identifier des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la pathologie.
Bénéfices attendus
La schizophrénie est une pathologie courante (500 000 à 600 000 patients en France) et très invalidante. Les traitements pharmacologiques de la schizophrénie traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Les grandes classes d’antipsychotiques et leurs modes d’action ont très peu évolué au cours des 50 dernières années. Le manque de progrès dans le développement thérapeutique est en grande partie une conséquence de notre compréhension limitée des troubles moléculaires sous-jacents. Très récemment, des mutations rares mais pénétrantes (qui augmentent très fortement le disque de la pathologie) dans certains gènes spécifiques ont été identifiées. Ces mutations sont très informatives car 1) elles ciblent un gène donné et 2) elles peuvent être modélisées chez l’animal. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en modifiant l’expression d’un gène impliqué dans la schizophrénie dans les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont pertinents pour comprendre les mécanismes de la schizophrénie, et possiblement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
1) Femelles gestantes : chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur). Injection d’un composé par voie intrapéritonéale (5 minutes) 2) Souris transgéniques ou issues d’embryons électroporés : Tests de comportement (6h40 en tout, répartis sur un mois). Une euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.
Impact sur les animaux
La perte d’expression du gène étudié par électroporation in utero sera localisée uniquement dans le cerveau au niveau du cortex frontal. De ce fait, les phénotypes comportementaux liés à la perte d’expression devraient affecter sélectivement des comportements dépendants du cortex frontal (mémoire de travail, anxiété, mémoire sociale). Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. La chirurgie peut induire un risque infectieux et de douleur associée à l’infection. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire. L’injection intrapéritonéale implique une contention et donc un stress momentané. Un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test des différents tests de comportements est attendu.
Devenir
Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie psychiatrique, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, notre étude de l'impact de la diminution d’expression d’un gène associé à la schizophrénie sur le fonctionnement du cortex nécessite d'utiliser des animaux pour pouvoir tirer des conclusions comportementales. Pour ces raisons, seule l’utilisation d’animaux permet d’aborder les mécanismes de régulation des fonctions corticales dans le cadre de cette étude. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la schizophrénie) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance.
Raffinement
Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale générée à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal prénatal sont des embryons à un stade de développement embryonnaire qui permet d’étudier à la fois les conséquences de la modification d’expression du gène étudié sur la prolifération et sur la migration des neurones immatures. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal posnatal sont des souris juvéniles (15 à 25 jours) ou jeunes adultes (60 à 100 jours).
Etablissement de lignées tumorales humaines issues de patients pour greffer chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie deux greffes sous-cutanées de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon, dont la croissance est suivie trois fois par semaine avant la mise à mort et le prélèvement des tumeurs. Le porteur indique que la croissance des tumeurs sous la peau peut provoquer une douleur modérée. Le projet vise à constituer un panel de tumeurs de patients pour de futures greffes, un modèle dont il affirme qu'il ne peut être remplacé par des cellules en culture faute de reproduire la complexité de l'"organisme entier".
Objectifs
La compréhension de la biologie des tumeurs est au cœur de la recherche actuelle. Issue de cette explosion de données et de connaissances, une multitude de thérapies ciblées a pu voir le jour. Ces dernières ont pour la plupart été préalablement testées sur des modèles animaux et reposent sur leur efficacité contre le cancer dans des expériences de greffe chez la souris qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. La sélection de nouvelles molécules repose notamment sur leur efficacité anticancéreuse dans des modèles animaux greffés. Dans ces derniers, des cellules cancéreuses issues de patients sont injectées dans des souris afin d’y faire se développer une tumeur et d’évaluer l’activité de ces molécules. Cependant, l’efficacité anticancéreux de ces molécules sur de telles greffes et sur les tumeurs issues de patients est souvent faiblement corrélée. L’amélioration du pouvoir de prédiction de ces modèles animaux peut être obtenue grâce à des modèles de greffe dérivée de la tumeur du patient dans lesquels un fragment du cancer du patient est greffé dans les plus brefs délais chez des souris. De plus, lorsque la tumeur est implantée, ces tumeurs issues de patients permettent parfois de mimer l’apparition de métastases. Pour ces raisons, un effort est actuellement en cours afin de générer un panel représentatif de tumeurs de patients pour chaque sous-type de cancer et plus particulièrement en ce qui nous concerne, les cancers (côlon, pancréas, foie et poumon). Le but de cette étude est d’établir un panel de différentes tumeurs de patients issus des 4 organes déjà cités, tumeurs qui pourront ainsi être des modèles cellulaires cancéreux qui seront greffés dans les modèles animaux dans nos futures études.
Bénéfices attendus
Communément, lorsque l’on parle de greffes, on fait référence au modèle qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. Pour la plupart des types tumoraux, des cellules ont pu être établies et sont fréquemment utilisées pour greffer des souris. Les cellules cancéreuses sont couramment utilisées car elles sont faciles à amplifier. Elles sont souvent bien caractérisées et relativement stables au cours du temps. Cependant, elles présentent quelques désavantages : i) une erreur de sélection lors de leur établissement et de leur propagation en culture, ii) une perte de l’aspect tridimensionnel de la tumeur puisque la plupart de ces cellules cancéreuses croissent en deux dimensions formant un tapis cellulaire ; iii) une perte de communication entre les cellules de l’environnement de la tumeur (cellules sanguines et immunitaires) et les cellules de la tumeur. Afin de palier la majorité de ces inconvénients, un modèle amélioré de greffe est de plus en plus utilisé : il s’agit de la greffe dérivée de la tumeur du patient. Ce modèle résulte d’une implantation après dissociation d’un fragment tumoral du patient fraîchement prélevé, chez des souris. La greffe dérivée de la tumeur du patient va alors se stabiliser et conserver dans la plupart des cas les caractéristiques pathologiques de la tumeur humaine initiale. Néanmoins, au vu de leurs avantages, les greffes dérivées de tumeurs de patients ont vu leur développement s’accélérer depuis quelques années et offrent aujourd’hui une approche pertinente pour mieux comprendre le développement des cancers afin d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon sous anesthésie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie par mesure régulière à l'aide d'un pied à coulisse électronique. L’ensemble des souris sera alors évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs, mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, au cours du temps.
Impact sur les animaux
(1) Un stress physique serait une nuisance induite par l’anesthésie lors de la xénogreffe et (2) une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses, dissociation et mise en culture.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant de travailler à l'échelle d'un organisme vivant entier. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.
Réduction
Dans le but de répondre à la règle des 3R, nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir un nombre de cellules tumorales pour en evisager leur culture in vitro après la mort de l'animal et la dissociation des tumeurs. Dans le but de réduire le nombre d'animaux par groupe, celui-ci sera de 2 souris chacune implantée de 2 tumeurs issues de patients sur chaque flanc (droit et gauche), c'est à dire 4 tumeurs implantées par prélèvement issu de patient, ceci dans le but d’obtenir suffisamment des cellules tumorales issues de patients à mettre en culture in vitro en fin d’expérience. Ce nombre de 2 souris par tumeur issues de patient est le nombre suffisant pour obtenir une quantité utile de cellules (2 à 5 millions) pour envisager leur culture in vitro. Ce résultat est le fruit de l'expérience de ce type de procédure qui a déjà été proposé dans de multiples demandes d'autorisation à expérimention animale précédentes.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. L’administration d’analgésique sera réalisée si nécessaire (en cas de douleur). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie des cancers du côlon, du pancréas, du foie et du poumon induits dans cette espèce animale est proche de celle chez l’Homme. De plus, ce modèle apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade de développement tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles hébergés dans une même cage.
Evaluation de l’effet du BIO101 sur l’occurrence de la neuropathie induite par la vincristine dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit de la vincristine, un anticancéreux qui provoque une hypersensibilité douloureuse au toucher, mesurée par l'application de filaments sous la patte à plusieurs reprises, avant que les animaux soient tués pour l'analyse des nerfs. Le porteur affirme que les souris ne présentent en dehors des tests aucun signe de souffrance ni de perte de poids, et teste un composé censé prévenir cette neuropathie. Les bénéfices avancés, un futur essai clinique chez des patients sous chimiothérapie, sont renvoyés au conditionnel et au long terme.
Objectifs
Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hépatotoxicité. Dans le domaine de l’onco-hématologie, la vincristine, un agent anticancéreux commumément utilisée pour la prise en charge des lymphomes, constitue une des chimiothérapies les plus neurotoxiques et est responsable de la neuropathie induite par la vincristine, caractérisée notamment par l'apparition d'une hypersensibilité tactile douloureuse. Cette complication impacte autant la qualité de vie des patients que la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de telles stratégies neuroprotectrices constitue un enjeu de santé publique. Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Il a déjà été démontré que la modulation pharmacologique des récepteurs à l’angiotensine II, permettait d’exercer un effet neuroprotecteur dans plusieurs modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Certains éléments du système rénine angiotensine, peu étudiés, pourraient jouer un rôle important dans les phénomènes de neuroprotection/neurorégénération du nerf périphérique. L’activation d'un récepteur du systéme rénine-angiotensine présenterait des propriétés analgésique et neurorégénérative au niveau du système nerveux périphérique. Nous supposons que l'activation de ce récepteur par un traitement préventif pourrait également avoir des effets neuroprotecteurs en l’administrant avant la chimiothérapie. A court terme, nous nous attendons à ce que ce traitement préventif améliore la sensibilité tactile chez des animaux ayant reçu de la vincristine et présentant une hypersentibilité tactile, et restaure/prévienne également les altérations morphologiques des tissus du système nerveux sensitif induites par la chimiothérapie. A plus long terme, nous espérons réaliser la même étude sur nos modèles de neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine, deux autres agents anticancéreux neurotoxiques, avec un effet bénéfique attendu du traitement préventif sur les troubles sensitifs et les atteintes nerveuses induites par les chimiothérapies. La mise en évidence d’un effet neuroprotecteur du traitement préventif dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur le développement des neuropathies induites par la chimiothérapie.
Procédures
Chaque animal (soit 100 animaux) recevra une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours. Sur les 100, 35 animaux subiront une injection i.p. le matin du traitement préventif puis une injection i.p de vincristine l'après-midi. Sur ces 35 animaux, 10 recevront en plus une injection sous-cutanée d'un bloqueur une heure avant l'i.p. du traitement préventif. L'ensemble des animaux sera également soumis au test des filaments qui permet d'évaluer le dégré de sensibilité tactile, une fois avant le début des traitements puis à J1, J3 et J7. L'injection intrapéritonéale a été privilégiée par rapport à l'injection intra-veineuse. Les injections seront répétées tous les jours pendant 7 jours, ainsi la répétition des injections sera plus aisée en intrapéritonéal qu'en intraveineux. La pose d'un cathéter a été exclu afin de garantir une liberté de mouvement totale à l'animal nécessaire pour le test comportemental. L'injection du bloqueur, qui n'est pas un produit irritant, se fera en sous-cutanée, afin de ne pas dépasser le nombre de deux injections i.p. par jour.
Impact sur les animaux
Nous avons déjà dévellopé et caractérisé le modèle de neuropathie induite par la vincristine. Dans ce modèle, nous observons l’apparition d’une allodynie mécanique suite à l’administration de vincristine. Cette allodynie se traduit par une hypersensibilité en réponse à un stimulus focalisé qui est l’application d’un filament sur la voute plantaire. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluée). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine présentent un comportement tout à fait similaire aux animaux témoins. Ils ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. Ainsi, nous nous attendons à ce que les animaux recevant de la vincristine et le traitement préventif présentent une amélioration de leur symptômes, à savoir un retour à la normale de la sensibilité tactile.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées à la vincristine et aux traitements seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique des tissus du système nerveux sensitif. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêts seront prélèvés sur chaque animal.
Remplacement
Il n'existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l'expérimentation animale disponible qui reproduit l'ensemble des mécanismes mis en jeu à la génération d'une douleur induite par des cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle dont la séquence d'injection des agents anti-cancéreux est la plus conforme aux protocoles de chimiothérapies neurotoxiques utilisés chez l'Homme. En parallèle de cette étude chez la souris, une étude in vitro évaluant l'effet de la vincristine et de sa combinaison avec le traitement préventif sur des neurones sensitifs humains dérivés est en cours. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, ...) mis en jeu au niveau du neurone sensitif humain, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation inhérents aux neuropathies induites par la chimiothérapie, ainsi que toute la complexité des phénomènes aboutissant à la sensation douloureuse.
Réduction
Le nombre de 10 animaux par groupe a été calculé à partir de résultats (moyenne et écart-type) obtenus au cours d'une étude sur le modèle de neuropathie induite par la vincristine. L'analyse statistique sera réalisée à l'aide de deux logiciels. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, le test de comportement puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur de cadavres.
Raffinement
Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement préventif sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide d'un test d'évaluation de la sensibilité tactile. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors cette étude pilote sera renouvelée avec des doses deux fois inférieures. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de cette étude pilote, et que le traitement préventif ne présente pas d’effet positif sur la neuropathie, alors la même étude sera réalisée sur deux nouveaux groupes de 5 souris. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement préventif présente un effet positif sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale, à la dose efficace. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul un test d'évitement sera utilisé pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la vincristine et/ou au traitement préventif doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôle pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses au test comportemental seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.
Choix des espèces
Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique. Ces conditions sont les mieux réunies avec des adultes jeunes (7-8 semaines, poids 25-30g).
Génotypage par coupe de bout de queue chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
20 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 5 000 tuées et 15 000 gardées vivantes pour l'élevage ou d'autres projets. À une dizaine de jours, chaque souriceau subit sous anesthésie l'ablation d'un millimètre de queue destinée au génotypage, les animaux surnuméraires ou ne portant pas la modification génétique recherchée étant ensuite tués au CO2. Le porteur affirme qu'aucun saignement ni effet indésirable n'est attendu et que le prélèvement de poils, moins invasif, a été écarté parce qu'il faussait les résultats. Il présente le génotypage comme "indispensable" à la gestion des lignées génétiquement modifiées, sans lequel le modèle vivant ne peut être remplacé.
Objectifs
Les études faites au sein de notre animalerie nécessitent l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Ces souris présentes les trois génotypes possibles, homozygote mutant, hétérozygotes et homozygotes sauvages. Afin de pouvoir définir le génotype des souris, un génotypage est nécessaire. Après avoir testé différents types de prélèvements sur les animaux, il s’avère que le prélèvement le moins invasif (prélèvement de poils) entraine des contaminations et donc des erreurs de génotypage. Nous devons donc effectuer ce génotypage par prélèvement de bout de queue. Ce mode de prélèvement a démontré une meilleure fiabilité que d’autres prélèvements. Afin de s’assurer du bien-être des animaux, ces prélèvements sont effectués sous anesthésie générale au vetflurane et les animaux sont tout de suite remis dans leurs cages d’hébergement pour réveil avec leurs parents.
Bénéfices attendus
Le génotypage permet de connaitre le génotype des animaux et donc de sélectionner les bons animaux pour le projet ou le maintien de lignée
Procédures
les animaux subiront un prélèvement de 1 mm de bout de queue vers 10 jours d'age sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les animaux étant prélevé à un jeune âge et sous anesthésie, la coagulation se fera rapidement, il n’y aura pas de saignement. Les animaux se réveilleront avec leurs parents, il n’y aura pas de nuisances ni d’effets indésirables.
Devenir
Les animaux surnuméraires ou ne possédant par le génotype nécessaire seront mis à mort par inhalation progressive de CO2. Les animaux possédant le bon génotype seront gardés en vie pour le maintien de la lignée ou pour la réalisation de projet ne nécessitant pas de demande d’autorisation de projet. Environ 25 % partiront dans le cadre d'une utlisation continue dans des projets necessitant une demande d'autiorisation de projet
Remplacement
Le génotypage des animaux est indispensable au bon déroulé des études et à la bonne gestion de lignées OGM. Le modèle vivant ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Le génotypage des animaux permet de ne garder que le minimum d’animaux. En effet si la lignée suit la loi de Mendel, nous pouvons supposer du nombre d’animaux possédant le bon génotype issu d’un accouplement. Cela permet donc de ne garder qu’un nombre minimum de parents géniteurs et donc un nombre minimum de petits à génotyper
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permet l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et prélèvements seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation.Afin de diminuer le stress des animaux, le puçage et la coupure du bout de la queue se font en même temps sous la même anesthésie générale par inhalation de vetflurane. Ainsi les animaux ne sont anesthésiés qu’une fois.
Choix des espèces
Au sein de notre animalerie, nous n’effectuons de prélèvements que sur les souris car seules les souris génétiquement modifiés sont mises en accouplement et nécessite un génotypage. Les animaux seront prélevés à l’âges de 10 jours, cet âge permet de pouvoir génotyper les animaux avant la date de sevrage et donc de pouvoir répartir les animaux dans les cages d’hébergement par génotype au moment du sevrage.